BR112019015611A2 - Anticorpos pró-coagulantes - Google Patents

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Abstract

a presente invenção refere-se a anticorpos pró-coagulantes aprimorados que incluem anticorpos biespecíficos capazes de se ligar ao fator ix de coagulação (fix) ou a sua forma ativada, fator ixa (fixa), e, opcionalmente, ao fator x (fx) e a sua forma ativada, fator xa (fxa), e de promover a ativação do fx pelo fixa, anticorpos que se ligam a seus epitopos e métodos .e composição para o tratamento de sujeitos que sofrem de uma coagulopatia, tal como hemofilia a

Description

ANTICORPOS PRÓ-COAGULANTES.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA [001] A Listagem de Sequência, intitulada 160163WO02_ST25, tem 198 kilobytes e foi criada em 30-JAN-2018 e está incorporada neste documento por referência.
ANTECEDENTES [002] Em pacientes com uma coagulopatia, tal como em seres humanos com hemofilia A e B, várias etapas da cascata de coagulação se tornam disfuncionais devido, por exemplo, à ausência ou presença insuficiente de um fator de coagulação funcional. Essa disfunção de uma parte da cascata de coagulação resulta na coagulação sanguínea insuficiente e hemorragia com potencial risco de morte, ou danos aos órgãos internos, tais como às articulações.
[003] A deficiência do Fator de Coagulação VIII (FVIII), comumente referida como hemofilia A, é um distúrbio hemorrágico congênito que afeta aproximadamente 420.000 pessoas no mundo todo, em que cerca de 105.000 são atualmente diagnosticadas.
[004] Pacientes com hemofilia A podem receber terapia de reposição do fator de coagulação, tal como FVIII exógeno. O tratamento convencional consiste na terapia de reposição, fornecida como profilaxia ou tratamento sob demanda dos episódios hemorrágicos. Até recentemente, o tratamento profilático para um paciente com hemofilia A grave era de até três injeções intravenosas/semana com o FVIII derivado do plasma ou FVIII recombinante ou suas variantes de ação prolongada.
[005] No entanto, esses pacientes estão em risco de desenvolver anticorpos neutralizantes, os assim chamados inibidores, a esses fatores exógenos, tornando a terapia, anteriormente eficiente, ineficaz.
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Pacientes com hemofilia A com inibidores são um exemplo não limitante de uma coagulopatia que é parcialmente congênita e parcialmente adquirida. Pacientes que desenvolveram inibidores para o FVIII não podem ser tratados com a terapia de reposição convencional. Recentemente, uma nova droga, Hemlibra, foi aprovada para tratamento profilático subcutâneo da hemofilia A com inibidores. Os fatores de coagulação exógenos podem ser administrados apenas por via intravenosa, que é inconveniente e de desconforto considerável para os pacientes. Por exemplo, crianças e crianças pequenas podem precisar ter cateteres intravenosos inseridos cirurgicamente em uma veia do tórax para garantir o acesso venoso. Isso os deixa em grande risco de desenvolver infecções bacterianas. Assim, mesmo com a entrada do Hemlibra, há a necessidade de tratamento subcutâneo alternativo na hemofilia com inibidores.
[006] Em um indivíduo com hemorragia, a coagulação é iniciada pela formação do complexo Fator Tecidual/Fator Vila (TF/FVIIa) quando o TF extravascular é exposto ao FVII ativado (FVIIa) no sangue. A formação do complexo TF/FVIIa leva à ativação do Fator X de coagulação (FX) ao Fator Xa de coagulação ativado (FXa) que, juntamente com o Fator V de coagulação ativado (FVa), gera uma quantidade limitada de trombina que, por sua vez, ativa as plaquetas do sangue. As plaquetas ativadas suportam a montagem do complexo tenase composto pelo Fator VIII ativado (FVIIIa) e pelo Fator IX de coagulação ativado (FIXa). O complexo tenase é um catalisador muito eficiente da ativação de FX e o FXa gerado nesta segunda etapa serve como a protease ativa no complexo pró-trombinase de FVa/FXa que é responsável pelo surgimento de trombina final. A trombina cliva o fibrinogênio para gerar monômeros de fibrina, que se polimerizam para formar uma rede de fibrina que veda o vaso rompido e pára o sangramento. O surgimento rápido e vasto de trombina é um pré
