CN108424457A

CN108424457A - 针对pcsk9抗体与检测试剂盒的制备及其用途

Info

Publication number: CN108424457A
Application number: CN201710075606.5A
Authority: CN
Inventors: 张晟; 付伟; 李生伟; 何刚; 代燕平; 程琳; 高小平
Original assignee: Chengdu Golden Rock Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Chengdu Jinluo strontium Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2017-02-13
Filing date: 2017-02-13
Publication date: 2018-08-21
Anticipated expiration: 2037-02-13
Also published as: CN108424457B

Abstract

本发明公开了一种抗人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)单克隆抗体以及包含该抗体的人PCSK9检测试剂盒的制备方法及其用途。本发明公开了抗PCSK9单克隆抗体的氨基酸序列及其编码基因、包含载体的宿主细胞及其制备方法。本发明以该抗体为基础，提供了一种针对作为抗原的人PCSK9的抗体‑三明治式ELISA方法和试剂盒，用以检测生物学样品中的PCSK9水平，并可以用作临床用药指导、诊断/预测的指标。

Description

针对PCSK9抗体与检测试剂盒的制备及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及诊断试剂领域，具体涉及利用抗体及包含抗体的试剂盒用于临床检测。

背景技术

前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是kexin样前蛋白转化酶枯草溶菌素家族的第9个成员，由692个氨基酸残基组成，分为信号肽、前结构域、催化结构域、羧基末端结构域；主要表达于肝脏、肾脏以及小肠。PCSK9的合成发生在内质网，后经内质网转运至高尔基体，并在高尔基体中经一系列修饰后分泌入血。目前认为，只有肝脏分泌的PCSK9可以分泌入血，并与肝细胞表面的低密度脂蛋白受体(LDLR)结合，介导LDLR降解，调节血浆胆固醇水平。作为低密度脂蛋白受体(LDLR)的负调节剂，过量PCSK9与肝细胞表面LDLR结合后可加速其降解，导致肝细胞对低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)的摄取下降，进而增加外周循环的LDL-C水平，最终使血液中胆固醇水平升高。因此，通过抑制PCSK9的功能来降低LDL-C给降脂治疗提供了一条新的思路。

高胆固醇血症分为家族性和非家族性，但均属于脂质代谢疾病，是冠状动脉疾病发生的重要危险因素。他汀类药物目前是治疗高胆固醇血症最为成功的药物，但一些不能耐受他汀类药物以及LDL-C水平过高的患者，其脂质水平始终不能达到预期目标。重要的是，大量研究证实，高胆固醇血症患者血清PCSK9水平显著升高，而且服用他汀类药物的患者血清PCSK9水平显著高于未服用他汀类药物患者。因此，血清PCSK9的检测不仅成为PCSK9抑制剂药物使用前的必须检测的临床指标，也将成为临床指导他汀类药物使用的必检项目。此外，血清PCSK9水平升高与年龄、TC、LDL-C、TG等动脉粥样硬化危险因素关系也十分密切，PCSK9与胆固醇以及LDL-C将并行成为诊断冠心病的重要标准。最近几年，对雌激素水平低下的更年期妇女血清检测发现，其PCSK9水平显著升高，提示PCSK9可能成为预测更年期女性患者冠心病危险因素的检测指标。预计PCSK9将作为一个非常重要的检测指标用于临床，且具有重大的临床意义并能产生长期的经济效益。

目前，国外已发展了多个针对PCSK9靶点的治疗性单克隆抗体，如Sanofi/Regeneron的alirocumab，Amgen的evolocumab，均在临床试验中显示良好的疗效，并于2015年内先后在美国和欧洲获批上市，但尚无应用针对PCSK9试剂盒进行该类药物或他汀类药物的临床指导检测；且国内亦未见有关生物学样品中PCSK9检测试剂盒的研究报道或发明专利申请。国外虽有用于科研的商品化人PCSK9检测试剂盒(如R&D公司，DYC900)上市，但尚无其用于临床生物学样品检测的研究数据或证明，且价格昂贵，若应用于临床检测将大幅增加了临床诊疗成本。

本发明提供了一种能特异性结合人PCSK9的单克隆抗体，以及包含该抗体的人PCSK9检测试剂盒的制备方法及其用途。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抗PCSK9的重组单克隆抗体及其编码基因。其具体序列如下：

