CN107531798A

CN107531798A - Pcsk9的抑制剂用于脂蛋白代谢病症的治疗

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Publication number: CN107531798A
Application number: CN201680026131.4A
Authority: CN
Inventors: C·古斯塔夫森; P·S·马德森; S·G·彼得森
Original assignee: Aarhus Universitet
Current assignee: Aarhus Universitet
Priority date: 2015-03-20
Filing date: 2016-03-18
Publication date: 2018-01-02
Anticipated expiration: 2036-03-18
Also published as: EP3973958A2; JP2021119148A; AU2016235662B2; KR20170123345A; EP3271405A1; WO2016150444A1; AU2016235662A1; EP3973958A3; JP2018511596A; JP6869894B2; MX2017011879A; US10688119B2; US20200330504A1; BR112017020091A2; AU2020256388A1; CA2979756A1; US20180193376A1; US20220072032A1; CN107531798B

Abstract

本公开涉及用于治疗脂蛋白代谢病症的9型前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶‑样/kexin(PCSK9)的抑制剂。

Description

PCSK9的抑制剂用于脂蛋白代谢病症的治疗

技术领域

本公开涉及用于治疗脂蛋白代谢病症(Lipoprotein metabolism disorders)的9型前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶-样/kexin(PCSK9)的抑制剂。

背景技术

动脉粥样硬化引起的冠状动脉疾病是欧洲和美国中死亡的主要原因。动脉粥样硬化的发展中的主要危险因素是高胆固醇血症，具有循环中携带胆固醇的低密度脂蛋白(LDL胆固醇或LDL-C)颗粒水平的升高。LDL胆固醇颗粒的代谢受到高度调节，以平衡胆固醇的合成与膳食摄入量，从而提供体内胆固醇的需要。LDL胆固醇转换(turnover)中的关键调节物是LDL受体(LDLR)，其介导LDL颗粒的细胞摄取，并降低循环中LDL胆固醇的水平，如通过由LDLR缺陷或功能受损引起的家族性高胆固醇血症患者所示的。

降低LDL胆固醇血浆水平的一个成功策略是增加LDLR的细胞水平，而今天使用最广泛的降低LDL胆固醇的药物是他汀类药物。他汀类药物抑制胆固醇的合成，并且上调LDLR的表达，因而总体上导致循环LDL胆固醇的量降低。然而，由于多种副作用，相当多的患者对于他汀类药物不响应或耐受。此外，他汀类药物还增加近来被鉴定为LDLR的强力负调节物的9型前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶-样/kexin(PCSK9)的表达(Seidah等,2014)，由此抵消了对LDL胆固醇的有益作用。

PCSK9的靶向是用于降低血浆LDL-C的新近的策略(Lagace等,2006)。LDLR的细胞水平由于PCSK9结合LDLR的能力而降低，由此损害再循环并增强受体的溶酶体降解。PCSK9功能增益突变由于LDLR的降解增加导致循环LDL-C的显著增加。相比之下，具有PCSK9功能丧失功能突变的个体显示LDL-C水平降低并呈现较少的冠心病的事件。几家领先的制药公司已获得了靶向PCSK9用于缓解高胆固醇血症的治疗策略的批准。据报道，直接针对PCSK9的LDLR结合位点的PCSK9特异性抗体的施用在III期临床试验中降低了LDL-C血浆水平(Mullard(2015)Nat Rev Drug Discov；Sheridan(2015)Nature Biotechnology)。然而，PCSK9:LDLR结合常数在120-620nM的范围(Cunningham等,2007；Fisher等,2007)，而PCSK9血浆浓度为约6nM(Lakoski等,2009)，这使得PCSK9在生理相关浓度下直接结合LDLR是高度不可能的。此外，PCSK9仅靶向肝脏中的、而非类固醇激素生成组织(其也表达高水平的LDLR)中的LDLR，这表明需要肝特异性共受体(Seidah等,2014)。因此，LDLR最有可能不是主要的PCSK9受体。相反，未知的受体(受体X)可捕获循环PCSK9并随后将其递送至LDLR。因此，与PCSK9:LDLR相互作用的抑制相比，PCSK9与此受体结合的抑制是一种优越的策略。

发明内容

本发明涉及以下发现：LDLR不是肝细胞表面上唯一的PCSK9受体。本发明人发现PCSK9携带硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的结合基序。引入该基序中的突变以及通过肝素抑制与HSPG的结合令人惊讶地保护LDLR免受PCSK9诱导的降解。与PCSK9抑制性抗体的临床试验相比，抑制PCSK9与HSPG之间的相互作用具有优越的治疗潜力(Chan等,2009)。重要的是，PCSK9中的HSPG结合基序与LDLR结合表面的不同。HSPG由用一个或多个硫酸乙酰肝素糖胺聚糖链取代的核心蛋白组成。肝素是一种类型的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖。HSPG是高度糖基化的细胞表面蛋白，其结合具有HSPG结合基序的蛋白质配体，产生例如生长因子的局部储库(Xu和Esko,2014)。数据显示PCSK9结合HSPG，并且通过在PCSK9中的HSPG结合基序的定点诱变来消除相互作用，导致PCSK9突变体不能结合肝素并显示出降解LDLR的能力受损。此外，细胞与肝素、肝素模拟物或针对PCSK9中的HSPG结合位点的单克隆抗体温育导致LDLR水平升高，伴随培养基中PCSK9的浓度增加。总之，本实例中概述的结果证明PCSK9功能依赖于HSPG的结合，且当PCSK9和HSPG之间的相互作用被废除时，LDLR的细胞水平增加。

因此，HSPG在细胞表面LDLR的PCSK9介导的降解中作为关键的共受体发挥功能。本发现显示，HSPG在LDLR的PCSK9诱导的下调中具有至关重要的功能。

PCSK9和HSPG之间的相互作用位点可在阻断PCSK9功能，特别是抑制PCSK9对LDLR水平的作用中被靶向。因此，公开了高胆固醇血症的治疗和冠心病的预防中的新策略。

在第一方面，本发明涉及一种化合物，其能够抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖受体与PCSK9的结合。

在另一个方面，本发明涉及如本申请中所述的化合物，其用于制备用于治疗脂蛋白代谢的病症的药物。

在又一个方面，本发明涉及如本申请中所述的化合物，其用作药物。

在又一个方面，本发明涉及如本申请中所述的化合物，其用于在有需要的受试者中治疗脂蛋白代谢的病症的方法。

在又一个方面，本发明涉及在有需要的受试者中治疗脂蛋白代谢的病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本申请中所述的化合物。

在又一个方面，本发明涉及在有需要的个体中治疗脂蛋白代谢的病症如(选自)下组的病症的方法：血脂异常、高胆固醇血症和冠心病，所述方法包括以下步骤：

i.提供从所述个体分离的组织样品或血浆样品，

ii.确定所述组织中的LDLR的水平和/或所述血浆样品中的LDL-C的水平和/或PCSK9的水平，

iii.将步骤ii)的表达水平与对照组织样品或对照血浆样品的水平关联，

iv.评估治疗方案，

v.向所述个体施用包含治疗有效量的如本申请中所述的化合物/组合物的组合物。

在又一个方面，本发明涉及抑制LDLR的降解的方法，所述方法包括施用如本申请中所述的化合物。

在又一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含如本申请中所述的化合物。

在又一个方面，本发明涉及选择抗体的方法，所述抗体特异性识别并结合PCSK9(SEQ ID NO:1)的HSPG结合位点之内的表位，所述方法包括以下步骤：

i.向哺乳动物施用PCSK9的多肽片段或编码PCSK9的多肽片段的多核苷酸，所述多肽片段包含由SEQ ID NO:1的氨基酸残基78至167组成的域的至少一个氨基酸残基，如由SEQ ID NO:1的氨基酸残基78至167组成的域的至少5个，如至少10个，如至少15个，如至少20个，如至少25个，如至少30个，如至少35个，如至少40个，如至少45个，如至少50个，如至少55个，如至少60个，如至少65个，如至少70个，如至少75个，如至少80个，如至少所有的氨基酸；

ii.鉴定并选择识别所述多肽的抗体，和

iii.确定所述选择的抗体是否能够在竞争性ELISA测定中顶替一个或多个参考抗体。

在又一个方面，本发明涉及选择能够抑制HSPG如肝素与PCSK9的结合的肽或肝素类似物或模拟物的方法，所述方法包括以下步骤：

i.提供多种肽或肝素类似物或模拟物；

ii.将所述多种肽或肝素类似物或模拟物与细胞一起在培养基中温育，所述细胞源自表达LDLR的细胞系如源自肝细胞的细胞系；

iii.确定所述培养基中PCSK9的水平和/或所述细胞的LDLR的水平；

iv.选择导致如步骤iii中所确定的最高水平的PCSK9和/或LDLR的肽或肝素类似物或模拟物。

在又一个方面，本发明涉及能够选择性结合如本申请中所述的化合物的化合物。

在又一个方面，本发明涉及用于产生如本申请中所述的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

i.向哺乳动物施用蛋白或编码蛋白的多核苷酸，所述蛋白包含PCSK9的HSPG结合域或其片段或其功能等同物；

ii.选择所述抗体，如果它能够结合于PCSK9(SEQ ID NO:1)；

iii.选择所述抗体，如果它不能结合于突变的PCSK9，其中所述突变的PCSK9不能结合于HSPG。

在另一个方面，本发明涉及用于在有需要的受试者中降低血浆LDL-C水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本申请中所述的化合物或药物组合物的步骤。

附图简述

图1：如文献中描述的当前模型的图，其显示LDLR从循环中摄取携带胆固醇的LDL-C颗粒，并将它们递送至溶酶体用于降解，而受体(LDLR)在内体中释放负荷后被再循环到细胞表面(A)。结合于PCSK9后，LDLR自身在溶酶体(B)中降解。因此，PCSK9的高活性导致细胞表面处的LDLR水平降低和血浆胆固醇升高，而PCSK9活性的抑制则降低血浆胆固醇水平，并减慢冠状动脉疾病的进展。

图2：(A)所示为PCSK9的空间填充模型，LDLR结合位点和HSPG结合位点分别由左侧和右侧箭头指示。(B)在PCSK9(PDB ID:2PMW)(Piper等,2007)中预测的HSPG结合位点的静电表面(红色阴性；蓝色阳性)处的肝素戊糖(SANORG,棍)，具有指示的带正电荷的氨基酸(R:精氨酸，H:组氨酸)。(C)SANORG在PCSK9中的HSPG结合位点上的叠加(色带)。(D)用或不用肝素酶I处理后表达PCSK9的非透化HepG2细胞(白色)。核用Hoechst染色(深灰色)。(E)通过肝素亲和层析分析结合于肝素的PCS9。PCSK9以500mM的NaCl浓度从柱洗脱。

图3：在CHO细胞中瞬时表达PCSK9变体，其中指示的氨基酸残基被突变为丙氨酸。(A)细胞裂解物和培养基的抗PCSK9Western印迹显示细胞裂解物中所有PCSK9变体的表达以及从前蛋白(proPCSK9)到成熟PCSK9的正确加工，以及成熟PCSK9到细胞的培养基的分泌。在模拟转染的细胞中未检测到PCSK9的表达。(B)分泌至瞬时转染的CHO细胞的培养基的PCSK9突变体通过亲和层析随后用抗PCSK9进行级分的Western印迹分析与肝素的结合。所有突变体在指示的位置都具有丙氨酸取代。在对应于0.3-0.4M NaCl的级分中洗脱野生型(WT)PCSK9和突变体R165R167，而PCSK9突变体R96R97和R104R105显示对肝素的亲和力降低，并且在流过物或在第一级分中发现。PCSK9突变体R93R104R105H139和R93R96R97R104R105H139只在流过物中被发现且不结合于肝素。(C)：在与LDLR片段(PDB:3P5B)复合的PCSK9的表面表示中，HSPG结合域位于与LDLR结合位点相对的位置，如PCSK9的空间填充模型中所示。LDLR片段包含β螺旋桨结构域和EGF结构域A和B和L7，而PCSK9C-末端、催化结构域和前结构域显示为具有基本螺旋。模型的肝素片段显示为棍。(D)当通过亲和层析和Western印迹分析时，来自HepG2细胞的培养基的内源性PCSK9和ApoE显示相似的与肝素的结合。

图4：与野生型PCSK9(10nM)温育18小时的HepG2细胞显示比与突变体(R93R96R97R104R105H139)PCSK9(突变体)温育的细胞显著更低的LDLR水平。通过Western印迹评价LDL受体水平(A)，GAPDH水平显示为对照。条形图(B)显示通过密度计量术定量的LDLR的平均值(n＝3)及均值的标准误差(SEM)。使用Student t检验评估结果。**p<0.01，****p<0.0001。

图5：与肝素(50U/ml)温育24小时的HepG2细胞显示通过Western印迹评价的LDLR水平升高(A)。GAPDH水平显示为对照。条形图(B)显示通过密度计量术(n＝4)定量的LDLR的平均值及均值的标准误差(SEM)。与肝素温育也导致培养基中PCSK9水平升高，如通过ELISA测量的(C)。条形图显示平均PCSK9浓度及SEM(n＝4)。使用Student t检验评估结果。***p<0.001，****p<0.0001。(D)＝未透化的HepG2细胞的PLA分析显示，细胞与肝素(50U/ml)温育后，LDLR和PCSK9之间的共定位显著降低。

图6：(A)使用无细胞PCSK9/LDLR结合测定法(BPS Bioscience)，我们发现与对照抑制剂抗PCSK9抗体(5nM)(其靶向PCSK9的LDLR结合区(BPS Bioscience 71207))相比，肝素(5和50U/ml)不抑制PCSK9与LDLR的直接相互作用。在结合测定法中，定量来自结合固定化LDLR的生物素化PCSK9的化学发光信号，并且在这里显示相对于来自无抑制剂的样品的信号归一化的结果。条形图显示平均值及标准偏差误差条(n＝3)。使用Student t检验评估结果。*****p<0.00001.Y轴：无抑制剂的％。(B)培养基中肝素对PCSK9的剂量依赖性作用，如通过ELISA测量的(n＝3)。Y轴：培养基中的PCSK9(％)；(C)细胞裂解物中的mRNA水平通过RT-PCR的定量分析。

图7：与浓度渐增(0-250Mg/ml)的肝素类似物磺达肝癸钠(Arixtra)(Fondaparinux,GlaxoSmithKline Pharma)温育24小时的HepG2细胞具有升高的LDLR水平。GAPDH Western印迹显示为加载对照。

图8：(A)与法安明(100U/ml)和亭扎肝素钠(Innohep)(100U/ml)温育18小时后HepG2细胞中LDLR的Western印迹，显示低分子量肝素的这两种治疗制剂可增加LDLR的细胞水平与肝素(50U/ml)的作用相当。GAPDH的Western印迹显示为加载对照。(B)显示在静脉内单独施用10μg PCSK9或与50U肝素组合后1小时小鼠肝脏中的LDLR水平的Western Blot。加载50μg膜制剂。如Western印迹中所示对于分拣蛋白的对照，先前显示不是PCSK9靶物的PCSK9受体诱导降解。(C)B)的定量通过密度计量术测定条带，点图以运载体(0.9％NaCl)注射的对照的百分数显示每个样品的个体水平及均值和SEM。用PCSK9和肝素共注射的小鼠显示显著更高的LDLR水平(60.3±12.3％的LDLR对24.0±4.04％，n＝7只小鼠/组，p＝0.0157，双尾Student t检验)。(D)放射自显影(16小时曝光)，其显示通过来自用具有人HSPG结合域的编码大鼠PCSK9的DNA免疫的三只大鼠的血清(1μl)免疫沉淀天然人35S标记的PCSK9。使用来自该动物的免疫前血清作为阴性对照。(E)在与免疫前或免疫IgG(1μg/ml)温育过夜后，显示HepG2细胞中的LDLR的Western印迹。与免疫前对照相比，与免疫IgG温育后，看到细胞LDLR水平的显著升高。(F)放射自显影(16小时曝光)，其显示通过由Aldevron进行的ELISA筛选中选择的24个个体单抗(500μl调节的杂交瘤培养基)的人35S-PCSK9的免疫沉淀。作为对照，使用在ELISA筛选(*)中未显示任何PCSK9免疫反应性的单抗#2A8(在由Aldevron进行的ELISA测试筛选中单抗#2A8测试为非特异性的)和未调节的杂交瘤培养基(**)。(G)条形图显示与单抗(调节的杂交瘤培养基的1:10稀释物)温育的HepG2细胞中的LDLR水平(2-4次实验的平均值及SEM)，如通过Western印迹分析的。十二个个体的单抗克隆给出约两倍的LDLR增加。(H)放射自显影(16小时曝光)，其显示通过全部显示PCSK9抑制作用的12个个体单抗(500μl调节的杂交瘤培养基)的人35S突变体PCSK9(R93R96R97R104R105H 139突变为丙氨酸残基)的免疫沉淀。作为对照使用多克隆抗体(来自R&D Systems的pAb，AF3888)。单抗中的三个未能沉淀PCSK9突变体，指示它们特异性识别HSPG结合域。(I)放射自显影，其显示35S-PCSK9野生型和变体R96R97、R104R104、R93R96R97H139和R93R96R97R104R105H139通过单抗1G8、5E11和10E5的免疫沉淀，指示单抗识别HSPG结合域内的表位。作为对照使用R&D Systems AF3888(pAb)。