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3/157 requisito para a formação de um coágulo de fibrina sólido e estável. [007] Uma formação de FXa inadequada e geração reduzida de trombina causadas pela atividade reduzida ou ausente de FVIII é a razão básica da diátese para hemorragia em paciente com hemofilia A. [008] Como mencionado, a conversão proteolítica de FX em sua forma enzimaticamente ativa, FXa, pode ser obtida pelo complexo de ativação de FX intrínseco que compreende FIXa e seu cofator FVIIIa. A ligação do cofator aumenta a atividade enzimática de FIXa em cerca de cinco vezes e acredita-se resultar através de múltiplos mecanismos, conforme resumido por Scheiflinger et al. (2008) J Thromb Haemost, 6:315-322. Particularmente, descobriu-se que o FVIIIa estabiliza uma conformação de FIXa que tem uma maior atividade proteolítica em relação ao FX (Kolkman JA, Mertens K (2000) Biochemistry, 39:73987405, Zõgg T, Brandstetter H (2009) Biol Chem, 390:391-400). Com base nesta observação e percebendo que os anticorpos são proteínas de ligação versáteis capazes de imitar uma variedade de interações de proteína-proteína, Scheiflinger et al. realizaram uma triagem para anticorpos agonistas anti-FIXa caracterizados por uma capacidade em intensificar a ativação de FX por FIXa na presença de uma superfície fosfolipídica e cálcio, mas na ausência do cofator natural FVIIIa. A partir de uma triagem de 5280 sobrenadantes de hibridoma, descobriram-se 88 como produzindo anticorpos que apresentavam diversos graus de atividade agonista de FIXa, cf. EP1220923 B1 e EP1660536 B1. Em relação à cinética da ativação de FX e à capacidade em estimular a geração de trombina no plasma humano deficiente de FVIII, EP1660536 B1 aponta consistentemente para 224F3 como o anticorpo mais eficiente (cf., por exemplo, seções 0060 e 0062).
[009] ACE910 ou Emicizumab (nome comercial Hemlibra®) é um anticorpo monoclonal anti-FIX(a)/anti-FX(a) biespecífico humanizado desenvolvido pela Chugai Pharmaceutical para o tratamento da
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4/157 hemofilia A. ACE910 é projetado para imitar a função do cofator FVIII (vide Sampei etal.: (2013) PLoS One, 8, e57479 e WO2012067176). [0010] Ainda existem muitas necessidades médicas não satisfeitas na comunidade da hemofilia, em particular, e em sujeitos com coagulopatias, em geral e na presente invenção relacionados a compostos aprimorados capazes de substituir o FVIII e, assim, serem úteis no tratamento de uma coagulopatia, tal coo a hemofilia A.
SUMÁRIO [0011] A presente invenção refere-se a compostos que servem como um substituto para o Fator VIII de coagulação (FVIII) em pacientes que sofrem de uma coagulopatia e, em particular, em pacientes em que falta o FVIII funcional, tais como pacientes com hemofilia A, incluindo pacientes com hemofilia A com inibidores.
[0012] Portanto, um aspecto da presente invenção refere-se a compostos capazes de melhorar a geração de FXa e, assim, restaurar parcial ou completamente a coagulação em pacientes em que falta o FVIII.
[0013] Em um aspecto, o composto é um anticorpo. Nesse aspecto, o composto é um anticorpo multiespecífico, tal como um anticorpo biespecífico.
[0014] Em um aspecto específico, a invenção refere-se a anticorpos do pró-coagulantes que servem como um substituto para o FVIII em pacientes em que falta o FVIII, tais como em paciente com hemofilia A. [0015] Nesse aspecto, o anticorpo se liga e aumenta a atividade enzimática de FIXa em relação ao FX, se ligando também, opcionalmente, ao FX.
[0016] Em um aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo prócoagulante que se liga ao FX, incluindo anticorpos pró-coagulantes biespecíficos que aumentam a atividade enzimática de FIXa em relação ao FX e a ligação do FX.
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5/157 [0017] Em um aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo biespecífico pró-coagulante que é capaz de se ligar ao FIX/FIXa e FX/FXa de coagulação.
[0018] Em um aspecto, o anticorpo é humano ou humanizado.
[0019] Um outro aspecto da invenção refere-se aos anticorpos individuais ou a seus fragmento de ligação a antígeno que são parte de um anticorpo pró-coagulante, tal como um anticorpo anti-FIX ou antiFlXa específico ou seu fragmento de ligação a antígeno. Um outro aspecto da invenção refere-se aos anticorpos individuais ou a seus fragmento de ligação a antígeno que são parte de um anticorpo prócoagulante, tal como um anticorpo anti-FX ou anti-FXa específico ou seu fragmento de ligação a antígeno.
[0020] Um outro aspecto da invenção refere-se à fabricação dos anticorpos - e de seus intermediários - conforme descrito neste documento.
