TW201835107A - 促凝血抗體 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於改善的促凝血抗體，其包括能夠結合至凝血因子IX(FIX)或其活化型因子IXa(FIXa)及視需要地結合至因子X(FX)及其活化型因子Xa(FXa)及促進透過FIXa的FX活化的雙專一性抗體、結合其等之表位的抗體及用於治療患有凝血病變(諸如血友病A)的對象的方法及組成物。
Description
被命名為「160163TW01_ST25」的序列表係198千位元組且係於30-JAN-2018創建且係以引用方式併入本文中。
於患有凝血病變的患者中(諸如於患有血友病A及B的人類中)，凝血級聯之種種步驟由於(例如)功能性凝血因子之缺乏或存在不充足而變得功能異常。如此凝血級聯之一個部份之功能異常造成不足的凝血及潛在危及生命的出血、或內部器官(諸如關節)之損傷。
凝血因子VIII(FVIII)缺乏(一般被稱為血友病A)係一種全世界影響大約420,000人(其中大約105,000人目前被診斷出)的先天性出血病症。
患有血友病A的患者可接受凝血因子補充治療，諸如外源性FVIII。習用治療由補充治療所組成，其以出血發作之預防性治療或需要時治療之形式提供。自前用於患有嚴重血友病A的患者的治療係至多達三劑使用血漿衍生性FVIII或重組FVIII或其長效變體的預防性靜脈內注射/週。
然而，如此患者有發展出針對如此外源性因子的中和性抗體(所 謂的抑制子)而使得先前高效的治療變得無效的風險。具有抑制子的血友病A患者係為部分先天及部分後天的凝血病變之非限制性實例。已發展出針對FVIII的抑制子的患者無法使用習用補充治療治療且亦無法使用預防性治療或需要時治療治療。
此外，外源性凝血因子僅可靜脈內投予，其對於患者而言係相當不方便及不舒服的。例如，嬰兒及幼兒可能必須有手術插入至胸部靜脈中的靜脈內導管，以確保靜脈途徑。此使得其等有高度的發展出細菌感染的風險。
於出血個體中，凝血係於血管外TF暴露至血液中的經活化FVII(FVIIa)時由組織因子/因子VIIa(TF/FVIIa)複合物之形成起始。TF/FVIIa複合物形成導致凝血因子X(FX)至經活化凝血因子Xa(FXa)的活化，其(與經活化凝血因子V(FVa)一起)產生有限量的凝血酶，其隨即活化血液血小板。經活化血小板支持經活化因子VIII(FVIIIa)及經活化凝血因子IX(FIXa)構成的tenase複合物之組合。tenase複合物係FX活化之極高效催化物且於此第二步驟產生的FXa擔任FVa/FXa凝血酶元酶複合物中的活性蛋白酶，其負責最終凝血酶爆發。凝血酶切裂血纖維蛋白原以產生血纖維蛋白單體，其多聚化以形成封住滲漏血管及停止出血的血纖維蛋白網路。快速及廣泛的凝血酶爆發對於堅固且穩定的血纖維蛋白凝塊之形成係先決條件。
由FVIII活性減低或缺乏造成的FXa形成不足及凝血酶產生減低係血友病A患者中的出血體質之基本原因。
如提及的，FX至其酵素活性形式FXa的蛋白分解性轉化可藉由包含FIXa及其輔因子FVIIIa的內在FX活化性複合物達成。輔因子結合增加FIXa之酵素活性達約五個數量級且被認為係透過多個機制造成，如由Scheiflinger等人(2008)J Thromb Haemost,6：315-322略述的。特別地，已發現FVIIIa會穩定具有增加的針對FX的蛋白分解性活性的FIXa之構形(Kolkman JA,Mertens K(2000) Biochemistry,39：7398-7405、Zögg T,Brandstetter H(2009)Biol Chem,390：391-400)。
基於此觀察及抗體係能夠模擬各種各樣的蛋白質-蛋白質交互作用的萬用結合性蛋白質之認知，Scheiflinger等人執行針對特徵在於在磷脂表面及鈣之存在和天然輔因子FVIIIa之缺乏下增強透過FIXa的FX活化的能力的促效性抗FIXa抗體的篩選。基於5280個融合瘤上清液的篩選，發現88個會製造展現種種程度的FIXa促效活性的抗體，參照EP1220923 B1及EP1660536 B1。關於FVIII不足人類血漿中FX活化之動力學及刺激凝血酶產生的能力，EP1660536 B1一致地指出224F3為最高效的抗體(參照例如第0060及0062段)。
ACE910或Emicizumab(商標名Hemlibra®)係由Chugai Pharmaceutical開發的用於血友病A之治療的人類化雙專一性抗FIX(a)/抗FX(a)單株抗體。ACE910被設計成模擬FVIII輔因子功能(參見Sampei等人：(2013)PLoS One,8,e57479及WO2012067176)。
於血友病群體(特別)中及於患有凝血病變的對象(一般)中仍有許多未被滿足的醫療需求且本發明係關於能夠取代FVIII及因此可用於治療凝血病變(諸如血友病A)的改善的化合物。
本發明係關於化合物，其等於患有凝血病變的患者及特別是缺乏功能性FVIII的患者(諸如血友病A患者，包括具有抑制子的血友病A患者)中擔任凝血因子VIII(FVIII)的替代物。
因此，本發明之一個方面係於缺乏FVIII的患者中提高FXa之產生及因此部分或完全回復凝血。
於一個特殊的方面，本發明係關於促凝血抗體，其於缺乏FVIII 的患者(諸如血友病A患者)中擔任FVIII之替代物。
於一個如此方面，該抗體結合至FIXa並增加FIXa針對FX的酵素活性，視需要亦結合FX。
於一個方面，本發明係關於促凝血抗體，其結合FX，包括增加FIXa針對FX的酵素活性及結合FX的雙專一性促凝血抗體。
於一個方面，本發明係關於促凝血雙專一性抗體，其能夠結合至凝血FIX/FIXa及FX/FXa。
於一個方面，該抗體係人類或經人類化。
本發明之進一步方面係關於為促凝血抗體之部分的個別抗體或其抗原結合片段，諸如特殊抗FIX或抗FIXa抗體或其抗原結合片段。本發明之進一步方面係關於為促凝血抗體之部分的個別抗體或其抗原結合片段，諸如特殊抗FX或抗FXa抗體或其抗原結合片段。
本發明之進一步方面係關於如於本文中揭露的抗體或其中間物之製造。
本發明之進一步方面係涉及與促凝血抗體或其抗原結合片段(如於本文中描述的)競爭對於FIX/FIXa的結合的抗體。
本發明之進一步方面係涉及與抗體或其抗原結合片段(如於本文中描述的)競爭對於FX/FXa的結合的促凝血抗體。
本發明之又進一步方面係關於醫藥組成物，其包含如於本文中揭露的促凝血抗體，其經調配以用於遞送該抗體以用於預防及/或治療凝血病變。
本發明之進一步方面係針對於本文中揭露的用於預防及/或治療凝血病變、伴隨凝血病變的疾病、或由凝血病變造成的疾病的促凝血抗體。
本發明亦可解決基於例示性實施方式之揭露內容會是明顯的進一步問題。
SEQ ID NO：1係人類凝血因子IX之胺基酸序列。
SEQ ID NO：2係人類凝血因子X之胺基酸序列。
SEQ ID NO：3-188係於本文中描述的抗FIX及抗FX單株抗體(mAb)之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)之序列。表格中亦顯示對應單臂(OA)抗體的ID。CDR1-3序列係於圖1之方框中強調。
抗體縮寫、標的及對應VH及VL序列之SEQ ID NO之概述：
於患有凝血病變的對象中(諸如於患有血友病A的人類中)，凝血級聯由於功能性FVIII之缺乏或存在不足而變得功能異常。如此凝血級聯之一個部分之功能異常造成不足的凝血及潛在危及生命的出血、或內部器官(諸如關節)之損傷。本發明係關於化合物，其於患有凝血病變的患者且特別是缺乏功能性FVIII的患者(諸如血友病A患者，包括具有抑制子的血友病A患者)中擔 任凝血因子VIII(FVIII)之替代物。於一個方面，如此化合物係抗體。
特別地，本發明之發明人已意外地鑑認出以高效力及效能模擬FVIII輔因子活性的抗體。
於一個特殊的方面，本發明係關於促凝血抗體，其於缺乏功能性FVIII的患者(諸如血友病A患者)中擔任FVIII之替代物。
於一個如此方面，該等促凝血抗體結合至凝血因子IXa(FIXa)及增加其對凝血因子X(FX)的酵素活性，視需要亦結合FX。於一個如此方面，本發明之抗體係能夠結合至FIX/FIXa及FX的雙專一性抗體。
FIX係維生素K依賴性凝血因子，其結構類似於因子VII、凝血酶原、因子X、及蛋白質C。其循環性酶原形式係由分成包含以下者的四個明顯不同的域的415個胺基酸所組成：N端富γ-羧基麩胺酸(Gla)域、二個EGF域及C端類胰蛋白酶絲胺酸蛋白酶域。FIX於血漿中以單鏈酶原(SEQ ID NO：1)的形式循環。FIX之活化係藉由釋放活化胜肽(SEQ ID NO：1之殘基146至180)的於Arg145及Arg180的限制性蛋白水解發生。因此，經活化FIX(FIXa)係由SEQ ID NO：1之殘基1-145(輕鏈)及SEQ ID NO：1之殘基181-415(重鏈)構成。
循環性FIX分子因此包含FIX酶原及FIX之活化型，其等關於SEQ ID NO：1於本文中總體被稱為FIX及FIXa。
經活化因子IX被稱為因子IXa或FIXa。術語「FIX(SEQ ID NO：1)及/或其活化型FIXa」可亦可被稱為「FIX/FIXa」。此亦可被稱為「FIX(a)」。
FIXa係類胰蛋白酶絲胺酸蛋白酶，其藉由於凝血期間產生支持適當的凝血酶形成所需的因子Xa之大部分(作為tenase複合物之部分)而於止血扮演關鍵性角色。
FIX於本文中係以對應於人類FIX之Ala148對偶基因形式的SEQ ID NO：1代表(Anson等人EMBO J.19843：1053-1060；McGraw等人，Proc Natl Acad Sci USA.1985 82：2847-2851；Graham等人Am.J.Hum.Genet.1988 42：573-580)。於本發明中，FIX意欲涵蓋所有FIX之天然變體，諸如T148變體(Uniprot ID P00740)。
FX係維生素K依賴性凝血因子，其結構類似於因子VII、凝血酶原、FIX、及蛋白質C。人類FX酶原包含包含以下者的四個明顯不同的域：N端富伽瑪-羧基麩胺酸(Gla)域、二個EGF域、及C端類胰蛋白酶絲胺酸蛋白酶域。FX於血漿中以包括SEQ ID NO：2之殘基1-139(輕鏈)及SEQ ID NO：2之殘基143-448(重鏈)的二鏈酶原的形式循環。FX之活化係藉由造成活化胜肽(Aa143-194)之釋放的的於Arg194的限制性蛋白水解發生。因此，經活化FX(FIXa)係由SEQ ID NO：2之殘基1-139(輕鏈)及SEQ ID NO：2之殘基195-448(經活化重鏈)構成。循環的FX分子因此包含FX酶原及FX之活化型，其等關於SEQ ID NO：2於本文中分別被稱為FX及FXa。於本發明中，FX意欲涵蓋所有FX之天然變體。術語「FX(SEQ ID NO：2)及/或其活化型Fxa」亦可被稱為「FX/FXa」。此亦可被稱為「FX(a)」。
術語「抗體」於本文中係論及衍生自免疫球蛋白序列的蛋白質，其能夠結合至抗原或其部分。術語抗體包括(但不限於)任何類型(或同型)(即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及/或IgY)的全長抗體。術語抗體包括(但不限於)為二價的抗體，諸如雙專一性抗體。
天然全長抗體包含至少四個多肽鏈：二個重鏈(HC)及二個輕鏈(LC)其等係藉由雙硫鍵連接。於一些例子中，天然抗體包含少於四個鏈，如在於軟骨魚綱中找到的IgNAR之例子中。一類醫藥上特別關注的免疫球蛋白為IgG。於人類中，IgG類型基於其等之重鏈恆定區序列可被分成四個次類型IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。輕鏈基於其等之序列組成之不同可被分成二個類型，卡帕及拉目達鏈。IgG分子係由二個重鏈(藉由二或多個雙硫鍵彼此連接)及二個輕鏈(各自藉由雙硫鍵接附至重鏈)構成。IgG重鏈可包含重鏈可變域(VH)及至多達三個重鏈恆定(CH)域：CH1、CH2及CH3。輕鏈可包含輕鏈可變域(VL)及輕鏈恆定域(CL)。VH及VL區域可被進一步細分成稱為互補性決定區(CDR)或高度變異區(HvR)的高度變異之區域，其等間點綴著稱為構架區(FR)的較保守性的區域。VH及VL域典型係由三個CDR及四個FR構成，其等自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。含有高度變異區(CDR)的重鏈可變域及輕鏈可變域形成能夠與抗原交互作用的結構，而抗體之恆定區可介導免疫球蛋白至宿主組織或因子(包括(但不限於)種種免疫系統之細胞(效應細胞)、Fc受體及經典補體系統之C1複合物之第一組份(C1q))的結合。
本發明之抗體可係單株抗體(mAb)，意謂其等代表一組如自單一B細胞或由B細胞之無性繁殖系族群表現的獨特重鏈可變域序列及輕鏈可變域序列。本發明之抗體可使用種種所屬技術領域中具有通常知識者已知的方法製造及純化。例如，抗體可自融合瘤細胞製造。抗體可藉由B細胞擴增製造。抗體或其片段可於哺乳動物或微生物表現系統中重組表現，或藉由試管內轉譯表現。抗體或其片段亦可以與細胞表面結合的分子的形式藉由例如噬菌體展示、細菌展示、酵母菌展示、哺乳動物細胞展示或核糖體或mRNA展示的方法重組表現。
本發明之抗體可經分離。術語「經分離的抗體」係論及抗體，該抗體已自該抗體在其中被製造的環境中的其他(另一)組份分離及/或回收及/或已自該抗體在其中被製造的環境中存在的組份之混合物純化。
抗體之某些抗原結合片段於本發明之前後文中可係合適的，因為咸已顯示抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。術語抗體之「抗原結合片段」係論及抗體之一或多個片段，其保留專一性結合至或辨認抗原(諸如FIX/FIXa、FX/FXa或另一標的分子，如於本文中描述的)的能力。抗原結合片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab2、Fab'2、Fv(典型為抗體之單一臂之VL及VH域之組合)、單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人Science 1988；242：423-426；及Huston等人PNAS 1988；85：5879-5883)、dsFv、Fd(典型為VH及CH1域)、包含單一VH及單一VL域二者的單價分子；微抗體(minibody)、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)、四鏈抗體(tetrabody)、及卡帕體(Kappa body)(參見(例如)Ill等人(1997)Protein Eng 10：949-57)；以及一或多個經分離的CDR或功能性互補位，其中該經分離的CDR或抗原結合殘基或多肽可被聯繫或連結在一起以形成功能性抗體片段。此等抗體片段可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的習用技術獲得，且可篩選該等片段來以與完整抗體相同的方式利用。
抗體之「Fab片段」(包括「Fab」及「Fab’2」片段)可藉由以下者自抗體衍生：於連接抗體之重鏈的鉸鏈半胱胺酸殘基之N端側或C端側(分別地)上的鉸鏈區的重鏈之切裂。「Fab」片段包括輕鏈之可變及恆定域及重鏈之可變域及CH1域。「Fab'2「片段包含一對「Fab'」片段，其等一般係藉由其等之鉸鏈半胱胺酸共價地連結。Fab'形式上係藉由Fab'2中連接重鏈的鉸鏈雙硫鍵之切裂自Fab'2片段衍生。除了抗體片段之二硫鍵聯以外的化學偶合於所屬技術領域中亦係已知的。Fab片段保留親本抗體結合至其抗原的能力(可能以較低的親和 力)。Fab'2片段能夠二價地結合，而Fab及Fab’片段僅可單價地結合。一般地，Fab片段缺乏恆定CH2及CH3域，即Fc部分，於該處與Fc受體及C1q的交互作用可發生。因此，Fab片段一般缺乏效應功能。Fab片段可藉由所屬技術領域中已知的方法製造，其係藉由抗體之酵素性切裂，例如使用木瓜酵素以獲得Fab或使用胃蛋白酶以獲得Fab'2，包括Fab、Fab'、Fab'2的Fab片段可使用對所屬技術領域中具有通常知識者而言係廣為人知的技術重組製造。
「Fv」(可變的片段)片段係抗體片段，其含有完整的抗原辨識及結合位置，且一般包含(例如)於單鏈可變域片段(scFv)中連結(本質上可係共價的)的一個重鏈可變域及一個輕鏈可變域。就是於此組態各可變域之三個高度變異區交互作用以界定VH-VL二聚體之表面上的抗原結合位置。一起，六個高度變異區或其等之次組賦予抗體抗原結合專一性。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體包含抗體之VH及VL域，其中此等域係以單一多肽鏈的形式存在。一般地，Fv多肽進一步於VH及VL域包含使scFv可形成用於抗原結合的所欲結構的多肽連結子。關於scFv回顧，參見Pluckthun,1994，於：The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg及Moore eds.Springer-Verlag，紐約，pp.269-315。