图9：(A)与肝素模拟物硫酸右旋糖酐(200μg/ml)温育24小时后，HepG2细胞中的LDLR的Western印迹，其显示此化合物可有力增加LDLR的细胞水平。用于比较显示了肝素(50U/ml)。GAPDH显示为加载对照。(B)LDLR水平的密度计量术定量，其显示在与硫酸右旋糖酐(0-200μg/ml)温育后HepG2细胞中LDLR的浓度依赖性增加。条形图显示以未处理细胞的％表示的LDLR平均值及SEM误差棒。(C)PCSK9和硫酸右旋糖酐的微量热泳动(MST)结合曲线。Y轴：荧光信号。X轴：硫酸右旋糖酐或右旋糖酐浓度，KD＝180μΜ。圆圈：硫酸右旋糖酐。方形：右旋糖酐。(D)Western印迹，与戊聚糖硫酸盐(0-200μg/ml)温育24小时后HepG2细胞中LDLR的密度计量术定量(E)，其显示来自用50-200μg/ml戊聚糖硫酸盐处理的细胞的裂解物中LDLR升高4倍。条形图显示以未处理细胞的％表示的LDLR平均值及SEM误差棒。(F)，PCSK9和戊聚糖硫酸盐的MST结合曲线Y轴：荧光信号。X轴：戊聚糖硫酸盐浓度。圆圈：戊聚糖硫酸盐，KD＝381μΜ。方形：对照。(G)，与苏拉明(0-200μg/ml)24小时温育后HepG2细胞中LDLR的定量。条形图显示以未处理细胞的％表示的LDLR平均值及SEM误差棒。苏拉明温育的HepG2细胞中LDLR的代表性Western印迹示于(A)中。(H)：PCSK9和苏拉明的MST结合曲线。Y轴：荧光信号。X轴苏拉明浓度。圆圈：苏拉明，KD＝190μΜ。方形：对照。(I)在与硫代磷酸寡核苷酸S-dC-36(0-5.0μΜ)24小时温育后HepG2细胞中的LDLR的Western印迹和密度计量术定量(J)，其显示细胞受体水平的浓度依赖性增加。条形图显示以未处理细胞的％表示的LDLR平均值及SEM误差棒。使用Student t检验评价结果。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。(K)PCSK9和S-dC-36的MST结合曲线。Y轴：荧光信号。X轴S-dC-36浓度。圆圈：S-dC-36，KD＝4.8μΜ。方形：对照。

图10：在注射PCSK9(10μg)之前输注肝素酶I完全抑制LDLR的PCSK9诱导的降解。显示的是代表性样品的Western印迹(A)和LDLR的条形图定量(B)。对于Western印迹，GAPDH用作加载对照，e：空泳道。对照n＝7，PCSK9n＝6，肝素酶n＝5，肝素酶/PCSK9n＝5。与只注射PCSK9的小鼠(C)相比，用PCSK9(10μg)和肝素(50U)或苏拉明(300μg)共注射的小鼠显示显著更高的LDLR水平。对照n＝15，PCSK9n＝10，PCSK9/肝素n＝7，PCSK9/苏拉明n＝3。(D)静脉内注射肝素(50u)后PCSK9的血浆水平，如通过鼠PCSK9特异性ELISA评估的。

图11：只静脉内施用10μg PCSK9或与50μg单抗组合1小时后小鼠肝脏中的LDLR水平。

图12：条形图，其显示在与苏拉明(200μg/ml)过夜温育随后与用荧光染料Bodipy标记的10ng/ml LDL颗粒温育4小时后HepG2细胞中的相对荧光信号。用苏拉明抑制PCSK9将LDL的摄取增加至两倍。

图13：A)和B)条形图，显示在用100μΜ苏拉明或HMG CoA还原酶抑制剂美伐他汀和辛伐他汀进行24小时和48小时温育后的HepG2细胞中LDLR水平，如通过Western印迹评估的。与苏拉明温育的细胞显示比与他汀类药物温育的细胞更高水平的LDLR。

定义

肝素类似物：如本申请中使用的该术语指结构上类似于肝素的化合物。

肝素模拟物：本申请中的该术语指在功能上行为像(模拟)肝素的化合物。在本公开的上下文中，此术语因而既包括结构上类似的化合物，也包括具有不同的结构但具有与肝素相同的功能性的化合物。

LDL-胆固醇(LDL-C)水平：给定个体的最佳LDL-C水平根据他/她潜在的心脏病风险而变化。对于健康个体，LDL-C水平应理想地低于2.6-3.3mmol/L(或100-129mg/dL)。3.4-4.1mmol/L或130-159mg/dL的水平为边缘性升高(borderline high)，4.1-4.9mmol/L或160-189mg/dL的水平是高的，而高于4.9mmol/L或189mg/dL的水平是非常高。对于处于心脏病风险的个体，推荐2.6mmol/L或100mg/dL以下的水平，而对于处于心脏病的非常高风险的个体1.8mmol/L或70mg/dL以下的水平是合意的。

低密度脂蛋白受体(LDLR)水平：细胞内LDLR的合成受游离的细胞内胆固醇水平的调节；如果胆固醇对于细胞的需要是过量的，则LDLR的转录将被抑制。LDLR水平可通过本领域已知的方法估算，如但不限于Western印迹、RT-PCR流式细胞术。

低分子量肝素：天然肝素由不同长度或分子量的分子链组成。例如，5000至超过40,000道尔顿不同分子量的链构成多分散药物级肝素。相比之下，低分子量的肝素只由多糖的短链组成。低分子量肝素定义为具有小于8000Da的平均分子量的肝素盐，所有链的至少60％具有小于8000Da的分子量。这些是通过本领域技术人员已知的多种方法获得的，例如聚合肝素的分级或解聚。

脂蛋白代谢病症：该术语指脂质稳态的病症和与其相关的病症，包括例如高胆固醇血症(hypercholesterolemia)，高脂血症(hyperlipidemia)，高甘油三酯血症(hypertriglyceridaemia)，静脉硬化症(sitosterolemia)，动脉粥样硬化(atherosclerosis)，动脉硬化(arteriosclerosis)，冠心病(coronary heart disease)，代谢综合征(metabolic syndrome)，急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome)，黄瘤(xanthoma)，高血压(hypertension)，心绞痛(angina)，肥胖(obesity)，糖尿病(diabetes)和血管炎症(vascular inflammation)。

PCSK9水平：PCSK9的血浆水平在一般人群中从30变化至3000ng/mL，而女性中的中位数水平通常高于男性。PCSK9水平与LDL-C水平相关。

硫代磷酸酯(或硫代磷酸寡核苷酸或S-寡聚物)是其中非桥连氧之一被硫代替的DNA变体。认为核苷酸间键的硫化急剧减少了多种核酸酶的作用，并增加了穿过脂质双层的可能性。

发明详述

本发明如权利要求中所限定。

本发明在第一方面涉及能够抑制HSPG与PCSK9结合的化合物。在整个本公开中会理解的是，能够抑制HSPG与PCSK9的变体结合的化合物也在本发明的范围内。PCSK9的变体被理解为具有与SEQ ID NO:1基本上相同的序列的多肽，例如SEQ ID NO:1的具有一些残基的保守取代的变体。

在一些实施方案中，该化合物特异性识别并结合PCSK9(SEQ ID NO:1)的HSPG识别位点内的区，所述区包含PCSK9(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基78至167的至少一个，如PCSK9(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基78至92的至少一个，如氨基酸残基93至97的至少一个，如氨基酸残基98至103的至少一个，如氨基酸残基104至105的至少一个，如氨基酸残基106至135的至少一个，如氨基酸残基136至139的至少一个，如氨基酸残基140至164的至少一个，如氨基酸残基165至167的至少一个。

本申请中提供的是化合物，其特异性识别并结合PCSK9(SEQ ID NO:1)的HSPG识别位点内的区，所述区包含PCSK9(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基78至167的至少一个，如PCSK9(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基78至167的至少2，如至少5，如至少10，如至少15，如至少20，如至少25，如至少30，如至少35，如至少40，如至少45，如至少50，如至少55，如至少60，如至少65，如至少70，如至少75，如至少80，如至少85个，如所有。

在一些实施方案中，该化合物特异性识别并结合区，所述区包含PCSK9(SEQ IDNO:1)的氨基酸残基78至92的至少一个，如氨基酸残基93至97的至少一个，如氨基酸残基98至103的至少一个，如氨基酸残基104至105的至少一个，如氨基酸残基106至135的至少一个，如氨基酸残基136至139的至少一个，如氨基酸残基140至164的至少一个，如氨基酸残基165至167的至少一个。

在一些实施方案中，该化合物特异性识别并结合区，所述区包含PCSK9(SEQ IDNO:1)的氨基酸残基78至92的至少一个，如氨基酸残基93至97，如氨基酸残基98至103，如氨基酸残基104至105，如氨基酸残基106至135，如氨基酸残基136至139，如氨基酸残基140至164，如氨基酸残基165至167的至少一个。

因此在一个实施方案中，该化合物特异性识别并结合PCSK9的HSPG识别位点之内包含氨基酸残基78至167的区。在另一个实施方案中，该化合物特异性识别并结合PCSK9的HSPG识别位点之内包含氨基酸残基78至95的区。在另一个实施方案中，该化合物特异性识别并结合PCSK9的HSPG识别位点之内包含氨基酸残基96至100的区。在另一个实施方案中，该化合物特异性识别并结合PCSK9的HSPG识别位点之内包含氨基酸残基101至105的区。在另一个实施方案中，该化合物特异性识别并结合PCSK9的HSPG识别位点之内包含氨基酸残基106至110的区。在另一个实施方案中，该化合物特异性识别并结合PCSK9的HSPG识别位点之内包含氨基酸残基111至115的区。在另一个实施方案中，该化合物特异性识别并结合PCSK9的HSPG识别位点之内包含氨基酸残基116至120的区。在另一个实施方案中，该化合物特异性识别并结合PCSK9的HSPG识别位点之内包含氨基酸残基121至125的区。在另一个实施方案中，该化合物特异性识别并结合PCSK9的HSPG识别位点之内包含氨基酸残基126至130的区。在另一个实施方案中，该化合物特异性识别并结合PCSK9的HSPG识别位点之内包含氨基酸残基131至135的区。在另一个实施方案中，该化合物特异性识别并结合PCSK9的HSPG识别位点之内包含氨基酸残基136至140的区。在另一个实施方案中，该化合物特异性识别并结合PCSK9的HSPG识别位点之内包含氨基酸残基141至145的区。在另一个实施方案中，该化合物特异性识别并结合PCSK9的HSPG识别位点之内包含氨基酸残基146至150的区。在另一个实施方案中，该化合物特异性识别并结合PCSK9的HSPG识别位点之内包含氨基酸残基151至155的区。在另一个实施方案中，该化合物特异性识别并结合PCSK9的HSPG识别位点之内包含氨基酸残基156至160的区。在另一个实施方案中，该化合物特异性识别并结合PCSK9的HSPG识别位点之内包含氨基酸残基161至167的区。

因此，提供一种化合物，其结合于选自下组的一个或多个氨基酸：PCSK9(SEQ IDNO:1)的R93，R96，R97，R104，R105，K136，H139，R165和R167，如选自下组的一个氨基酸，如两个氨基酸，如三个氨基酸，如四个氨基酸，如五个氨基酸，如六个氨基酸，如七个氨基酸，如八个氨基酸，如所有氨基酸：PCSK9的R93，R96，R97，R104，R105，K136，H139，R165和R167。

因此在一个实施方案中，该化合物结合于PCSK9的R93。在另一个实施方案中，该化合物结合于PCSK9的R96。在另一个实施方案中，该化合物结合于PCSK9的R97。在另一个实施方案中，该化合物结合于PCSK9的R104。在另一个实施方案中，该化合物结合于PCSK9的R105。在另一个实施方案中，该化合物结合于PCSK9的K136。在另一个实施方案中，该化合物结合于PCSK9的H139。在另一个实施方案中，该化合物结合于PCSK9的R165。在另一个实施方案中，该化合物结合于PCSK9的R167。

在一个实施方案中，该化合物结合于PCSK9的R96和R97。在另一个实施方案中，该化合物结合于PCSK9的R104和R105。在另一个实施方案中，该化合物结合于PCSK9的K136和H139。在另一个实施方案中，该化合物结合于PCSK9的R93和H139。在另一个实施方案中，该化合物结合于PCSK9的R93,R104,R105和H139。在另一个实施方案中，该化合物结合于PCSK9的R165和R167。在另一个实施方案中，该化合物结合于PCSK9的R93,R96,R97,R104,R105和H139。

抗体

还公开的是如本申请中所述的化合物，其中该化合物是抗体或其功能等同物。

本发明的抗体可为能够识别和结合如本申请所述的抗原的任何多肽或蛋白质。优选地，所述抗体能够特异性结合所述抗原。术语“特异性结合”意指以对于非特异性抗原(例如BSA)的至少10倍高的亲和力结合于所述抗原。

抗体可为天然存在的抗体或其功能等同物。天然存在的抗体是能够识别并结合抗原的异四聚体糖蛋白。它包含通过二硫键相互连接的两个相同的重(H)链和两个相同的轻(L)链。每个重链包含或优选组成为重链可变区(本申请中缩写为V_H)和重链恒定区(本申请中缩写为C_H)。每个轻链包含或优选组成为轻链可变区(本申请中缩写为V_L)和轻链恒定区(本申请中缩写为C_L)。V_H和V_L区可进一步细分为高变性的区，称为互补决定区(CDR)，其穿插有更保守的区，称为框架区(FR)。每个V_H和V_L包含并优选组成为三个CDR和四个FR，其从氨基末端至羧基末端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。

天然存在的抗体也可为重链抗体(HCAbs)，如通过骆驼科(camelids)(骆驼(camels)、单峰驼(dromedaries)和美洲驼(llamas))产生的。HCAb仅是重链的同二聚体，没有轻链和第一个恒定域(Hamers-Casterman等,1993)。其他天然存在的抗体可没有轻链，如对于New或Nurse Shark Antigen Receptor(NAR)蛋白质的情况，其作为两个重链而无相关轻链的二聚体存在。每个链由一个可变域(V)和五个恒定域组成。NAR蛋白构成单个免疫球蛋白可变样域(Greenberg等,1995.)，其比抗体分子轻得多。

根据本发明的天然存在的抗体可由一个异源四聚体组成或它们可包含几个相同的异源四聚体。因此，根据本发明的天然存在的抗体可例如选自下组：IgG,IgM,IgA,IgD和IgE。这些不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是已知的。在本发明的一个优选的实施方案中该抗体为IgG，例如lgG-1,IgG-2,lgG-3和lgG-4。

该抗体可为单克隆抗体，如天然存在的单克隆抗体。在另外的实施方案中，该抗体可为多克隆抗体，如天然存在的多克隆抗体。单克隆和多克隆抗体在本申请下文中进一步详细讨论。

天然存在的抗体可为特定物种的抗体，例如该抗体可为鼠类、大鼠、兔、山羊、绵羊、鸡(chicken)、驴、骆驼科或人抗体。该抗体可为鼠类或大鼠单克隆抗体。然而该抗体也可为来自几个物种之间的杂合体，例如该抗体可为嵌合抗体，如人源化抗体。人和人源化抗体在本申请下文中进一步详细讨论。

抗体的抗原结合片段

抗体的抗原结合片段是保留特异性结合抗原的能力的抗体的片段。因此，在一些实施方案中，抗体的功能等同物包含抗体的结合片段。优选地，所述片段是天然存在的抗体的抗原结合片段。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段进行。天然存在的抗体的抗原结合片段的实例包括例如(i)Fab片段，由V_L，V_H，C_L和C_H1域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和C_H1域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的V_L和V_H域组成的Fv片段或(v)dAb片段(Ward等,1989)，其由V_H域组成。Fab片段可通过木瓜蛋白酶消化来制备。F(ab')₂片段可通过胃蛋白酶处理来制备。

抗体的抗原结合片段优选包含至少一个互补决定区(CDR)或更优选两个或更多个分离的CDR的组合，所述CDR可任选地通过合成的接头连接。抗体的抗原结合片段的进一步的实例为结合域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)融合于免疫球蛋白铰链区多肽的抗原结合位点，(ii)融合于所述铰链区的免疫球蛋白重链CH2恒定区，和(iii)融合于所述CH2恒定区的免疫球蛋白重链CH3恒定区。该抗原结合位点可为重链可变区或轻链可变区。这样结合域免疫球蛋白融合蛋白进一步在US 2003/01 18592和US 2003/0133939中公开。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，而且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的功用。

抗体的抗原结合片段也可为双抗体，其为具有两个抗原结合位点的小抗体片段。双抗体优选包含与相同多肽链(VH-VL)中的轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)。通过使用接头(它太短以不允许相同链上两个域之间的配对)，域被迫与另一条链的互补域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地在例如EP404,097；WO 93/1 1161；和Hollinger等,1993中描述。

杂特异性(Heterospecific)抗体

本申请中公开的抗体还可为“杂特异性抗体”，如双特异性抗体。双特异性抗体是蛋白或多肽，其包含具有不同特异性的两个不同的抗原结合位点。例如，双特异性抗体可识别并结合于(a)第一抗原内的第一表位和(b)第二抗原内的第二表位；或它可识别并结合于相同抗原内的两个不同的表位。术语“杂特异性抗体”意欲包括任何蛋白或多肽，其含有具有不同特异性的多于两个不同的抗原结合位点。例如，杂特异性抗体可识别并结合于(a)第一抗原上的第一表位，(b)第二抗原上的第二表位和(c)第三抗原上的第三表位；或它可识别并结合于(a)第一抗原上的第一表位和(b)第二抗原上的第二和第三表位；或它可识别并结合于相同抗原上的不同表位。因此，本发明包括但不限于双特异性、三特异性、四特异性和其他多特异性抗体，其针对相同或不同抗原上的不同表位。

双特异性抗体可例如从单克隆抗体出发制备，例如通过融合两个杂交瘤以组合它们的特异性，其通过化学交联或使用重组技术进行。例如，两个不同抗体(1和2)的V_H和V_L可通过重组手段连接以形成“交叉”链V_H1-V_L2和V_H2-V_L1，然后二聚化以重组装两个抗原结合位点(参见WO 94/09131)。双特异性抗体也可通过遗传上连接两个具有不同特异性的单链抗体来制备，如例如WO 94/13806中所述。抗体的两个抗原结合片段也可连接。