[0021] Um outro aspecto da invenção refere-se a um anticorpo que compete com um anticorpo pró-coagulante ou seu fragmento de ligação a antígeno, conforme descrito neste documento, pela ligação ao FIX/FIXa.
[0022] Um outro aspecto da invenção refere-se a um anticorpo prócoagulante que compete com um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, conforme descrito neste documento, pela ligação ao FX/FXa.
[0023] Ainda outro aspecto da invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo prócoagulante, conforme descrito neste documento, formulado para a distribuição do referido anticorpo para a prevenção e/ou tratamento de uma coagulopatia.
[0024] Ainda outro aspecto da invenção direciona-se aos anticorpos pró-coagulantes descritos neste documentos para prevenção e/ou
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6/157 tratamento de uma coagulopatia, de uma doença que acompanha uma coagulopatia, ou de uma doença causada por uma coagulopatia.
[0025] A invenção também pode resolver outros problemas que estarão evidentes a partir da descrição das modalidades exemplares.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0026] A Figura 1 mostra as sequências alinhadas das SEQ ID NOs:3-188, em que a Região Determinante de Complementariedade 1, 2 e 3 (CDR1, CDR2 e CDR3) dos domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve foram destacados consecutivamente em caixas.
[0027] A Figura 2 mostra dados do teste de geração de trombina (TGT) a partir dos anticorpos biespecíficos mAb4-7761, mAb4-7762, mAb4-7789, mAb5-0057, mAb5-1409 e ACE910 no plasma humano de paciente com hemofilia A deficiente em plaquetas com fator tecidual ativado (HA-PPP). O experimento foi realizado conforme descrito no Exemplo 17. As linhas tracejadas e pontilhadas indicam o nível de pico de trombina (nM) observado na ausência do anticorpo anti-FVI11 em HAPPP e PPP normal, respectivamente, e com sua derivação padrão indicada pelas linhas tracejadas. Os perfis de mAb4-7761, mAb4-7762, mAb4-7789, mAb5-0057 e mAb5-1409 estão indicados por triângulos apontados para cima, enquanto que os de ACE910 estão indicados por triângulos apontados para baixo. Exp. A - D refere-se a experimentos independentes; dentro de cada um desses experimentos, o nível de pico de trombina em cada concentração de anticorpo representa a média ± desvio padrão de pelo menos três execuções independentes.
[0028] A Figura 3 mostra dados do teste de geração de trombina (TGT) a partir dos anticorpos biespecíficos mAb5-0057, mAb5-1409 e ACE910 no plasma humano de paciente com hemofilia A rico em plaquetas com fator tecidual ativado (HA-PRP). O experimento foi realizado conforme descrito no Exemplo 17. As linhas tracejadas e pontilhadas indicam o nível de pico de trombina (nM) observado na
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7/157 ausência do anticorpo anti-FVIII em HA-PRP e PRP normal, respectivamente, e com sua derivação padrão indicada pelas linhas tracejadas. Os perfis de mAb5-0057 e mAb5-1409 estão indicados por triângulos apontados para cima, enquanto que os de ACE910 estão indicados por triângulos apontados para baixo. Os resultados são mostrados como média ± desvio padrão de quatro experimentos independentes.
[0029] A Figura 4 mostra dados do teste de geração de trombina (TGT) a partir dos anticorpos de um braço (OA) monovalentes de mAb1 9016 e 224F3 no plasma humano deficiente em plaquetas com Fator Xla ativado. O experimento foi realizado conforme descrito no Exemplo 18. As linhas pontilhadas indicam o nível de pico de trombina médio (nM) observado na ausência de anticorpo e com seu desvio padrão (± 1 SD) indicado pelas linhas tracejadas. Os perfis de versões de OA de mAb1-9016 e 224F3 (mAb1-1582) estão indicadas pelos triângulos apontados para cima e para baixo, respectivamente.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS [0030] SEQ ID NO:1 é a sequência de aminoácidos do Fator IX de coagulação humana.
[0031] SEQ ID NO:2 é a sequência de aminoácidos do Fator X de coagulação humana.
[0032] SEQ ID NO:3-188 são as sequências do domínios variáveis de cadeia pesada (Vh) e domínios variáveis de cadeia leve (Vl) de anticorpos monoclonais anti-FIX e anti-FX (mAbs) descritos neste documento. IDs para anticorpos de um braço (OA) correspondentes, bem como certos anticorpos biespecíficos, também são mostrados na tabela. As sequências de CDR1-3 são destacadas em caixas na Figura
1.