鼠源抗体轻链氨基酸如序列表中的SEQ ID NO：1所述；

鼠源抗体重链氨基酸如序列表中的SEQ ID NO：3所述；

嵌合抗体轻链氨基酸如序列表中的SEQ ID NO：5所述；

嵌合抗体重链氨基酸如序列表中的SEQ ID NO：7所述；

编码所述上述融合蛋白核苷酸序列如下：

鼠源抗体轻链核苷酸如序列表中的SEQ ID NO：2所述；

鼠源抗体重链核苷酸如序列表中的SEQ ID NO：4所述；

嵌合抗体轻链核苷酸如序列表中的SEQ ID NO：6所述；

嵌合抗体重链核苷酸如序列表中的SEQ ID NO：8所述；

本发明的目的之二在于提供一种抗人PCSK9单克隆抗体的制备方法；

1)克隆人PCSK9抗体基因序列；

2)抗体真核表达载体构建；

3)选择CHO-K1、CHO-DG44或CHO-S细胞作为宿主细胞表达抗体。

本发明同时提供了上述核酸序列的表达载体，表达载体包含多种商业化载体或经过改造的商业化真核表达载体，包含pCDNA4.1、pCHO1.0、UCOE Expression Vector-Mouse3.2kb等，优选经改造后的UCOE Expression Vector-Mouse 3.2kb，将上述表达载体引入合适的表达系统，所述表达系统为真核表达系统，它们包含但不限于哺乳动物细胞、酵母、昆虫细胞等。可用于蛋白质大规模表达的哺乳动物细胞有多种，如293细胞、CHO细胞、SP20细胞、NS0细胞、COS细胞、BHK细胞或PerC6细胞等，优选CHO细胞；转染细胞的方法有多种，其中包括但不限于：电穿孔，脂质体介导法，钙介导法等，优选电穿孔法。

所述抗体的表达方式是在已经稳定转染的宿主细胞中对重组载体进行基因扩增，以提高相应重组抗体的表达量，例如用含有二氢叶酸还原酶(DHFR)的重组载体稳定转染缺乏DHFR的宿主细胞后，可在细胞培养液中添加甲氨喋啶(MTX)的浓度以扩增重组载体在宿主细胞中的拷贝数量。含有所述抗体表达后，可用酶联免疫吸附法(ELISA)或其他方法测定培养液中的目的蛋白浓度。抗体蛋白可用Mabselect SURE亲和层析法提纯。

本发明的目的之三在于提供所述抗体的用途；

本发明提供的抗体用于开发一种针对人PCSK9的抗体-三明治式ELISA方法，用以检测生物学样品中的PCSK9水平。包括如下步骤：

(a)使生物学样品与固定化至固体支持物的捕获试剂接触并一起孵育，其中所述捕获试剂是与人PCSK9特异性结合的单克隆抗体；(b)将所述生物学样品与所述固定化捕获试剂分开；(c)使所述固定化捕获试剂-靶物分子复合物与可检测抗体接触，所述可检测抗体是能结合人PCSK9的多克隆抗体；并(d)使用针对所述可检测抗体的检测手段来测量所述捕获试剂所结合的人PCSK9含量。

在本发明的实施方案中，捕获试剂是本发明目的之一、二所述的单克隆抗体，固定化的捕获试剂包被在微量滴定板上；可检测抗体是可直接检测的，也可受比色试剂放大，或者是生物素化的，且检测手段为链亲和素-过氧化酶和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。

在本发明中，所述生物学样品指来自任何动物来源的样品，但优选来自哺乳动物，更优选来自人。在某些实施方案中，此类生物学样品来自人受试者。此类样品包括生物学流体，如血清、血浆、组织培养液、以及组织提取物(诸如匀浆组织、肿瘤组织、和细胞提取物、细胞培养上清)。

本发明的目的之四在于提供一种可检测生物学样品中人PCSK9含量的试剂盒。该试剂盒是包含如下基本元件的成套组合：(a)作为捕获试剂的针对人PCSK9的抗体，最优选本发明目的之一、二所述的单克隆抗体；和(b)作为检测试剂的可检测抗体，其能特异结合人PCSK9；