人抗体和人源化抗体

使用非人体抗体用于人治疗并不总是合意的，因此根据本发明的抗体可为人抗体或人源化抗体。

如本申请中理解的人抗体是抗体，其从使用人免疫球蛋白序列的系统获得。人抗体可为例如抗体，其分离自用于人免疫球蛋白基因为转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤。人抗体也可分离自经转化以例如从转染瘤表达抗体的宿主细胞。人抗体也可分离自重组的、组合人抗体文库。

人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在一些实施方案中，这样的重组人抗体可进行体外诱变或体内体细胞诱变，因而重组抗体的V_H和V_L区的氨基酸序列是序列，其虽然源自并涉及人种系V_H和V_L序列，但可以不天然存在于体内的人抗体种系库内。

人抗体在氨基酸序列上与由野生型人免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列为优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少96％、97％、98％或99％同一的。所述转基因或转染色体动物可含有编码未重排人重(μ和/或γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小位点。此外，动物可含有灭活内源性重链和轻链基因座的一个或多个突变。这类动物的实例描述于Lonberg等(1994)和WO 02/43478中。

本申请中公开的抗体可为嵌合抗体，即包含源自不同物种的区的抗体。嵌合抗体可例如包含来自一个动物物种的可变区和来自另一个动物物种的恒定区。例如，嵌合抗体可为抗体，其具有源自小鼠单克隆抗体的可变区和人的恒定区。这样的抗体也可称为人源化抗体。因此，抗体也可为人源化的抗体，其部分由获得自人种系免疫球蛋白序列的序列编码且部分来自其他序列。所述其他序列优选为来自其他物种的种系免疫球蛋白，更优选来自其他哺乳动物物种。特别地，人源化抗体可为抗体，其中抗原结点位于源自来自非人物种(优选来自非人哺乳动物，例如来自小鼠或大鼠)的免疫球蛋白，而分子的其余的免疫球蛋白衍生部分中的一些或全部源自人免疫球蛋白。来自所述非人类物种的抗原结合位点可例如由完整的V_L或V_H或两者或移接于V_L或V_H或两者中的适当的人框架区上的一个或多个CDR组成。因此，在人源化抗体中，CDR可来自小鼠或大鼠单克隆抗体，而抗体的其它区是人来源的。

单克隆抗体

单克隆抗体(单抗)指抗体的群体，其中所述抗体分子相似并由此识别并结合于相同的表位。单克隆抗体通常由宿主细胞系产生并经常由杂交瘤细胞系产生。制成单克隆抗体和合成抗体的杂交瘤细胞的方法是本领域技术人员已知的。产生杂交瘤的抗体可例如通过产生抗体的B淋巴细胞与永生化B淋巴细胞细胞系的融合来制备。根据本发明的单克隆抗体可例如通过Kohler和Milstein Nature 256:495(1975)的标准体细胞杂交技术，或如Antibody:A Laboratory Manual，由Ed Harlow和David Lane著,Cold Spring HarborLaboratory Press,1988所述来制备。所述单克隆抗体可源自任何合适的哺乳动物物种，然而单克隆抗体经常会是啮齿动物抗体，例如鼠类或大鼠单克隆抗体。

多克隆抗体

多克隆抗体指抗体的群体，其包含识别并结合于特定的给定抗原的不同抗体分子的混合物，因此多克隆抗体可识别所述抗原内的不同表位。一般地，从先前已经用抗原免疫的动物(优选哺乳动物)的血清纯化多克隆抗体。多克隆抗体可例如通过Antibody:ALaboratory Manual，由Ed Harlow和David Lane著,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1988中所述的任何方法制备。

重组抗体

抗体也可为重组抗体，即通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体。根据本发明的重组抗体可例如使用合成文库或通过噬菌体展示产生。在一些实施方案中，该抗体在重组细胞中产生。所述重组细胞可为选自下组的微生物：细菌和真核微生物。重组抗体可在微生物宿主生物体中产生，如细菌、酵母或源自多细胞生物的细胞的培养物。通常，大肠杆菌可用作宿主生物。通常重组抗体是天然存在的抗体的片段，其包含至少一个抗原结合位点，如Fab片段、F(ab')₂、Fv片段或者重组抗体为scFV。因此，在一些实施方案中，抗体是天然存在的抗体的片段，其包含至少一个抗原结合位点，如Fab片段、F(ab')₂、Fv片段。在另外的实施方案中，重组抗体是scFV。

重组抗体可使用多种系统鉴定，如噬菌体展示或核糖体展示。噬菌体展示的起点通常是由噬菌体表达的天然存在的抗体的片段或抗体(如单链抗体)的文库。多种不同种类的噬菌体适用于噬菌体展示，例如M13，fd丝状噬菌体，T4，T7或A噬菌体。也可使用噬菌粒，但通常需要使用辅助噬菌体。通常，文库包括10⁷至10¹⁵，如10⁹至10¹¹个不同的噬菌体的范围。抗体可为未处理的(naive)或免疫来源的。文库的抗体可融合至噬菌体外壳蛋白(例如g3p或g8p)以确保在表面上显示。因此，抗体(片段)可由克隆在编码噬菌体外壳蛋白的核酸的上游或下游的核酸序列编码，所述核酸序列可操作地连接到合适的启动子。

编码抗体例如抗体可变域的基因组信息可使用重组DNA技术从非免疫或免疫供体的B细胞获得，以扩增V_H和V_L基因片段并克隆入适当的噬菌体。可通过在体外重排V_H和V_L基因区段和/或通过将人工序列引入V_H和V_L基因区段来制备合成文库。例如，可使用V_H和V_L基因框架但向其中导入可由随机寡核苷酸编码的人造互补决定区(CDR)来制备合成文库。该文库也可为不同的文库，然后将其在宿主细胞中组合。因此，一个文库可包含重链序列，如重链Fv片段或Fab片段或V_H和其它轻链序列，如轻链Fv片段或Fab片段V_L。通常进行几轮选择，例如2至5，如2至3。这可通过使抗原固定化、使抗原与噬菌体接触并分离结合的噬菌体来完成。抗原可固定在任何合适的固体表面上，如塑料表面、珠子(如磁珠)、柱中的树脂，或者它可在细胞的表面上表达。

单链抗体

天然存在的抗体是异四聚体。然而，本申请中所述的抗体也可为包含一个或多个抗原结合位点的单个多肽。这样的抗体也称为“单链抗体”。因此，抗体也可为单链抗体。单链抗体可包含Fv片段的两个域V_L和V_H。为了获得这样的单链抗体，可使用重组方法连接编码V_L和V_H的基因。通常它们通过合成的接头分开，例如5至100，如5至50个，例如25个氨基酸的接头。所述接头可将V_H的N末端与V_L的C末端连接，反之亦然。这使得能够产生单个蛋白质链，其中V_L和V_H区配对以形成单价抗体样分子(也称为单链抗体或单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等(1988)Science 242:423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。

单链抗体也可为二价抗体，例如包含两个V_H和两个V_L区的单个肽链，其可通过接头两两连接。单链抗体也可为多价抗体，例如包含多个V_H和多个V_L区的单个肽链，其可通过接头两两连接。所述V_H和V_L区可为相同的或不同的，分别得到单特异性或杂特异性抗体。所述V_H和所述V_L可为天然存在的V_H或V_L，或合成的V_H和V_L，其包含至少一个抗原结合位点。优选地，所述V_H和V_L是天然存在的V_H和V_L。

本申请公开的化合物可为单克隆或多克隆抗体。抗体可源自本领域中已知的适用于产生抗体的任何生物，如活的生物，例如小鼠、羊、兔或细胞培养物如细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞如CHO细胞。抗体可被人源化。优选地，所述抗体是鼠类单克隆抗体。

也在本发明的范围内的是包含抗体的结合片段的功能等同物。所述片段可选自Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段如ScFv片段。所述功能等同物也可为单链抗体。其他实施方案涉及例如包含以下或由以下组成的功能等同物：如上详述的与PCSK9的HSPG结合域结合的抗体的结合片段。在一些实施方案中，所述功能等同物可进一步包含工程改造的域，其可例如增加抗体片段的半衰期、稳定性、生物利用度、溶解度或其他相关特征。例如，本领域已知的是工程改造的域内硫化物键可稳定抗体(Wozniak-Knopp等2012)。其他稳定化方法包括例如在V_H和V_L域之间使用肽接头，导致Fv片段的稳定化(Reiter等,1994)。

功能等同物也可为抗体模拟物，或模仿抗体的小分子。抗体模拟物是有机化合物，其包括但不限于可特异性结合抗原但结构上与抗体不相关的核酸。它们通常是人工的肽或蛋白质，通常具有约3至20kDa的摩尔质量。一些类型具有抗体样β-片层结构。与抗体相比，抗体模拟物有时表现出更好的溶解性、组织穿透、对热和酶的稳定性，以及相对低的生产成本。

因此，提供了抗体或其功能等同物，其特异性识别并结合PCSK9(SEQ ID NO:1)的HSPG结合位点之内的表位，其包含PCSK9(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基78至167的至少一个，如PCSK9(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基78至167的至少2，如至少5，如至少10，如至少15，如至少20，如至少25，如至少30，如至少35，如至少40，如至少45，如至少50，如至少55，如至少60，如至少65，如至少70，如至少75，如至少80，如至少85，如所有。

在一些实施方案中，抗体或其功能等同物特异性识别并结合表位，其包含PCSK9(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基78至92的至少一个，如氨基酸残基93至97的至少一个，如氨基酸残基98至103的至少一个，如氨基酸残基104至105的至少一个，如氨基酸残基106至135的至少一个，如氨基酸残基136至139的至少一个，如氨基酸残基140至164的至少一个，如氨基酸残基165至167的至少一个。

在一些实施方案中，抗体或其功能等同物特异性识别并结合表位，其包含PCSK9(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基78至92，如氨基酸残基93至97，如氨基酸残基98至103，如氨基酸残基104至105，如氨基酸残基106至135，如氨基酸残基136至139，如氨基酸残基140至164，如氨基酸残基165至167中的至少一个。

因此在一个实施方案中，抗体或其功能等同物特异性识别并结合PCSK9的HSPG结合位点内的表位，其包含氨基酸残基78至167。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物特异性识别并结合PCSK9的HSPG结合位点内的表位，其包含氨基酸残基78至95。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物特异性识别并结合PCSK9的HSPG结合位点内的表位，其包含氨基酸残基96至100。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物特异性识别并结合PCSK9的HSPG结合位点内的表位，其包含氨基酸残基101至105。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物特异性识别并结合PCSK9的HSPG结合位点内的表位，其包含氨基酸残基106至110。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物特异性识别并结合PCSK9的HSPG结合位点内的表位，其包含氨基酸残基111至115。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物特异性识别并结合PCSK9的HSPG结合位点内的表位，其包含氨基酸残基116至120。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物特异性识别并结合PCSK9的HSPG结合位点内的表位，其包含氨基酸残基121至125。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物特异性识别并结合PCSK9的HSPG结合位点内的表位，其包含氨基酸残基126至130。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物特异性识别并结合PCSK9的HSPG结合位点内的表位，其包含氨基酸残基131至135。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物特异性识别并结合PCSK9的HSPG结合位点内的表位，其包含氨基酸残基136至140。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物特异性识别并结合PCSK9的HSPG结合位点内的表位，其包含氨基酸残基141至145。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物特异性识别并结合PCSK9的HSPG结合位点内的表位，其包含氨基酸残基146至150。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物特异性识别并结合PCSK9的HSPG结合位点内的表位，其包含氨基酸残基151至155。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物特异性识别并结合PCSK9的HSPG结合位点内的表位，其包含氨基酸残基156至160。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物特异性识别并结合PCSK9的HSPG结合位点内的表位，其包含氨基酸残基161至167。

因此，提供了抗体或其功能等同物，其结合于选自下组的一个或多个氨基酸：PCSK9(SEQ ID NO:1)的R93,R96,R97,R104,R105,K136,H139,R165和R167，如选自下组的一个氨基酸，如两个氨基酸，如三个氨基酸，如四个氨基酸，如五个氨基酸，如六个氨基酸，如七个氨基酸，如八个氨基酸，如所有氨基酸：PCSK9的R93,R96,R97,R104,R105,K136,H139,R165和R167。

因此在一个实施方案中，抗体或其功能等同物结合于PCSK9的R93。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物结合于PCSK9的R96。在另一个实施方案中，该化合物结合于PCSK9的R97。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物结合于PCSK9的R104。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物结合于PCSK9的R105。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物结合于PCSK9的K136。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物结合于PCSK9的H139。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物结合于PCSK9的R165。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物结合于PCSK9的R167。

在一个实施方案中，抗体或其功能等同物结合于PCSK9的R96和R97。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物结合于PCSK9的R104和R105。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物结合于PCSK9的K136和H139。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物结合于PCSK9的R93和H139。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物结合于PCSK9的R93,R104,R105和H139。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物结合于PCSK9的R165和R167。在另一个实施方案中，抗体或其功能等同物结合于PCSK9的R93,R96,R97,R104,R105和H139。

在一个具体的实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体是鼠类单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体或其功能等同物已被人源化。抗体可为单链抗体。

在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体能够识别并结合PCSK9的HSPG结合位点，如上详述的，但也能够结合并识别PCSK9的LDLR结合位点，使得这种抗体与PCSK9的结合抑制HSPG和LDLR与PCSK9的结合。不受理论的限制，LDLR结合位点包含残基194(A194)和包含PCSK9(SEQ ID NO:1)的残基367至381，特别是P379的域。因此，在一些实施方案中，化合物是能够结合于如上所述的PCSK9的HSPG结合位点并能够结合LDLR结合域的至少一个氨基酸残基的双特异性抗体，其中LDLR结合域的至少一个氨基酸残基是SEQ ID NO：1的残基194或包含于含有SEQ ID NO:1的残基367至381的域内。

在一些实施方案中，抗体不能结合于PCSK9的LDLR结合域。

因此，还公开了抗体或其抗原结合片段，其包含：

(i)重链可变区或其人源化形式，其包含如通过SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:1 1或SEQ ID NO:12限定的三个CDR中的至少一个，和

(ii)轻链可变区或其人源化形式，其包含如通过SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15限定的三个CDR中的至少一个。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:10),CDR2(SEQ ID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)之一，和轻链可变区或其人源化形式。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:10),CDR2(SEQ ID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)之一，和轻链可变区或其人源化形式，其包含CDR1(SEQ ID NO:13),CDR 2(SEQ ID NO:14)或CDR3(SEQ ID NO:15)中的至少一个。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:10),CDR2(SEQ ID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)之一，和轻链可变区或其人源化形式，其包含CDR1(SEQ ID NO:13),CDR 2(SEQ ID NO:14)或CDR3(SEQ ID NO:15)中的至少两个。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:10),CDR2(SEQ ID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)之一，和轻链可变区或其人源化形式，其包含CDR1(SEQ ID NO:13),CDR 2(SEQ ID NO:14)和CDR3(SEQ ID NO:15)中的所有。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:10),CDR2(SEQ ID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)中的两个，和轻链可变区或其人源化形式。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:10),CDR2(SEQ ID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)中的两个，和轻链可变区或其人源化形式，其包含CDR1(SEQ ID NO:13),CDR 2(SEQ ID NO:14)或CDR3(SEQ ID NO:15)中的至少一个。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:10),CDR2(SEQ ID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)中的两个，和轻链可变区或其人源化形式，其包含CDR1(SEQ ID NO:13),CDR 2(SEQ ID NO:14)或CDR3(SEQ ID NO:15)中的至少两个。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:10),CDR2(SEQ ID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)中的两个，和轻链可变区或其人源化形式，其包含CDR1(SEQ ID NO:13),CDR 2(SEQ ID NO:14)和CDR3(SEQ ID NO:15)中的所有。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:10),CDR2(SEQ ID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)中的所有，和轻链可变区或其人源化形式。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:10),CDR2(SEQ ID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)中的所有，和轻链可变区或其人源化形式，其包含CDR1(SEQ ID NO:13),CDR 2(SEQ ID NO:14)或CDR3(SEQ ID NO:15)中的至少一个。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:10),CDR2(SEQ ID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)中的所有，和轻链可变区或其人源化形式，其包含CDR1(SEQ ID NO:13),CDR 2(SEQ ID NO:14)或CDR3(SEQ ID NO:15)中的至少两个。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:10),CDR2(SEQ ID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)中的所有，和轻链可变区或其人源化形式，其包含CDR1(SEQ ID NO:13),CDR 2(SEQ ID NO:14)和CDR3(SEQ ID NO:15)中的所有。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或其人源化形式(如通过SEQ ID NO:7限定的)，和/或轻链可变区或其人源化形式(通过SEQ ID NO:5限定的)，

在另外的实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：

(i)重链可变区或其人源化形式，其包含如通过SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18限定的三个CDR中的至少一个，和