[0033] Visão geral das abreviações de anticorpos, alvo e SEQ ID NOs para sequências Vh e Vl correspondentes:
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OA ou anticorpo biespecífico ID mAb ID Alvo SEQ ID NO (Vh) SEQ ID NO (Vl)
1-4857 FIX 3 4
1-4861 FIX 5 6
1-4707 FIX 7 8
1-4763 FIX 9 10
1-4071 FIX 11 12
1-4624 FIX 13 14
4-0004 0-1998 FIX 15 16
3-3279 1-1307 FIX 17 18
4-0673 0-1886 FIX 19 20
4-6934 1-6723 FX 21 22
1-6705 FX 23 24
1-6716 FX 25 26
1-6721 FX 27 28
1-6730 FX 29 30
1-6731 FX 31 32
1-6737 FX 33 34
1-6754 FX 35 36
1-7378 FX 37 38
1-7388 FX 39 40
1-7413 FX 41 42
1-7424 FX 43 44
1-7441 FX 45 46
1-7447 FX 47 48
1-7449 FX 49 50
1-7462 FX 51 52
1-7466 FX 53 54
1-7481 FX 55 56
1-7483 FX 57 58
1-7563 FX 59 60
1-7571 FX 61 62
1-7591 FX 63 64
1-1371 FX 65 66
1-1376 FX 67 68
0-2000 FIX 69 70
0-2001 FIX 71 72
0-2003 FIX 73 74
1-0072 FIX 75 76
1-0073 FIX 77 78
1-0970 FIX 79 80
1-0982 FIX 81 82
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OA ou anticorpo biespecífico ID mAb ID Alvo SEQ ID NO (Vh) SEQ ID NO (Vl)
1-0985 FIX 83 84
0-1448 FIX 85 86
1-0021 FX 87 88
1-1335 FIX 89 90
1-5788 FIX 91 92
1-2375 FX 93 94
4-3461 1-5754 FIX 95 96
4-3486 1-5781 FIX 97 98
4-3490 1-5783 FIX 99 100
4-3503 1-5796 FIX 101 102
4-3505 1-5797 FIX 103 104
4-5337 1-6566 FIX 105 106
4-5347 1-6582 FIX 107 108
4-5355 1-6584 FIX 109 110
4-5342 1-6586 FIX 111 112
4-5357 1-6590 FIX 113 114
4-5344 1-6592 FIX 115 116
4-5368 1-6606 FIX 117 118
4-5375 1-6609 FIX 119 120
4-9578 1-7977 FIX 121 122
5-0900 1-8459 FIX 123 124
5-0908 1-8467 FIX 125 126
5-0514 1-8543 FIX 127 128
5-0658 1-8679 FIX 129 130
5-0144 1-8780 FIX 131 132
5-0152 1-8782 FIX 133 134
5-0161 1-8785 FIX 135 136
5-1257 1-9002 FIX 137 138
5-1263 1-9015 FIX 139 140
5-1270 1-9016 FIX 141 142
5-1528 1-9058 FIX 143 144
5-1695 1-9134 FIX 145 146
5-2035 1-9285 FIX 147 148
4-5925 1-4857/1-6723 FIX/FX 149,151 150,152
4-7687 1-6037/1-6723 FIX/FX 153,155 154,156
4-7756 1-6584/1-6723 FIX/FX 159,157 160,158
4-7758 1-6584/1-6097 FIX/FX 163,161 164,162
4-7762 1-6584/1-6738 FIX/FX 167,165 168,166
4-7786 1-6081/1-6463 FIX/FX 171,169 172,170
4-7789 1-6584/1-6463 FIX/FX 175,173 176,174
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OA ou anticorpo biespecífico ID mAb ID Alvo SEQ ID NO (Vh) SEQ ID NO (Vl)
5-0057 1-8768/1-6723 FIX/FX 177,179 178,180
5-1409 1-8768/1-7503 FIX/FX 181,183 182,184
4-7761 1-5743/1-6738 FIX/FX 187,185 188,186
[0034] A primeira coluna (OA ou anticorpo biespecífico ID) contém abreviações para anticorpos de um braço (OA) monovalentes e/ou anticorpos biespecíficos. A segunda coluna (mAb ID) representa abreviações para anticorpos de componentes correspondentes (para anticorpos biespecíficos, o primeiro anticorpo mencionado na segunda coluna é um anticorpo anti-FIX/FIXa e o segundo é um anticorpo antiFX/FXa). A quarta (SEQ ID NO (VH)) e quinta (SEQ ID NO (VL)) coluna representam as SEQ ID NOs para as sequências Vh e Vl, respectivamente, com a primeira SEQ ID NO em cada coluna representando o anticorpo anti-FIX/FIXa, e a segunda, o anticorpo antiFX/FXa.