所述试剂盒还包含捕获试剂的固体支持物，其可以作为分开的元件提供或者其上已经固定化捕获试剂。优选地，捕获试剂包被在微量滴定板上。检测抗体可以是直接检测的标记抗体或由不同物种中产生的针对未标记抗体的经标记抗体检测的未标记抗体。若标记物是酶，则试剂盒通常会包括酶所需的辅助因子和底物，若标记物是荧光基团，则试剂盒包括可检测生色基团的染料，且若标记物是生物素，则试剂盒包括链亲和素或与辣根过氧化物酶或β－半乳糖苷酶偶联的链亲和素以及底物。所述试剂盒还包含作为抗原标准品的纯化的人PCSK9蛋白。

附图说明

图1抗人PCSK9鼠源抗体轻链表达载体

图2抗人PCSK9鼠源抗体重链表达载体

图3抗人PCSK9嵌合抗体轻链表达载体

图4抗人PCSK9嵌合抗体重链表达载体

图5抗人PCSK9单克隆抗体与抗原结合解离曲线

图6抗体-三明治式ELISA检测人PCSK9标准曲线

具体实施方式

提供以下实施例对本发明作进一步阐释。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。

实施例1 抗人PCSK9单克隆抗体的制备

1.抗人PCSK9单克隆抗体表达质粒制备

1.1抗体可变区序列制备

利用PCR扩增技术，由分泌抗人PCSK9抗体的杂交瘤细胞株中获得抗体可变区序列。PCR反应体系如下(总体积50μl)：10×Buffer 5μl、dNTP 2μl、1μl(引物序列见表1)、模板为cDNA、rTaq酶0.2μl，双蒸水补至50μl。反应条件：95℃预变性3min，95℃15s、52℃30s、72℃30s，33个循环，最后72℃15min。获得重、轻链可变区基因片段分别命名为5H和6K。

表1 抗体可变区扩增引物

1.2抗体表达载体构建

(1)鼠源抗体表达载体构建：

将前期所获得的轻链可变区片段(6K)以重叠延伸PCR和轻链恒定区拼接在一起，获得轻链序列(氨基酸序列如序列表中序列SEO ID，NO1所示，核酸序列如序列表中序列SEOID，NO2所示)。重链可变区片段(5H)以重叠延伸PCR和小鼠IgG1Fc恒定区拼接在一起，获得重链序列(氨基酸序列如序列表中序列SEO ID，NO3所示，核酸序列如序列表中序列SEO ID，NO4所示)。再将上述获得的轻、重链序列重组至表达质粒BP0001中，获得鼠源抗体表达载体。

具体操作如下所述(所用引物见表2)：(1)轻链需以重叠延伸PCR和CK恒定区拼接在一起，再重组至真核表达载体BP0001中。首先通过引物P144，P169进行桥接PCR获得轻链g1片段，同时利用P171，P146进行PCR扩增获得轻链g2片段，将轻链g1和g2片段通过桥接PCR扩增获得轻链基因片段，轻链基因片段以AvrII酶(NEB公司)和PacI酶(NEB公司)双酶切后，以T4连接酶(NEB公司)与相同方式酶切的BP0001大片段相连接，并经酶切与测序鉴定正确，成功获得轻链表达载体BP4036(图1)。(2)重链需以重叠延伸PCR和小鼠IgG1恒定区拼接在一起，再重组至真核表达载体BP0001中。首先通过引物P148，P369进行桥接PCR获得重链g1片段，同时利用P371和P372进行PCR扩增获得含小鼠IgG1恒定区的重链g2片段。将重链g1与g2片段通过桥接PCR扩增获得重链基因片段，重链基因片段以AvrII酶和PacI酶双酶切后，以T4连接酶与经相同方式酶切的BP0001大片段相连接，并经酶切与测序鉴定正确，成功获得重链表达载体BP4037(图2)。

表2 PCR体系所需引物

(2)嵌合抗体表达载体构建：

将前期所获得的轻链可变区(6K)以重叠延伸PCR和轻链恒定区拼接在一起，获得轻链序列(氨基酸序列如序列表中序列SEO ID，NO5所示，核酸序列如序列表中序列SEO ID，NO6所示)。重链片段(5H)以重叠延伸PCR和人IgG1恒定区拼接在一起，获得重链序列(氨基酸序列如序列表中序列SEO ID，NO7所示，核酸序列如序列表中序列SEO ID，NO8所示)。再将上述获得的轻、重链序列重组至表达质粒BP0001中，获得嵌合抗体表达载体。