(ii)轻链可变区或其人源化形式，其包含如通过SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21限定的三个CDR中的至少一个。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:16),CDR2(SEQ ID NO:17)和CDR3(SEQ ID NO:18)之一，和轻链可变区或其人源化形式。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:16),CDR2(SEQ ID NO:17)和CDR3(SEQ ID NO:18)之一，和轻链可变区或其人源化形式，其包含CDR1(SEQ ID NO:19),CDR 2(SEQ ID NO:20)或CDR3(SEQ ID NO:21)中的至少一个。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:16),CDR2(SEQ ID NO:17)和CDR3(SEQ ID NO:18)之一，和轻链可变区或其人源化形式，其包含CDR1(SEQ ID NO:19),CDR 2(SEQ ID NO:20)或CDR3(SEQ ID NO:21)中的至少两个。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:16),CDR2(SEQ ID NO:17)和CDR3(SEQ ID NO:18)之一，和轻链可变区或其人源化形式，其包含CDR1(SEQ ID NO:19),CDR 2(SEQ ID NO:20),CDR3(SEQ ID NO:21)中的所有。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:16),CDR2(SEQ ID NO:17)和CDR3(SEQ ID NO:18)中的两个，和轻链可变区或其人源化形式。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:16),CDR2(SEQ ID NO:17)和CDR3(SEQ ID NO:18)中的两个，和轻链可变区或其人源化形式，其包含CDR1(SEQ ID NO:19),CDR 2(SEQ ID NO:20)或CDR3(SEQ ID NO:21)中的至少一个。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:16),CDR2(SEQ ID NO:17)和CDR3(SEQ ID NO:18)中的两个，和轻链可变区或其人源化形式，其包含CDR1(SEQ ID NO:19),CDR 2(SEQ ID NO:20)或CDR3(SEQ ID NO:21)中的至少两个。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:16),CDR2(SEQ ID NO:17)和CDR3(SEQ ID NO:18)中的两个，和轻链可变区或其人源化形式，其包含(SEQ ID NO:19),CDR 2(SEQ ID NO:20)和CDR3(SEQ ID NO:21)中的所有。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:16),CDR2(SEQ ID NO:17)和CDR3(SEQ ID NO:18)中的所有，和轻链可变区或其人源化形式。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:16),CDR2(SEQ ID NO:17)和CDR3(SEQ ID NO:18)中的所有，和轻链可变区或其人源化形式，其包含CDR1(SEQ ID NO:19),CDR 2(SEQ ID NO:20)或CDR3(SEQ ID NO:21)中的至少一个。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:16),CDR2(SEQ ID NO:17)和CDR3(SEQ ID NO:18)中的所有，和轻链可变区或其人源化形式，其包含CDR1(SEQ ID NO:19),CDR 2(SEQ ID NO:20)或CDR3(SEQ ID NO:21)中的至少两个。

在一些实施方案中，重链可变区或其人源化形式包含CDR1(SEQ ID NO:16),CDR2(SEQ ID NO:17)和CDR3(SEQ ID NO:18)中的所有，和轻链可变区或其人源化形式，其包含CDR1(SEQ ID NO:19),CDR 2(SEQ ID NO:20)和CDR3(SEQ ID NO:21)中的所有。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区或其人源化形式(如通过SEQ ID NO:9限定的)，和/或轻链可变区或其人源化形式(通过SEQ ID NO:3限定的)，

在一些实施方案中，抗体或其功能等同物为抗体变体。这类变体包括，但不限于已经修饰以增加半衰期、溶解度和/或生物利用度的抗体。功能等同物可包含抗体的片段，其能够结合于PCSK9(SEQ ID NO:1)的HSPG结合位点。在一些实施方案中，片段选自下组：Fab,Fab',F(ab')₂和Fv片段。这类变体可包含工程改造的域内二硫键。

抗体或其功能等同物可通过域重排(domain shuffling)获得。域重排可通过本领域已知的方法进行，如通过传统的克隆或通过连接酶非依赖性方法(例如尿嘧啶特异性切除试剂(USER)克隆和融合)(Nour-Eldin等,2010；Villiers等,2010)进行。

在一些实施方案中，抗体或其功能等同物的一个或多个Fv片段包含V_H和V_L域之间的肽接头。

LDLR和LDL-C水平

本申请公开的化合物与PCSK9的结合导致与不存在所述化合物时的结合相比，PCSK9与LDLR的结合降低。这又导致源自表达LDLR的细胞系(如源自肝细胞的细胞系)的细胞的LDLR水平(例如在它们表面上的)升高。在一些实施方案中，化合物是抗体，且其与PCSK9的结合导致与不存在所述抗体时的结合相比，PCSK9与LDLR的结合减少。这又导致源自表达LDLR的细胞系(如源自肝细胞的细胞系)的细胞的LDLR水平与不存在所述抗体时的水平相比升高。

因此，在一些实施方案中，与不存在所述化合物时的水平相比，化合物与PCSK9的结合导致源自表达LDLR的细胞系(如源自肝细胞的细胞系)的细胞的LDLR水平升高。在具体实施方案中，化合物是如上所定义的抗体，且抗体与PCSK9的结合导致源自表达LDLR的细胞系(如源自肝细胞的细胞系)的细胞的LDLR水平与不存在所述抗体时的水平相比升高。

在一些实施方案中，与不存在所述化合物时的降解相比，化合物与PCSK9的结合导致LDLR的溶酶体降解降低。在具体实施方案中，化合物是如上所定义的抗体，抗体与PCSK9的结合导致LDLR的溶酶体降解与不存在所述抗体时的降解相比降低。

在一些实施方案中，与不存在所述化合物时的水平相比，化合物与PCSK9的结合导致LDL-C的血浆水平降低。术语“血浆LDL-C水平”应理解为指血浆中LDL-C的水平，即LDL-C蛋白的量。在具体实施方案中，化合物是如上定义的抗体，抗体与PCSK9的结合导致LDL-C的血浆水平与不存在所述抗体时的水平相比降低。

LDL-C的血浆水平可在体内或体外确定。确定LDL-C血浆水平的方法是本领域已知的，并包括但不限于Western印迹、免疫染色、ELISA、超离心、快速蛋白质液相色谱(FPLC)和电泳方法。

本申请中公开的化合物在血清中可为抗体稳定的。

本申请中还提供如上所述的化合物，其是无毒的，特别是施用后。在一些实施方案中，化合物是施用后无毒的抗体。

在一些实施方案中，该化合物与另外的化合物组合使用，如抗PCSK9抗体，如结合PCSK9的LDLR结合位点的抗体，或他汀类药物。在一些实施方案中，该化合物与选自下组的抗体一起施用：罗德希珠单抗(lodelcizumab)、劳潘希珠单抗(ralpancizumab)、阿利库单抗(alirocumab),依伏库单抗(evolocumab)和bococizumab。

因此，本申请提供了在有需要的受试者中降低血浆LDL-C水平的方法。所述方法包括向所述受试者施用如本申请所述的化合物或药物组合物的步骤。血浆LDL-C水平可通过本领域已知的任何方法在体内或体外确定，如上所述。

肝素类似物和肝素模拟物

在一些实施方案中，能够抑制HSPG与PCSK9结合的化合物是肝素类似物或肝素模拟物。参见例如R.Lever等(编)，Heparin-A Century of Progress,Handbook ofExperimental Pharmacology 207,Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012，通过提述并入本文。

肝素类似物或肝素模拟物可为HSPG的竞争性拮抗剂、反竞争性拮抗剂(uncompetitive antagonist)、非竞争性拮抗剂(non-competitive antagonist)、沉默拮抗剂、部分激动剂或反向激动剂。

在一些实施方案中，化合物为肝素。在另外的实施方案中，所述肝素类似物或肝素模拟物为肽。

在一些实施方案中，肝素类似物或肝素模拟物能够抑制肝素与PCSK9的结合。肝素类似物或肝素模拟物可结合于PCSK9的任何氨基酸残基，如本申请中上文所述。

化合物，肝素类似物或肝素模拟物可具有式(I)的一般结构：

其中：

-R₁选自下组：COOH和^-O₃SO，

-R₂,R₃,R₅和R₇选自下组：O和OH

-R₄选自下组：硫酸盐基团(sulfate group)，

-R₆选自下组：氨基磺酸盐基团(sulfamate group)、OH和O，

-R₈选自下组：硫酸盐基团，

-n是大于或等于1的整数，

而且其中R₂和/或R₇任选地能够充当连接单体单元的接头。

在一个实施方案中，所述肝素类似物或模拟物为

a)磺达肝癸盐(Fondaparinux(Arixtra^TM))并具有下式：：

b)低分子量肝素如达肝素钠(dalteparin sodium)或锡扎宾钠(tinzaparinsodium)；和

c)式(II)的化合物：

其中R₉和R₁₀独立地选自下组：H,COOH,^-O₃SO,O,OH,硫酸盐和氨基磺酸盐，其中n是大于或等于1的整数。

在一个实施方案中，式(II)的化合物为戊聚糖并具有下式：

其中n为大于或等于1的整数。

在一个实施方案中，化合物为低分子量肝素。在一个具体的实施方案中，低分子量肝素为达肝素钠(商品名法安明)。在另一个实施方案中，低分子量肝素为锡扎宾钠(商品名亭扎肝素钠(Innohep^TM))。

在又一个实施方案中，化合物为式(II)的化合物：

在一个实施方案中，式(II)的化合物为戊聚糖并具有下式：

其中n为大于或等于1的整数.

在一些实施方案中，化合物为苏拉明。

苏拉明具有下式：

在一个具体的实施方案中，化合物为式(III)的化合物：：

其中R₁₁,R₁₂,R₁₃,R₁₄,R₁₅,R₁₆,R₁₇,R₁₈和R₁₉独立地选自下组：COOH,^-O₃SO,O,OH,硫酸盐和氨基磺酸盐，且n是大于或等于1的整数，而且其中R₁₄任选地能够充当连接单体单元的接头。

在一个实施方案中，式(III)的化合物为硫酸右旋糖酐并具有下式：

其中n为大于或等于1的整数。

在另一个实施方案中，所述化合物为硫代磷酸寡核苷酸S-dNn，其中N为任何核苷酸且n为所述硫代磷酸寡核苷酸中硫代磷酸酯键的数目。已知硫代磷酸寡核苷酸充当肝素模拟物并结合于肝素结合蛋白如bFGF(Benimetskaya等,1995)。它们的聚阴离子骨架使它们类似于肝素、硫酸右旋糖酐和戊聚糖。在一些实施方案中，硫代磷酸寡核苷酸为S-dCn。在另外的实施方案中，硫代磷酸寡核苷酸为S-dAn。在另外的实施方案中，硫代磷酸寡核苷酸为S-dGn。在另外的实施方案中，硫代磷酸寡核苷酸为S-dTn。在另外的实施方案中，硫代磷酸寡核苷酸的任何核苷酸独立地选自下组：A,T,G和C。

S-dCn核苷酸的一般结构在下式中表示，其中n为整数：

优选地，n为12-60。因此在一些实施方案中，n为1-55，如20-50，如25-45，如30-40，如36。

通常，设计S-寡核苷酸以使它们的序列与靶mRNA互补，从而特异性地诱导所述靶mRNA的降解。不受理论的约束，本发明人认为在本公开的上下文中磷酸硫酸酯寡核苷酸的重要机制是它们非特异性结合多种蛋白质的能力(参见例如Yabukov等,1993；Stein等1995)。因此，在一些实施方案中，硫代磷酸寡核苷酸不具有或具有极低的反义活性；相反，它们结合核苷酸序列而与如本文所述的PCSK9的任何氨基酸残基无关。本领域技术人员知道如何优化S-寡核苷酸的设计以获得此类具有不呈现反义活性的核苷酸序列的硫代磷酸寡核苷酸。

虽然寡核苷酸的长度和特别是硫代磷酸酯键的数目影响硫代磷酸寡核苷酸的肝素模拟物活性，但看起来S-寡核苷酸内的核苷酸序列对肝素模拟物活性基本上没有影响。因此，可使用任何序列，只要S寡核苷酸中的硫代磷酸酯键的数目和长度已经如本领域中的常规优化。

合成硫代磷酸寡核苷酸的方法是本领域已知的。作为非限制性实例，一种方法涉及二硫化碳中的元素硫的溶液对于氢膦酸酯的作用，而另一种方法涉及用二硫化四乙基秋兰姆(tetraethylthiuram disulfide,TETD)或3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(3H-1,2-bensodithiol-3-one 1,1-dioxide,BDTD)硫化亚磷酸三酯。

硫代磷酸酯键固有地是手性的。硫化方法在每个并入位点产生异构体的混合物，得到长度为n的寡聚物的2n-1个异构体。不受理论的束缚，任何标准S-寡核苷酸制备中的异构体混合物看起来不影响寡核苷酸的生物学活性。在一个实施方案中，S-寡核苷酸为异构体混合物。在另一个实施方案中，S-寡核苷酸作为一种异构体形式提供。

为了寡核苷酸抗降解，硫代磷酸酯键不必遍及整个寡核苷酸存在。本领域技术人员知道可如何调节硫代磷酸酯键的数目。

脂蛋白代谢的病症

本申请中还提供如上所述的化合物，其用作药物。

本申请中公开的化合物可用于治疗脂蛋白代谢的病症。因此，本申请中还提供如本申请中所述的化合物在制备用于治疗脂蛋白代谢的病症的药物中的用途。还公开了如上所述的化合物，其用于在有需要的受试者中治疗脂蛋白代谢的病症的方法中。PCSK9的序列可从一个受试者到另一个受试者变化，例如可导致保守取代的个体特异性SNP可见于一些个体中。会理解的是，抑制HSPG与这类PCSK9变体结合的化合物也在本发明的范围内。

脂蛋白代谢的病症是脂质稳态的病症和与之相关的疾病，且包括例如高胆固醇血症，高脂血症，高甘油三酯血症，谷固醇血症(sitosterolemia)，动脉粥样硬化，动脉硬化，冠心病，代谢综合征，急性冠状动脉综合征，黄瘤，高血压，心绞痛，肥胖，糖尿病和血管炎症。这样的病症可由例如在识别各种类型的脂蛋白的细胞受体中或在分解脂肪的酶中的脂蛋白颗粒的结构蛋白中的缺陷引起。由于这样的缺陷，脂质可变为沉积在血管壁中。

高胆固醇血症(或血脂异常(dyslipidemia))是血液中存在高水平的胆固醇。它是高脂血症(血液中脂质水平升高)和高脂蛋白血症(血液中脂蛋白水平升高)的形式。

高甘油三酯血症表示甘油三酯的高血液水平。甘油三酯水平升高与动脉粥样硬化有关，即使没有高胆固醇血症，并容易发生心血管疾病。非常高的甘油三酯水平也增加急性胰腺炎的风险。

谷固醇血症或植物甾醇血症是罕见的常染色体隐性遗传性脂质代谢病症，其特征是超吸收和饮食胆固醇的胆汁排泄降低，其导致例如高胆固醇血症，肌腱和结节性黄瘤，动脉粥样硬化过早发展。

动脉粥样硬化(也称为动脉硬化性血管病或ASVD)是动脉硬化的特定形式，其中动脉壁由于白细胞(含有活的活性白细胞(产生炎症)和死细胞的残余物(包括胆固醇和甘油三酯))的入侵和积累而增厚。因此，动脉粥样硬化是由于动脉壁中的白细胞的慢性炎症反应所致影响动脉血管的综合征。

动脉硬化是涉及动脉壁的增厚、硬化和弹性丧失的病况。

冠心病(也称为动脉粥样硬化性动脉疾病、动脉粥样硬化性心血管病、冠心病或缺血性心脏病)是心脏病最常见的类型和心脏病发作的原因。该疾病是由沿着心脏动脉内壁的斑块积累引起的，其使动脉内腔变窄并减少流向心脏的血流。

代谢综合征是一种能量利用和储存的病症，由以下五种医学病况中的三种的共发生诊断：腹部(中间)肥胖，血压升高，空腹血浆葡萄糖糖升高，高血清甘油三酯和低的高密度胆固醇水平。代谢综合征增加发生心血管疾病(特别是心力衰竭和糖尿病)的风险。代谢综合征也被称为代谢综合征X、心脏代谢综合征、X综合征、胰岛素抗性综合征、Reaven综合征和CHAOS(在澳大利亚)。代谢综合征和前期糖尿病看起来是相同的病症，只是由不同的生物标志物组诊断。

急性冠状动脉综合征指由于冠状动脉中血流量减少使得部分心肌不能正常发挥功能或死亡所致的一组病况。

黄瘤是脂质沉积的皮肤表现，其中脂质积累在皮肤内的大泡沫细胞中。黄瘤与高脂血症有关。

高血压(有时称为动脉高血压)是动脉中的血压升高的慢性医学病况。

心绞痛指胸痛、压力或挤压的感觉，常常是由于心肌从冠状动脉阻塞或痉挛的缺血所致。虽然心绞痛可源于贫血、心律失常和心力衰竭，其主要原因是冠状动脉疾病。

肥胖是一种医学病状，其中过量的身体脂肪已积累至可对健康有负面影响的程度，导致寿命预期降低和/或健康问题增加，如心脏病、2型糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暂停、某些类型的癌症和骨关节炎的风险增加。

糖尿病(通常称为糖尿病)是一组代谢疾病，其中长期存在高血糖水平。存在几种类型的糖尿病，包括I型糖尿病，II型糖尿病和妊娠糖尿病。1型糖尿病的特征在于胰腺中朗格汉斯(Langerhans)的岛的产生胰岛素的β细胞的丧失，导致胰岛素缺乏。2型糖尿病的特征在于胰岛素抗性，其可与相对减少的胰岛素分泌组合。身体组织对胰岛素的缺陷响应性被认为涉及胰岛素受体。类似2型糖尿病的妊娠糖尿病发生在所有怀孕的约2-10％中。

在一些实施方案中，脂蛋白代谢的病症与异常的PCSK9血浆水平相关。在另外的实施方案中，脂蛋白代谢的病症与在表达LDLR的细胞如肝细胞的表面处异常的LDLR水平相关。脂蛋白代谢的病症也可与在表达LDLR的细胞如肝细胞的表面处异常的PCSK9血浆水平和异常的LDLR相关。PCSK9血浆水平在人中从30至3000ng/ml变化。异常的PCSK9血浆水平指PCSK9的血浆水平与健康个体中的平均水平显著不同。在一些实施方案中，异常的PCSK9血浆水平显著高于健康个体中的平均水平。同样，在例如肝细胞的表面处异常的LDLR水平指LDLR水平与健康个体中的平均水平显著不同。在一些实施方案中，在表达LDLR的细胞如肝细胞的表面处异常的LDLR水平显著低于健康个体中的平均水平。