DESCRIÇÃO [0035] Em sujeitos com uma coagulopatia, tal como em seres humanos com hemofilia A, a cascata de coagulação se torna disfuncional devido à ausência ou presença insuficiente do FVIII funcional. Essa disfunção de uma parte da cascata de coagulação resulta na coagulação sanguínea insuficiente e hemorragia com potencial risco de morte, ou danos aos órgãos internos, tais como às articulações. A presente invenção refere-se a compostos que servem como um substituto para o Fator VIII de coagulação (FVIII) em pacientes que sofrem de uma coagulopatia e, em particular, em pacientes em que falta o FVIII funcional, tais como pacientes com hemofilia A, incluindo pacientes com hemofilia A com inibidores. Em um aspecto, tal composto é um anticorpo.
[0036] Em particular, os inventores da presente invenção
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11/157 surpreendentemente identificaram anticorpos que imitam a atividade do cofator FVIII com alta potência e eficácia.
[0037] Em um aspecto específico, a invenção refere-se a anticorpos do pró-coagulantes que servem como um substituto para o FVIII em pacientes em que falta o FVIII funcional, tais como em paciente com hemofilia A.
[0038] Nesse aspecto, os anticorpos pró-coagulantes se ligam e aumentam a atividade enzimática do Fator IXa de coagulação (FIXa) em relação ao Fator X de coagulação (FX), se ligando também, opcionalmente, ao FX. Nesse aspecto, os anticorpos da invenção são anticorpos biespecíficos capazes de se ligar ao FIX/FIXa e ao FX.
Fator IX de Coagulação [0039] O FIX é um fator de coagulação dependente da vitamina K com similaridades estruturais ao Fator VII, protrombina, Fator X e Proteína C. A forma de zimógeno circulante consiste em 415 aminoácidos dividido em quatro domínios distintos compreendendo um domínio N-terminal rico em ácido γ-carboxiglutâmico (Gla), dois domínios EGF e um domínio C-terminal serina protease similar à tripsina. O FIX circula no plasma como um zimógeno de cadeia única (SEQ ID NO:1). A ativação do FIX ocorre por proteólise limitada em Arg145 e Arg180 para liberar o peptídeo de ativação (resíduos 146 ao 180 da SEQ ID NO:1). Assim, o FIX ativado (FIXa) é composto de resíduos 1-145 da SEQ ID NO:1 (cadeia leve) e resíduos 181-415 da SEQ ID NO:1 (cadeia pesada).
[0040] As moléculas de FIX circulantes compreendem, assim, o zimógeno de FIX e a forma ativada de FIX que são geralmente referidas, neste documento, como FIX e FIXa com referência à SEQ ID NO:1.
[0041] O Fator IX Ativado é referido como Fator IXa ou FIXa. O termo FIX (SEQ ID NO:1) e/ou sua forma ativada (FIXa) também pode ser referido como FIX/FIXa ou FIX(a).
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12/157 [0042] O FIXa é uma serina protease similar à tripsina que serve um papel fundamental na hemostasia, gerando, como parte do complexo tenase, a maior parte do Fator Xa necessária para suportar a formação adequada de trombina durante a coagulação.
[0043] O FIX é, neste documento, representado pela SEQ ID NO:1 correspondente à forma alélica Ala148 do FIX humano (Anson et al. EMBO J. 1984 3:1053-1060; McGraw et al., Proc Natl Acad Sei USA. 1985 82:2847-2851; Graham et al. Am. J. Hum. Genet. 1988 42:573580). Na presente invenção, o FIX destina-se a cobrir todas as variantes naturais do FIX, tais como a variante T148 (Uniprot ID P00740).
Fator X de Coagulação [0044] O FX é um fator de coagulação dependente da vitamina K com similaridades estruturais ao Fator VII, protrombina, FIX e Proteína C. O zimógeno de FX humano compreende quatro domínios distintos compreendendo um domínio N-terminal rico em ácido gamacarboxiglutâmico (Gla), dois domínios EGF e um domínio C-terminal serina protease similar à tripsina. O FX circula no plasma como um zimógeno de duas cadeias incluindo os resíduos 1 -139 da SEQ ID NO:2 (cadeia leve) e resíduos 143-448 da SEQ ID NO:2 (cadeia pesada). A ativação do FX ocorre por proteólise limitada na Arg194, o que resulta na liberação do peptídeo de ativação (Aa143-194). Assim, o FX ativado (FXa) é composto de resíduos 1-139 da SEQ ID NO:2 (cadeia leve) e resíduos 195-448 da SEQ ID NO:2 (cadeia pesada ativada). As moléculas de FX circulantes compreendem, assim, o zimógeno de FX e a forma ativada de FX que são então referidas, neste documento, como FX e FXa, respectivamente, com referência à SEQ ID NO:2. Na presente invenção, o FX destina-se a cobrir todas as variantes naturais do FX. O termo FX (SEQ ID NO:2) e/ou sua forma ativada (FXa) também pode ser referido como FX/FXa ou FX(a).