具体操作如下所述(所用引物见表2)：(1)轻链需以重叠延伸PCR和CK恒定区拼接在一起，再重组至真核表达载体BP0001中。首先通过引物P144，P169进行桥接PCR获得轻链g1片段，同时利用P170，P147进行PCR扩增获得轻链g2片段，将轻链g1和g2片段通过桥接PCR扩增获得轻链基因片段，轻链基因片段以AvrII酶(NEB公司)和PacI酶(NEB公司)双酶切后，以T4连接酶(NEB公司)与相同方式酶切的BP0001大片段相连接，并经酶切与测序鉴定正确，成功获得轻链表达载体BP4038(图3)。(2)重链需以重叠延伸PCR和IgG1恒定区拼接在一起，再重组至真核表达载体BP0001中。首先通过引物P148，P369进行桥接PCR获得重链g1片段，同时利用P370和P373进行PCR扩增获得含IgG1恒定区的重链g2片段。将重链g1与g2片段通过桥接PCR扩增获得重链基因片段，重链基因片段以AvrII酶和PacI酶双酶切后，以T4连接酶与经相同方式酶切的BP0001大片段相连接，并经酶切与测序鉴定正确,成功获得重链表达载体BP4039(图4)。

表3 PCR体系所需引物(2)

3、质粒转染及细胞筛选

利用小样质粒提取试剂盒(QIAGEN公司)制备上述构建成功的鼠源抗体轻、重链表达质粒以及嵌合抗体轻、重链表达质粒。分别将相应质粒共转染宿主细胞CHO-S或DG44，MTX加压筛选获得稳定转染的细胞，经过单克隆筛选获得高产的单细胞克隆，分别命名为CHO-BP4036/4037-3、CHO-BP4038/4039-1。

4、单克隆抗体表达纯化

将上述获得的单细胞克隆分别进行摇瓶培养7天，目的抗体分泌至细胞培养上清中；收集培养上清，纯化获得相应的抗体蛋白，分别命名为P4036/4037-3、P4038/4039-1。具体纯化步骤如下：

1)层析填料

Mabselect Sure(GE公司)、Superdex 200(GE公司)

2)缓冲液

母液1：0.2M Na₂HPO₄：称14.2g磷酸氢二钠溶解于500ml超纯水，0.45μm滤膜过滤。母液2：0.2M NaH₂PO₄：称12.0g磷酸二氢钠溶解于500ml超纯水，0.45μm滤膜过滤。母液3:2MNaCl：称58.5g氯化钠溶解于500mll超纯水，0.45μm滤膜过滤。母液4:0.1M柠檬酸：称1.92g柠檬酸溶解于100ml超纯水，0.45μm滤膜过滤。母液5:0.1M柠檬酸钠：称2.58g无水柠檬酸三钠溶解于100ml超纯水，0.45μm滤膜过滤。母液6:1M NaOH：称20g氢氧化钠溶解于500ml超纯水，0.45μm滤膜过滤。

亲和平衡缓冲液(PBS):0.2M Na₂HPO₄:82.5mL/L,0.2M NaH₂PO₄:17.5mL/L,2MNaCl：75mL/L,补加超纯水至1L，充分搅拌混匀，用1M氢氧化钠或1M盐酸调节pH至7.2。亲和洗脱缓冲液:20mM柠檬酸缓冲液(pH 3.2)：8.6ml 0.1M柠檬酸；1.4ml 0.1M柠檬酸钠，补加超纯水至50ml。亲和CIP缓冲液:1M NaOH:100mL/L。凝胶过滤层析溶液(PBS):0.2M Na₂HPO₄:82.5mL/L；0.2M NaH₂PO₄:17.5mL/L,2M NaCl：75mL/L,补加超纯水至1L，充分搅拌混匀，用1M氢氧化钠或1M盐酸调节pH至6.8。