在一些实施方案中，该疾病的特征是LDL-C水平异常，特别是LDL-C水平升高。

脂蛋白代谢病症的治疗

需要治疗脂蛋白代谢的病症的个体或受试者是患有或被患有、疑似患有或处于患有脂蛋白代谢的病症的风险的个体。在一些实施方案中，需要治疗的个体为哺乳动物，优选人。

在优选的实施方案中，脂蛋白代谢的病症选自下组：血脂异常，高胆固醇血症和冠心病。在一个优选的实施方案中，脂蛋白代谢的病症是冠心病。

在一些实施方案中，治疗是预防性的。

在一些实施方案中，治疗包括向所述受试者施用如本申请中公开的化合物的步骤。化合物可以0.1mg-1000mg每kg体重的每日剂量施用。因此在一些实施方案中，化合物以0.1mg-1000mg每kg体重，如0.2-900mg每kg体重，如0.3-800mg每kg体重，如0.5-700mg每kg体重，如1.0-500mg每kg体重，如5-400mg每kg体重，如10-300mg每kg体重，如25-250mg每kg体重，如50-200mg每kg体重，如75-150mg每kg体重，如100-125mg每kg体重的每日剂量施用。在一些实施方案中，化合物以0.1mg-1000mg每kg体重，如0.1-10mg每kg体重，如10-25mg每kg体重，如25-50mg每kg体重，如50-100mg每kg体重，如100-250mg每kg体重，如250-500mg每kg体重，如500-750mg每kg体重，如750-1000mg每kg体重的每日剂量施用。

本申请中还公开在有需要的个体中治疗选自下组的脂蛋白代谢的病症的方法：血脂异常、高胆固醇血症和冠心病，所述方法包括以下步骤：

i.提供从所述个体分离的组织样品或血浆样品，

iv.评估治疗方案，

v.向所述个体施用包含治疗有效量的如本申请中公开的化合物的组合物。

在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：

i.提供从所述个体分离的组织样品，

ii.确定所述组织的LDLR的水平，

iii.将步骤ii)的表达水平与对照组织样品的水平关联，

iv.评估治疗方案，

因此在一些实施方案中，向所述个体施用包含治疗有效量的如本申请中公开的化合物的组合物，如果在所述组织的细胞的表面处的LDLR水平是异常的。在一些实施方案中，异常的LDLR水平是LDLR水平降低。在一些实施方案中，组织样品包含表达LDLR的细胞如肝细胞，并测量在所述细胞的表面处的LDLR水平。

在另外的实施方案中，所述方法包括以下步骤：

i.提供从所述个体分离的血浆样品，

ii.确定所述血浆样品中的LDL-C的水平和/或PCSK9的水平，

iii.将步骤ii)的表达水平与对照血浆样品的水平关联，

iv.评估治疗方案，

因此在一些实施方案中，向所述个体施用包含治疗有效量的如本申请中公开的化合物的组合物，如果血浆样品中的LDL-C水平和/或PCSK9水平是异常的。在一些实施方案中，异常的LDL-C水平是LDL-C水平升高。在一些实施方案中，组织样品包含表达LDLR的细胞如肝细胞，并测量在所述细胞的表面处的LDLR水平。

本申请中还公开了抑制LDLR的降解的方法，所述方法包括施用如本申请中所述的化合物。特别地，该化合物可为如本申请中上文所定义的通式(I)的化合物。

在一些实施方案中，化合物是肝素类似物或模拟物如磺达肝癸盐(Fondaparinux)。在另一个实施方案中，化合物是戊聚糖。在又一个实施方案中，化合物是苏拉明。在又一个实施方案中，化合物是硫酸右旋糖酐。在又一个实施方案中，化合物是低分子肝素如达肝素钠或锡扎宾钠。在又一个实施方案中，化合物是如本申请中上文所定义的硫代磷酸寡核苷酸。

药物组合物

本文还公开了药物组合物，其包含至少一个如本申请中所述的化合物。在一些实施方案中，组合物包含本申请中公开的一种化合物。在另外的实施方案中，组合物包含两种化合物或更多，如三种化合物或更多，如四种化合物或更多，如五种化合物或更多。

在一些实施方案中，所述组合物进一步包含以下的至少一个：

-抑制PCSK9与LDLR结合的抗体；

-他汀类药物；

-消胆胺；

-胆固醇吸收抑制剂例如依折替米贝(ezetimibe)。

因此在一些实施方案中，药物组合物包含至少一个如本申请中所述的化合物和至少一个选自下组的另外的化合物：抑制PCSK9与LDLR结合的抗体、他汀类药物或消胆胺。在一个实施方案中，药物组合物包含一个如本申请中所述的化合物和抑制PCSK9与LDLR结合的抗体。在一个实施方案中，药物组合物包含一个如本申请中所述的化合物和一种他汀类药物。在一个实施方案中，药物组合物包含一个如本申请中所述的化合物和消胆胺。在一个实施方案中，药物组合物包含一个本申请中所述的化合物、抑制PCSK9与LDLR结合的抗体和他汀类药物。在一个实施方案中，药物组合物包含一个本申请中所述的化合物、抑制PCSK9与LDLR结合的抗体和消胆胺。在一个实施方案中，药物组合物包含一个如本申请中所述的化合物、消胆胺和他汀类药物。在一个实施方案中，药物组合物包含一个本申请中所述的化合物、抑制PCSK9与LDLR结合的抗体、他汀类药物和消胆胺。

药物组合物可任选地包含一个或多个药学上可接受的载体赋形剂，并且可通过常规技术制备，例如如Remington:The Science和Practice of Pharmacy1995,由E.W.Martin编,Mack Publishing Company,第19版,Easton,Pa.中描述的。组合物可以常规形式出现，例如胶囊，片剂，气溶胶，溶液，悬浮液或局部施用。通常，本发明的药物组合物可经配制用于胃肠外施用，例如通过静脉内或皮下注射，并且可在安瓿、预填充注射器、小体积输注中或添加有防腐剂的多剂量容器中以单位剂量形式存在。组合物可采取这样的形式如在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，例如水性聚乙二醇水中的溶液。组合物可适用于口服摄入。这对于小分子组合物特别相关。油性或非水性载体、稀释剂、溶剂或运载体的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如油酸乙酯)，并可含有配制剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂或悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可为粉末形式，通过无菌固体的无菌分离或通过冻干从溶液获得用于在使用前用合适的运载体例如无菌无热原水构成。用于胃肠外制剂的油包括石油、动物油、植物油或合成油。可用于这类制剂的油的具体实例包括花生、大豆、芝麻、棉籽、玉米、橄榄、矿脂/凡士林(petrolatum)和矿物质。用于胃肠外制剂的合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。胃肠外制剂通常在溶液中会含有按重量计约0.0001至约25％，如约0.5至约25％的活性成分。可使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射部位处的刺激，这样的组合物可含有具有约12至约17的亲和亲油平衡(HLB)的一个或多个非离子表面活性剂。这类制剂中的表面活性剂的量通常为按重量计约0.000001至约15％，如按重量计约0.000001至约5％或按重量计约5至约15％。合适的表面活性剂包括聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，如脱水山梨糖醇单油酸酯，以及通过环氧丙烷与丙二醇的缩合形成的环氧乙烷与疏水基的高分子量加合物。胃肠外制剂可以单位剂量或多剂量密封容器(如安瓿和小瓶)存在，并可以冷冻干燥(冻干)条件存储，其仅需在使用前立即添加无菌液体赋形剂(例如水)用于注射。

然而，根据本发明的药物递送的主要途径是胃肠外，从而将药剂引入血流中以最终靶向相关组织。

也可施用药剂以穿过要给予生物活性物质的动物的任何粘膜，例如鼻、阴道、眼、口，生殖道、肺、胃肠道或直肠中的，优选鼻或口的粘膜。

在一个优选的实施方案中，本发明的药剂胃肠外施用，即通过静脉内、肌内、脊柱内、皮下、鼻内、直肠内、阴道内或腹膜内施用。通常优选胃肠外施用的皮下和肌内形式。用于这种施用的适当剂型可通过常规技术制备。化合物也可通过吸入施用，其为通过鼻内和口服吸入施用。用于这种施用的适当剂型(如气溶胶制剂或计量剂量吸入器)可通过常规技术制备。

在一个实施方案中，根据本发明的药物组合物经配制用于胃肠外施用，如通过注射进行。

在另一个实施方案中，根据本发明的药物组合物经配制用于静脉内、肌内、脊柱内、腹膜内、皮下、推注或连续施用。

施用的速率和频率可由医师基于个案病例来确定。在一个实施方案中，施用以30分钟至24小时的间隔，如以1至6小时的间隔，如每天一次进行。

治疗的持续时间可根据病症的严重程度而变化。在一个实施方案中，治疗的持续时间为1天至28天，如2天至25天，如5天至20天，如7天至15天。在慢性病例中，治疗的持续时间可为终身的。

剂量可由负责的医师基于患者的特征和施用的手段和方式确定。在本发明的一个实施方案中，如本申请中上文所述的药物组合物的活性化合物的剂量为0.1mg至1000mg每kg体重。

剂量可作为推注给药或作为连续给药施用。关于推注给药，药物组合物可以30分钟至24小时的间隔，如每天一次施用。

在一些实施方案中，组合物的pH为pH 4-pH 10。

在一些实施方案中，组合物经配制用于口服施用。

在一些实施方案中，组合物经配制用于胃肠外施用。在具体实施方案中，胃肠外给药是通过注射进行的。这种胃肠外给药可为静脉内、肌内、脊柱内、腹膜内、皮下、推注或连续施用。

选择抗体的方法

本申请中还公开选择抗体的方法，所述抗体特异性识别并结合PCSK9(SEQ ID NO:1)的HSPG结合位点之内的表位，所述方法包括以下步骤：

ii.鉴定并选择识别所述多肽的抗体，和

用于施用PCSK9的多肽片段或编码PCSK9的多肽片段的多核苷酸的方法是本领域中已知的并包括哺乳动物的免疫或噬菌体展示。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括选择能够顶替至少一个所述参考抗体的抗体的步骤。所述参考抗体是能够结合于PCSK9或其片段的抗体。

所述确定所述选择的抗体是否能够在竞争性ELISA中顶替一个或多个参考抗体的步骤包括以下步骤：

i.提供包含被所述参考抗体识别的表位的PCSK9或其片段；和

ii.将测试抗体和所述参考抗体添加至所述PCSK9或其片段，其中所述测试抗体或者所述参考抗体用可检测的标记物标记或两种抗体用不同的可检测的标记物标记；和

iii.检测所述可检测的标记物在PCSK9处的存在；

由此检测所述测试抗体是否能够顶替所述参考抗体。

所述方法可进一步包括测试所述抗体以确定它们是否能够抑制LDLR降解和选择能够抑制LDLR降解的抗体。

本申请中还公开选择能够抑制HSPG如肝素与PCSK9的结合的肽或肝素类似物或模拟物的方法，所述方法包括以下步骤：

i.提供多种肽或肝素类似物或模拟物；

iii.确定所述培养基中PCSK9水平和/或所述细胞的LDLR水平；

在一些实施方案中，PCSK9水平是从细胞表面脱离的PCSK9的水平。

能够结合本申请中公开的化合物的化合物

本申请中还公开能够选择性结合如上所述的化合物的化合物。在一些实施方案中，能够选择性结合如上所述的化合物的化合物为抗体。

产生本申请中公开的抗体的方法

用于产生如本申请中所述的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

ii.选择所述抗体，如果它能够结合于PCSK9(SEQ ID NO:1)；

用于施用蛋白或编码蛋白(其包含PCSK9的HSPG结合域或其片段或其功能等同物)的多核苷酸的方法是本领域中已知的并包括哺乳动物的免疫或噬菌体展示。

在一些实施方案中，所述突变的PCSK9是至少在位置93,96,97,104,105,136,139,165或167之一处突变的。在一些实施方案中，突变是丙氨酸取代。在一些实施方案中，在位置93,96,97,104,105,136,139,165或167处的两个或更多个氨基酸残基突变。

在具体实施方案中，突变的PCSK9选自下组：突变体R93A，R96A，R97A，R104A，R105A，K136A，H139A，R165A或R167A，其中位置是如SEQ ID NO:1所示的PCSK9的位置。在一个具体实施方案中，突变的PCSK9是在PCSK9的位置R93,R96,R97,R104,R105和H139处突变的。优选地，突变是变为丙氨酸的突变。

在一些实施方案中，对其施用包含PCSK9的HSPG结合域的蛋白质或其片段或其功能等同物的哺乳动物是啮齿动物，如小鼠，大鼠，仓鼠或豚鼠。

所述方法可进一步包括从所述哺乳动物分离产生抗体的细胞，从所述产生抗体的细胞制备杂交瘤细胞，培养所述杂交瘤并分离由所述杂交瘤产生的抗体。从杂交瘤细胞中分离抗体的方法是本领域中已知的。

在一些实施方案中，方法是用于产生如本申请中所公开的抗体，并且包括用编码所述抗体的核酸构建体转染宿主细胞的步骤。抗体可由重组细胞产生。合适的重组细胞可为选自细菌和真核微生物的微生物。

在一些实施方案中，微生物是选自下组的细菌：大肠杆菌(Escherichia coli)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

在另外的实施方案中，微生物是选自下组的真核微生物：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。

宿主细胞还可选自植物细胞和动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是选自下组的植物细胞：拟南芥、豌豆、稻、玉米、烟草、大麦或它们的种子。在另外的实施方案中，宿主细胞是源于选自下组的哺乳动物的动物细胞：中国仓鼠卵巢、小鼠和人。在另外的实施方案中，动物细胞源自昆虫或禽类(avian)细胞系。

所述方法还可包括鉴定并选择抗体的步骤。

实施例

实施例1：在PCSK9中定位HSPG结合位点。

我们检查了PCSK9(PDB:2PMW)的静电表面(图2B)，并鉴定了由位于PCSK9前域中的六个表面暴露的碱性残基组成的推定的肝素结合位点。结合位点由位置93,96,97,104和105处的精氨酸(R)残基和位置139处的组氨酸(H)形成，其显示与肝素戊糖(SANORG)的硫酸盐基团完美配对(Herbert等,1996)(Herbert等,1996)(图2B和2C)。发现该位点与位于PCSK9的无活性催化域中的LDLR结合表面相对(图2A)。肝素片段对接于与LDLR复合的PCSK9的共晶体结构(PDB:3P5B)表明HSPG结合允许随后的PCSK9:LDLR复合物形成(图3C)。

实施例2：肝素酶处理在体外抑制PCSK9细胞表面结合，并保护LDL受体免受体内 PCSK9诱导的降解

我们认为HSPG可牵涉PCSK9的捕获。因此，我们用肝素酶I处理稳定表达PCSK9的人肝细胞来源的HepG2细胞。酶肝素酶I在糖醛酸(uronic acid)和D-葡糖胺之间的1,4O-连接处切割硫酸乙酰肝素GAG链，由此除去细胞表面硫酸乙酰肝素链。

将用PCSK9稳定转染的HepG2细胞以每盖玻片50,000细胞接种，并温育过夜然后添加PBS中的肝素酶I(Sigma Aldrich/H2519)(0,0002UN/ml)或单独PBS。将细胞在37℃温育1小时，然后在4％多聚甲醛中固定，并用初级和次级抗体免疫染色非透化的细胞。用Hoechst染料(Sigma Aldrich)使核可视化。图像在Zeiss LSM780上获得。

事实上，处理导致表面PCSK9染色的强度明显降低，这表明HSPG对于PCSK9细胞结合是关键的(图2D)。

为了测试硫酸乙酰肝素GAG酶法去除对于PCSK9体内活性的作用，在注射PCSK9(10μg)前5分钟用通过尾静脉导管施用的肝素酶I(30U)输注10-12周龄雄性BALB6/cJRj小鼠。在对照小鼠中，用注射0.9％盐水代替肝素酶注射和/或PCSK9注射。在肝素酶输注期间，通过面罩连续施用异氟烷(isoflurane)轻度麻醉小鼠。注射后一小时处死小鼠，收获肝脏组织样品并快速冷冻然后提取蛋白质并通过Western印迹评价LDLR水平(图10A)。肝素酶I的注射完全保护LDLR免受PCSK9诱导的降解，这证明HSPGs在体内LDLR的PCSK9诱导的降解中是起作用的(图10A和B)。

为了验证PCSK9和硫酸乙酰肝素GAG链之间的直接相互作用，我们采用使用与肝素共价偶联的琼脂糖(Sepharose)珠的亲和层析。

将纯化的PCSK9加载到PBS中的5ml HiTrap肝素HP柱(GE Healthcare)上。该柱连接于Akta Prime并用5柱体积的10mM NaH₂PO₄(pH 7.4)洗涤。使用10mM NaH₂PO₄(pH 7.4)和2M NaCl的线性梯度洗脱PCSK9，并通过SDS-PAGE分析级分。基于测量的电导率，使用0.065mS/mM NaCl的转化系数将洗脱概貌转化为NaCl浓度的函数。将PCSK9保留在肝素柱上，并以约500mM的NaCl浓度洗脱(图2E)，这指示与肝素的强和高度特异性的相互作用。

在不同的实验中，将来自HepG2细胞的调节的培养基与肝素琼脂糖CL-6B珠(GEHealthcare)在10mM NaH₂PO₄(结合缓冲液)中温育。在4℃在转子上温育过夜后，将珠子在结合缓冲液中洗涤，然后以渐增浓度的NaCl分批洗脱结合肝素的蛋白质。通过Western印迹评价输入、流过和洗脱组级分中的PCSK9。

我们发现来自HepG2细胞的调节的培养基的内源性PCSK9也结合肝素琼脂糖，并显示与ApoE(一种公认的HSPG结合蛋白)相似的洗脱概貌(图3D)。

实施例3：鉴定对于PCSK9/HSPG相互作用重要的残基

为了进一步缩小涉及PCSK9/HSPG相互作用的关键残基，克隆和表达了在HSPG结合基序中具有点突变的PCSK9变体。通过PCR引入突变以通过中性残基如丙氨酸(Ala/A)代替由3D结构模型对接鉴定的带电荷的氨基酸精氨酸(Arg/R)、赖氨酸(Lys/K)和组氨酸(His/H)。

分析人野生型和以下丙氨酸取代变体：野生型PCSK9(SEQ ID NO：1)