「單鏈Fab」或「scFab」抗體包含抗體之VH、CH1、VL及CL域，其中此等域係以單一多肽鏈的形式存在。一般地，該Fab多肽於VH及CL或VL及CH1域間進一步包含使scFab可形成用於抗原結合的所欲結構的多肽連結子(Koerber等人(2015)J Mol Biol.427：576-86)。
術語「雙鏈抗體」係論及具有二個抗原結合位置的小型抗體片段，其中片段於相同的多肽鏈(VH及VL)中的包含連接至輕鏈可變域(VL)的重鏈可變域(VH)。藉由使用對在相同鏈上允許二個可變域間的配對而言過短的連結子，該等可變域被強迫與另一鏈之互補域配對，形成二個抗原結合位置。
表現方式「線性抗體」係論及如於Zapata等人(1995)Protein Eng.8：1057-1062中描述的抗體。簡言之，此等抗體含有一對串聯的Fd節段(VH-CH1-VH-CH1)，其等(與互補的輕鏈多肽一起)形成一對抗原結合區域。線性抗體可係雙專一性或單專一性。
抗體片段可使用習用重組或蛋白質工程改造技術獲得且可針對以與完整抗體相同的方式與FIX及其活化型、FX結合或另一種功能來篩選該等片段。
本發明之抗體片段可藉由截短製作，例如藉由自多肽之N及/或C端移除一或多個胺基酸。片段亦可藉由一或多個內部缺失產生。
本發明之抗體可係(或可包含)於本文中揭露的抗體或抗體之任一者之變體之片段。本發明之抗體可係(或可包含)此等抗體或其等之變體之一者之抗原結合部分。例如，本發明之抗體可係此等抗體或其等之變體之一者之Fab片段，或其可係衍生自此等抗體或其等之變體之一者的單鏈抗體。此外，本發明之抗體可係全長抗體及其片段之組合。
術語「單專一性」抗體用於本文中係論及能夠結合至一個特殊表位的抗體(包括但不限於二價抗體)。
術語「雙專一性」抗體用於本文中係論及能夠結合至二個不同抗原或相同抗原上的二個不同表位的抗體。
術語「三專一性」抗體用於本文中係論及能夠結合至三個不同抗原或相同抗原上的三個不同表位或存在於二個不同抗原上的三個不同表位的抗體。
術語「多專一性」抗體用於本文中係論及能夠結合至二或多個不同抗原或相同抗原上的二或多個不同表位的抗體。多專一性抗體因此包含雙及三專一性抗體。
呈全長IgG形式的雙專一性抗體可藉由融合二個個別的融合瘤以形成雜合四源雜交瘤(quadroma)產生，該四源雜交瘤製造包括雙專一性雜二聚化抗體之部分的抗體之混合物(Chelius D.等人；MAbs.2010 May-Jun；2(3)：309-319)。雙專一性雜二聚化抗體可供選擇地藉由使用重組技術製造。雜二聚化亦可藉由工程改造Fc區之二聚化介面以促進雜二聚化來達成。此之一個實例係所謂的孔中球(knob-in-hole)突變，其中於一個Fc中導入被相對的Fc上的小型立體側鏈(孔)配對的大型立體側鏈(球)而藉此創造促進雜二聚化的立體互補性。其他用於經工程改造雜二聚化Fc介面的方法係靜電互補性、與非IgG雜二聚化域融合或利用人類IgG4之天然Fab-臂交換現象以控制雜二聚化。經雜二聚化雙專一性抗體之實例係於文獻(例如Klein C、等人；MAbs.2012 Nov-Dec；4(6)：653-663)中充分描述。對雜二聚體抗體中輕鏈必須特別注意。LC及HC之正確配對可藉由使用共同輕鏈完成。再次地，可使用LC/HC介面之工程改造以促進雜二聚化或輕鏈交叉工程改造，如於CrossMab中者。亦可使用自二個含有適當突變的個別IgG的抗體在溫和還原條件下的試管內重新組合以產生雙專一性抗體(例如Labrijn等人，PNAS,110,5145-5150(2013))。此外，報導了天然Fab-臂交換方法確保正確輕鏈修剪。
基於多專一性抗體的分子亦可以組合IgG之天然組件的融合蛋白質之形式重組地表現以形成如於文獻中描述的多專一性及多價抗體衍生物。融合抗體之實例係DVD-Ig、IgG-scFV、雙鏈抗體、DART、等等。可於融合蛋白質中併入專一性偵測或純化標籤、半生期延長部分或其他組份。亦可於融合蛋白質中併入其他非IgG形式。無論LC修剪方法學為何，基於Fc雜二聚化的雙專一性全長抗體一般被稱為不對稱IgG。
一般地，雙專一性抗體可以各種各樣的分子形式製造，如由Brinkmann等人(Brinkmann等人The making of bispeeific antibodies.Mabs 9, 182-212(2017))回顧的。
基於多專一性抗體的分子亦可如於文獻中描述地藉由化學綴合或偶合個別的全長IgG或偶合IgG之片段以形成多專一性及多價抗體衍生物來製造。實例為經化學偶合的Fab片段、IgG-二聚體、等等。可於綴合蛋白質中併入專一性偵測或純化標籤、半生期延長分子或其他組份。亦可於融合蛋白質中併入其他非IgG多肽。多專一性分子亦可藉由組合重組及化學方法(包括該等以上描述者)製造。
於一個方面，本發明之抗體係嵌合抗體、人類抗體或人類化抗體。如此抗體可藉由使用(例如)所屬技術領域中已知的合適抗體展示或致免疫平台或其他合適的平台或方法來產生。術語「人類抗體」用於本文中係意欲包括具有可變域的抗體，該等可變域中構架區之至少一部份及/或CDR區之至少一部分係衍生自人類生殖細胞系免疫球蛋白序列。例如，人類抗體可具有其中構架及CDR區之二者皆衍生自人類生殖細胞系免疫球蛋白序列的可變域。此外，若抗體含有恆定區，該恆定區或其部分亦衍生自人類生殖細胞系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包括不被人類生殖細胞系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，藉由試管內隨機或定點突變誘發或藉由活體內體突變導入的突變)。
如此人類抗體可係人類單株抗體。如此人類單株抗體可藉由包括與永生化細胞融合的自基因轉植非人類動物(例如基因轉植小鼠)獲得且具有包含全套人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因節段的基因組的B細胞的融合瘤製造。
人類抗體可自基於人類生殖系序列之選擇建立的序列文庫分離，進一步以天然及合成序列多樣性多樣化。
人類抗體可藉由試管內致免疫人類淋巴球接著以Epstein-Barr病毒轉形該等淋巴球來製備。
人類抗體可藉由所屬技術領域中已知的重組方法製造。
術語「人類抗體衍生物」係論及任何人類抗體之修飾形式，諸如抗體及另一藥劑或抗體的綴合物。
術語「人類化抗體」用於本文中係論及含有衍生自非人類免疫球蛋白的序列(CDR區或其部分)的人類/非人類抗體。人類化抗體因此係人類免疫球蛋白(受者抗體)，其中來自受者之至少高度變異區的殘基係以來自源自非人類物種(諸如來自小鼠、大鼠、兔或非人類靈長動物)的抗體(供者抗體)(其具有所欲的專一性、親和力、序列組成及功能性)之高度變異區的殘基置換。於一些實例中，人類免疫球蛋白之構架(FR)殘基係以相對應的非人類殘基置換。如此修飾之實例係導入一或多個所謂的回復突變，其等典型係衍生自供者抗體的胺基酸殘基。抗體之人類化可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的重組技術實現(參見(例如)Antibody Engineering,Methods in Molecular Biology,vol.248,Benny K.Lo編輯)。用於輕鏈可變域及重鏈可變域兩者的合適人類受者構架可藉由(例如)序列或結構同源性鑑認。供選擇地，可使用固定的受者構架(例如基於結構、生物物理學及生物化學特性之知識)。受者構架可係衍生自生殖系或衍生自成熟抗體序列。來自供者抗體的CDR區可藉由CDR嫁接轉移。經嫁接CDR的人類化抗體可進一步藉由鑑認於該處來自供者抗體的胺基酸殘基之再導入(回復突變)對人類化抗體之特性有有益的影響的關鍵性構架位置針對例如親和力、功能性及生物物理學特性作優化。除了衍生自供者抗體的回復突變外，人類化抗體可藉由於CDR或構架區中的生殖系殘基之導入、免疫性表位之消除、定點突變誘發、親和力成熟、等等來工程改造。
此外，人類化抗體可包含未於受者抗體中或於供者抗體中找到的殘基。作此等修飾以進一步完善抗體功能。一般，人類化抗體會包含至少一個(典型係二個)可變域，其中CDR區之所有或實質上所有者對應於該等非人類 免疫球蛋白者及其中FR殘基之所有或實質上所有者係該等人類免疫球蛋白序列者。視需要地，人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)(典型係人類免疫球蛋白者)之至少一部分。
術語「人類化抗體衍生物」係論及人類化抗體之任何修飾形式，諸如該抗體及另一化學藥劑或抗體的綴合物。
術語「嵌合抗體」用於本文中係論及包含衍生自二或多個物種的抗體之部分的抗體。例如，編碼如此抗體的基因包含源自二個不同物種的編碼可變域的基因及編碼恆定域的基因。例如，可將編碼小鼠單株抗體之可變域的基因連接至編碼源自人類的抗體之恆定域的基因。
抗體之可結晶片段區(「Fc區」/」Fc域」)係抗體之C端區域，其包含鉸鏈域及恆定CH2及CH3域。Fc域可與稱為Fc受體的細胞表面受體以及補體系統之一些蛋白質交互作用。Fc區使抗體能夠與免疫系統交互作用。於本發明之一個方面，可工程改造抗體以使之在Fc區內包括修飾，典型以改變其功能特性之一或多者，諸如血清半生期、補體結合、Fc-受體結合、蛋白質穩定性及/或抗原依賴性細胞性細胞毒性、至使之缺乏其等、以及其他。此外，本發明之抗體可被化學修飾(例如可將一或多個化學部分接附至該抗體)或被修飾以改變其糖化(再次地)以改變該抗體之一或多個功能特性。IgG1抗體可帶有包含分別會造成以下者的以下突變之一或多者及可能所有者的經修飾的Fc域：對某些Fc-伽瑪受體的親和力減少(L234A、L235E、及G237A)及C1q介導性補體結合減少(A330S及P331S)(殘基編號根據EU索引(EU index))。供選擇地，可使用其他胺基酸取代及其等之組合及與以上提及的所屬技術領域中已知導致改變的(減少的或增加的)Fc-伽瑪受體結合者的組合。
本發明之抗體可包含經修飾的Fc-區域，其係藉由所屬技術領域中已知的方法工程改造以具有改變的對於新生兒Fc受體(FcRn)的親和力。增 加的與FcRn的結合可提供進一步的半生期延長可藉由例如導入YTE-突變(M252Y、S254T、T256E(Medimune)，J Biol Chem,2006,281：23514-23524)或LS-突變(M428L、N434S(Xencor)，Nat Biotechnol,2010 28：157-159)(所有皆根據EU索引編號)來獲得。其他實例係T250Q/M428L變體(J Immunol.2006,176(1)：346-56)及N434H變體(Clinical Pharmacology & Therapeutics(2011)89(2)：283-290。
本發明之抗體之同型可係IgG，諸如IgG1，諸如IgG2，諸如IgG4。若所欲，可藉由已知的技術「轉換」抗體之類型。例如，可將原本以IgM分子的形式製造的抗體類型轉換成IgG抗體。亦可使用類型轉換技術以使IgG次型轉變成另一種，例如：自IgG1至IgG2或IgG4；自IgG2至IgG1或IgG4；至自IgG4至IgG1或IgG2。亦可藉由組合來自不同的IgG次型的區域來執行抗體之工程改造以產生恆定區嵌合分子。
於一個實施方式中，修飾抗體之鉸鏈區以使得鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數目被改變(例如增加至減少)。此方法係例如於Bodmer等人之U.S.專利案No.5,677,425中進一步描述。
可修飾恆定區以穩定抗體，例如以減少二價抗體分離成半抗體的風險。例如，於lgG4恆定區中，可將殘基S228(根據EU編號索引且根據Kabat係S241)突變成脯胺酸(P)殘基以穩定於鉸鏈的重鏈間雙硫橋形成(參見(例如)Angal等人Mol Immunol.1993；30：105-8)。
抗體或其片段可於其等之互補性決定區(CDR)方面界定。術語「互補性決定區」或「高度變異區」當於本文中使用時係論及涉及抗原結合的胺基酸殘基座落於其中的抗體之區域。高度變異性之區域或CDR可被鑑認為於抗體可變域之胺基酸排比中具有最高可變性的區域。可將資料庫用於CDR鑑認，諸如Kabat資料庫，該等CDR例如被鑑認成包含輕鏈可變域之胺基酸殘基 24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)及重鏈可變域中的胺基酸殘基31-35(H1)，50-65(H2)及95-102(H3)；(Kabat等人1991；Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國衛生與人群服務部，NIH出版No.91-3242)供選擇地，CDR可被定義為該等來自「高度變異環」的殘基(輕鏈可變域中的殘基26-33(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)及重鏈可變域中的殘基26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)；Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.1987；196：901-917)。典型地，此區域中的胺基酸殘基之編號係藉由Kabat等人如上者中描述的方法執行。諸如「Kabat位置」、「Kabat殘基」、及「根據Kabat」的語詞於本文中係論及此用於重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用Kabat編號系統，胜肽之實際線性胺基酸序列可含有對應於可變域之構架(FR)或CDR之縮短的較少的胺基酸或至其之插入的額外的胺基酸。例如，重鏈可變域可包括位於CDR H2之殘基52之後的胺基酸插入(殘基52a、52b及52c，根據Kabat)及位於重鏈FR殘基82之後的插入的殘基(例如殘基82a、82b、及82c、等等，根據Kabat)。可藉由於抗體之序列之同源區域與經「標準」Kabat編號的序列作排比來決定給定抗體之殘基之Kabat編號。
術語「構架區」或「FR」殘基係論及該等非位於CDR(如於本文中界定的)內的VH或VL胺基酸殘基。
本發明之抗體可包含來自於本文中揭露的特殊抗體之一或多者的CDR區。
術語「促凝血抗體」係論及增強起始、加速及/或促進凝血之過程的抗體。
術語「促凝血活性」係論及化合物(諸如抗體)增強起始、加速及/或促進凝血之過程的能力。
術語「抗原」(Ag)係論及用於致免疫免疫勝任脊椎動物以製造 辨識該Ag的抗體(Ab)的分子實體。於本文中，Ag之定義更寬且一般意欲包括被該Ab專一性辨識的標的分子，因此包括用於供產生該Ab之用的致免疫方法或其他方法(例如噬菌體展示)的分子之片段或模擬物。
術語「表位」用於本文中係於「抗原結合多肽」(諸如抗體(Ab))及其相對應的抗原(Ag)間的分子交互作用之前後文中定義。一般地，「表位」係論及Ag上Ab結合至其的地區或區域，即與該Ab物理接觸的地區或區域。物理接觸可針對該Ab及Ag分子中的原子使用種種基準定義(例如2-6Å的距離截止，諸如3Å，諸如3.5Å諸如4Å，諸如4.5Å，諸如5Å；或溶劑可及性)。
FIX/FIXa及FX/FXa可包含一些不同的表位，其可包括(但不限於)(1)線性胜肽表位(2)構形性表位，其等由一或多個在成熟FIX/FIXa或FX/FXa構形中彼此位置相近的不連續胺基酸所組成；及(3)(完全或部分)由共價接附至FIX/FIXa或FX/FXa的分子結構(諸如碳水化合物基團)所組成的表位。
給定抗體(Ab)/抗原(Ag)對之表位可使用各種各樣的實驗及電腦表位定位方法以不同詳細程度描述和定特徵。實驗方法包括突變誘發、X射線結晶學、核磁共振(NMR)分光術、氫氘交換質譜術(HDX-MS)及種種競爭性結合方法；所屬技術領域中已知的方法。由於各個方法依賴獨特的原理，表位之描述與其以何種方法測定密切相關。因此，取決於所利用的表位定位方法，給定Ab/Ag對之表位可被不同地描述。
於藉由Ab(例如Fab片段)及其Ag間的複合物之空間坐標定義的衍生自X射線的結晶結構之前後文中，術語表位於本文中(除非另加具體指出或與前後文矛盾)被具體定義成特徵在於在離該Ab中的重原子(即非氫原子)3.5Å的距離內具有重原子的FIX/FIXa或FX殘基。
若其等含有相同組的胺基酸殘基，則於胺基酸水平描述的表位(例如自X射線結構測定者)被稱為完全相同。若表位共有至少一個胺基酸殘 基，則該等表位被稱為重疊。若表位不共有胺基酸殘基，則該等表位被稱為分開的(獨特的)。