3)样品预处理：收集培养液进行离心去除细胞及碎片物，5000～6000rpm，离心15min；转移上清再用0.45μM滤器过滤。

4)亲和层析

运行AKTA纯化系统，安装亲和层析柱Mabselect Sure。用超纯水冲洗系统至少3倍柱体积，再用亲和平衡缓冲液平衡系统至少5倍柱体积直至基线稳定，然后上样。上样结束后，用亲和平衡缓冲液冲洗至少10倍柱体积，再用亲和洗脱缓冲液进行洗脱，根据紫外检测值收集280nm处主吸收峰。继续流洗1倍柱体积后用亲和平衡缓冲液平衡pH至中性。之后，用Mabselect Sure CIP缓冲液在位清洗5倍柱体积，然后亲和平衡缓冲液冲洗3倍柱体积直至基线稳定。用超纯水冲洗3～5倍柱体积后，以20％乙醇溶液冲洗系统至少3倍柱体积，保存亲和层析柱。

5)凝胶过滤层析

启动AKTA纯化系统并安装Superdex 200凝胶过滤层析柱。调节流速5ml/min，用超纯水冲洗3倍柱体积，用Superdex200柱层析平衡液冲洗3倍柱体积；再调低流速至2.5ml/min，取上述亲和层析洗脱样品上样。而后用Superdex200柱层析平衡液进行洗脱，收集280nm处目的峰。再继续冲洗3倍柱体积，最后用0.01M NaOH溶液保存层析柱。

实施例2 单克隆抗体与人PCSK9结合亲和力

本发明所述的单克隆抗体与人PCSK9的结合亲和力通过生物膜干涉技术测定。具体测定过程如下：首先，将人PCSK9蛋白进行生物素标记，具体讲是人PCSK9与NHS-LCLC-biotin(Thermo-Fisher公司)以摩尔比1:5混匀，于室温孵育1h后用PD-10脱盐柱(GE公司)去除剩余的NHS-LCLC-biotin，获得生物素化的人PCSK9。再在蛋白分子相互作用仪OtectQK^e(Pall公司)上将其固化于SA Biosensor传感器(Pall公司)上，设置不同浓度(600nM到0.82nM)的抗体，以Sample Diluent buffer为空白对照；采用Otect QK^e的StandardKinetics Assays(0.6HZ,averaged by 5)进行人PCSK9与单克隆抗体的结合动力学检测，记录响应信号并计算结合亲和力参数，概括在图5、表4中，数据以Mean±SD表示。

表4.抗PCSK9抗体与抗原的结合亲和力参数

实施例3 定量检测人PCSK9的ELISA方法

1.抗体-三明治式ELISA方法的建立

用实施例1-2所述的抗人PCSK9单克隆抗体建立定量检测人PCSK9的抗体-三明治式ELISA方法。具体地说，首先将抗人PCSK9单克隆抗体作为捕获试剂固定于微量滴定板上，固定化方法是用碳酸盐缓冲液(pH9.6)将抗人PCSK9抗体稀释至2μg/ml，按100μl/孔加至微量滴定板上，并于4℃孵育16～20h；而后用含0.05％Tween-20的PBS溶液洗涤3次，以3％BSA的PBS于37℃封闭2h；最后将固定化后的微量滴定板密封于-20℃保存，备用。检测人PCSK9含量的过程是：将上述预先固定化捕获试剂的微量滴定板平衡至室温，加入不同浓度的人PCSK9标准品以及经相同的样品稀释液配制的待测样品，37℃孵育2h。用可检测抗体测定抗PCSK9单克隆抗体-人PCSK9蛋白复合物，具体讲，洗板后加入生物素标记的山羊抗人PCSK9多克隆抗体(R&D公司)，0.25μg/ml，37℃孵育2h。洗板后加入偶联有辣根过氧化物酶的链亲和素，室温孵育1h。洗板后加底物TMB进行显色反应，并用2M硫酸溶液终止反应，检测450nm处吸光值。建立PCSK9标准品的浓度与吸光值的线性曲线，并利用线性曲线计算待测样品中人PCSK9含量。

2.ELISA方法性能评价

2.1线性范围

依照上述已建立的抗体-三明治式ELISA检测人PCSK9的方法，检测不同浓度的人PCSK9标准品，建立标准品浓度与吸光值的线性关系曲线，线性相关系数(R²)须大于0.990。测试结果见图6，该ELISA方法检测人PCSK9的线性范围为2.5ng/ml～160ng/ml，标准曲线的R²＝0.999。

2.2精密度

利用上述检测方法测试线性范围内的高、中、低浓度的人PCSK9质控品，每个样品设20个平行组，计算待测样品的检测浓度及其变异系数。测试结果在表5中概括，ELISA方法检测样品的批次内变异系数(CV％)均小于6％。