突变R93

突变体R96R97

突变体R104R105

突变体R165R167

突变体R93R104R105H139A

突变体R93R96R97R104R105H139

由于不正确折叠的PCSK9通常不会在前肽中切割并因此保留在内质网中，所以可通过监测它们的加工和分泌来评价PCSK9突变体变体的正确折叠。通过瞬时转染中国卵巢仓鼠(CHO)细胞然后是细胞裂解物中和周围培养基中PCSK9的Western印迹分析来评估proPCSK9加工成成熟蛋白质和成熟PCSK9变体的分泌(图3A)。

通过亲和层析然后是用抗PCSK9抗体进行Western印迹来评估PCSK9突变体蛋白与肝素结合的能力。将来自用感兴趣的PCSK9变体转染的CHO细胞的调节的培养基与肝素琼脂糖CL-6B珠(GE Healthcare)在10mM NaH₂PO₄(结合缓冲液)中温育。在4℃在转子上过夜温育后，将珠子在结合缓冲液中洗涤然后在渐增浓度的NaCl中分批洗脱肝素结合的蛋白质。通过Western印迹评价输入、流过和洗脱级分中的PCSK9。

与野生型PCSK9或突变体R165R167相比，突变体R93,R96R97和R104R105显示对肝素较低的亲和力，而突变体R93R104R105H139和R93R96R97R104R105H139不结合肝素且仅仅在流过物中发现(图3B)。

实施例4：具有突变的HSPG结合域的PCSK9变体不能诱导LDL受体降解

与野生型PCSK9相比，在细胞测定法中测试了纯化的PCSK9变体以测试其诱导LDLR降解的能力。通过将HepG2细胞与野生型PCSK9(野生型)或上述PCSK9突变体温育分析了LDLR降解的诱导并通过Western印迹评估了LDLR水平。将HepG2细胞以250,000个细胞/孔的密度接种在12孔板中。过夜温育后，用含有PCSK9野生型或突变体R93R96R97R104R105H139的新鲜培养基替换培养基。在18小时温育后收获并裂解细胞，并通过Western印迹和密度剂量术定量评估了LDLR水平。

与和野生型PCSK9温育的细胞中测量的水平相比，与突变体R93R96R97R104R105H139温育的细胞中的LDLR水平显著更高(约两倍)(图4A和B)，这显示HSPG结合域内的突变导致PCSK9诱导的LDLR降解降低。

实施例5：肝素和肝素类似物防止PCSK9:LDLR复合物形成。

使用邻位连接测定法(PLA)，我们测试了外源性添加的肝素是否与细胞表面HSPG竞争内源性PCSK9的结合并由此防止PCSK9:LDLR复合物形成(Soderberg等,2006)。

根据制造商的方案，使用抗PCSK9(R&D Systems/AF3888)和抗LDLR(Abcam/ab52818)作为初级抗体进行PLA(Duolink II,Olink Bioscience)。彼此位于30nm以内的PCSK9和LDLR通过寡核苷酸缀合的二级抗体(其与形成圆形的寡核苷酸杂交由此引发滚环扩增)可视化。扩增的DNA通过添加互补的荧光标记的寡核苷酸二可视化(Soderberg等,2006)。

在非透化HepG2细胞中在内源性细胞表面PCSK9和LDLR上使用此测定法，观察到PCSK9:LDLR复合物的丰富聚簇(图5D)。这些在与肝素温育后数目和强度都明显降低，表明PCSK9与HSPG的结合是在随后与细胞表面LDLR的复合物形成中起作用的。

我们发现HepG2细胞与肝素(50U/ml进行18小时)的温育导致两至三倍高的LDLR蛋白水平(图5A-5B)，并观察到与低分子量肝素的两种治疗制备物类似的作用(图8A)。

肝素治疗的HepG2细胞中细胞LDLR的增加是剂量依赖性的，并伴随培养基中PCSK9的显着增加(图6B)。根据制造商的方案使用来自R&D Systems的Human(DPC900)QuantikineELISA试剂盒测量PCSK9浓度。

肝素诱导的细胞LDLR和细胞外PCSK9的增加在翻译后水平发生，因为我们观察到mRNA没有变化，除了在最高肝素浓度处的PCSK9(图6C)。

通过iScript cDNA合成试剂盒(BIORAD)从0.5μg RNA模板进行cDNA合成后，使用NucleoSpin RNA制备试剂盒(Macherey-Nagel)进行从HepG2细胞提取RNA。用iQ SYBRGreen超混合物和Taq聚合酶使用以下引物进行实时PCR以检测以下的转录物：LDLR(正向引物5'ACGGCGTCTCTTCCTATGACA3',反向引物5CCTTGGTATCCGCAACAGA3'),PCSK9(正向引物5CTGGAGCGGATTAC-CCCT3',反向引物5TGTATGCTGGTGTCTAGGAGA3'),和GAPDH(正向引物5'ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG3',反向引物5'GCCATCACGCCACA-GTTTC3')。

我们发现，尽管PCSK9mRNA水平增加了两倍，但25U/ml肝素有效拮抗了PCSK9活性，如从LDLR水平增加约2.5倍所示的(图8B)。

与肝素(50U/ml)温育24小时的HepG2细胞显示LDLR水平升高，如通过Western印迹评价的(图5A)。LDLR水平也通过密度计量术定量(n＝4)(图5B)。与肝素温育也导致培养基中PCSK9水平的升高，如通过ELISA测量的(图5C)。

如根据制造商的方案通过PCSK9/LDLR结合测定法分析的(图6A)(BPSBioscience)，肝素不干扰PCSK9与LDLR之间的直接相互作用。简言之，将涂覆有LDLR胞外域的微量滴定板孔在肝素(5或50U/ml)或针对PCSK9的LDLR结合域产生的抗PCSK9抗体(BPSBioscience#71207)的存在下与生物素化的PCSK9温育。洗涤后，将孔与辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素(streptavidi)温育，并通过添加HRP底物和使用化学发光酶标仪的评价来评估PCSK9与LDLR胞外域的结合。

PCSK9与LDLR之间的相互作用不受添加肝素的影响，这指示肝素与PCSK9的结合通过防止PCSK9与细胞表面HSPG的相互作用导致LDLR降解降低。

用磺达肝癸盐(Arixtra)(25,100或250μg/ml)温育24小时的HepG2细胞显示LDLR水平升高，如通过Western印迹评价的(图7)。这些结果指示，通过防止PCSK9与细胞表面HSPG的相互作用，肝素类似物(如磺达肝癸盐)与PCSK9的结合导致LDLR降解降低。

实施例6：肝素模拟物防止PCSK9:LDLR相互作用。

在过去的100年中，已经开发了几种模拟肝素结构的分子用于多种治疗应用，其中7种目前在临床使用。这些被称为肝素模拟物，且属于不同的化学类别，包括多种寡糖、寡核苷酸和萘衍生物。我们测试了肝素模拟物的亚组的结合PCSK9和增加HepG2细胞中的LDLR的能力(图9)。

使用微量热泳动(Microscale Thermophoresis,MST)(Jerabek-Wllemsen等,2011)评估了PCSK9和配体(苏拉明、硫酸右旋糖酐5000、右旋糖酐5000、戊聚糖硫酸酯和S-dC-36)之间的平衡结合亲和力。使用MO-L003Monolith Blue-NHS标记试剂盒(NanoTemperTechnologies)标记PCSK9，并实现了蛋白质对染料为1:1摩尔比的标记效率。以100nM的最终浓度施用PCSK9。未标记的结合配偶体在1:1稀释物中(于PBS+0.05％Tween-20中)滴定，其中苏拉明的最高浓度为15.4mM，硫酸右旋糖酐的最高浓度为2.3mM，右旋糖酐5000的最高浓度为2.3mM，戊聚糖硫酸酯的最高浓度为16.3mM，和S-dC-36的最高浓度为250μM。使用20％LED和80％MST功率在Monolith NT.115仪器(NanoTemper Technologies)上在标准处理的毛细管(NanoTemper Technologies)中进行MST测量。激光开启和关闭时间分别为5秒和35秒。在与上述相同的条件下，在所有16个毛细管中使用MST缓冲液中100nM的标记的PCSK9进行阴性对照。从苏拉明、硫酸右旋糖酐5000和S-dC-36的80％MST功率处的温度跃升阶段；以及从戊聚糖硫酸酯的80％MST功率处的热泳动+温度跃升阶段获得了结合曲线。对于每个结合配偶体，用GraphPad Prism 6拟合S形剂量-响应曲线以得到平均KD值。在高浓度苏拉明存在下观察到PCSK9的荧光猝灭，通过用10％SDS预处理PCSK9然后在90℃加热样品15分钟进行变性测试，然后在MST仪器上进行分析。这消除了猝灭效应，指示在非变性条件下PCSK9的荧光猝灭是由于实际的配体结合事件所致。

硫酸化寡糖硫酸右旋糖酐(图9C)和戊聚糖硫酸酯(图9F)分别以179.5μΜ和381.3μΜ的亲和力直接结合于PCSK9，如使用MST确定的，并导致细胞LDLR的剂量依赖性增加(图9A-B和图9D-E)，与运载体对照相比达到约400％的平台，并且在此测定法中显著优于他汀类药物的最大效果。相互作用取决于硫酸盐基团的存在，因为非硫酸化右旋糖酐对PCSK9不显示亲和力。硫酸化萘衍生物苏拉明是非洲昏睡病(African sleeping sickness)中的一种抗寄生虫药，以190μΜ的亲和力结合PCSK9(图9H)导致LDLR增加高达十五倍(图9A，9G)，伴随着荧光标记的LDL颗粒的细胞摄取增加(图12)。我们进一步测试了36聚体单链DNA分子，并发现其以4.8μΜ的KD结合PCSK9(图9K)，并在此浓度范围内显示强的抑制作用(图9I-J)。

实施例7:低分子肝素的治疗制剂保护LDLR免受PCSK9诱导的降解。

与低分子量肝素制备物法安明(1-100U/ml)或亭扎肝素钠(1-100U/ml)温育过夜的HepG2细胞显示LDLR水平升高，如通过Western印迹评价的(图8A)。法安明和亭扎肝素钠的效果与肝素(图5A)和戊糖Arixtra(图7)的作用相当。

这些结果显示，使用肝素:PCKS9复合物作为模板的基于结构的药物设计在小分子PCSK9抑制剂的开发中是可行的方法。

实施例8：肝素保护LDLR免受体内PCSK9诱导的降解。

对小鼠(BALB6/cJRj)进行单独的10μg人重组PCSK9或与肝素(50U)组合的单次静脉内施用(尾静脉)。注射后1小时将小鼠处死，并收集肝脏组织。膜蛋白制剂中LDLR的蛋白质印迹分析显示，与单独用PCSK9注射的小鼠相比，在与肝素共注射的小鼠中肝脏LDLR水平显著更高(图8B，在图8C中定量)。

这些结果显示，PCSK9:肝素相互作用可为小分子PCSK9抑制剂的开发提供框架。

实施例9:针对PCSK9的HSPG结合的多克隆抗体抑制PCSK9活性

通过用编码含有人HSPG结合域的嵌合大鼠PCSK9的DNA免疫三只大鼠产生多克隆抗体。通过免疫沉淀测试从免疫的动物获得的血清样品的PCSK9结合抗体。

将来自1μl免疫或免疫前大鼠血清的抗体固定在GammaBind珠(GE Healthcare)上，并用于35S人PCSK9从如前所述的(Gustafsen等,2014)用PCSK9瞬时转染的代谢标记的HEK293的调节的培养基的沉淀(在4C 3小时)。在含有0.1％Triton X100的TBS中进行3次洗涤后，通过在补充有20mM二硫赤藓糖醇(DTE)的NUPAGE样品缓冲液中通过煮沸样品洗脱沉淀的蛋白质，通过SDS-PAGE分离，并通过磷屏成像(phosphorimaging)可视化。

来自所有动物的免疫血清特异性沉淀35-S标记的PCSK9。在用来自免疫前动物的血清进行的对照免疫沉淀中检测不到PCSK9的拉下(pull down)(图8D)。

使用PCSK9诱导的LDLR降解的体外模型测试从免疫和免疫前血清样品中纯化的IgG，其中与免疫IgG温育的HepG2细胞显示LDLR水平的显著升高(图8E)。这些结果指示，靶向PCSK9的HSPG结合域的抗体有效抑制PCSK9活性。

实施例10：产生针对PCSK9HSPG结合域的PCSK9抑制性单抗

通过用编码含有人HSPG结合域的嵌合大鼠PCSK9的DNA免疫三只大鼠，由AldevronFreiburg,Germany产生针对PCSK9中的HSPG结合域的单克隆抗体(单抗)。通过将大鼠脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合和随后的产生抗体的细胞的单细胞亚克隆获得产生单克隆抗体的杂交瘤克隆，然后收集含有单抗的杂交瘤上清液。使用来自固定在GammaBind珠(GEHealthcare)上的产生单抗的杂交瘤克隆的500μl调节的培养基，通过35S人PCSK9的免疫沉淀测试个体单抗。我们发现26个测试的单抗中的16个特异性沉淀天然的35S人PCSK9(图8F)。

HepG2细胞中结合PCSK9的单抗的进一步功能测试显示12个克隆抑制PSCK9活性，并将LDLR的细胞水平增加为约两倍(图8G)。

测试这12个克隆以看它们是否可结合R93R96R97R104R105H139PCSK9突变体(图8H)。能够将LDLR的细胞水平增加为大约两倍的四个克隆不能结合此突变体(比较图8F、8G和8H中的单抗1G8、5E11、8HA和10E5)。进一步测试显示单抗10E5沉淀野生型PCSK9以及变体R96R97和R104R105(图8I)，而单抗1G8和5E11仅识别野生型PCSK9(图8I)。这些结果证明这三个克隆特异性结合于HSPG结合域。

对克隆5E11和8HA进行了测序(SEQ ID NO:2,4,6和8)。

实施例11：产生人源化单克隆抗体用于临床测试。

通过用编码由大鼠PCSK9和人PCSK9HSPG结合基序组成的嵌合蛋白的DNA免疫大鼠而产生单克隆抗体，通过在ELISA测定中筛选与人PCSK9的结合来发现候选抗体。候选抗体相对于表位、对人PCSK9的亲和力和天然PCSK9的识别来表征。在HepG2细胞培养测定中测试选择的候选抗体的抑制PCSK9功能的能力，并且于在内源性鼠类PCSK9启动子的控制下表达人PCSK9的转基因小鼠中测试最有希望的抗体。在施用后，分析肝脏中的LDL受体水平和血浆中的胆固醇会评估抗体的PCSK9中和作用。首要的候选物是人源化的并准备用于临床测试。

实施例12：使用针对PCSK9的HSPG结合位点的抗体降低LDL胆固醇。

给具有升高的LDL胆固醇水平的患者开药由针对人PCSK9中的HSPG结合位点的人源化抗体组成的活性化合物。患者以1-28天的间隔接受25-500mg的组合物的皮下注射。观察到LDL-C水平的显著降低。这些数据显示，针对人PCSK9中的HSPG结合位点的抗体的胃肠外施用可导致受试者中LDL-C水平的降低。

实施例13：在不响应于他汀类药物治疗的患者中降低LDL胆固醇。

给具有LDL胆固醇升高的患者开药他汀类药物治疗。患者不响应于他汀类药物治疗。然后给患者开药皮下注射25-500mg的包含针对人PCSK9中的HSPG结合位点的人源化抗体的组合物的治疗。注射以1-28天的间隔进行。观察到LDL-C水平的显著降低，这显示针对人PCSK9中的HSPG结合位点的抗体的胃肠外施用可在对他汀类药物治疗无响应的患者中导致LDL-C水平降低。

实施例14：使用针对PCSK9的HSPG结合位点的小分子化合物降低LDL胆固醇。

给具有升高的LDL胆固醇水平的患者开药经设计以阻断人PCSK9中的HSPG结合位点的小分子化合物的施用。化合物以0.1-30mg/kg的剂量口服施用。观察到LDL-C水平的显著降低，这显示口服施用设计以阻断人PCSK9中的HSPG结合位点的小分子可导致患者中LDL-C水平降低。

实施例15：产生针对PCSK9中的HSPG结合位点的抗体。

构建纯化的小鼠PCSK9嵌合体，其中小鼠HSPG结合序列延伸段被人序列延伸段(涵盖在SEQ ID NO:1的氨基酸残基78至167内)取代。用嵌合体免疫小鼠。随后在两步中通过直接ELISA选择克隆。在第一步中，使用涂覆有纯化的野生型人PCSK9的微量滴定孔选择能够结合野生型人PCSK9的抗体。在第二选择步骤中，用不能结合HSPG的突变型人PCSK9涂覆微量滴定孔。选择能够结合突变体PCSK9的抗体。通过确定它们的K_d来评价所选择的抗体对固定化的人PCSK9的亲和力。随后测试抗体在HepG2细胞中抑制PCSK9诱导的LDLR降解的能力。

因此选择针对人PCSK9的HSPG结合域并能够抑制PCSK9诱导的LDLR降解的抗体。

实施例16：使用Biacore选择针对HSPG结合位点的抗体。

使用在配备有如所述激活的CM5传感器芯片的Biacore 3000仪器(MunckPetersen等,1999)上进行的表面等离振子共振来评价针对PCSK9中HSPG结合位点的抗体的亲和力和特异性。将不能结合HSPG的野生型人PCSK9或人突变体PCSK9固定至10mM乙酸钠,pH 4.0中的密度74-83fmol/mm²，并用1M乙醇胺封闭剩余的偶联位点。抗体样品在25℃在10mM HEPES,pH 7.4,150mM NaCl,1.5mM CaCl₂,1mM EGTA和0.005％Tween 20(CaHBS)中以5μl/分钟注射。结合以相对响应单位(RU)表示，计算为固定化蛋白质流动池和相应的对照流动池之间的响应差。确定动力学参数，例如使用BIAevaluation 4.1进行。