術語「互補位」之定義係藉由倒轉觀點自「表位」之以上定義衍生。因此，術語「互補位」係論及該Ab上Ag與之結合的地區或區域，即其以之與該Ag作物理接觸。
於藉由Ab(例如Fab片段)及其Ag間的複合物之空間坐標定義的衍生自X射線的結晶結構之前後文中，術語互補位於本文中(除非另加具體指出或與前後文矛盾)具體定義成特徵在於在離FIX/FIXa或FX中的重原子(即非氫原子)3.5Å的距離內具有重原子的Ab殘基。
給定抗體(Ab)/抗原(Ag)對之表位及互補位可藉由例行方法鑑認。例如，表位之大致位置可藉由評估抗體結合至FIX/FIXa或FX之不同片段或變體的能力來測定。FIX/FIXa或FX內與抗體接觸的特殊胺基酸(表位)及抗體內與FIX/FIXa或FX接觸的特殊胺基酸(互補位)亦可使用例行方法測定。例如，可組合抗體及標的分子及可結晶Ab：Ag複合物。可測定複合物之結晶結構及將其用於鑑認該抗體及其標的間的交互作用之特別位置。
抗原上的表位可包含一或多個熱點殘基，即對於與同源抗體交互作用而言特別重要且其中由該熱點殘基之側鏈介導的交互作用對抗體/抗原交互作用之結合能有顯著貢獻的殘基(Peng等人(2014)PNAS 111,E2656-E2665)。熱點殘基可藉由針對與同源抗體之結合測試抗原(此處為FIX/FIXa及FX)之變體(其中單一表位殘基已由例如丙胺酸取代)來鑑認。若以丙胺酸取代表位殘基對於與該抗體之結合有強烈影響，則該表位殘基被認為係熱點殘基，且因此對該抗體與其抗原之結合而言特別重要性。
結合至相同抗原的抗體可在其等同時與其等之共同抗原結合的能力的方面描述特徵及可接受「競爭性結合」/「分倉(binning)」。於此前後文 中，術語「分倉」係論及分組結合至相同抗原的抗體的方法。抗體之「分倉」可基於二個抗體於基於標準技術的分析中與其等之共同抗原的競爭性結合。
抗體之「倉(bin)」係使用參考抗體界定。若第二抗體無法與參考抗體同時結合至一抗原，該第二抗體被稱為與參考抗體屬於相同的「倉」。於此例子中，參考抗體及該第二抗體競爭性地結合一抗原之相同部分且被稱為「競爭性抗體」。若第二抗體能夠與參考抗體同時結合至一抗原，該第二抗體被稱為屬於分開的「倉」。於此例子中，參考抗體及該第二抗體不競爭性地結合一抗原之相同部分且被稱為「非競爭性抗體」。
抗體「分倉」不提供關於表位的直接資訊。
競爭性抗體(即屬於相同「倉」的抗體)可具有完全相同的表位、重疊的表位或甚至分開的表位。後者係以下者之例子：參考抗體結合至其抗原上的表位，該表位佔有該第二抗體接觸其抗原上的表位所需的空間(「位阻」)。非競爭性抗體一般具有分開的表位。因此，於一些實施方式中，本發明之抗體會與於本文中具體揭露的抗體之至少一者結合至相同的表位。
用於測定一抗體是否與於本文中揭露的抗FIX/FIXa抗體或抗X抗體競爭結合的競爭分析係所屬技術領域中已知的。例示性競爭分析包括免疫分析(例如ELISA分析、RIA分析)、表面電漿子共振分析(例如使用BIAcoreTM儀器)、生物膜干涉法(ForteBio®)及流式細胞測量術。
典型地，競爭分析涉及使用結合至固體表面或在細胞表面上表現的抗原、測試FIX結合抗體或測試FIXa結合抗體及參考抗體。參考抗體係經標記且測試抗體係未經標記。競爭性抑制係藉由測定於測試抗體之存在下結合至該固體表面或細胞的經標記參考抗體的量來測量。通常，測試抗體係以過量存在(例如1、5、10、20、100、1000、10000或100000倍)。於競爭分析中被鑑認為競爭性的抗體(即競爭性抗體)包括與參考抗體結合至相同表位或重疊表位的 抗體、及結合至與參考抗體所結合的表位近到可使位阻發生的鄰近表位的抗體。
於例示性競爭分析中，參考抗FIX抗體或抗FIXa抗體係使用商業上可得的試劑生物素化。經生物素化參考抗體係與測試抗體或未經標記的參考抗體(自我競爭對照組)之連續稀釋物混合，得到種種測試抗體(或未經標記的參考抗體)比經標記參考抗體的莫耳比率(例如1、5、10、20,100、1000、10000或100000倍)之混合物。將該抗體混合物加至經FIX或FIXa多肽塗覆的ELISA盤。接著洗滌盤子，及將辣根過氧化酶(HRP)-鏈黴抗生物素蛋白加至盤子作為偵測試劑。結合至標的抗原的經標記參考抗體之量係於添加所屬技術領域中已知的發色受質(例如TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)或ABTS(2,2"-次偶氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯))之後偵測。使用分光計(例如SpectraMax® M2分光計(Molecular Devices))作光學密度讀數(OD單位)。對應於百分之零的抑制的反應(OD單位)係自無任何競爭性抗體的槽孔測定。對應於100%抑制的反應(OD單位)(即分析背景)係自無任何經標記參考抗體或測試抗體的槽孔測定。藉由各個濃度的測試抗體(或未經標記的參考抗體)的經標記參考抗體至FIX或FIXa的百分比抑制係如下計算：%抑制=(1-(OD單位-100%抑制)/(0%抑制-100%抑制))* 100。
所屬技術領域中具有通常知識者會瞭解可執行類似的分析以測定二或多個抗FX/FXa抗體是否共有結合區(倉)及/或競爭性結合抗原。所屬技術領域中具有通常知識者亦會領會到競爭分析可使用種種所屬技術領域中已知的偵測系統執行。
若過量的測試抗體與參考抗體之一(例如1、5、10、20、100、1000、10000或100000倍)抑制另一抗體之結合(例如達至少50%、75%、90%、95%或99%，如於競爭性結合分析中測量的)，則該測試抗體與參考抗體競爭對於抗原的結合。
除非另加指出，競爭係使用競爭性ELISA分析測定，如以上描述的。
術語「結合親和力」於本文中係用作為二個分子(例如抗體(或其片段)及抗原)間的非共價交互作用之強度之度量。術語「結合親和力」係用於描述單價交互作用。
二個分子(例如抗體(或其片段)及抗原)間透過單價交互作用的結合親和力可藉由測定平衡解離常數(KD)來定量。KD可藉由測量複合物形成及解離之動力學來測定，例如藉由表面電漿子共振(SPR)方法。對應於單價複合物之締合及解離的速率常數分別被稱為締合速率常數ka(或kon)及解離速率常數kd(或koff)。KD透過方程式KD=kd/ka而與ka及kd有關。
按以上定義，與不同分子交互作用有關的結合親和力(諸如不同抗體對於給定抗原的結合親和力之比較)可藉由比較個別抗體/抗原複合物之KD值而比較。
解離常數之值可藉由廣為人知的方法直接測定。用於評估配體(諸如抗體)對標的的結合能力的標準分析係所屬技術領域中已知的且包括(例如)ELISA、西方印漬、RIA、及流式細胞測量術分析。抗體之結合動力學及結合親和力亦可藉由所屬技術領域中已知的標準分析(諸如SPR)評估。然而，較佳地，可使用等溫滴定熱量測定法(ITC)以測量抗體/標的交互作用之親和力以及以獲得交互作用之熱力學參數。
可實施競爭性結合分析，其中抗體至標的的結合係與該標的之另一配體(諸如另一抗體)與該標的的結合比較。
本發明之抗體可具有以下的對其標的的KD：1 x 10-4M或更低、1 x 10-5M或更低、1 x 10-6M或更低、1 x 10-7M或更低、1 x 10-8M或更低、或1 x 10-9M或更低、或1 x 10-10M或更低、1 x 10-11M或更低、1 x 10-12M或更低、1 x 10-13M 或更低或1 x 10-14M或更低。
本發明之抗體之KD可低於100μM，諸如低於10μM，諸如低於1μM，諸如低於0.9μM，諸如低於0.8μM，諸如低於0.7μM，諸如低於0.6μM，諸如低於0.5μM，諸如低於0.4μM，諸如低於0.3μM，諸如低於0.2μM，諸如低於0.1μM。
於一個如此實施方式中，該抗體係雙專一性抗體，其包含具有以下者的對FX的KD的抗FX臂：低於100μM，諸如低於10μM，諸如低於1μM，諸如低於0.9μM，諸如低於0.8μM，諸如低於0.7μM，諸如低於0.6μM，諸如低於0.5μM，諸如低於0.4μM，諸如低於0.3μM，諸如低於0.2μM，諸如低於0.1μM，諸如低於0.09μM，諸如低於0.08μM，諸如低於0.07μM，諸如低於0.06μM，諸如低於0.05μM，諸如低於0.04μM，諸如低於0.03μM，諸如低於0.02μM，諸如低於0.01μM，諸如低於9nM，諸如低於8nM，諸如低於7nM，諸如低於6nM，諸如低於5nM，諸如低於4nM，諸如低於3nM，諸如低於2nM，諸如低於1nM諸如低於0.5nM。
如於本文中描述的抗體及其抗體片段可與所屬技術領域中已知的其他抗體及抗體片段組合，以創造雙專一性、三專一性或多專一性抗體分子。模擬FVIII輔因子功能的化合物先前已使用其他FIX/IXa及FX/Xa結合域創造，該等FIX/IXa及FX/Xa結合域各可潛在地取代於本文中描述的FIX/IXa及/或FX/Xa結合域。因此，清楚地，本發明之FIX/IXa及FX/Xa結合域係以個別的分子以及作為包含至少一個FIX/IXa及/或FX/Xa結合域的雙、三或多專一性抗體之部分的「中間物」的形式被分開地關注
包括雙、三及多專一性抗體的促凝血抗體之活性可藉由所屬技術領域中已知的方法測定。標準分析包括全血凝血酶產生測試(TGT)、藉由血栓彈力圖(thrombelastography)的凝結時間之測量(TEG)及FXa產生分析。
術語「一致性」如所屬技術領域中已知的係論及二或多個多肽之序列間的關係，如藉由比較該等序列而測定的。於所屬技術領域中，「一致性」亦意謂多肽間的序列相關性之程度，如藉由二或多個胺基酸殘基串間的吻合之數目測定的。「一致性」測量二或多個序列之較小者間完全相同的吻合之百分比，而空隙排比(若有)係藉由特殊數學模型或電腦程式(即「演算法」)處理。相關多肽之一致性可藉由已知的方法輕易地計算。如此方法包括(但不限於)該等於以下者中描述者：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press，紐約，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press，紐約，1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.,eds.,Humana Press，紐澤西，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,eds.,M.Stockton Press，紐約，1991；及Carillo等人SIAM J.Applied Math.1988；48：1073
較佳的用於測定一致性的方法被設計成給出所測試序列間的最大吻合。測定一致性的方法係於公眾可得的電腦程式中描述。較佳的用於測定二個序列間的一致性的方法的電腦程式包括GCG套裝軟體，包括GAP(Devereux等人Nucl.Acid.Res.1984；12：387)；Genetics Computer Group，威斯康辛大學，麥迪遜，Wis.)、BLASTP、BLASTN、及FASTA(Altschul等人J.Mol.Biol.1990；215：403-410)。BLASTX軟體係公眾可得自國家生物技術資訊中心(NCBI)及其他來源(BLAST手冊，Altschul等人NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.20894；Altschul等人，如上)。亦可使用廣為人知的Smith Waterman演算法以測定一致性。
例如，使用電腦演算法GAP(Genetics Computer Group，威斯康 辛大學，麥迪遜，Wis.)，欲測定百分比序列一致性的二個多肽係針對其等分別之胺基酸之最佳的吻合作排比(「吻合的跨度」，如由該演算法測定的)。空隙開放罰分(其被計算為3乘以平均對角線；「平均對角線」係所使用的比較矩陣之對角線之平均；「-對角線」係由特殊比較矩陣指派給各完美胺基酸吻合的分數或數字)及空隙延長罰分(其通常係{分數(1/10)}乘以空隙開放罰分)、以及比較矩陣(諸如PAM 250或BLOSUM 62)係結合該演算法使用。標準比較矩陣(參見Dayhoff等人1978；Atlas of Protein Sequence and Structure,vol.5,supp.3(關於PAM 250比較矩陣)；Henikoff等人PNAS 1992；89：10915-10919(關於BLOSUM 62比較矩陣))亦被該演算法使用。
用於胜肽序列比較的較佳參數包括以下者：演算法：Needleman等人J.Mol.Biol.1970；48：443-453；比較矩陣：BLOSUM 62，來自Henikoff等人PNAS 1992；89：10915-10919；空隙罰分：12，空隙長度罰分：4，類似性之閾值：0。
使用以上參數，GAP程式係有用的。以上提及的參數(加上末端空隙無罰分)係用於使用GAP演算法的胜肽比較的預設參數。
術語「類似性」係相關的概念，但與「一致性」相比，係論及包括完全相同的吻合及保守性取代吻合的序列關係。若二個多肽序列具有(例如)(分數(10/20))完全相同的胺基酸，且剩下者皆係非保守性取代，則百分比一致性及類似性會皆為50%。若，於相同的實例中，有另外5個有保守性取代的位置，則百分比一致性係25%且百分比類似性會係75%((分數(15/20)))。因此，於其中有保守性取代的例子中，二個多肽間的類似性程度會高於該二個多肽間的百分比一致性。
於另一方面，本發明提供包含本發明之化合物(諸如該等於本文中描述的抗體)的組成物及調配物。例如，本發明提供包含與醫藥上可接受的載劑一起調配的一或多種本發明之抗體的醫藥組成物。
因此，本發明之一個目的係提供包含以0.25mg/ml至250mg/ml的濃度存在的如此抗體的醫藥調配物，且其中該調配物具有2.0至10.0的pH。該調配物可進一步包含以下者之一或多者：緩衝系統、防腐劑、張力劑、螯合劑、穩定劑、或介面活性劑、以及其等之種種組合。防腐劑、等張劑、螯合劑、穩定劑及介面活性劑於醫藥組成物中的使用對所屬技術領域中具有通常知識者而言係廣為人知的。可參考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
於一個實施方式中，該醫藥調配物係水性調配物。如此調配物典型係溶液或懸浮液，但亦可包括膠體、分散液、乳液、及多相物質。術語「水性調配物」係定義成包含至少50% w/w水的調配物。類似地，術語「水溶液」係定義成包含至少50% w/w水的溶液，且術語「水性懸浮液」係定義成包含至少50%w/w水的懸浮液。
於另一個實施方式中，該醫藥調配物係凍乾調配物，至其醫師或患者於使用前添加溶劑及/或稀釋劑。
於進一步的方面，該醫藥調配物包含如此抗體及緩衝劑之水溶液，其中該抗體係以1mg/ml或以上的濃度存在，且其中該調配物具有約2.0至約10.0的pH。
本發明之化合物(諸如抗體)可非經口地(諸如靜脈內地，諸如肌肉內地，諸如皮下地)投予。供選擇地，本發明之抗體可通過非非經口途徑 (諸如口周地或外用地)投予。本發明之抗體可預防性地投予。本發明之抗體可治療性地(需要時)投予。
欲遞送的化合物之劑量可係約0.01mg至500mg的該化合物每日，較佳係約0.1mg至250mg每日，且更較佳係約0.5mg至約250mg每日，每週，每二週或每月作為速效劑量及維持劑量，取決於病況之嚴重性。適合的劑量亦可針對特定化合物基於該化合物之特性(包括其活體內半生期或平均滯留時間及其生物活性)作調整。例如，欲遞送的化合物可於一個實施方式中每週投予一次，或於另一個實施方式中每二週投予一次或於另一個實施方式中一月投予一次且於該等實施方式之任一者中以例如0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg每kg體重的劑量投予。
可投予含有於本文中揭露化合物的組成物以用於預防性治療及/或於一些實施方式中治療性治療。於治療性應用中，組成物係以足以治癒、減輕或部分地停止疾病(諸如任何出血病症，如以上描述的)及其併發症的量投予至已患有該疾病的對象。適用於完成此的量係定義成「治療有效量」。如所屬技術領域中具有通常知識者會瞭解的，有效於此目的的量會取決於疾病或損傷之嚴重性以及該對象之重量及一般狀態。
圖1顯示SEQ ID NO：3-188之經排比序列，其中重鏈及輕鏈可變域之互補性決定區1、2及3(CDR1、CDR2及CDR3)已以方框連續地強調。
圖2顯示來自經人類組織因子活化的血友病A乏血小板血漿(HA-PPP)中雙專一性抗體mAb4-7761、mAb4-7762、mAb4-7789、mAb5-0057、mAb5-1409及ACE910的凝血酶產生測試(TGT)數據。該實驗係如於實施例17中描述地執行。點線及虛線分別指出於HA-PPP及正常PPP中於缺乏抗FVIII抗體下觀察到的峰凝血酶水平(nM)，而其等之標準差係以點線指出。mAb4-7761、mAb4-7762、mAb4-7789、mAb5-0057、及mAb5-1409之輪廓係以向上指的三角形指出，而ACE910之輪廓係以向下指的三角形指出。Exp.A-D係指獨立的實驗；而在此等實驗之各者內於各抗體濃度的峰凝血酶水平代表至少三個獨立的回合之平均值±標準差。