表5 ELISA方法的批次内精密度

配制不同浓度的人PCSK9质控品进行多次重复检测，评价ELISA方法的批次间精密度。具体过程是：将线性范围内的高、中、低浓度的人PCSK9质控品分别平行测定共计5次，每次10个平行组，检测浓度的回收率须在配制浓度的100±10％内，计算5次独立试验共50个平行组的变异系数。测试结果在表6中概括，待测样品5次独立试验共50个平行组的变异系数CV％均≤12％，体现该ELISA方法具有良好的批次间精密度。

表6 ELISA方法的批次间精密度

2.3灵敏度

根据上述ELISA方法所确定的线性范围，配制线性下限附近的不同浓度的人PCSK9质控品作为待测样品进行检测，并计算检测浓度的回收率，允许回收率在配制浓度的100±20％内，平行组内变异系数(CV)小于10％。实验结果表明上述建立的ELISA方法检测人PCSK9的最低检测限范围约为0.156-0.625ng/ml。2.4准确度

为了评价上述建立的ELISA方法检测人PCSK9蛋白的准确度，分别用细胞上清液、人血清、人血浆、组织匀浆及磷酸盐缓冲液配制已知浓度的人PCSK9质控品作为待测样品，测定待测样品的浓度，每个样品设5个平行组，计算各样品的回收率(Recovery％)。实验结果概括在表6中，该ELISA检测不同类型样品中人PCSK9含量的回收率均在配制浓度的100±13％内,磷酸盐缓冲液、细胞上清的回收率更是在100±8％内。

表6 ELISA方法的回收率

2.5线性度

评价上述ELISA方法检测人PCSK9含量的线性度。具体方法如下：将人PCSK9质控品分别用不同样品基质(如细胞上清、血清、血浆)不同比例稀释后作为待测样品，测试待测样品的浓度，每个待测样品设5个平行组，计算待测样品的回收率。实验结果在表7中显示，人PCSK9质控品经过不同比例稀释后的检测回收率均在配制浓度的100±12％内，说明该ELISA方法检测人PCSK9具有良好的线性度。

表7 ELISA方法的线性度

2.6特异性

人PCSK9与小鼠PCSK9二者在氨基酸序列和分子结构有一定的同源性；此外，PCSK家族其他成员与PCSK9也有一定的结构相似性。为验证上述ELISA方法检测人PCSK9的特异性，分别取1μg/ml的小鼠PCSK9、人PCSK1、人PCSK4与100ng/ml的人PCSK9质控品混匀作为待测样品，测试待测样品的浓度并计算回收率。测试结果表明上述ELISA方法检测人PCSK9与小鼠PCSK9、人PCSK1、人PCSK4均无明显交叉反应。

实施例4 检测人肝细胞系培养液及细胞裂解物中PCSK9

利用实施例3所述的抗体-三明治式ELISA方法检测了人肝细胞系HepG2培养液及细胞裂解物中PCSK9水平。具体过程是：HepG2细胞用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的高糖DMEM培养基于T-75培养瓶中进行培养，至细胞回合率达85％时收集细胞培养液，2000rpm离心5min，转移上清，备用；并收集细胞，裂解并制备细胞裂解物。检测细胞培养液及裂解物中PCSK9水平。测试结果显示：HepG2细胞培养液中PCSK9含量为102.4ng/ml，细胞裂解物中PCSK9含量为13.7ng/ml。

实施例5 检测家族性高脂血症患者血清中PCSK9

利用实施例3所述的抗体-三明治式ELISA方法检测了15例家族性高脂血症患者与10例健康人血清PCSK9水平，同时检测其血清LDL-C、TG水平。测试结果显示：15例家族性高脂血症患者血清PCSK9平均水平为418.35±26.14ng/ml；10例健康人血清PCSK9平均水平为167.52±32.21ng/ml。15例家族性高脂血症患者血清LDL-C和TG水平分别为5.02±0.28mmol/L和3.41±0.45mmol/L；10例健康人血清LDL-C和TG水平分别为2.63±0.51mmol/L和1.58±0.13mmol/L。