实施例17

使用具有人PCSK9在内源性鼠类PCSK9启动子的控制下表达的LDLR(LDLR+/-)的冠状动脉疾病小鼠模型杂合子测试针对HSPG结合域的PCSK9单抗。西方型饮食喂养的动物每三周用PCSK9单抗(10mg/kg)治疗6-8个月的时间。在实验结束时处死小鼠并通过显微术评价主动脉中的动脉粥样硬化病变。在实验过程中，每两个月(every second months)通过ELISA评价血浆LDL-c。

实施例18：使用针对HSPG和LDLR结合位点的抗体的组合治疗。

将针对PCSK9的HSPG结合域(SEQ ID NO:1的氨基酸78至167之中)的人源化抗体与抑制PCSK9与LDLR结合的抗体组合使用。观察到协同作用，由此需要施用较少量的每种抗体，导致副作用降低。

实施例19：在不响应于他汀类药物治疗的患者降低LDL胆固醇。

患者针对升高的LDL-C水平接受他汀类药物治疗。然而，在LDL-C水平初次下降后，由于他汀类药物诱导的PCSK9表达升高，该治疗在显著降低LDL-C水平方面不成功。

除了他汀类药物外，对患者施用抑制HSPG与PCSK9结合的化合物。施用每周进行，并以所述化合物的低剂量(25-150mg)与他汀类药物组合。观察到LDL-C水平的显著降低，并达到合意的LDL-C水平。

此实施例显示，用针对PCSK9的HSPG结合域的抗体的施用来补充基于他汀类药物的治疗可成功地降低LDL-C水平。

实施例20：具有突变的HSPG结合位点的PCSK9不能增加LDL胆固醇水平。

野生型PCSK9和PCSK9的HSPG结合突变体通过不含CG二核苷酸的表达质粒(Invivogen)的流体动力学尾注射而在小鼠肝脏中过表达；这些质粒与通过CG碱基对的甲基化易于失活的常规质粒相比呈现长期表达。野生型PCSK9的过表达诱导LDLR降解的增强，导致血清LDL胆固醇升高，由此表现为“功能增益”变体。PCSK9的HSPG突变体表现为“功能丧失”变体，其由于LDL受体降解的降低产生血清LDL胆固醇水平升高较少。

结果证明了PCSK9HSPG结合域对动物中LDL受体降解的关键作用。

实施例21：基于PCSK9与肝素和肝素模拟物相互作用的小分子PCSK9抑制剂的基于结构的药物设计。

在HepG2细胞培养测定中，测试选自低分子肝素和肝素模拟物的候选化合物的抑制PCSK9功能并增加LDLR水平的能力。肝素类似物磺达肝癸盐(商品名Arixtra)用作参考化合物。获得的结构信息用于导出3-5个药效团模型，其用于筛选300万可购买化合物的现有数据库。选择50种化合物的基于多样性的集合用于HepG2细胞中的功能测试。成功的抑制剂促进分子对接模型的校准和可购买化合物的二次筛选。选择五十种化合物用于购买和体外测试。随后在小鼠模型中测试三个最有希望的候选物以评价在肝脏中对LDLR水平和在血浆中对胆固醇的体内作用。

实施例22：PCSK9抑制剂候选物的测试

使用具有人PCSK9在内源性鼠类PCSK9启动子的控制下表达的LDLR(LDLR+/-)的冠状动脉疾病小鼠模型杂合子进行PCSK9抑制剂候选物的临床前测试。西方型饮食喂养的动物用PCSK9抑制剂处理6-8个月的时间，然后在解剖的主动脉中的脂肪沉积物的油红O染色后通过显微术评价动脉粥样硬化斑块面积。在实验过程中每两个月通过ELISA评估胆固醇的血浆浓度。

这些研究会允许评价PCSK9抑制剂候选物降低血清胆固醇的能力。

实施例23：苏拉明保护LDLR免受PCSK9诱导的降解

苏拉明属于基于非碳水化合物的硫酸化肝素模拟物，并在其与凝血酶的复合物的结构模型中显示与肝素重叠的结合位点(Lima等,2009)。在HepG2细胞中测试了与苏拉明(0-200μg/ml)过夜温育的PCSK9抑制作用(图9A-B)。LDLR水平在具有最高测试浓度(200μg/ml)的苏拉明的细胞中上调15倍，表明苏拉明有力保护LDLR免受PCSK9诱导的降解。

实施例24：苏拉明对肝脏LDLR水平的作用

进行苏拉明的体内测试，对进行西方型饮食的小鼠和未进行西方饮食的小鼠进行单独5-20μg人重组PCSK9或与50-200μg苏拉明组合的单次静脉内施用(尾静脉)。处死5-7只小鼠的组以通过Western印迹分析评价肝脏LDLR水平(注射后1小时)并通过ELISA评价血浆LDL-c(注射后7小时)。

这些研究会证实苏拉明的施用导致体内LDLR水平升高。

实施例25：葡聚糖硫酸酯和戊聚糖保护LDLR免受PCSK9诱导的降解

在基于HepG2的体外细胞测定中，测试了肝素模拟物类的改性多糖化合物中的硫酸右旋糖酐(图9A-B)和戊聚糖(图9D-E)。过夜温育后，通过Western印迹评估LDLR水平，这显示用硫酸右旋糖酐(0-200g/ml)处理后LDLR的浓度依赖性增加，具有LDLR的多至3倍上调。戊聚糖(0-200g/ml)温育以50μg/ml的浓度导致LDLR升高4倍。

实施例26：戊聚糖对肝脏LDLR水平的作用

将戊聚糖-聚硫酸酯/盐注射入表达人PCSK9的小鼠中以评价该物质保护LDLR免受PCSK9诱导的降解的能力。

这些研究会证实戊聚糖的施用导致体内LDLR水平升高。

实施例27：戊聚糖对血清胆固醇水平的作用

用口服或皮下注射戊聚糖-聚硫酸酯/盐治疗具有血清胆固醇升高的患者，以评价该物质降低血清胆固醇的能力。根据制造商，戊聚糖-聚硫酸酯/盐以摄入口服剂量后2小时的中位数从消化道吸收。然后测量胆固醇水平。

这些研究会证实戊聚糖导致血清胆固醇水平降低。

实施例28：硫代磷酸寡核苷酸S-dC-36保护LDLR免受PCSK9诱导的降解

用寡核苷酸s-dC-36(0.5-5.0μΜ)温育的HepG2细胞(图9I-J)显示细胞LDLR蛋白水平增加(在5.0μΜS-dC-36处增加2倍)。S-dC-36属于硫代磷酸寡核苷酸的肝素模拟物种类，且数据表明S-dC-36有效地保护了LDLR免受PCSK9诱导的降解。

实施例29：确定硫代磷酸寡核苷酸用于LDLR保护的最佳长度

硫代磷酸寡核苷酸结合于肝素结合蛋白并抑制其功能。硫代磷酸寡核苷酸非特异性结合多种蛋白质的能力已有充分的记载(Yakubov等,1993；Stein1995)。反义硫代磷酸寡核苷酸通常经设计以具有用于特异性结合靶mRNA的互补碱基序列并由此诱导mRNA的降解。

在使用HepG2细胞系的细胞培养测定中确定硫代磷酸寡核苷酸用于结合PCSK9并由此保护LDLR免于降解的最佳长度。选择硫代磷酸寡核苷酸的碱基序列以对多种细胞系和组织中的基因表达具有最小的影响。

实施例30：优化的硫代磷酸寡核苷酸对LDLR保护的作用

将优化的硫代磷酸寡核苷酸注射入表达人PCSK9的小鼠中以评价物质保护LDLR免受PCSK9诱导的降解的能力。

实施例31：优化的硫代磷酸寡核苷酸对血清胆固醇水平的作用

将优化的硫代磷酸寡核苷酸注射入具有升高的血清胆固醇的患者中以评价该物质降低血清胆固醇的能力。

实施例32：Mipomersen对LDLR水平的作用

将HepG2细胞与Mipomersen温育以评价该物质增加LDLR水平的能力。Mipomersen是一种apoBIOO反义修饰的硫代磷酸寡核苷酸和胆固醇降低药物。它是靶向载脂蛋白B100的信使RNA的反义治疗剂。它作为用于家族性高胆固醇血症的每周注射施用。

这些研究会显示Mipomersen导致LDLR水平增加。

实施例33

对用苏拉明或PPDAS(吡哆醛-磷酸-6-氮杂苯基-2'-二磺酸)处理的ApoE-/-小鼠测试肝脏LDLR水平的上调。已报道苏拉明和PPDAS减少apoE-/-小鼠中的斑块大小(Guns等,2009)。

实施例34

对用苏拉明处理的ApoE-/-小鼠测试肝脏LDLR水平的上调。已报道苏拉明减少apoE-/-小鼠中的斑块大小(Guns等,2009)。

实施例36

与ATP相对，P2Y6选择性激动剂UDP增加J774巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶和白细胞介素-6的mRNA表达和活性；此作用被苏拉明(100-300mM)或吡哆醛-磷酸-6-氮杂苯基-2'-二磺酸(PPADS,10-30mM)阻断。最后，胆固醇喂养的apoE-/-小鼠用苏拉明或PPADS(分别为50和25mg kg^-1日^-1)的4周处理减少斑块大小，而不会改变斑块组成(相对的SMC和巨噬细胞含量)或细胞复制。

实施例37

在10-12周龄的雄性BALB6/cJRj小鼠中测试单抗5E11的体内作用。用0.9％盐水(运载体对照)或PCSK9(10μg)具有或不具有5E11(50-250ug)静脉注射小鼠(尾静脉)。在一个实验中，在注射后1小时收获小鼠并通过Western印迹评价肝脏LDLR水平。在平行实验中，小鼠注射相当量的5E11和针对PCSK9中的LDL受体结合位点的抗体的1:1混合物，以评价靶向LDLR和HSPG结合位点两者的PCSK9抑制的作用。在注射后的特定时间点通过ELISA评价血浆LDL-c浓度。使用单抗8H4进行类似的实验。

序列

SEQ ID NO:1:PCSK9蛋白-NCBI登录号:NG_009061.1

MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVWLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLWLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCWRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQ*

通过对大鼠杂交瘤BNT-8H4-B8/C7-E11,BNT-5E1 1-D4/G1-E4表达的免疫球蛋白基因的可变区的测序获得SEQ ID NO:2(3),4(5),6(7)和8(9)，如所示的。

SEQ ID NO:2:BNT-8H4-B8/C7-E11_VK DNA

SEQ ID NO:3:BNT-8H4-B8/C7-E11VK DNA

DIVMTQSPSLLSASVGDRVTLSCKGSQNINNYLAWYQQKLGEAPKLLIYNTNSLQTGIPSRFSGSGSGTDCTLTIRSLQPEDVATYFCYQYNNGNTFGGGTKLELK

SEQ ID NO:4:BNT-5E11-D4/G1-E4_VK DNA

SEQ ID NO:5:BNT-5E11-D4/G1-E4_VK蛋白质

DVVLTQTPVFLSVTLGDQTSISCRSSQSLEYSDGYTYLEWYLQKPGQSPQLLIYEVSN

RFSGVPDRFIGSGSGTDFTLKISRVEPEDLGVYYCFQGTHDPLTFGSGTKLEIK

SEQ ID NO:6:BNT-5E11-D4/G1-E4_VH DNA

SEQ ID NO:7:BNT-5E11-D4/G1-E4_VH蛋白质

EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYTITSGYDWSWIRRFPGNTMEWMGDISYSGSTNYNPSLKSRVSITRDTSKNQFFLQLNSVTTGDTATYYCAKLPGWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:8:BNT-8H4-B8/C7-E11_VH DNA

SEQ ID NO:9:BNT-8H4-B8/C7-E11_VH蛋白质

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSSSGICVSWIRQPSGKGLEWLATICWEDSKGYNPSLKNRLTISKDTSNNQALLRITSVDTADTAIYYCARVYYWYFDFWGPGTMVTVSS

SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:7的CDR1

SGYDWS

SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:7的CDR2

DISYSGSTNY NPSLKS

SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:7的CDR3

LPG

SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:5的CDR1

RSSQSLEYSD GYTYLE

SEQ ID NO:14-SEQ ID NO:5的CDR2

EVSNRFS

SEQ ID NO:15-SEQ ID NO:5的CDR3

FQGTHDPLT

SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:9的CDR 1

SSGICVS

SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:9的CDR 2

TICWEDSKGY NPSLKN

SEQ ID NO:18-SEQ ID NO:9的CDR 3

VYYWYFDF

SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:3的CDR1

KGSQNINNYL A

SEQ ID NO:20-SEQ ID NO:3的CDR2

NTNSLQT

SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:3的CDR3

YQYNNGNT

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序列表

<110> 奥胡斯大学(Aarhus Universitet)

<120> PCSK9的抑制剂用于脂蛋白代谢病症的治疗

<130> P3627PC00

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 692

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<220>

<221> 结合

<222> (78)..(167)

<223> HSPG结合位点

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (93)..(93)

<223> R93

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (96)..(96)

<223> R96

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (97)..(97)

<223> R97

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (104)..(104)

<223> R104

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (105)..(105)

<223> R105

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (136)..(136)

<223> K136

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (139)..(139)

<223> H139

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (165)..(165)

<223> R165

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (167)..(167)

<223> R167

<400> 1

Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu

20 25 30

Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu

35 40 45

Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe

50 55 60

His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val

65 70 75 80

Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg

85 90 95

Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu

100 105 110

His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly

115 120 125

Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu

130 135 140

Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg

145 150 155 160

Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp

180 185 190

His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val

195 200 205

Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp

210 215 220

Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly

225 230 235 240

Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln

245 250 255

Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg

260 265 270

Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro

275 280 285

Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu

290 295 300

Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp

305 310 315 320

Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val

325 330 335

Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly

340 345 350

Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile

355 360 365

Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly

370 375 380

Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu

385 390 395 400

Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile

405 410 415

His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp

420 425 430

Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr

435 440 445

His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His

450 455 460

Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp

465 470 475 480

Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg

485 490 495

Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His

500 505 510

Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu

515 520 525

Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala

530 535 540

Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr

545 550 555 560

Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro

565 570 575

Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg

580 585 590

Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys

595 600 605

Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val

610 615 620

Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly

625 630 635 640

Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val

645 650 655

Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val

660 665 670

Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser

675 680 685

Gln Glu Leu Gln

690

<210> 2

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 通过测序由大鼠杂交瘤BNT-8H4-B8/C7-E11, BNT-5E11-D4/G1-E4表达的免疫球蛋白基因的可变区获得的序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(318)

<223> BNT-8H4-B8/C7-E11_VK

<220>

<221> V_区

<222> (1)..(69)

<220>

<221> V_区段

<222> (70)..(102)

<223> CDR1

<220>

<221> V_区

<222> (103)..(147)

<220>

<221> V_区段

<222> (148)..(168)

<223> CDR2

<220>

<221> V_区

<222> (169)..(264)

<220>

<221> V_区段

<222> (265)..(288)

<223> CDR3

<220>

<221> J_区段

<222> (289)..(318)

<400> 2

gat att gtg atg acc cag tct ccc tca ctc ctg tct gca tct gtg gga 48

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

gac aga gtc act ctt agc tgc aaa gga agt cag aat att aac aat tac 96

Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

tta gcc tgg tac caa caa aag ctc gga gaa gct ccc aaa ctc ctg atc 144

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

tat aat aca aac agt tta caa acg ggc atc cca tca agg ttc agt ggc 192

Tyr Asn Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

agt gga tct ggt aca gat tgc aca ctc acc atc aga agc ctg cag cct 240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Cys Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

gaa gat gtt gcc aca tat ttc tgc tat cag tat aac aac ggg aac acg 288

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Asn Thr

85 90 95

ttt gga ggt ggg acc aag ctg gag ctg aaa 318

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 3

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 3

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Thr Asn Ser Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Cys Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Asn Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 4

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(336)

<223> BNT-5E11-D4/G1-E4_VK

<220>

<221> V_区

<222> (1)..(69)

<223> FWR1

<220>

<221> V_区段

<222> (70)..(117)

<223> CDR1

<220>

<221> V_区

<222> (118)..(162)

<223> FWR2

<220>

<221> V_区段

<222> (163)..(183)

<223> CDR2

<220>

<221> V_区

<222> (184)..(279)

<223> FWR3

<220>

<221> V_区段

<222> (280)..(306)

<223> CDR3

<220>

<221> J_区段

<222> (307)..(336)

<223> JK

<400> 4

gat gtt gtg ttg aca caa act cca gtt ttc ctg tct gtc aca ctt gga 48

Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Val Phe Leu Ser Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

gat cag act tct ata tct tgt agg tct agt cag agt ctg gaa tat agt 96

Asp Gln Thr Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser

20 25 30

gat gga tac act tat ttg gaa tgg tac cta cag aaa ccg ggc cag tct 144

Asp Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

cca cag ctc ctc atc tat gaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

gac agg ttc att ggc agt ggg tca ggg aca gat ttc acc ctc aag atc 240

Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

agc aga gta gag cct gag gac ttg gga gtt tat tac tgc ttc caa ggt 288

Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

aca cat gat cct ctc acg ttc ggt tct ggg acc aag ctg gag atc aaa 336

Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 5

Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Val Phe Leu Ser Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Thr Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 6

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(336)

<223> BNT-5E11-D4/G1-E4_VH

<220>

<221> V_区

<222> (1)..(90)

<223> FWR1

<220>

<221> V_区段

<222> (91)..(108)

<223> CDR1

<220>

<221> V_区

<222> (109)..(150)

<223> FWR2

<220>

<221> V_区段

<222> (151)..(198)

<223> CDR2

<220>

<221> V_区

<222> (199)..(294)

<223> FWR3

<220>

<221> V_区段

<222> (295)..(303)

<223> CDR3

<220>

<221> J_区段

<222> (304)..(336)