Anticorpos
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13/157 [0045] O termo anticorpo, neste documento, refere-se a uma proteína, derivada de uma sequência de imunoglobulina, que é capaz de se ligar a um antígeno ou uma porção deste. O termo anticorpo inclui, mas não está limitado a, anticorpos de comprimento total de qualquer classe (ou isotipo), ou seja, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM e/ou IgY. O termo anticorpo inclui - mas não está limitado a - anticorpos que sejam bivalentes, tais como anticorpos biespecíficos.
[0046] Anticorpos naturais de comprimento total compreendem pelo menos quatro cadeias polipeptídicas: duas cadeias pesadas (HC) e duas cadeias leves (LC) que são conectadas por ligações dissulfeto. Em alguns casos, os anticorpos naturais compreendem menos de quatro cadeias, como no caso dos IgNARs encontrados em Chondrichthyes. Uma classe de imunoglobulinas de interesse farmacêutico particular são as IgGs. Em humanos, a classe de IgG pode ser dividida em quatro subclasses lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4, com base na sequência de suas regiões constantes de cadeia pesada. As cadeias leves podem ser divididas em dois tipos, cadeias kappa e lambda, com base nas diferenças na composição de sua sequência. As moléculas de IgG são compostas por duas cadeias pesadas, interligadas por duas ou mais ligações dissulfeto, e duas cadeias leves, cada uma ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto. Uma cadeia pesada de IgG pode compreender um domínio variável de cadeia pesada (Vh) e até três domínios constantes de cadeia pesada (Ch): Ch1, Ch2 e Ch3. Uma cadeia leve pode compreender um domínio variável de cadeia leve (Vl) e um domínio constante de cadeia leve (Cl). As regiões Vh e Vl podem ser ainda subdividas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementariedade (CDRs) ou regiões hipervariáveis (HvRs), interespaçadas com regiões que sejam mais conservadas, denominadas regiões de framework (FR). Os domínios Vh e Vl são normalmente compostos por três CDRs e quatro FRs,
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14/157 dispostos do terminal amino para o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Os domínios variáveis de cadeia pesada e leve contendo as regiões hipervariáveis (CDRs) formam uma estrutura que é capaz de interagir com um antígeno, enquanto que a região constante de um anticorpo pode mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo, mas não se limitando a, diversas células do sistema imunológico (células efetoras), receptores Fc e o primeiro componente, C1q, do complexo C1 do sistema do complemento clássico.
[0047] Os anticorpos da invenção podem ser anticorpos monoclonais (mAbs), no sentido de que representam um conjunto de sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve exclusivas, conforme expressas a partir de uma única célula B ou por uma população clonal de células B. Os anticorpos da invenção podem ser produzidos e purificados usando vários métodos que são conhecidos pelos versados na técnica. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos a partir de células de hibridoma. Os anticorpos podem ser produzidos pela expansão de células B. Os anticorpos ou seu fragmento podem ser expressos de forma recombinante em sistemas de expressão de mamíferos ou microbiana, ou por tradução in vitro. Os anticorpos ou seu fragmento também podem ser expressos de forma recombinante como moléculas ligadas na superfície celular por meio de, por exemplo, exibição em fago (phage display), exibição bacteriana, exibição em levedura, exibição em células de mamíferos ou exibição em ribossoma ou mRNA.
[0048] Os anticorpos da presente invenção podem ser isolados. O termo anticorpo isolado refere-se a um anticorpo que foi separado e/ou recuperado de outro(s) componente(s) no ambiente em que foi produzido e/ou que foi purificado a partir de uma mistura de componentes presentes no ambiente em que foi produzido.