实施例6 检测绝经期女性受试者血清中PCSK9

利用实施例3所述的抗体-三明治式ELISA方法检测了绝经期女性受试者血清中PCSK9水平，同时检测其血清雌二醇水平。具体过程如下：首先收集了27例绝经期女性的血清样本，年龄43-58周岁，平均值53.1周岁，绝经年限1～12年。根据血清雌二醇水平测试结果将样本分为高雌二醇组11例(血清雌二醇≥200pmol/L)、低雌二醇组16例(血清雌二醇≤200pmol/L)两组。分别测试上述两组样品血清PCSK9水平，测试结果显示：11例高雌二醇组血清PCSK9平均水平为197.36±24.19ng/ml；16例低雌二醇组血清PCSK9平均水平为309.21±41.08ng/ml。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都贝爱特生物科技有限公司

<120> 针对PCSK9抗体与检测试剂盒的制备及其用途

<130> 0

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Ile Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Arg Thr Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 2

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgacctaggg ccaccatgga catgagggtg cctgcccagc tgctgggact gctgctgctg 60

tggctgaggg gcgccaggtg tgacattgtt ctcacccagt ctccagcact catgtctgca 120

tctccagggg agaagatcac catgacctgc agtgccagct caagtgtaag ttacatgttc 180

tggtaccaac agaagccaag atcctccccc aaaccctgga tttatctcac atccaacctg 240

gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc agtgggtctg ggacctctta ctctctcaca 300

atcagcagca tggaggctga agatgctgcc acttattact gccagcagtg gagtagtaac 360

ccgtggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaataaaac gccgtacgga tgctgcacca 420

actgtatcca tcttcccacc atccagtgag cagttaacat ctggaggtgc ctcagtcgtg 480

tgcttcttga acaacttcta ccccaaagac atcaatgtca agtggaagat tgatggcagt 540

gaacgacaaa atggcgtcct gaacagttgg actgatcagg acagcaaaga cagcacctac 600

agcatgagca gcaccctcac gttgaccaag gacgagtatg aacgacataa cagctatacc 660

tgtgaggcca ctcacaagac atcaacttca cccattgtca agagcttcaa caggaatgag 720

tgttag 726

<210> 3

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Arg Gly Asp Ala Gly Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Gly Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly His Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Val Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Tyr Asn Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Ala Ser Lys Thr Thr Pro Pro Ser

115 120 125

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val

130 135 140

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro

195 200 205

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

210 215 220

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

290 295 300

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

305 310 315 320

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

340 345 350

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

355 360 365

Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly

385 390 395 400

Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

405 410 415

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

420 425 430

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 4

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgacctaggg ccaccatggc ctggatgatg ctgctgctgg gactgctggc ctacggaagc 60

ggcgtggact cccgaggtga tgctggggag tctggggcag agcttgtgaa gccaggggcc 120

tcagtcaagt tgtcctgcac agcttctggc ttcaacatta aagacaccta tatccactgg 180

gtgaagcaga ggcctgaaca gggcctgggg tggattggaa ggattgatcc tgcgaatggt 240

catactaaat atgacccgaa gttccaggtc aaggccacta taacagcaga ctcatcctcc 300

aacacagcct acctgcagct cagcagcctg acatctgagg acactgccgt ctattactgt 360

gctagaagtt actataactc ctggtttgct tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 420

tcttcagcca aagctagcaa aacgacaccc ccatctgtct atccactggc ccctggatct 480

gctgcccaaa ctaactccat ggtgaccctg ggatgcctgg tcaagggcta tttccctgag 540

ccagtgacag tgacctggaa ctctggatcc ctgtccagcg gtgtgcacac cttcccagct 600

gtcctggagt ctgacctcta cactctgagc agctcagtga ctgtcccctc cagccctcgg 660

cccagcgaga ccgtcacctg caacgttgcc cacccggcca gcagcaccaa ggtggacaag 720

aaaattgtgc ccagggattg tggttgtaag ccttgcatat gtacagtccc agaagtatca 780

tctgtcttca tcttcccccc aaagcccaag gatgtgctca ccattactct gactcctaag 840

gtcacgtgtg ttgtggtaga catcagcaag gatgatcccg aggtccagtt cagctggttt 900

gtagatgatg tggaggtgca cacagctcag acgcaacccc gggaggagca gttcaacagc 960

actttccgct cagtcagtga acttcccatc atgcaccagg actggctcaa tggcaaggag 1020

ttcaaatgca gggtcaacag tgcagctttc cctgccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080

accaaaggca gaccgaaggc tccacaggtg tacaccattc cacctcccaa ggagcagatg 1140

gccaaggata aagtcagtct gacctgcatg ataacagact tcttccctga agacattact 1200

gtggagtggc agtggaatgg gcagccagcg gagaactaca agaacactca gcccatcatg 1260

aacacgaatg gctcttactt cgtctacagc aagctcaatg tgcagaagag caactgggag 1320

gcaggaaata ctttcacctg ctctgtgtta catgagggcc tgcacaacca ccatactgag 1380

aagagcctct cccactctcc tggtaaatga 1410

<210> 5

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Ile Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 6