圖3顯示來自經人類組織因子活化的血友病A富血小板血漿(HA-PRP)中雙專一性抗體mAb5-0057、mAb5-1409及ACE910的凝血酶產生測試(TGT)數據。該實驗係如於實例17中描述地執行。點線及虛線分別指出於HA-PRP及正常PRP中於缺乏抗FVIII抗體下觀察到的峰凝血酶水平(nM)，而其等之標準差係由點線指出。5-0057及5-1409之輪廓係以向上指的三角形指出，而ACE910之輪廓係以向下指的三角形指出。結果係以來自四個獨立的實驗的平均值±標準差顯示。
圖4顯示來自經人類因子XIa活化乏血小板血漿中mAb1-9016及224F3之單價單臂抗體的凝血酶產生測試(TGT)數據。該實驗係如於實施例18中描述地執行。虛線指出於缺乏抗體下觀察到的平均峰凝血酶水平(nM)而其標準差(±1 SD)係以點線指出。mAb1-9016及224F3之OA版本(mAb1-1582) 之輪廓係分別以向上指及向下指的三角形指出。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基H256的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基H257的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基N258的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基K293的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基K301的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基D332的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基R333的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基A334的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基T335的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基L337的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基R338的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基S339的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基T340的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基K341的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基T343的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基N346的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基R403的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基Y404的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基N406的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基W407的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基E410的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基K411的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基L337、R338、S339、T340、K341、及T343的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基K301、D332、R333、A334、T335、R338、及N346的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合包含FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa之殘基H256、H257、N258、K293、R403、Y404、N406、 W407、E410、及K411的表位。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa，其中該抗體與Fab7236競爭對於FIX的結合。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa，其中該抗體與Fab7237競爭對於FIX的結合。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa，其中該抗體與Fab7238競爭對於FIX的結合。
於一個實施方式中，本發明之抗體專一性結合FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa，其中該抗體與Fab7236屬於相同的「倉」。
於一個實施方式中，本發明之抗體專一性結合FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa，其中該抗體與Fab7237屬於相同的「倉」。
於一個實施方式中，本發明之抗體專一性結合FIX(SEQ ID NO：1)或其活化型FIXa，其中該抗體與Fab7238屬於相同的「倉」。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠結合FX(SEQ ID NO：2)或其活化型FXa，其中該抗體與包含mAb1-6723之CDR的抗體競爭。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體包含根據SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22的mAb1-6723之可變域。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體包含根據SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22的mAb1-6723之CDR。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體與包含根據SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22的mAb1-6723之可變域的Fab屬於相同的「倉」。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體與根據SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22的mAb1-6723屬於相同的「倉」。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體與包含根據SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：22的抗原結合域的抗體或Fab屬於相同的「倉」。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體與包含mAb1-1371之CDR的抗體競爭。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體包含根據SEQ ID NO：65及SEQ ID NO：66的mAb1-1371之可變域。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體包含根據SEQ ID NO：65及SEQ ID NO：66的mAb1-1371之CDR。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體與包含根據SEQ ID NO：65及SEQ ID NO：66的mAb1-1371之可變域的Fab屬於相同的「倉」，其於本文中被稱為「倉A」。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體與根據SEQ ID NO：65及SEQ ID NO：66的mAb1-1371屬於相同的「倉」。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體與包含根據SEQ ID NO：65及SEQ ID NO：66的抗原結合域的抗體或Fab屬於相同的「倉」。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體與包含mAb1-1376、mAb1-6705、mAb1-7388或mAb1-7563之CDR的抗體競爭。此等抗體於本文中被稱為屬於倉B。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體包含如分別由SEQ ID NO：67及68、SEQ ID NO：23及24、SEQ ID NO：39及40、及SEQ ID NO：59及60識別的mAb1-1376、mAb1-6705、mAb1-7388或mAb1-7563之可變域。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體包含如分別由SEQ ID NO：67及68、SEQ ID NO：23及24、SEQ ID NO：39及40、及SEQ ID NO：59及60識別的mAb1-1376、mAb1-6705、mAb1-7388或mAb1-7563之CDR。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體與包含如分別由SEQ ID NO：67及68、SEQ ID NO：23及24、SEQ ID NO：39及40、及SEQ ID NO：59及60識別的mAb1-1376、mAb1-6705、mAb1-7388或mAb1-7563之可變域的Fab屬於相同的「倉」。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體與如分別由SEQ ID NO：67及68、SEQ ID NO：23及24、SEQ ID NO：39及40、及SEQ ID NO：59及60識別的mAb1-1376、mAb1-6705、mAb1-7388或mAb1-7563屬於相同的「倉」。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體與包含根據SEQ ID NO：67及68、SEQ ID NO：23及24、SEQ ID NO：39及40、或SEQ ID NO：59及60的抗原結合域的抗體或Fab屬於相同的「倉」。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體包含選自由以下者所組成的群組的抗體之CDR或可變域：mAb1-6723、1-6716、1-6721、1-6730、1-6731、1-6737、1-6754、1-7378、1-7413、1-7424、1-7466、1-7481、1-7483及mAb1-7591。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體包含選自由以下者所組成的群組的抗體之CDR或可變域：mAb1-6723、1-6716、1-6721、1-6730、1-6731、1-6737、1-6754、1-7378、1-7413、1-7424、1-7466、1-7481、1-7483、1-7591、1-7388、1-7563、1-7462及mAb1-7571。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其 中該抗體與選自包含選自以下者的可變序列或其等之CDR的mAb之群組的mAb屬於相同的「倉」：SEQ ID NO：21及22、SEQ ID NO：25及26、SEQ ID NO：27及28、SEQ ID NO：29及30、SEQ ID NO：31及32、SEQ ID NO：33及34、SEQ ID NO：35及36、SEQ ID NO：37及38、SEQ ID NO：39及40、SEQ ID NO：41及42、SEQ ID NO：43及44、SEQ ID NO：45及46、SEQ ID NO：51及52、SEQ ID NO：53及54、SEQ ID NO：55及56、SEQ ID NO：57及58、SEQ ID NO：59及60、SEQ ID NO：61及62、及SEQ ID NO：63及64。此抗體之「倉」於本文中已被稱為倉C並以大量個別抗體(諸如mAb1-6723、1-6716、1-6721、1-6730、1-6731、1-6737、1-6754、1-7378、1-7413、1-7424、1-7466、1-7481、1-7483、1-7591、1-7388、1-7563、1-7462及mAb1-7571)例示。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體與選自由包含選自以下者的可變序列或其等之CDR的mAb所組成的抗體之群組的參考抗體競爭對於FX、FX酶原或FXa的結合：SEQ ID NO：21及22、SEQ ID NO：25及26、SEQ ID NO：27及28、SEQ ID NO：29及30、SEQ ID NO：31及32、SEQ ID NO：33及34、SEQ ID NO：35及36、SEQ ID NO：37及38、SEQ ID NO：41及42、SEQ ID NO：43及44、SEQ ID NO：53及54、SEQ ID NO：55及56、SEQ ID NO：57及58、及SEQ ID NO：63及64。
於一個實施方式中，根據本發明的抗體或其抗原結合片段與包含以下者之CDR的抗原結合片段競爭對於FX/FXa的結合：SEQ ID NO：21及22、SEQ ID NO：25及26、SEQ ID NO：27及28、SEQ ID NO：29及30、SEQ ID NO：31及32、SEQ ID NO：33及34、SEQ ID NO：35及36、SEQ ID NO：37及38、SEQ ID NO：41及42、SEQ ID NO：43及44、SEQ ID NO：53及54、SEQ ID NO：55及56、SEQ ID NO：57及58、及SEQ ID NO：63及64。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其 中該抗體與包含mAb1-7447、1-7441、1-7571或1-7462之CDR的抗體競爭。此等於本文中被稱為倉D之抗體。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體包含分別根據SEQ ID NO：47及48、SEQ ID NO：45及46、SEQ ID NO：51及53或SEQ ID NO：61及62的mAb1-7447、1-7441、1-7571或1-7462之可變域。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體包含分別根據SEQ ID NO：47及48、SEQ ID NO：45及46的mAb1-7447或1-7441之可變域。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體包含分別根據SEQ ID NO：47及48、SEQ ID NO：45及46、SEQ ID NO：51及53或SEQ ID NO：61及62的mAb1-7447、1-7441、1-7571或1-7462之CDR。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合根據SEQ ID NO：2的FX/FXa，其中該抗體與包含分別根據SEQ ID NO：47及48、SEQ ID NO：45及46、SEQ ID NO：51及53或SEQ ID NO：61及62的mAb1-7447、1-7441、1-7571或mAb1-7462之可變域的Fab屬於相同的「倉」。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體與分別根據SEQ ID NO：47及48、SEQ ID NO：45及46、SEQ ID NO：51及53或SEQ ID NO：61及62的mAb1-7447、1-7441、1-7571或mAb1-7462屬於相同的「倉」。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠專一性結合FX/FXa，其中該抗體與包含根據SEQ ID NO：47及48、SEQ ID NO：45及46、SEQ ID NO：51及53或SEQ ID NO：61及62的抗原結合域的抗體或Fab屬於相同的「倉」。