<223> JH

<400> 6

gag gtg cag ctg cag gag tca gga cct ggc ctt gtg aaa cct tca cag 48

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

tca ctc tcc ctc acc tgt tct gtc act ggt tac acc att acc agt ggt 96

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Thr Ile Thr Ser Gly

20 25 30

tat gat tgg agc tgg atc cgg agg ttc cca gga aat aca atg gag tgg 144

Tyr Asp Trp Ser Trp Ile Arg Arg Phe Pro Gly Asn Thr Met Glu Trp

35 40 45

atg gga gac ata agt tac agt ggt agc act aac tac aac cca tcg ctc 192

Met Gly Asp Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

aaa agt cga gtc tcc att aca aga gac aca tcc aag aat cag ttc ttc 240

Lys Ser Arg Val Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

ctg cag ttg aac tct gta act act ggg gat aca gcc aca tat tac tgt 288

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

gca aaa cta ccc ggc tgg ggc caa ggc act ctg gtc act gtc tct tca 336

Ala Lys Leu Pro Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 7

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Thr Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Asp Trp Ser Trp Ile Arg Arg Phe Pro Gly Asn Thr Met Glu Trp

35 40 45

Met Gly Asp Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Leu Pro Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 8

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(354)

<223> BNT-8H4-B8/C7-E11_VH

<220>

<221> V_区

<222> (1)..(90)

<223> FWR1

<220>

<221> V_区段

<222> (91)..(111)

<223> CDR1

<220>

<221> V_区

<222> (112)..(153)

<223> FWR2

<220>

<221> V_区段

<222> (154)..(201)

<223> CDR2

<220>

<221> V_区

<222> (202)..(297)

<223> FWR3

<220>

<221> V_区段

<222> (298)..(321)

<223> CDR3

<220>

<221> J_区段

<222> (322)..(354)

<223> JH

<400> 8

cag gtt act ctg aaa gag tct ggc cct ggg ata ttg cag cct tcc cag 48

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

acc ctc agt ctg act tgc tct ttc tct ggg ttt tca ctg agc agt tca 96

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser

20 25 30

ggt ata tgt gtg agc tgg att cgt cag cct tca ggg aag ggt ctg gag 144

Gly Ile Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

tgg ctg gca act att tgt tgg gag gat agt aag ggc tac aac cct tct 192

Trp Leu Ala Thr Ile Cys Trp Glu Asp Ser Lys Gly Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

ctg aag aac cgg ctc acg atc tcc aag gac acc tcc aac aac caa gca 240

Leu Lys Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Ala

65 70 75 80

ctc ctc agg atc acc agt gtg gac act gca gat acc gcc att tac tac 288

Leu Leu Arg Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

85 90 95

tgt gct cgg gtt tat tac tgg tac ttt gac ttc tgg ggc cca gga acc 336

Cys Ala Arg Val Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Pro Gly Thr

100 105 110

atg gtc acc gtg tcc tca 354

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 9

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser

20 25 30

Gly Ile Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala Thr Ile Cys Trp Glu Asp Ser Lys Gly Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Ala

65 70 75 80

Leu Leu Arg Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Val Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Pro Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO: 7的CDR1

<400> 10

Ser Gly Tyr Asp Trp Ser

1 5

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO: 7的CDR2

<400> 11

Asp Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 12

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO: 7的CDR3

<400> 12

Leu Pro Gly

1

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO: 5的CDR1

<400> 13

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser Asp Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO: 5的CDR2

<400> 14

Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO: 5的CDR3

<400> 15

Phe Gln Gly Thr His Asp Pro Leu Thr

1 5

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO: 9的CDR1

<400> 16

Ser Ser Gly Ile Cys Val Ser

1 5

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO: 9的CDR2

<400> 17

Thr Ile Cys Trp Glu Asp Ser Lys Gly Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn

1 5 10 15

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO: 9的CDR3

<400> 18

Val Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe

1 5

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO: 3的CDR1

<400> 19

Lys Gly Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO: 3的CDR2

<400> 20

Asn Thr Asn Ser Leu Gln Thr

1 5

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO: 3的CDR3

<400> 21

Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Asn Thr

1 5

Claims

1.一种化合物，其能够抑制硫酸乙酰肝素蛋白多糖受体(HSPG)与PCSK9的结合。

2.根据权利要求1的化合物，其中所述化合物特异性识别并结合PCSK9(SEQ ID NO:1)的HSPG结合位点之内的区，其包含PCSK9(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基78至167的至少一个，如PCSK9(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基78至92的至少一个，如氨基酸残基93至97的至少一个，如氨基酸残基98至103的至少一个，如氨基酸残基104至105的至少一个，如氨基酸残基106至135的至少一个，如氨基酸残基136至139的至少一个，如氨基酸残基140至164的至少一个，如氨基酸残基165至167的至少一个。

3.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述化合物结合于选自下组的一个或多个氨基酸：PCSK9(SEQ ID NO:1)的R93,R96,R97,R104,R105,K136,H139,R165和R167。

4.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述化合物结合于PCSK9(SEQ ID NO:1)的R93,R96,R97,R104,R105和H139中的至少一个，如至少两个，如至少三个，如至少四个，如至少五个，如全部六个。

5.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述化合物是抗体或其功能等同物。

6.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述化合物是单克隆抗体。

7.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体或其功能等同物是鼠单克隆抗体。

8.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体或其功能等同物已经人源化。

9.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体的功能等同物包含所述抗体的抗原结合片段，其能够结合于PCSK9(SEQ ID NO:1)的HSPG结合位点。

10.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述片段选自下组：Fab,Fab',F(ab')₂和Fv片段。

11.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体是单链抗体。

12.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体或其功能等同物特异性识别并结合PCSK9(SEQ ID NO:1)的HSPG结合位点之内的表位，其包含PCSK9(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基93,96,97,104,105,136,139,165或167的至少一个，如包含PCSK9(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基93,96,97,104,105和139中的至少一个，如至少两个，如至少三个，如至少四个，如至少五个，如全部六个的表位。

13.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：

重链可变区或其人源化的形式，其包含由SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12限定的三个CDR的至少一个，和

轻链可变区或其人源化的形式，其包含由SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15限定的三个CDR的至少一个。

14.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQID NO:7限定的重链可变区或其人源化的形式和/或由SEQ ID NO:5限定的轻链可变区或其人源化的形式。

15.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：

(i)重链可变区或其人源化的形式，其包含由SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17或SEQ IDNO:18限定的三个CDR的至少一个，和

(ii)轻链可变区或其人源化的形式，其包含由SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:21限定的三个CDR的至少一个。

16.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQID NO:9限定的重链可变区或其人源化的形式和/或由SEQ ID NO:3限定的轻链可变区或其人源化的形式。

17.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体是通过域重排构建的。

18.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体是抗体变体。

19.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体变体已经突变以增加半寿期、稳定性、溶解性和/或生物利用度。

20.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体变体包含工程化的域内二硫键。

21.根据前述权利要求任一项的化合物，其中一个或多个Fv片段包含V_H和V_L域之间的肽接头。

22.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体与PCSK9的结合导致PCSK9与LDLR的结合与不存在所述抗体情况下的结合相比降低。

23.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体进一步能够识别并结合PCSK9(SEQ ID NO:1)的LDLR结合位点之内的区，其中所述区包含PCSK9的残基194或367-381的至少一个。

24.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体与PCSK9的结合导致LDLR表达细胞如肝细胞的LDLR的水平与不存在所述抗体情况下的水平相比增加。

25.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体与PCSK9的结合导致LDLR的溶酶体降解与不存在所述抗体情况下的降解相比降低。

26.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体与PCSK9的结合导致LDL-C的血浆水平与不存在所述抗体情况下的水平相比降低。

27.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述LDL-C的血浆水平在体外确定。

28.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述LDL-C的血浆水平通过Western印迹、免疫染色、ELISA、超离心、FPLC或电泳确定。

29.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体是在血清中稳定的。

30.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述抗体是在施用后无毒的。

31.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述肝素类似物是HSPG的竞争性拮抗剂、反竞争性拮抗剂(uncompetitive antagonist)、非竞争性拮抗剂(non-competitiveantagonist)、沉默拮抗剂、部分激动剂或反向激动剂。

32.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述肝素类似物是肝素。

33.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述肝素类似物是肽。

34.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述肝素类似物能够抑制肝素与PCSK9的结合。

35.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述化合物是肝素模拟物或肝素类似物。

36.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述化合物具有式(I)的一般结构：

其中：

-R₁选自下组：COOH和^-O₃SO，

-R₂,R₃,R₅和R₇选自下组：O和OH

-R₄选自下组：硫酸盐基团，

-R₆选自下组：氨基磺酸盐基团、OH和O，

-R₈选自下组：硫酸盐基团，

-n是大于或等于1的整数，

而且其中R₂和/或R₇任选地能够充当连接单体单元的接头。

37.根据前述权利要求任一项的化合物，其中式(I)的化合物为

a)磺达肝癸盐(Fondaparinux)并具有下式：

b)低分子量肝素如达肝素钠(dalteparin sodium)或锡扎宾钠(tinzaparin sodium)；和

c)式(II)的化合物：

38.权利要求37的化合物，其中式(II)的化合物为戊聚糖并具有下式：

其中n是大于或等于1的整数。

39.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述化合物具有式(III)的一般结构：

其中R₁₁,R₁₂,R₁₃,R₁₄,R₁₅,R₁₆,R₁₇,R₁₈,和R₁₉独立地选自下组：COOH,^-O₃SO,O,OH,硫酸盐和氨基磺酸盐，且n是大于或等于1的整数，而且其中R₁₄任选地能够充当连接单体单元的接头。

40.根据权利要求39的化合物，其中所述化合物为硫酸右旋糖酐(dextran sulphate)并具有下式：

其中n是大于或等于1的整数。

41.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述化合物为苏拉明(suramin)并具有下式：

42.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述化合物为硫代磷酸寡核苷酸S-dNn，其中n为所述硫代磷酸寡核苷酸中硫代磷酸酯键的数目。

43.根据权利要求42的化合物，其中n为12-60。

44.根据权利要求43的化合物，其中n为15-55，如20-50，如25-45，如30-40，如36。

45.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述化合物不能结合于PCSK9(SEQ IDNO:1)的LDLR结合域。

46.如前述权利要求任一项中所述的化合物在制备用于治疗脂蛋白代谢病症的药物中的用途。

47.根据权利要求1至45任一项的化合物，其用作药物。

48.根据权利要求1至45任一项的化合物，其用于在对其有需要的受试者中治疗脂蛋白代谢病症的方法中。

49.根据权利要求48用于所述用途的化合物，其中所述脂蛋白代谢病症与LDL-C的异常水平，如LDL-C水平升高相关。

50.根据权利要求48至49任一项用于所述用途的化合物，其中所述脂蛋白代谢病症与LDLR表达细胞如肝细胞的异常LDLR水平和/或异常PCSK9血浆水平相关。

51.根据权利要求48至50任一项用于所述用途的化合物，其中所述脂蛋白代谢病症选自下组：血脂异常、高胆固醇血症和冠心病。

52.根据权利要求48至51任一项用于所述用途的化合物，其中所述治疗为预防性的。

53.根据权利要求48至52任一项用于所述用途的化合物，其中所述受试者为哺乳动物。

54.根据权利要求48至53任一项用于所述用途的化合物，其中所述哺乳动物是人。

55.一种在对其有需要的受试者中治疗脂蛋白代谢病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1至45中任一项所述的化合物。

56.根据权利要求49的方法，其中将所述化合物以0.1mg-1000mg每kg体重的每日剂量施用。

57.一种在对其有需要的个体中治疗脂蛋白代谢病症如血脂异常、高胆固醇血症和冠心病的方法，所述方法包括以下步骤：

i.提供从所述个体分离的组织样品或血浆样品，

ii.确定所述组织的LDLR的水平和/或所述血浆样品中的LDL-C的水平和/或PCSK9的水平，

iv.评估治疗方案，

v.向所述个体施用包含治疗有效量的如权利要求1至45任一项所述的化合物的组合物。

58.一种抑制LDLR的降解的方法，所述方法包括

施用如权利要求1至45任一项所述的化合物或如权利要求59至69任一项所述的药物组合物。

59.一种药物组合物，其包含至少一种如权利要求1至45任一项所述的化合物。

60.根据权利要求59的药物组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种他汀类药物或抗PCK9抗体，如结合于PCSK9的LDLR结合位点的抗体。

61.根据权利要求59至60任一项的药物组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种另外的化合物，如选自下组的化合物：罗德希珠单抗(lodelcizumab)、劳潘希珠单抗(ralpancizumab)、阿利库单抗(alirocumab),依伏库单抗(evolocumab)和bococizumab。

62.根据权利要求59至61任一项的药物组合物，其中所述组合物进一步包含以下的至少一个：

-抑制PCSK9与LDLR结合的抗体；

-他汀类药物；

-消胆胺；

-依折替米贝。

63.根据权利要求59至62任一项的药物组合物，其进一步包含一个或多个药学可接受的赋形剂。

64.根据权利要求59至63任一项的药物组合物，其中所述组合物的pH为pH 4-pH 10。

65.根据权利要求59至64任一项的药物组合物，其中所述组合物经配制用于口服施用。

66.根据权利要求59至65任一项的药物组合物，其中所述组合物经配制用于胃肠外施用。

67.根据权利要求59至64或66任一项的药物组合物，其中所述胃肠外施用是通过注射进行的。

68.根据权利要求59至64或66至67任一项的药物组合物，其中所述胃肠外施用是静脉内、肌内、脊柱内、腹膜内、皮下、推注或连续施用。

69.根据权利要求59至68任一项的药物组合物，其中所述化合物以0.1mg-1000mg每kg体重的每日剂量施用。

70.一种选择特异性识别并结合PCSK9(SEQ ID NO:1)的HSPG结合位点之内的表位的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

i.向哺乳动物施用PCSK9的多肽片段或编码PCSK9的多肽片段的多核苷酸，所述多肽片段包含由SEQ ID NO:1的氨基酸残基78至167组成的域的至少一个氨基酸残基，如由SEQ IDNO:1的氨基酸残基78至167组成的域的至少5个，如至少10个，如至少15个，如至少20个，如至少25个，如至少30个，如至少35个，如至少40个，如至少45个，如至少50个，如至少55个，如至少60个，如至少65个，如至少70个，如至少75个，如至少80个，如至少所有氨基酸；

ii.鉴定并选择识别所述多肽的抗体，和

71.根据权利要求70的方法，其中所述方法进一步包括选择能够顶替至少一个所述参考抗体的抗体的步骤。

72.根据权利要求70至71任一项的方法，其中确定所述选择的抗体是否能够在竞争性ELISA中顶替一个或多个参考抗体的步骤包括以下步骤：

i.提供包含被所述参考抗体识别的表位的PCSK9或其片段；和

iii.检测所述可检测的标记物在PCSK9处的存在；

由此检测所述测试抗体是否能够顶替所述参考抗体。

73.根据权利要求70至72任一项的方法，其中所述方法进一步包括测试所述抗体以确定所述抗体是否能够抑制LDLR降解和选择能够抑制LDLR降解的抗体。

74.一种选择能够抑制HSPG如肝素与PCSK9的结合的肽或肝素类似物的方法，所述方法包括以下步骤：

i.提供多种肽或肝素类似物；

ii.将所述多种肽或肝素类似物与细胞一起在培养基中温育，所述细胞源自表达LDLR的细胞系如源自肝细胞的细胞系；

iii.确定所述培养基中PCSK9的水平和/或所述细胞的LDLR水平；

iv.选择导致如步骤iii中所确定的最高水平的PCSK9和/或LDLR的肽或肝素类似物。

75.一种能够选择性结合如权利要求1至45任一项所述的化合物的化合物。

76.根据权利要求75的化合物，其中所述化合物是抗体。

77.一种用于产生如权利要求1至45任一项所述的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

ii.选择所述抗体，如果它能够结合于PCSK9(SEQ ID NO:1)；

78.根据权利要求77的方法，其中所述突变的PCSK9是在位置93,96,97,104,105,136,139,165或167处突变的。

79.根据权利要求77至78任一项的方法，其中所述突变的PCSK9是在位置93,96,97,104,105和139处突变的。

80.根据权利要求77至79任一项的方法，其中所述突变的PCSK9选自下组：突变体R93A,R96A,R97A,R104A,R105A,K136A,H139A,R165A或R167A。

81.根据权利要求77至80任一项的方法，其中所述突变的PCSK9为R93A,R96A,R97A,R104A,R105A,R39A突变体。

82.根据权利要求77至81任一项的方法，其中所述哺乳动物是啮齿动物。

83.根据权利要求77至82任一项的方法，其中所述方法进一步包括从所述哺乳动物分离产生抗体的细胞，从所述产生抗体的细胞制备杂交瘤细胞，培养所述杂交瘤和分离通过所述杂交瘤产生的抗体。

84.根据权利要求77至83任一项的方法，其中所述化合物是根据前述权利要求任一项的抗体，且其中所述方法包括用编码所述抗体的核酸构建体转染宿主细胞的步骤。

85.根据权利要求77至84任一项的方法，其中所述抗体通过重组细胞产生。

86.根据权利要求77至85任一项的方法，其中所述重组细胞是选自下组的微生物：细菌和真核的微生物。

87.根据权利要求77至86任一项的方法，其中所述微生物是选自下组的细菌：大肠杆菌(Escherichia coli)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。

88.根据权利要求77至87任一项的方法，其中所述微生物是选自下组的真核的微生物：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。

89.根据权利要求77至88任一项的方法，其中所述宿主细胞选自下组：植物细胞和动物细胞。

90.根据权利要求89的方法，其中所述植物细胞选自下组：拟南芥、豌豆、水稻、玉米、烟草、大麦或它们的种子。

91.根据权利要求89的方法，其中所述动物细胞源自选自下组的哺乳动物：中国仓鼠卵巢、小鼠和人。

92.根据权利要求89的方法，其中所述动物细胞源自昆虫或禽类细胞系。

93.根据权利要求77至92任一项的方法，其进一步包括鉴定并选择所述抗体的步骤。

94.一种用于在有需要的受试者中降低血浆LDL-C水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1至45任一项所述的化合物或如权利要求59至69任一项所述的药物组合物的步骤。

95.权利要求94的方法，其中所述受试者不响应于他汀类药物治疗。