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgacctaggg ccaccatgga catgagggtg cctgcccagc tgctgggact gctgctgctg 60

tggctgaggg gcgccaggtg tgacattgtt ctcacccagt ctccagcact catgtctgca 120

tctccagggg agaagatcac catgacctgc agtgccagct caagtgtaag ttacatgttc 180

tggtaccaac agaagccaag atcctccccc aaaccctgga tttatctcac atccaacctg 240

gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc agtgggtctg ggacctctta ctctctcaca 300

atcagcagca tggaggctga agatgctgcc acttattact gccagcagtg gagtagtaac 360

ccgtggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaataaaac gccgtacggt tgctgcacca 420

tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 480

tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 540

ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 600

agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 660

tgcgaagtca cccatcaggg cctgagttca ccggtgacaa agagcttcaa caggggagag 720

tgttaa 726

<210> 7

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Arg Gly Asp Ala Gly Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Gly Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly His Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Val Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Tyr Asn Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Ala Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 8

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgacctaggg ccaccatggc ctggatgatg ctgctgctgg gactgctggc ctacggaagc 60

ggcgtggact cccgaggtga tgctggggag tctggggcag agcttgtgaa gccaggggcc 120

tcagtcaagt tgtcctgcac agcttctggc ttcaacatta aagacaccta tatccactgg 180

gtgaagcaga ggcctgaaca gggcctgggg tggattggaa ggattgatcc tgcgaatggt 240

catactaaat atgacccgaa gttccaggtc aaggccacta taacagcaga ctcatcctcc 300

aacacagcct acctgcagct cagcagcctg acatctgagg acactgccgt ctattactgt 360

gctagaagtt actataactc ctggtttgct tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 420

tcttcagcca aagctagctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 480

aagagcacct ctgggggcac agcagccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 540

ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 600

gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 660

ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 720

aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 780

gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 840

atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 900

gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960

gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020

tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1080

gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1140

ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200

tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260

accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1320

gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380

cacaaccact acacacagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatga 1428

Claims

1.一种能够特异性结合人PCSK9的单克隆抗体，其特征在于

(a)一种抗人PCSK9的鼠源抗体，所述抗体包含SEQ ID NO：1所示的轻链氨基酸序列、SEQ ID NO：3所示的重链氨基酸序列、

(b)一种抗人PCSK9的人-鼠嵌合抗体，所述抗体包括SEQ ID NO：5所示的轻链氨基酸序列、SEQ ID NO：7所示的重链恒定区氨基酸序列。

2.制备如权利要求1所述的单克隆抗体的方法，包括以下步骤：

克隆抗体基因序列；

构建抗体真核表达载体；

选择CHO-K1、CHO-DG44或CHO-S细胞作为宿主细胞表达抗体，以及

从细胞培养液中纯化上述抗体。

3.一种能够特异性与人PCSK9结合的抗体的用途，用于制备可以检测样品中PCSK9含量的检测试剂盒。

4.一种用于在生物学样品中检测人PCSK9的方法，包括：

(a)使生物学样品与固定化至固体支持物的捕获试剂结合，其中所述捕获试剂是能与人PCSK9特异性结合的抗体，所述的抗体是权利要求1-2所述的单克隆抗体。

(b)检测所述抗PCSK9抗体和所述生物学样品中PCSK9蛋白之间复合物的形成。

5.一种试剂盒，包括：

作为捕获试剂的针对人PCSK9的抗体，其中所述单克隆抗体能特异性结合人PCSK9。

6.一种试剂盒的用途，用于临床使用PCSK9抑制剂药物或他汀药物的病人血清PCSK9检测，或者用于临床评价高胆固醇血症患者、更年期女性患冠心病危险因素的病人血清PCSK9检测。