於一個實施方式中，本發明之抗體係根據上述實施方式之任何者的抗體，其中該抗體專一性結合FX酶原。
於如此實施方式中，該抗體專一性結合根據SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1-139、143-448的FX酶原。
於一個實施方式中，本發明之抗體係根據上述實施方式之任何者的抗體，其中該抗體專一性結合FX。
於一個實施方式中，本發明之抗體係根據上述實施方式之任何者的抗體，其中該抗體專一性結合FXa。
於一個如此實施方式中，該抗體專一性結合根據SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1-139、195-448的FXa。
於一個實施方式中，該抗體係單專一性抗體。於一個實施方式中，該抗體係多專一性抗體。於一個如此實施方式中，該抗體係雙專一性抗體。於一個如此實施方式中，該雙專一性抗體能夠結合至FIX或其活化型FIXa及FX/FXa。於一個如此實施方式中，該雙專一性抗體能夠專一性結合至FIX/FIXa及FX/FXa。
於一個實施方式中，該抗體係能夠結合FIX/FIXa及FX/Fxa的雙專一性抗體，其中其FIX/FIXa結合域係衍生自倉1之抗體且其FX/FXa結合域係衍生自倉A之抗體。
於一個實施方式中，該抗體係結合FIX/FIXa及FX/FXa的雙專一性抗體，其中其FIX/FIXa結合域係衍生自倉2之抗體且其FX/FXa結合域係衍生自倉A之抗體。
於一個實施方式中，該抗體係結合FIX/FIXa及FX/FXa的雙專一性抗體，其中其FIX/FIXa結合域係衍生自倉2之抗體且其FX/FXa結合域係衍生自倉B之抗體。
於一個實施方式中，該抗體係結合FIX/FIXa及FX/FXa的雙專一性抗體，其中其FIX/FIXa結合域係衍生自倉2之抗體且其FX/FXa結合域係衍生自 倉B之抗體。
於一個實施方式中，該抗體係結合FIX/FIXa及FX/FXa的雙專一性抗體，其中其FIX/FIXa結合域係衍生自倉1之抗體且其FX/FXa結合域係衍生自倉C或D之抗體。
於一個實施方式中，該抗體係結合FIX/FIXa及FX/FXa的雙專一性抗體，其中其結合域係衍生自由以下者所組成的mAb對：mAb1-1371/mAb1-1307、mAb1-6705/mAb1-1307、mAb1-1371/mAb0-1886、mAb1-7441/mAb0-1886、mAb1-7447/mAb0-1886、mAb1-7481/mAb0-1886、mAb1-1371/mAb0-1998、mAb1-6716/mAb0-1998、mAb1-6723/mAb0-1998、mAb1-6730/mAb0-1998、mAb1-6731/mAb0-1998、mAb1-6737/mAb0-1998、mAb1-6754/mAb0-1998、mAb1-7378/mAb0-1998、mAb1-7441/mAb0-1998、mAb1-7447/mAb0-1998及mAb1-7481/mAb0-1998。
於一個實施方式中，雙專一性抗體包含結合至FX的抗體臂及結合至FIX/FIXa的抗體臂。於一個如此實施方式中，該結合至FX的抗體臂結合至包含FX之活化胜肽中的一或多個殘基的表位且該結合FIX/FIXa的抗體臂結合至包含FIX蛋白酶域中的一或多個殘基的表位。
於另一個實施方式中，該抗體係三專一性抗體。
於一個實施方式中，本發明之抗體係呈IgG形式，諸如全長IgG。
於一個實施方式中，本發明之抗體係二個抗體片段之化學綴合物，諸如二個Fab片段或scFv片段或其等之組合之綴合物。
於一個實施方式中，本發明之抗體係人類或人類化抗體。
於一個實施方式中，於本文中揭露的抗體係用於雙專一性抗體之製造的中間物。
於一個實施方式中，本發明包括與於本文中揭露的抗體競爭對於 FIX/FIXa的結合的抗體。
本發明之抗體可用於治療患有凝血病變且特別是血友病A的對象。因此，本發明亦係關於使用能夠結合FIX/FIXa之蛋白酶域的單株抗體以治療需要其的對象；以及使用該抗體以製造用於治療需要其的對象的醫藥品。此外，本發明包括使用能夠結合至FIX/FIXa之蛋白酶域的單株抗體治療需要其的對象的方法。
於一個實施方式中，本發明之抗體以高於FIX的親和力結合FIXa。
於一個實施方式中，本發明之抗體能夠增加FIXa針對FX的酵素活性。
於一個如此實施方式中，本發明之抗體能夠增加FIXa針對FX的酵素活性，如在使用如於本文中描述的單價單臂抗體的FXa產生分析中測量的。
於一個如此實施方式中，本發明之抗體能夠增加FIXa針對FX的酵素活性，如在使用如於本文中描述的二價抗體的FXa產生分析中測量的。
於一個實施方式中，本發明之抗體非如於Rohlena等人(2003)J.Biol.Chem.278(11)：9394-9401中描述的抗FIX抗體CLB-FIX 13。於一個實施方式中，本發明之抗體非抗FIX抗體HIX-1(IgG1鼠類)(Merck KGaA,SigmaAldrich)。於一個實施方式中，本發明之抗體非抗FIX抗體AHIX-5041(IgG1)(Haematologic Technologies,Inc.)。
於一個實施方式中，本發明之抗體相較於所屬技術領域之促凝血抗體具有減少的致免疫性。
CDR：互補性決定區
EGR-CK：EGR-氯甲基酮
FIX：凝血因子IX
FIXa：凝血因子IXa
FX：凝血因子X
FXa：凝血因子Xa
hFIXa：人類凝血因子IXa
ITC：等溫滴定熱量測定法
OA：單臂
PCR：聚合酶連鎖反應
SPR：表面電漿子共振
如於本文中揭露的FIX/FIXa結合抗體係使用種種抗體開發方法鑑認。為了產生不同組的靶向FIXa及FX的抗體，執行小鼠及兔之致免疫以及自噬菌體展示及Adimab酵母菌展示的挑選。
Adimab平台係包含具有1010的多樣性的完全人類初始IgG1/卡帕文庫且涵蓋42個VH家族中的20個的酵母菌展示系統。所利用的抗體噬菌體展示平台係私有的完全人類Fab展示文庫。該文庫大小為1010且係藉由利用輕鏈以及重鏈CDR1及CDR2之化學合成輔以來自人類周邊血液單核細胞的重鏈CDR3之PCR擴增的組合方法構築。抗體挑選程序係使用基於MACS及FACS的方法(其等允許實時監視所應用的挑選基準)指揮。因為挑選係基於MACS及FACS，所 以需要經標記的抗原(例如生物素)。挑選活動係使用經生物素標記且活性位置受抑制的hFIXa(FIXa-EGR-生物素)或hFIXa之抗體介導性固定執行。命中係針對結合使用生物膜干涉法(Octet fortebio系統)評估。
為最大化表位多樣性之範圍，探究不同的淘選策略，包括使用生物素化FIXa-EGR、FX、活性位置被抑制的FXa的淘選、或使用抗FIXa抗體的抗原捕捉。最初命中係藉由噬菌體ELISA鑑認。於序列分析後，選殖獨特的命中，將其等以IgG1的形式表現、並使用SPR(Biacore)或生物膜干涉法(Octet fortebio系統)分級。
對於完全人類抗體於小鼠中的產生，使用KymouseTM小鼠HK及HL 1.0(分別利用卡帕及拉目達鏈)。另外的致免疫係於野生型小鼠及兔中實現以最大化抗體多樣性。
小鼠或兔係以FIXa、FIXa-EGR、或FX使用標準方案致免疫。於小鼠或兔中產生的抗體係於ELISA中篩選。FIXa結合性兔B細胞係使用隨機生物素化FIXa-EGR以FACS分選。來自兔及小鼠的抗體命中被重組表現(兔mAb)或繁殖(小鼠融合瘤)且隨後抗體被小規模純化。
Kymouse小鼠及兔係以FX使用標準或於多位置重複致免疫 (RIMMS)方案致免疫。兔B細胞係藉由FACS分選使用隨機生物素化FX分離。來自融合及分選的抗FX mAb係使用ELISA及Octet fortebio系統篩選。
衍生自Kymouse小鼠或wt小鼠的抗FIXa及抗FX抗體製造性融合瘤係使用標準技術定序及於HEK293細胞中表現。所表現的抗體係針對結合使用Octet fortebio系統評估。
所得的所挑選的抗體之可變域(VH及VL)編碼性DNA序列被插入至含有抗體恆定區編碼性DNA序列的基於pTT的哺乳動物表現載體(Durocher等人(2002)Nucleic Acid Res.30：E9)中或至pcDNA3.4哺乳動物表現載體(Invitrogen)中。對於pTT/pcDNA3.4 mAb表現載體，VH及VL DNA序列係分別與人類IgG1或IgG4 S228P(CH1CH2CH3)或人類CL卡帕恆定區編碼性DNA序列符合讀框地插入。對於相對應的pTT/pcDNA3.4 Fab表現載體，VH DNA序列係與人類IgG1 CH1編碼性DNA序列符合讀框地插入。
對於以下實施例6中使用的224F3參考化合物，224F3 VH及VL序列係獲自EP1660536 B1(分別為SEQ ID NO：1及2)。224F3 VH及VL編碼性DNA序列係分別與人類IgG1(CH1CH2CH3)或人類CL卡帕恆定區編碼性DNA序列符合讀框地插入至基於pTT5/pcDNA3.4的哺乳動物表現載體中。
所有的表現載體皆包括含有kozak序列的5’端DNA序列及與抗體編碼性DNA序列符合讀框的編碼訊息胜肽的DNA序列。
抗體及抗體Fab片段係使用HEK293懸浮細胞(293Expi，Invitrogen)之暫時轉染基本上按照製造商之操作指南來表現。293Expi細胞典型 係每3-4日於補充有1% P/S(GIBCO目錄編號15140-122)的Expi293F表現培養基(Invitrogen，目錄編號A1435104)中繼代培養。Expi293F細胞於以2.5-3mill/mL的細胞密度使用Expifectamine轉染。對於每公升的Expi293F細胞，轉染係藉由將總共1mg的質體DNA(VH-CH1(對於Fab)或VH-CH1-CH2-CH3(對於mAb)及LC質體，以1：1比率)稀釋至50mL Optimem(GIBCO，cat.no.51985-026，稀釋物A)中及藉由將2.7mL Expifectamine稀釋至50mL Optimem(稀釋物B)中來執行。對於Fab及mAb製造性共轉染，VH-CH1及LC質體(Fab)及VH-CH1-CH2-CH3及LC質體(mAb)係分別以1：1比率使用。混合稀釋物A及B並將其於室溫下培養10-20分鐘。之後將轉染混合物加至Expi293F細胞並於37℃下在濕潤的培養器中伴隨軌道旋轉(85-125rpm)培養細胞。於轉染後一日時，經轉染細胞係以5ml的ExpiFectamine 293轉染增強劑1及50ml的ExpiFectamine 293轉染增強劑2補充。細胞培養上清液典型係於轉染後4-5時藉由離心然後過濾來收穫。
Fab分子之純化係以由使用KappaSelect樹脂(GE Healthcare，cat.no.17-5458-11)的親和力層析法及使用Superdex200樹脂(GE Healthcare，cat.no.17-1043-04)的粒徑排阻層析法構成的2步驟程序的形式實施。純化係使用AktaExplorer層析系統(GE Healthcare，cat.no.18-1112-41)實施。用於親和力純化步驟的緩衝系統係由20mM磷酸Na pH 7.2、150mM NaCl構成的平衡緩衝劑及由10mM甲酸pH 3.5構成的溶析緩衝劑及由0.4M磷酸Na pH 9.0構成的pH調整緩衝劑。細胞上清液係直接施加至預平衡的KappaSelect SuRe管柱上而無任何調整。將管柱以10管柱體積的平衡緩衝劑洗滌且Fab分子係在大約5管柱體積的溶析緩衝劑中等度地溶析。於溶析後立即使用所描述的pH調整緩衝劑將倒在一起 的流份之pH調整至中性。將Fab分子進一步純化並使用預先裝入管柱中的該凝膠過濾樹脂作緩衝劑交換。用於粒徑排阻層析的運作緩衝劑係25mM HEPES及150mM NaCl，pH 7.4。Fab分子以於大約0.5管柱體積的單一峰的形式溶析。涵蓋該峰的流份係使用粒徑排阻高效能液相層析(SE-HPLC)法設置在Agilent LC 1100/1200系統上及使用BIOSep-SEC-S3000 300×7.8mm管柱(Phenomenex，cat.no.00H-2146-K0)及由200mM磷酸Na pH 6.9、300mM NaCl及10%異丙醇構成的運作緩衝劑分析。基於此分析，將各流份倒在一起以獲得均質蛋白質製備物。最終製備物係以1ml/min的流率於大約10min的滯留時間以單一對稱峰的形式溶析。
經純化Fab分子係使用SDS-PAGE/考馬斯及液相層析質譜術分析進一步定特徵。SDS-PAGE/考馬斯分析係使用NuPage 4-12% Bis-Tris凝膠(Invitrogen，cat.no.NP0321BOX)執行。所有的Fab分子皆展示預期的輕鏈及重鏈組份。完整分子量測定係使用液相層析電灑游離飛行時間質譜術方法設置在Agilent 6210儀器及去鹽管柱MassPREP(Waters，cat.no.USRM10008656)上執行。所使用的緩衝系統係由在LC-MS級H2O中的0.1%甲酸構成的平衡緩衝劑及由在LC-MS級ACN中的0.1%甲酸構成的溶析緩衝劑。所有的Fab分子皆展示根據序列預期的完整分子量。最終純度係基於SE-HPLC分析測定。對於不同的Fab片段，純度估計值皆在95-99%間。為測定最終蛋白質濃度，執行使用NanoDrop分光光度計(Thermo Scientific)於280nm下的吸光度測量且對各個Fab分子使用比消光係數計算濃度。
抗體之純化係藉由親和力層析法使用蛋白質A MabSelect SuRe樹脂(GE Healthcare，cat.no.17-5438-01)實施。純化係使用ÄktaExplorer層析 系統(GE Healthcare，cat.no.18-1112-41)實施。用於親和力純化步驟的緩衝系統係係由20mM磷酸Na pH 7.2、150mM NaCl構成的平衡緩衝劑及由10mM甲酸pH 3.5構成的溶析緩衝劑及由0.4M磷酸Na pH 9.0構成的pH調整緩衝劑。細胞上清液係直接施加至經預平衡的MabSelect SuRe管柱上而無任何調整。將管柱以10管柱體積的平衡緩衝劑洗滌且抗體係於大約2-5管柱體積的溶析緩衝劑中等度地溶析。於溶析後立即將倒在一起的流份之pH使用所描述的pH調整緩衝劑調整至中性。
經純化的抗體係使用SDS-PAGE/考馬斯、粒徑排阻高壓液相層析(SE-HPLC)及液相層析質譜術(LC-MS)分析界定特徵。SDS-PAGE/考馬斯分析係使用NuPage 4-12% Bis-Tris凝膠(Invitrogen，cat.no.NP0321BOX)執行。此處，所有抗體皆展示預期的輕鏈及重鏈組份。完整的分子量測定係使用液相層析電灑游離飛行時間質譜術方法設置在Agilent 6210儀器及去鹽管柱MassPREP(Waters，cat.no.USRM10008656)上執行。所使用的緩衝系統係由在LC-MS級H2O中的0.1%甲酸構成的平衡緩衝劑及由在LC-MS級ACN中的0.1%甲酸構成的溶析緩衝劑。分析係使用及不使用N-醣苷酶F(Roche Diagnostics，cat.no.11365177001)及還原劑(即巰乙醇或DTT)執行。所有的抗體皆展示根據序列及一個重鏈N聚醣預期的完整分子量。純度係基於SE-HPLC測定。最終蛋白質純度係基於SE-HPLC方法設置在Agilent LC 1100/1200系統上及使用BIOSep-SEC-S3000 300×7.8mm管柱(Phenomenex，cat.no.00H-2146-K0)及由200mM磷酸Na pH 6.9、300mM NaCl及10%異丙醇構成的運作緩衝劑分析。將UV280及螢光(Ex 280nm/Em 354nm)偵測器用於偵測。抗體以單一對稱峰的形式溶析而滯留時間反映抗體之大小。對於不同的抗體，純度估計值皆於95-99%間。為測量最終蛋白質濃度，對該等抗體之各者使用NanoDrop分光光度計(Thermo Scientific)以及比消光係數。