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15/157 [0049] Certos fragmentos de ligação a antígeno de anticorpos podem ser adequados no contexto da presente invenção, uma vez que foi demonstrado que a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. O termo fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo referese a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente ou reconhecer um antígeno, tal como FIX/FIXa, FX/FXa ou outra molécula alvo, conforme descrito neste documento. Exemplos de fragmentos de ligação a antígeno incluem (mas não estão limitados a) Fab, Fab’, Fab2, Fab’2, Fv (normalmente a combinação dos domínios Vl e Vh de um braço único de um anticorpo), Fv de cadeia única (scFv); vide, por exemplo, Bird et al. Science 1988; 242:423-426; e Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883), dsFv, Fd (normalmente os domínios Vh e Ch1), moléculas monovalentes compreendendo um domínio único Vh e um único Vl; minibodies, diabodies, triabodies, tetrabodies, e kappa bodies (vide, por exemplo, III et al (1997) Protein Eng 10: 949-57); bem como uma ou mais CDRs isoladas ou um parátopo funcional, em que as CDRs isoladas ou os resíduos ou polipeptídeos de ligação a antígeno podem ser associados ou ligados de modo a formar um fragmento de anticorpo funcional. Esses fragmentos de anticorpo podem ser obtidos usando técnicas convencionais conhecidas aos versados na técnica, e os fragmentos podem ser triados para utilidade da mesma maneira que os anticorpos intactos.
[0050] Fragmentos Fab de um anticorpo, incluindo os fragmentos Fab e Fab’2” podem ser derivados de um anticorpo pela divagem da cadeia pesada na região de dobradiça no lado N-terminal ou C-terminal, respectivamente, dos resíduos de cisteína de dobradiça que conectam as cadeias pesadas do anticorpo. Um fragmento Fab inclui os domínios variáveis e constantes da cadeia leve e do domínio variável e
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16/157 o domínio Ch1 da cadeia pesada. Os fragmentos Fab’2 compreendem um par de fragmentos Fab’ que são geralmente ligados de forma covalente por suas cisteínas de dobradiça. Um Fab’ é formalmente derivado de um fragmento Fab’2 pela divagem das ligações dissulfeto da dobradiça que conecta as cadeias pesadas no Fab’2. Outros acoplamentos químicos diferentes das ligações dissulfeto dos fragmentos de anticorpo também são conhecidos na técnica. Um fragmento Fab retém a capacidade do anticorpo original de se ligar a seu antígeno, potencialmente com uma afinidade menor. Os fragmentos Fab’2 são capazes de se ligar de forma bivalente, enquanto os fragmentos Fab e Fab’ podem se ligar apenas de forma monovalente. Geralmente, os fragmentos Fab não possuem os domínios constantes Ch2 e Ch3, isto é, a parte Fc, em que a interação com os receptores Fc e C1q ocorrería. Assim, os fragmentos Fab são em geral desprovidos de funções efetoras. Os fragmentos Fab podem ser produzidos pelos métodos conhecidos na técnica, ou por divagem enzimática de um anticorpo, por exemplo, usando papaína para obter 0 Fab ou pepsina para obter 0 Fab’2, os fragmentos Fab, incluindo Fab, Fab’, Fab’2 podem ser produzidos de forma recombinante usando técnicas que são bem conhecidas aos versados na técnica.
[0051] Um fragmento Fv (variável de fragmento) é um fragmento de anticorpo que contém um sítio de reconhecimento e de ligação a antígeno completo e geralmente compreende um domínio variável de uma cadeia leve e uma pesada em associação que pode ser de natureza covalente, por exemplo, em um fragmento de domínio variável de cadeia única (scFv). É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação a antígeno na superfície do dímero Vh-Vl. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis ou um subconjunto destas conferem especificidade de ligação a antígeno ao anticorpo.
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17/157 [0052] O anticorpo Fv de cadeia única ou scFv compreende os domínios Vh e Vl de anticorpo, onde esses domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Geralmente, o polipeptídeo Fv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios Vh e Vl que permite que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antígeno. Para uma revisão de scFv, veja Pluckthun, 1994, In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg e Moore eds. Springer-Verlag, Nova York, pp. 269-315.
[0053] O anticorpo Fab de cadeia única ou scFab compreende os domínios Vh, Ch1, Vl e Cl de um anticorpo, onde esses domínios estão presentes em uma cadeia polipeptídica única. Geralmente, o polipeptídeo Fab compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios Vh e Cl ou Vl e Ch1 que permite que o scFab forme a estrutura desejada para a ligação ao antígeno (Koerber et al. (2015) J Mol Biol. 427:576-86).
[0054] O termo diabodies refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação a antígeno, nos quais fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectados a um domínio variável de cadeia leve (Vl) na mesma cadeia polipeptídica (Vh e Vl). Ao usar um ligante que seja muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios variáveis na mesma cadeia, os domínios variáveis são forçados a parear com domínios complementares de outra cadeia, criando dois sítios de ligação a antígeno.