以能夠刺激FIXa活性來挑選的抗體係於分倉實驗中分析以使用以下描述的方法測定所鑑認的抗體之結合特徵。
分倉實驗係使用配備有抗人類IgG感應器(Pall Life Sciences，Menlo Park，CA)的Octet fortebio系統(HTX，Red384)及使用8或32頻道模式(Red384及HTX)執行。分倉分析係使用經典三明治表位分倉設置執行。簡言之，(1)第一抗體係以抗人類AHC尖(抗人類IgG Fc捕捉尖(AHC Part NO：18-5064)捕捉，(2)AHC尖上未被封阻的IgG結合位置係以人類多株IgG(I4506 SIGMA)封阻，(3)FIXa或FX係結合至第一抗體，(4)將競爭性抗體提供給尖上的抗體-抗原複合物，且若無法偵測到第二抗體之結合，該等抗體被記為屬於相同的倉。
此分析鑑認出分別由抗體mAb0-1886及mAb1-1307定義的二個不同的倉(倉1及2)。
所選抗FIX抗體係針對彼此分倉，且鑑認出二個不同的倉(倉1及2)。數字係論及mAb ID，例如0-1998代表mAb0-1998。
此概述顯示發現數種抗體屬於倉1，包括mAb0-1886及mAb0-1998。發現倉2除了mAb1-1307外包括四種抗體。倉1及2共有二種抗體，mAb1-0072及mAb1-0073。
因為於本實施例中提供數據的抗體變體在基於在實施例5中提供的親本抗體-FIXa複合物之結晶結構被顯示對於表位辨識而言係關鍵的位置上不含有胺基酸取代，所屬技術領域中具有通常知識者會瞭解該等作為起始點的變體會與其等所源自的抗體(即mAb0-1998、mAb0-1886、或mAb1-1307)屬於相同的倉、競爭結合及至少辨識FIX/FIXa表位中的相同熱點殘基。
供結晶的FIXa蛋白質(Cambridge Protein Works，產品碼10316)係由以下者構成：經截短輕鏈(SEQ ID NO：1之殘基85-142)，其由於細菌表現而具有接附於N端的非天然甲硫胺酸殘基、及含有SEQ ID NO：1之殘基181-415的重鏈。該蛋白酶之活性位置係藉由EGR-氯甲基酮封阻。
與FIXa蛋白質以1：1莫耳比率混合的Fab0-7237(對應於mAb0-1886的Fab片段)之結晶係使用懸滴蒸氣擴散技術於18℃下生長。0.8μl於20mM Tris-HCl，pH 7.4、50mM NaCl、及2.5mM CaCl2中的7.5mg/ml的蛋白質溶液係與等體積的4M甲酸鈉(作為沈澱劑)混合並以1ml沈澱劑培養。
與FIXa蛋白質以1：1莫耳比率混合的Fab0-7238(對應於mAb0-1998的Fab片段)之結晶係使用坐滴蒸氣擴散技術於18℃下生長。0.1μl於20mM Tris-HCl，pH 7.4、50mM NaCl、及2.5mM CaCl2中的6.2mg/ml的蛋白質溶液係與0.1μl的100mM二甲砷酸鈉，pH 6.5及1M檸檬酸鹽三鈉(作為沈澱劑)混合並以60μl沈澱劑培養。
與FIXa蛋白質以1：1莫耳比率混合的Fab0-7236(對應於mAb1-1307的Fab片段)之結晶係使用坐滴蒸氣擴散技術於18℃下生長。0.1μl於20mM Tris-HCl，pH 7.4、50mM NaCl、及2.5mM CaCl2中的6.4mg/ml的蛋白質溶液係與等體積的0.2M硫酸鋰、40(v/v)% PEG400、及0.1M Tris pH，8.5(作為沈澱劑)混合並以1ml沈澱劑培養。
結晶係於在液態氮中急速冷卻前在由3M甲酸鈉、4%甘油、4%乙二醇、4.5%蔗糖、及1%葡萄醣所組成的溶液中冷凍保護。繞射數據係於100K於Swiss Light Source光束線X06DA(1.0000Å波長)使用來自Dectris的Pilatus2M像素偵測器收集。數據之自動索引、集成及縮放係使用來自XDS套裝的程式執行(繞射數據統計係在表1中概述)。
結晶係於在液態氮中急速冷卻前在由75mM二甲砷酸鈉，pH 6.5及0.75M檸檬酸三鈉、4%甘油、4%乙二醇、4.5%蔗糖、及1%葡萄醣所組成的溶液中冷凍保護。繞射數據係於100K於Swiss Light Source光束線X06DA(1.0000Å波長)使用來自Dectris的Pilatus2M像素偵測器收集。數據之自動索引、集成及縮放係使用來自XDS套裝的程式執行(繞射數據統計係在表1中概述)。
三個結晶係於在液態氮中急速冷卻前在由0.15M硫酸鋰、30(v/v)% PEG400、及0.075M Tris pH，8.5、4%甘油、4%乙二醇、4.5%蔗糖、及1%葡萄醣所組成的溶液中冷凍保護。繞射數據係於100K於Swiss Light Source光束線X06DA(1.0000Å波長)使用來自Dectris的Pilatus2M像素偵測器收集。數據之自動索引、集成、合併及縮放係使用來自XDS套裝的程式執行(繞射數據統計係在表1中概述)。
結構係藉由分子置換使用Phaser如於程式套裝Phenix中實施地以蛋白質資料庫登錄4NP4之鏈H及L及來自蛋白質資料庫登錄3KCG的鏈H及L測定。不對稱的單元含有二個Fab：FIXa複合物。模型係使用Phenix精修及COOT中的手動重建之步驟精修。精修統計可在表1中找到。
結構係藉由分子置換使用Phaser如於程式套裝Phenix中實施地以蛋白質資料庫登錄4PUB之鏈H及L及來自蛋白質資料庫登錄3KCG的鏈H及L測定。不對稱的單元含有二個Fab：FIXa複合物。模型係使用Phenix精修及COOT中的手動重建之步驟精修。精修統計可在表1中找到。
結構係藉由分子置換使用Phaser如於程式套裝Phenix中實施地以以上描述的Fab0-7238：FIXa複合物之複合物結構之Fab部分及來自蛋白質資料庫登錄3KCG的鏈H及L測定。不對稱的單元含有一個Fab：FIXa複合物。模型係使用Phenix精修及COOT中的手動重建之步驟精修。精修統計可在表1中找到。
對於最高解析殼之統計係在括弧中顯示。
基於以上，發現mAb0-1998、mAb1-1307及mAb0-1886結合至FIXa上不同的表位，其中表位係定義成在離該等抗體中的重原子3.5Å的距離內具有至少一個重原子的殘基。
mAb0-1998表位係位於170-環中且包含蛋白酶域中的以下殘基：L337、R338、S339、T340、K341、及T343。
mAb1-1307表位包含以下殘基：H256、H257、N258、K293、R403、Y404、N406、W407、E410及K411。
mAb0-1886表位係位於170-螺旋中且包含蛋白酶域中的以下殘基：K301、D332、R333、A334、T335、R338及N346。
發現mAb0-1998及mAb0-1886之表位彼此重疊，此與該二種抗體 競爭對於FIX/FIXa的結合之觀察結果(實施例4)充分對應。
因為於以上實施例4及一些以下實施例中提供數據的抗體變體在基於本實施例中提供的親本抗體-FIXa複合物之結晶結構對於表位辨識顯示為關鍵的位置不含有胺基酸取代，所屬技術領域中具有通常知識者會瞭解該等作為起始點的變體會與其等所源自的抗體(即mAb0-1998、mAb0-1886、或mAb1-1307)屬於相同的倉，競爭結合，及至少辨識FIX/FIXa表位中的相同熱點殘基。
二價抗FIX/FIXa抗體對FIXa針對FX的酵素活性的刺激功效係從其等於促凝血磷脂膜之存在下促進透過FIXa的FX活化的能力根據由Scheiflinger等人(2008)J Thromb Haemost,6：315-322描述的原理測定。鑑於抗FIXa抗體224F3在Scheiflinger等人所鑑認的抗體中的高活性，於以下實驗中選擇224F3作為參考(參照實施例1對於224F3構築的資訊)。
抗FIXa抗體對FIXa介導的FX變成FXa之活化的刺激功效係於自動化高通量生物化學分析中在384槽孔盤中測量。簡言之，FIXa係與經純化抗體以四點5倍劑量反應混合。添加FX/磷脂(PL)混合物並藉由添加FXa受質(Pefaflour)測量FXa產生而受質水解速率係藉由在多標記讀取機(PheraSTAR)上偵測螢光五分鐘來測定。相對FIXa刺激活性係以來自FIXa-抗體複合物的FXa產生之速率對來自單獨FIXa的FXa產生之速率的形式計算。
各抗體係以0-200nM的濃度範圍測試，其藉由以3nM人類血漿衍生性FIXa(Haematologic Technologies Inc,USA)及10μM 25：75磷脂醯絲胺酸： 磷脂醯膽鹼磷脂囊泡(Haematologic Technologies Inc,USA)於分析緩衝劑(50mM HEPES、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1%(w/v)PEG8000，pH 7.3+1mg/ml BSA)中預培養10min之後添加人類血漿衍生性FX(Haematologic Technologies Inc,USA)至150nM的濃度。於室溫下10min活化後，反應(50μl)係藉由添加25μl終止緩衝劑(50mM HEPES、100mM NaCl、60mM EDTA、0.1% PEG8000，pH 7.3+1mg/ml BSA)來終止。接著，產生的FX之量係藉由添加25μl 2mM S-2765發色受質(Chromogenix，瑞典)並藉由於微盤讀取機中於405mm測量吸光度(△OD/min)以測量發色受質轉化來測定。於各抗體濃度的FXa產生之速率係自使用已知量的人類血漿衍生性FXa(Haematologic Technologies Inc,USA)製作的標準曲線測定。
表二2列表所測量的各抗體於所測試濃度的FXa產生速率。自此，峰刺激活性係以相對於224F3者所觀察到的最大FXa產生速率形式對各抗體計算。此數據係於表3中呈現，而表3顯示屬於三個家族(分別為0-1886、0-1998、及1-1307)之各者的抗體具有比對於224F3觀察到者(Scheiflinger等人)高10-67倍的活性。
表2-FXa產生速率所列抗FIX/FIXa抗體的呈pM/min的FXa產生速率(平均±SD，n=2)。各抗體係以如於第一欄中指出的0-200nM的濃度範圍測試。
為避免任何與習用單專一性及二價抗體有關的可能總結合力(avidity)效果(例如於FXa產生分析中及於某些SPR實驗中)，使用如由Martens等人：A Novel One-Armed Anti-c-Met Antibody Inhibits Glioblastoma Growth In vivo.Clin.Cancer Res.12,6144-6152(2006)描述的單價單臂(OA)抗體形式，其中完整重鏈、經截短重鏈(缺乏Fab區)及輕鏈被共表現。替代由Martens等人描述的三個鏈之共表現，本發明中單價抗體係使用如針對雙專一性抗體描述的Duobody®原理(實施例10)製備。因此，單價抗體係藉由以下者製備：混合完整單專一性及二價抗體及經截短重鏈二聚體(形式上藉由移除Fab區而自完整抗體衍生)並允許鏈之交換以在與於其他實施例中描述者相同的實驗條件下繼續進行。單價抗體之形成需要該抗體及經截短重鏈二聚體帶有適當的互補突變以促進雜二聚化，即對於IgG1係F405L/K409R及對於IgG4係F405L+R409K/WT，如於其他實施例中描述的。
於IgG1子型之單價抗體之例子中，重鏈之截短可係從N端至介於Cys 220及較上的鉸鏈Cys 226(EU編號)之間的位置。一經截短IgG1重鏈之特別實例係其中殘基1-220經截短者。
於IgG4子型之單價抗體之例子中，重鏈之截短可係從N端至介於Cys 200及較上的鉸鏈Cys 226(EU編號)之間的位置。一經截短IgG4重鏈之特別實例係其中殘基1-214經截短者。
為避免任何導因於習用抗體形式之二價性的可能總結合力效果，抗FIX/FIXa抗體對於FIXa針對FX的酵素活性的刺激活性係於將形式改成單價單臂(OA)抗體形式(參見實施例8)後測定。所測試的抗體係於以下表4中列出。亦包括抗FIXa抗體224F3之單價OA版本(以mAb1-1582表示)(亦於實施例7中提及)以供比較。
OA抗體之刺激活性係在分析緩衝劑(50mM HEPES、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1%(w/v)PEG8000，pH 7.3+1mg/ml BSA)中以固定 濃度的磷脂醯絲胺酸(PS)：磷脂醯膽鹼(PC)磷脂囊泡(500μM的最終濃度；Haematologic Technologies Inc,USA)及血漿衍生性FIXa(0.17、0.5或1nM的最終濃度；Haematologic Technologies Inc,USA)測量。FIXa之濃度係經挑選以確保少於15%的受質FX被轉變成FXa。於在單價OA抗體(在表1中列出的最終濃度)之存在下預培養後，添加150nM血漿衍生性FX以給出50μl的最終反應體積，並允許活化於室溫下繼續進行20min。接著反應係藉由添加25μl終止緩衝劑(50mM HEPES、100mM NaCl、60mM EDTA、0.1% PEG8000，pH 7.3+1mg/ml BSA)終止且所產生的FXa之量係藉由進一步添加25μl 2mM S-2765發色受質(Chromogenix，瑞典)並藉由於微盤讀取機中於405nm測量吸光度(△OD/min)以測量發色受質轉化來測定。所測量的活性係藉由減去相同但FIXa及抗體以分析緩衝劑置換的分析中測量的訊號而針對背景活性作校正，且接著係根據分析中存在的FIXa之濃度([FIXa]總)作標準化。將此數字除以於缺乏抗體下的FXa產生之經類似地標準化的速率(AFIXa,norm)，計算出抗體刺激指數，其提供透過所使用濃度的抗體的FIXa活性之刺激倍數。由於透過自由FIXa的FXa產生之緩慢速率，於缺乏抗體下的活化反應係如以上描述但在有5、10、或20nM FIXa存在下實現。接著所測量的活性係減去背景並根據分析中的FIXa濃度標準化。對於刺激指數之計算，使用三個自由FIXa之經標準化活性之平均。
總結來說，刺激指數之計算可如下描述 刺激指數=((AFIXa+OA-Abckg)/[FIXa]總)/AFIXa,norm其中AFIXa+OA係於OA抗體存在下測量的活性，Abckg係於缺乏FIXa及單價抗體下測量的背景活性，[FIXa]總係分析中的FIXa濃度，且AFIXa,norm係自由FIXa之平均經標準化活性。
分析中以OA抗體飽和的FIXa之部分係藉由FIXa及OA抗體之濃度及支配其等之交互作用的平衡解離常數(K d )測定。後者可藉由所屬技術領域中已知的技術(諸如等溫滴定熱量測定法(ITC))測量。
因為刺激指數會隨著OA抗體之濃度增加而增加直到達到FIXa之飽和，分析中OA抗體之濃度應經挑選以確保分析中FIXa之至少80%飽和以提供於完全FIXa飽和的刺激指數之適當估計。
於平衡下結合至OA抗體的FIXa之部分(fFIXa+OA)，可從分析中的FIXa之總濃度([FIXa]總)及OA之總濃度([OA]總)及其等之交互作用之平衡解離常數(K d )使用如由Krishnaswamy等人(1992)J.Biol.Chem.，267：23696-23706描述及於以下Eq.1及2詳述的二次結合方程式計算，其中[ FIXa + OA ]分析代表所計算的於分析中於平衡的FIXa-OA抗體複合物之濃度 f FIXa + OA 代表所計算的於分析中於平衡的結合至OA抗體的FIXa之部分(以百分比計)
各單價OA抗體之刺激指數係在表4中提供。對於所有的所測試抗體，發現所測量的刺激指數係高於對於單價單臂224F3抗體(mAb1-1582)測量到者。
使用3260nM的分析中單臂224F3抗體之濃度及0.477nM的與FIXa的交互作用之K d (如由Kerschbaumer等人(US7297336-B2)報導的)，超過95%的FIXa於分析中係結合至單臂224F3抗體。
如於本文中揭露的抗FX/FXa抗體係使用標準抗體開發方法開發且表現質體係如於實施例1針對抗FIX/FIXa Fab及mAb表現質體描述地製備。抗FX/Xa抗體之表現、純化及特徵界定係同樣地如於實施例2-4中針對抗FIX/FIXa抗體描述地執行。
雙專一性抗體係藉由試管內組合第一及第二抗體產生，其係透過針對雙專一性IgG1抗體描述的Duobody®方法(Genmab)(Labrijn等人PNAS 2013,vol.110,pp.5145-5150)及針對雙專一性IgG4抗體使用經稍微修飾的變體，如於以下詳述的。
對於IgG1，第一抗體之重鏈恆定區係IgG1 K409R(抗FIX/FIXa)且第二抗體之重鏈恆定區係IgG1 F405L(抗FX/FXa)。IgG1可係具有減少的效應功能的IgG1變體，如先前提及的。
對於IgG4，第一抗體之重鏈恆定區係IgG4 S228P(抗FIX/FIXa)且第二抗體之重鏈恆定區係IgG4 S228P F405L R409K(抗FX)。二種親本抗體係如於實施例1-3中描述地製造。Fab臂交換反應係在HEPES緩衝劑(pH 7.4)中於還原條件下使用75mM 2-巰乙胺(2-MEA)及於30℃下培養4小時來實現。
將抗FIXa及抗hFX抗體之對做成雙專一性抗體，其係藉由如以上描述的Duobody®技術(實施例10)。雙專一性抗體係於種種分析(諸如以上描述的FXa產生分析(實施例6)及如於以下段落中描述的凝血酶生產測試(TGT))中針對促凝血活性作測試。
TGT係於自動化HTP 384槽孔設置使用高嶺土觸發(Haemonetics Corporation,#6300)實施。簡言之，將抗體以111nM的濃度添加(除了mAb1-1371係以55nM添加且mAb1-0021係以166nM添加)至血友病A(HA)血漿(George King)。接著添加與磷脂(Rossix，#PL604T)混合的高嶺土，之後添加FIIa受質(FluCa,Thrombinoscope,#TS50.00)。螢光係在Perkin Elmer EnVision多標記讀盤機上以1分鐘間隔測量2小時。峰高係計算成凝血酶圖(thrombogram)中觀察到的最大值，且接著係針對對參考抗FIXa及抗FX抗體觀察到的峰高作標準化。參考物總是包括來自抗FX抗體mAb1-2375(由SEQ ID NO：93及94識別)的結合域，加上來自由mAb1-4707、mAb1-5788及mAb1-4857代表的三個家族之各者的FIX域。抗體係根據其等之相對TGT活性分組成低(0-24%)、+(24-50%)、++(50-75%)及+++(>75%)，其中+係較佳的，++係更佳的且+++係最佳的。
大量的抗FX抗體係以與屬於該三個譜系(mAb1-1307、mAb0-1886及mAb0-1998)的抗FIXa抗體變體組合的雙專一性抗體的形式測試。所挑選的於TGT分析中顯示顯著活性的抗FIXa/抗FX對之組合係於表5中顯示。
基於表5很明顯的，由雙專一性抗體展現的活性之水平係取決於特殊抗FIXa/抗FX組合。例如，抗FX抗體mAb1-6723組合抗FIXa抗體mAb0-1998展現強活性(+++)，而mAb1-6723之活性與mAb0-1886(+)及與mAb1-1307(+)組合時較低。
呈與抗hFIXa抗體組合的雙專一性抗體形式時顯示顯著的TGT活性的抗FX抗體係針對彼此使用Octet fortebio系統使用與如針對抗FIXa抗體描述者(實施例4)相同的設置(除了以FX取代FIXa)分倉。
此分析鑑認出五個不同的倉，倉A-E，其等分別由抗體mAb1-1371、mAb1-1376、mAb1-6723、mAb1-7447及mAb1-7449定義。二個倉(倉A及倉E)各僅由單一抗FX抗體(參見表6)代表。
大量的殖株由於與1-6723競爭而被鑑認為屬於倉C。
表6-抗FX抗體之分倉一些所選抗FX抗體係針對彼此分倉，且鑑認出五個不同的倉(倉
因為於本實施例中提供數據的抗體變體在基於在以下實施例13中提供的親本抗體-FXa複合物之結晶結構被顯示對於表位辨識而言係關鍵的位置上不含有胺基酸取代，所屬技術領域中具有通常知識者會瞭解該等作為起始點的變體會與其等所源自的抗體(即mAb1-6723)屬於相同的倉、競爭結合及至少辨識FX/FXa表位中的相同熱點殘基。
對於結晶與FX複合的Fab0-8954(對應於mAb1-6723的Fab片段) 的嘗試不成功，但獲得品質良好的與活性位置經抑制的FXa複合者之結晶。因此，與活性位置經抑制的去gla FXa(人類EGR經抑制因子Xa無gla域(野生型)細菌表現，Lot# hGDFXAEGR-022，Cambridge Protein Works)以1：1莫耳比率混合的Fab0-8954之結晶係使用坐滴蒸氣擴散技術於18℃下生長。150nl的6.7mg/ml複合物於20mM Tris-HCl，pH 7.4、50mM NaCl、及2.5mM CaCl2中的的蛋白質溶液係與50nl的0.2M醋酸鎂、0.1M二甲砷酸鈉，pH 6.5、20%(w/v)PEG 8000(作為沈澱劑)混合並以60μl沈澱劑培養。
結晶係於在液態氮中急速冷卻前藉由將1μl加有20%的乙二醇的沈澱劑加至結晶滴而冷凍保護。繞射數據係於100K於Swiss Light Source光束線X06DA(1.0000Å波長)使用來自Dectris的Pilatus2M像素偵測器收集。數據之自動索引、集成及縮放係使用來自XDS套裝的程式執行(繞射數據統計係於表7中概述)。
如基於Matthews係數分析判斷的，不對稱單元含有四個Fab：FXa複合物。結構係藉由分子置換測定。使用如於程式套裝Phenix中實施的Phaser，並利用蛋白質資料庫登錄5I1K之鏈H及L作為定位四個Fab的搜尋模型。此等係以正確胺基酸序列使用COOT建立模型且之後使用Phenix精修精修。固定經精修的Fab模型同時於來自CCP4套裝的Molrep中以來自蛋白質資料庫登錄1G2L的鏈A及B作為搜尋模型應用分子置換。發現四種FXa片段。模型係使用Phenix精修及COOT中的手動重建之步驟精修。精修統計可在表7中找到。
對於最高解析殼之統計係在括弧中顯示。
Fab0-8954：FXa複合物之結晶結構具有四個副本的呈不對稱單元的複合物，且此等係於來自CCP4套裝的Contact程式中使用3.5Å截止距離分開地分析以鑑認表位及互補位。
若一殘基於該複合物之四個副本之至少一者中被鑑認為表位/互補位殘基，則該殘基被包括於表位/互補位中。交互作用之關鍵殘基被測定為於全部四個副本中於3.5Å的最大距離的殘基。分析之結果係於以下表8中提供。
因為於本實施例中提供數據的抗體變體在基於本實施例中提供的親本抗體-FXa複合物之結晶結構被顯示對於表位辨識而言係關鍵的位置上不含有胺基酸取代，所屬技術領域中具有通常知識者會瞭解該等作為起始點的變體會與其等所源自的抗體(即mAb1-6723)屬於相同的倉、競爭結合、及至少辨識FX/FXa表位中的相同的熱點殘基
類似於針對mAb1-1307、mAb0-1886及mAb0-1998的FIX上的熱點表位殘基之定位(如於實施例15中描述的)，本實施例中提供的數據針對mAb1-6723測定FX上的熱點表位殘基。所使用的FX變體係去Gla-去EGF1-FX(對應於SEQ ID NO：2之殘基86-448，具有透過短GS連接子(GGGGSGGGGS)接附的N端His-標籤(HHHHHH，用於親和力純化))之單一位置丙胺酸變體(除了位置118，其於野生型係丙胺酸，於該處導入丙胺酸至絲胺酸取代)。涵蓋如於實施例13中定義的表位殘基的變體係於表9中列出。
1)根據SEQ ID No：2
2)EGF2及PD係分別論及第二類表皮生長因子及蛋白酶域
野生型去Gla-去EGF1-FX及表9中所列的變體係於HEK293系統中表現並藉由親和力層析法純化。對於L117A、L303A、P304A及M426A變體，觀察到無表現或差的純度，而對於該四種變體而言結合之評估係不可能的。
熱點表位殘基之鑑認係使用Biacore T200儀器於25℃下完成。將2μg/ml來自人類抗體捕捉套組(GE Healthcare，目錄# BR100839)的抗hIgG Fc抗體使用標準胺偶合化學固定在S系列感應晶片CM5(GE Healthcare，目錄# BR100530)上。將抗FX抗體(mAb1-6723之單價變體)以5μL/min的流率注射30sec並藉由所固定的抗hIgG Fc抗體捕捉。隨後，5μM(以2或3倍連續稀釋) 的T116A、A118S、T127A、F229A及E226A變體、10μM(以5倍連續稀釋)的Y230A變體、及10μM(以2或3倍連續稀釋)WT及H101A、E103A、R113A、S227A、E228A、R287A、E305A、L419A、K420A、D423A、R424A、K427A及T428A變體係以5μL/min的流率注射90sec以允許結合至所捕捉的抗FX抗體，接著為90sec緩衝劑注射以允許去Gla-去EGF1-FX變體之解離。運作緩衝劑(亦用於稀釋抗FX抗體及去Gla-去EGF1-hFX變體)含有10mM HEPES、150mM NaCl、1mg/mL BSA及5mM CaCl2(pH 7.4)。感應晶片之再生係使用1M甲酸達成。結合數據係使用穩態擬合根據1：1模型於由GE Healthcare供應的Biacore評估軟體2.0中分析。結合數據係以於注射5或10μM FX變體時相對於野生型FX至抗FX抗體的結合的FX變體至抗FX抗體的%結合的形式報導且係根據下式計算： 結合(%)=100%×[(R max_FXvar,Ab )/(R max_Ab )]/[(R max_FXwt,Ab )/(R max_Ab )]其中R max_Ab 代表抗FX抗體之捕捉水平(RU)，且R max_FXvar,Ab 及R max_FXwt,Ab 分別代表於相同的濃度(對於所有者皆為5μM，除了Y230A變體，其濃度係10μM)FX變體及野生型至所捕捉的抗FX抗體的結合(RU)。結果係於下表顯示。
對於mAb1-6723的熱點殘基係定義成於該處以丙胺酸取代野生型殘基(或對於位置118係以絲胺酸取代丙胺酸)於5μM濃度的WT(或變體)去Gla-去EGF1-FX相對於該抗體至野生型FX的結合減低該抗體之結合至30%或更低的位置。
對於mAb1-6723(實驗上由其單價對應物(mAb4-6934)代表)的熱點殘基：R113、Y230、K420、D423、R424及K427
為了測定位對於抗FIX/FIXa Ab(mAb0-1886、mAb0-1998及mAb1-1307)與FIX間的交互作用為關鍵的殘基(被稱為熱點)，一組FIX變體係基於與相對應的Fab片段(分別為Fab7237、Fab7238及Fab7236)複合的FIXa之結晶結構挑選。如於以下詳述的，所選FIX變體係於哺乳動物細胞中暫時表現、純化並使用表面電漿子共振(SPR)於其等至mAb0-1886、mAb0-1998及mAb1-1307之單價變體的結合的方面界定特徵。
適用於暫時哺乳動物表現的DNA質體係以編碼後面緊接著六個組胺酸(6×His標籤，用於親和力純化)的人類FIX之胺基酸殘基1-461(uniprot P00740，除了根據UNIPROT編號的T194A突變，對應於SEQ ID NO：1之T148A)的表現匣構築。使用此構築體製造的分泌的成熟FIX蛋白質鏈係與人類FIX之A148對偶基因形式(Anson等人EMBO J.1984 3：1053-1060、McGraw等人，Proc Natl Acad Sci USA.198582：2847-2851)完全相同，除了加有C端His標籤外。
使用該構築體作為模版，將所選突變藉由PCR導入。對於表11中所列的各單點突變，設計含有所欲胺基酸改變的正向引子及無胺基酸突變的逆向引子。於標準PCR反應中使用此等引子及以上描述作為模版的載體以擴增整個載體序列。使用無連接選殖以將所得的經擴增DNA片段之末端使用藉由該正向及逆向引子導入的重疊序列連接至環狀表現質體中。
將環化質體轉形至大腸桿菌細胞中，於選擇性瓊脂盤上生長以形成菌落，並使用該等菌落以起始液態大腸桿菌培養。於大腸桿菌培養之過夜生長後，執行質體製備並藉由DNA定序鑑認突變體。
重組蛋白質製造係藉由使用ExpiFectamineTM 293轉染套組(ThermoFisher Scientific，cat# A14525)及編碼所欲的變體之各者以及野生型FIX(對應於SEQ ID NO：1，具有C端His標籤)的質體DNA轉染於Expi293表現TM培養基(ThermoFisher Scientific，cat# A1435101)中以懸浮培養的形式生長的expi293F細胞執行。於轉染時添加維生素K至5mg/mL的最終濃度。於轉染後之日添加來自ExpiFectamineTM 293轉染套組的轉染增強劑1及2。於轉染後5日時藉由離心收穫細胞培養物。
以多槽孔機械人設置將各FIX變體上的C端His標籤用於批次蛋白質純化。簡言之，將所收穫的細胞培養上清液調整至結合條件，與Ni Sepharose 6快速流動親和力純化樹脂(GE Healthcare，cat# 17-5318-02，50μl沈澱樹脂/ml細胞培養基)混合並伴隨搖晃培養20分鐘。接著將樹脂/上清液混合物轉移至過濾盤並藉由施加真空使液體通過過濾盤。將留在過濾盤中的樹脂洗滌三次，之後於高咪唑緩衝劑中溶析。
所純化的蛋白質溶液之濃度測定係藉由ELISA執行，其使用抗FIX抗體以用於偵測及高純度重組野生型FIX以用於標準曲線。
3)根據SEQ ID NO：1
4)EGF2及PD係分別論及第二類表皮生長因子及蛋白酶域
*以星號標記的變體展現極低的表現水平且無法於結合研究中評估
為測試FIX變體中胺基酸取代之導入是否導致去穩定及不適當的折疊，對於該等變體測定熱解折疊轉變之中點(T m )。
將經純化的FIX變體裝載至標準毛細管(Prometheus NT.48 nanoDSF級標準毛細管，Nanotemper Technologies GmbH，München)中並插入至Prometheus NT.48(Nanotemper Technologies GmbH，München)中。使用70%的激發強度且熱解折疊係以1.5℃/min的加熱坡度於20-90℃追蹤。色胺酸螢光係藉由於280nm的激發測量並紀錄於330nm及350nm的發射。該等FIX變體之T m 可自於350nm及330nm測量的螢光之比率(F350/F330)測定(除了當蛋白質濃度係低於20μg/mL時，其係FIX N101D、H256A、L330A S339A、G393I、Y404A及N406Q的例子)。於所有的例子中，程式PR.ThermControl v2.0.4(Nanotemper Technologies GmbH，München)可藉由測定F350/F330解折疊曲線之一階導數之最大值自動擬合T m 。發現對於野生型FIX的T m 係51℃且對於該等變體的T m 範圍在47至54℃，表示胺基酸取代未引發重大的去穩定。
FIX變體係於其等至mAb0-1886、mAb0-1998及mAb1-1307的結合的方面界定特徵，其係使用表面電漿子共振(SPR)藉由透過C端His標籤捕捉FIX變體。為避免總結合力效果(即確保1：1交互作用)，使用mAb0-1886、mAb0-1998及mAb1-1307之單價變體(分別以mAb4-0673、mAb4-0004及mAb3-3279表示)作為分析物。
SPR分析係在Biacore 4000或Biacore T200儀器(Biacore AB，烏普沙拉，瑞典)上實現。對於在T200儀器上的實驗，應用以下條件：測量係於25℃的溫度下實施。將25μg/ml的抗His抗體(R&D Systems，目錄# MAB050)使用標準胺偶合化學固定在CM5感應晶片上。將25nM的抗FIX變體以10μl/min的流率注射1min並透過其等之His標籤藉由經固定的抗His抗體捕捉。隨後，將分別200nM(以4×稀釋)、1600nM(以3×稀釋)、及2000nM(以3×稀釋)的mAb4-0004、mAb3-3279及mAb4-0673以50μl/min的流率注射5min以允許至經捕 捉的FIX變體的結合，接著為允許單價抗FIX抗體之解離的10min緩衝劑注射。所使用的運作緩衝劑係20mM Tris、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.05% Tween-20、1mg/ml BSA，pH 7.4。亦將此用於稀釋抗FIX抗體及FIX樣本。晶片之再生係使用10mM甘胺酸pH 2.0達成。結合數據只要有可能就根據1：1模型及穩態分析使用由製造商(Biacore AB，烏普沙拉，瑞典)供應的BiaEvaluation 4.1分析。此外，針對所有FIX變體報導捕捉訊號以及針對單價抗體於用於分析中的最高濃度的結合報導Rmax。將類似的實驗設置用於Biacore 4000儀器。
一開始，所有表X中所列FIX變體係使用Biacore 4000儀器針對至全部三種單價抗體(mAb4-0004、mAb3-3279及mAb4-0673)的結合作篩選。該等抗體至於對應於其等分別的表位殘基(由如於實施例6中略述的距離準則定義的)的位置包含突變的FIX變體的結合被(如預期的)不同程度地擾動。對於在不對應於其等分別的表位殘基的位置包含突變的FIX變體，未觀察到顯著的對抗體結合的影響。特別是，於EGF2域作的取代無一具有任何對於至該等抗體之任一者的結合的影響(數據未顯示)
更詳細的結合分析係使用Biacore T200儀器針對被定義為表位殘基(參見實施例6)的殘基實施。結果係於表12給出。
結合數據係以相對於該抗體至野生型FIX的結合該抗體至該FIX變體的%結合的形式報導且係根據下式計算：結合(%)=100%×[(R max_Ab,FIX_var )/(R max_FIXvar )]/[(R max_Ab,FIX_wt )/(R max_FIXwt )]其中Rmax_FIXvar及Rmax_FIXwt分別代表FIX變體及野生型FIX之捕捉水平(RU)，且其中Rmax_Ab,FIX_var及Rmax_Ab,FIX_wt分別代表抗體至經捕捉FIX變體及野生型FIX的結合(RU)。結果係於表12顯示。
表12-來自SPR分析的結果
1)根據SEQ ID NO：1位置
2)100%×[(Rmax_Ab,FIX_var)/(Rmax_FIXvar)]/[(Rmax_Ab,FIX_wt)/(Rmax_FIXwt)]
對於mAb1-1307、mAb0-1998及mAb0-1886的熱點殘基係定義成於該處以丙胺酸取代野生型殘基相對於該抗體至野生型FIX的結合減低該抗體之結合至30%或更低的位置。
對於mAb1-1307(實驗上由mAb3-3279代表)的熱點殘基： H257、K293及N406
對於mAb0-1998(實驗上由mAb4-0004代表)的熱點殘基： R338及K341
對於mAb0-1886(實驗上由mAb4-0673代表)的熱點殘基： D332、R333、L337及R338
對於mAb0-1998及mAb0-1886二者，對結合貢獻最大的殘基係R338；於FIX中以丙胺酸取代R338(R338A)對抗體結合展現最大影響，其對於mAb0-1998及mAb0-1886二者相對於抗體至野生型FIX的結合分別被大大減少至2%。
抗FIXa/FX雙專一性抗體之促凝血活性係基於其等於促凝血磷脂膜存在下促進透過FIXa的FX活化的能力測定。所測試的雙專一性抗體(BiAb)係於表13中列出且包括ACE910以供比較。
各雙專一性抗體之促凝血活性係以於給定抗體濃度下相對於透過自由FIXa的FX活化的刺激倍數的形式報導。雙專一性抗體係以8個濃度(藉由於分析緩衝劑的三倍系列稀釋製作)藉由以於分析緩衝劑(50mM HEPES、100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1%(w/v)PEG8000，pH 7.3+1mg/ml BSA)中的125pM人類血漿衍生性FIXa(Haematologic Technologies Inc,USA)及500μM 25：75磷脂醯絲胺酸：磷脂醯膽鹼磷脂囊泡(Haematologic Technologies Inc,USA)預培養10min來測試。接著活化係藉由添加人類血漿衍生性FX(Haematologic Technologies Inc,USA)至25nM的濃度來起始。在於室溫下的15min活化後，反應(50μl)係藉由添加25μl終止緩衝劑(50mM HEPES、100mM NaCl、60mM EDTA、0.1% PEG8000，pH 7.3+1mg/ml BSA)終止。所產生的FXa之量係藉由添加25μl 2mM S-2765發色受質(Chromogenix，瑞典)並藉由於微盤讀取機中於405nm測量吸光度(△OD/min)以測量發色受質轉化來測定。類似地，透過FIXa的FX活化係於25nM的FIXa濃度及60min的反應時間測定。
所測量的活性係根據於分析中存在的FIXa之濃度及反應時間作標準化。藉由將此數字除以於缺乏抗體下的FXa產生之經類似地標準化的速率，計算通過給定濃度的該抗體之刺激倍數。
總結來說，biAb刺激之計算可如下描述 BiAb刺激=(AFIXa+biAb/([FIXa]分析×t反應))/AFIXa,nom其中AFIXa+biAb係於雙專一性抗體存在下所測量的活性，[FIXa]分析係於分析中的FIXa濃度，t反應係反應時間，且AFIXa,norm係自由FIXa之經標準化活性。
表13列舉於8種所測試的抗體濃度中針對各雙專一性抗體測定的 最大刺激以及觀察到最大刺激的濃度。對於全部的所測試的雙專一性抗體，發現最大刺激高於對於ACE910測量到者，其係於0至15300nM的濃度間隔測試。
雙專一性抗體mAb4-7761、mAb4-7762、mAb4-7789、mAb5-0057、及mAb5-1409(參見表14)之促凝血活性係根據由Hemker等人描述的原理(Pathophysiol Haemost Thromb，2002；32：249-253)以其等於促凝血合成性磷脂膜或血小板存在下促進凝血酶產生的能力的形式測定。包括ACE910以供比較，各抗體(測試化合物)係於凝血酶生產測試(TGT)中於血友病A(HA)患者倒在一起的乏血小板血漿(HA-PPP)及/或HA誘發性人類富血小板血漿 (HA-PRP)中測試。
血液係藉由靜脈穿刺自健康的同意供者獲得。將六倍體積的血液收集至1倍體積的酸檸檬酸右旋糖(ACD；85mM檸檬酸鈉、110mM右旋糖、及62.3mM檸檬酸，pH 4.9)，最終pH 6.5，並於220g於室溫(RT)下離心20min。收集富血小板血漿(PRP)並將血小板濃度以Medonic CA 620血液學分析儀(Boule Diagnostics AB，Spånga，瑞典)測定。將含有紅血球的血漿部分於RT下於600g離心另外10min。收集乏血小板血漿(PPP)並將其用於將PRP稀釋至300,000血小板s/μl。HA條件係藉由添加FVIII中和性抗人類FVIII抗體(綿羊抗人類因子VIII-5mg，Haematologic Technologies,VT,USA)至0.1mg/ml的最終濃度並於RT下以2rpm溫和地旋轉30分鐘而誘發。
於HA-PRP及HA-PPP(George King Bio-Medical Inc,KS,USA)中的凝血酶生產測試(TGT)係藉由標準自動校正凝血酶曲線法(thrombography)使用96槽孔盤螢光計(Fluoroscan Ascent FL,Thermolabsystems，赫爾辛基，芬蘭)執行。反應混合物含有70μl HA-PRP(300,000個血小板/μl)或HA-PPP、10μl 測試化合物稀釋物(於20mM HEPES、140mM NaCl，pH 7.4、2% BSA中稀釋)、20μl含有組織因子(TF)的CAT試劑(PRP試劑；無合成的磷脂的TF，PPP-試劑LOW；有合成的磷脂的TF，1pM TF最終，Thrombinoscope BV，馬斯垂克，荷蘭)或凝血酶校正劑(Thrombinoscope BV)、及20μl的含有經螢光標記的凝血酶受質z-Gly-Gly-Arg-AMC(3mM)及CaCl2(90mM)(thrombinoscope BV)的混合物。TGT係於至多達八個濃度的測試化合物(0.3、1.0、3、10、30、100、300、及900nM，最終血漿濃度)或僅添加緩衝劑(20mM HEPES，140mM NaCl，pH 7.4、2% BSA)(代表HA對照組)下執行。濃度範圍係於至少三個獨立的實驗中於來自相同儲備物的HA-PPP中或於來自四名不同供者的血液中測試。TGT中的正常對照組水平係使用僅添加緩衝劑(20mM HEPES、140mM NaCl，pH 7.4、2% BSA)的未經處理的人類PRP或CRYOcheckTM倒在一起的正常人類PPP血漿(Precision Biologic Inc.，達特茅斯，加拿大)測量。允許TGT繼續進行共90分鐘並藉由Thrombinoscope軟體(Thrombinoscope BV)分析TGT參數峰凝血酶高(nM)。
圖2/表15顯示針對各雙專一性抗體於在HA-PPP中測試的濃度的所測量的峰凝血酶產生速率。數據顯示所有測試化合物皆增加峰凝血酶形成超過於缺乏抗體下觀察到的水平，即展現促凝血活性。此外，針對mAb4-7761、mAb4-7762、mAb4-7789、mAb5-0057、及mAb5-1409的30及300nM間的凝血酶產生水平係高於針對ACE910觀察到者，顯示優越的效力。此外，mAb5-0057及mAb5-1409之於300至900nM的凝血酶產生水平係高於以900nM ACE910觀察到者，顯示此等化合物相較於ACE910較高的效力及效能。
圖3/表16顯示針對mAb5-0057及mAb5-1409於在HA-PRP中測試 的濃度的所測量的峰凝血酶產生水平。於此等條件下，mAb5-0057及mAb5-1409亦展示相較於ACE910為較佳的效力及效能。
表16-雙專一性抗體mAb5-0057、mAb5-1409及ACE910之凝血酶生產測試(TGT)雙專一性抗體mAb5-0057、mAb5-1409及ACE910於經人類組織因子活化的血友病A富血小板血漿(PRP)中的凝血酶生產測試(TGT)。於HA-PRP中來自四個獨立實驗的於所測試化合物濃度之各者的平均峰凝血酶產生±標準差。
mAb1-9016之單價單臂(OA)版本之促凝血活性係根據由Hemker等人(2002)Pathophysiol Haemost Thromb,32：249-253描述的原理基於其於促凝血磷脂膜存在下促進凝血酶產生的能力測定。包括224F3抗體之單臂版本(mAb1-1582)以供比較。各抗體(測試化合物)係於凝血酶生產測試(TGT)中於血友病A(HA)患者倒在一起的乏血小板血漿(HA-PPP)(George King Bio-Medical Inc,KS,USA)中藉由標準自動校正凝血酶曲線法使用96槽孔盤螢光計(Fluoroscan Ascent FL,Thermolabsystems，赫爾辛基，芬蘭)測試。反應混合物含有70μl HA-PPP、10μl測試化合物(於20mM HEPES、140mM NaCl，pH 7.4、2% BSA中稀釋)、20μl含有經活化人類血漿衍生性因子XI(hFXIa，8.3mU/mL最終)(Enzyme Research Laboratories,IN,USA)或凝血酶校正劑(Thrombinoscope BV)的PRP試劑(合成的磷脂，thrombinoscope BV，馬斯垂克，荷蘭)、及20μl含有經螢光標記凝血酶受質Z-Gly-Gly-Arg-AMC(3mM)及CaCl2(90mM)(thrombinoscope BV)的混合物。TGT係於五種濃度的測試化合物(30、100、300、600及900nM，最終血漿濃度)或僅添加緩衝劑(20mM HEPES， 140mM NaCl，pH 7.4、2% BSA)(代表HA對照組)下執行。濃度範圍係於二個獨立的實驗於來自相同儲備物的HA-PPP中測試。允許TGT繼續進行共90分鐘並藉由Thrombinoscope軟體(thrombinoscope BV)分析TGT參數峰凝血酶高(nM)。圖4及表17顯示/列表對於各單價單臂抗體於所測試濃度下測量的峰凝血酶產生速率。數據顯示mAb1-9016之OA抗體版本增加峰凝血酶形成超過於缺乏抗體下觀察到的水平，即展現促凝血活性。此外，由mAb1-9016之OA抗體版本誘發的凝血酶產生係高於對於224F3抗體之單價OA版本(mAb1-1582)觀察到者。
對於抗FIX/FIXa及抗FX/FXa抗體分別至FIX/FIXa及FX/FXa的結合之結合親和力係藉由等溫滴定熱量測定法(ITC)藉由使用PEAQ-ITC熱量計(馬爾文，UK)測量。實驗係於37℃及pH 7.4下使用25mM Tris、150mM NaCl、5mM CaCl2(Tris-緩衝劑)實施。含有FIX、FIXa、FX或FXa及抗FIX/FIXa及抗 FX/FXa抗體的樣本細胞(200μl)係藉由注射器注射。所有蛋白質皆在測量前於Tris-緩衝劑中大範圍透析以確保適當的緩衝條件。熱平衡步驟後為60-s延遲及隨後的抗體之最初0.2-μl注射，之後為2.5μl的抗體以120s的間隔的14個注射。將攪拌速度維持在750rpm，且將參考功率保持恆定於5-10μcal/s。將與抗體之各注射有關的熱併入並相對於配體比巨分子之莫耳比率作圖。將所得的等溫線擬合至單點結合模型以使用製造商提供的軟體獲得親和力(KD)、化學計量(n)、及交互作用之焓(△H)。實驗係以二重複或三重複執行。
雖然本發明之一些特徵已於本文中闡明及描述，許多修飾、取代、改變、及同等物對所屬技術領域中具有通常知識者現會存在。因此，應瞭解所附申請專利範圍係意欲涵蓋落入本發明之真正精神的所有如此修飾及改變。
<110> 諾佛．儂迪克股份有限公司
<120> 促凝血抗體
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Claims (14)
- 一種多專一性抗體或其抗原結合片段，其能夠刺激FIXa針對FX的酵素活性，其包含能夠結合至FIX(SEQ ID NO：1)及/或其活化型FIXa的第一抗原結合位置、及能夠結合至FX(SEQ ID NO：2)及/或其活化型FXa的第二抗原結合位置。
- 根據申請專利範圍第1項的抗體或其抗原結合片段，其中該第一抗原結合位置能夠結合包含FIX/FIXa之胺基酸殘基R338的表位，及其中該第二抗原結合位置能夠於FX/FXa之EGF-2域及/或催化性次單元中結合。
- 根據申請專利範圍第1或2項的抗體或其抗原結合片段，其中該第一抗原結合位置能夠結合包含FIX/FIXa之胺基酸殘基R338及K341的表位。
- 根據申請專利範圍第3項的抗體或其抗原結合片段，其中該第一抗原結合位置能夠結合包含FIX/FIXa之胺基酸殘基L337、R338、S339、T340、K341及T343的表位。
- 根據申請專利範圍第1或2項的抗體或其抗原結合片段，其中該第一抗原結合位置能夠結合包含FIX/FIXa之胺基酸殘基D332、R333、L337及R338的表位，且其中該第二抗原結合位置能夠於FX/FXa之EGF-2域及/或催化性次單元中結合。
- 根據申請專利範圍第5項的抗體或其抗原結合片段，其中該第一抗原結合位置能夠結合包含FIX/FIXa之胺基酸殘基K301、D332、R333、A334、T335、R338及N346的表位。
- 根據前述申請專利範圍請求項中之任一項的抗體或其抗原結合片段，其中該第二抗原結合位置能夠結合包含FX/FXa之胺基酸殘基R113、Y230、 K420、D423及K427的表位。
- 根據前述申請專利範圍請求項中之任一項的抗體或其抗原結合片段，其中該第二抗原結合位置能夠結合包含FX/FXa之胺基酸殘基H101、E103、R113、T116、L117、A118、T127、S227、E228、F229、Y230、E266、R287、P304、E305、L333、L419、K420、D423、R424、M426、K427及T428之多者之一者的表位。
- 根據申請專利範圍第1項的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與參考抗體競爭對於FIX/FIXa之結合，其中該參考抗體包含a)由SEQ ID NO：15識別的重鏈可變域及由SEQ ID NO：16識別的輕鏈可變域、或b)由SEQ ID NO：17識別的重鏈可變域及由SEQ ID NO：18識別的輕鏈可變域、或c)由SEQ ID NO：19識別的重鏈可變域及由SEQ ID NO：20識別的輕鏈可變域。
- 根據前述申請專利範圍請求項中之任一項的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段係雙專一性抗體。
- 根據前述申請專利範圍請求項中之任一項的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含a.由SEQ ID NO：177識別的抗FIX/FIXa重鏈可變域之CDR序列及由SEQ ID NO：178識別的抗FIX/FIXa輕鏈可變域之CDR序列、及由SEQ ID NO：179識別的抗FX/FXa重鏈可變域之CDR序列及由SEQ ID NO：180識別的抗FX/FXa輕鏈可變域之CDR序列b.由SEQ ID NO：181識別的抗FIX/FIXa重鏈可變域之CDR序列及由SEQ ID NO：182識別的抗FIX/FIXa輕鏈可變域之CDR序列、及由SEQ ID NO：183識別的抗FX/FXa重鏈可變域之CDR序列及由SEQ ID NO：184識別的抗FX/FXa輕鏈可變域之CDR序列c.由SEQ ID NO：187識別的抗FIX/FIXa重鏈可變域之CDR序列及由SEQ ID NO：188識別的抗FIX/FIXa輕鏈可變域之CDR序列及由SEQ ID NO：185識別的抗FX/FXa重鏈可變域之CDR序列及由SEQ ID NO：186識別的抗FX/FXa輕鏈可變域之CDR序列，
- 一種用於治療凝血病變或凝血病症的方法中之根據前述申請專利範圍請求項中之任一項的抗體或其抗原結合片段。
- 一種醫藥組成物，其包含根據前述申請專利範圍請求項中之任一項的抗體或其抗原結合片段，其係用於治療凝血病變或凝血病症，諸如具有的血友病A或具有抑制子的血友病A。
- 一種治療患有諸如具有的血友病A或具有抑制子的血友病A的凝血病變凝血病症的對象的方法，其包含將根據前述申請專利範圍請求項中之任一項的抗體或其抗原結合片段投予至該對象。
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