[0055] A expressão anticorpos lineares refere-se a anticorpos conforme descrito em Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8: 1057-1062. Resumidamente, esses anticorpos contêm um par de segmentos Fd tandem (Vh-Ch1-Vh-Ch1) que, juntamente com polipeptídeos de cadeia leve complementares, formam um par de regiões de ligação a antígeno. Anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.
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18/157 [0056] Fragmentos de anticorpos podem ser obtidos usando técnicas de manipulação de proteína ou recombinantes convencionais e os fragmentos podem ser triados para a ligação ao FIX e a sua forma ativada, ao FX, ou outra função, da mesma maneira que os anticorpos intactos.
[0057] Os fragmentos de anticorpos da invenção podem ser feitos por truncamento, por exemplo, pela remoção de um ou mais aminoácidos das extremidades N e/ou C-terminais de um polipeptideo. Os fragmentos também podem ser gerados por uma ou mais deleções internas.
[0058] Um anticorpo da invenção pode ser, ou pode compreender, um fragmento do anticorpo, ou uma variante de qualquer um dos anticorpos descritos neste documento. Um anticorpo da invenção pode ser, ou pode compreender, uma porção de ligação a antígeno de um desses anticorpos, ou variantes destes. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser um fragmento Fab de um desses anticorpos ou variantes destes, ou pode ser um anticorpo de cadeia única derivado de um desses anticorpos, ou uma variante destes. Além disso, um anticorpo da invenção pode ser uma combinação de um anticorpo de comprimento total e seu fragmento.
[0059] O termo de um braço, como usado neste documento, refere-se a um tipo específico de anticorpo monovalente constituído por uma cadeia pesada de anticorpo, uma cadeia pesada truncada em que falta a região Fab, e uma única cadeia leve.
[0060] O termo anticorpo monoespecífico, como usado neste documento, refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a um epítopo específico (incluindo, mas não se limitando a, anticorpos bivalentes).
[0061] O termo anticorpo biespecífico, como usado neste documento, refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a dois
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19/157 antígenos diferentes ou dois epitopes diferentes no mesmo antígeno. [0062] O termo anticorpo triespecífico, como usado neste documento, refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a três antígenos diferentes ou três epitopes diferentes no mesmo antígeno ou três epitopes diferentes presentes em dois antígenos diferentes.
[0063] O termo anticorpo multiespecífico, como usado neste documento, refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a dois ou mais antígenos diferentes ou dois ou mais epitopes diferentes no mesmo antígeno. Anticorpos multiespecíficos compreendem, assim, anticorpos bi- e triespecíficos.
[0064] Anticorpos biespecíficos no formato de IgG de comprimento total podem ser gerados pela fusão de dois hibridomas individuais para formar um quadroma híbrido que produz uma mistura de anticorpos, incluindo uma fração de anticorpos de heterodimerização biespecífica (Chelius D. et al.; MAbs. Maio-Jun de 2010; 2(3): 309-319). Anticorpos de heterodimerização biespecíficos podem ser, alternativamente, produzidos usando tecnologias recombinantes. A heterodimerização também pode ser obtida por meio da engenharia da interface de dimerização da região Fc para promover a heterodimerização. Um exemplo disto são as chamadas mutações knob-in-hole, em que cadeias laterais estericamente volumosas (knobs) são introduzidas em um Fc correspondente por cadeias laterais estericamente pequenas (holes) no Fc oposto, criando, desse modo, uma complementaridade estérica, promovendo a heterodimerização. Outros métodos para interfaces de Fc de heterodimerização manipulada são complementaridade eletrostática, fusão a domínios de heterodimerização não-lgG ou utilização de fenômeno de troca de braço de Fab de lgG4 humano para controlar a heterodimerização. Exemplos de anticorpos biespecíficos heterodimerizados estão bem descritos na literatura, por exemplo, (Klein C, etal.; MAbs. 2012 Nov-Dez; 4(6): 653
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663). Atenção especial deve ser dada às cadeias leves em anticorpos heterodiméricos. O pareamento correto de LCs e HCs pode ser realizado pelo uso de uma cadeia leve comum. Novamente, a engenharia da interface LC/HC pode ser usada para promover a heterodimerização ou engenharia cruzada de cadeia leve como em CrossMabs. A remontagem in vitro em condições redutoras brandas de anticorpos a partir de duas IgGs individuais contendo mutações adequadas também pode ser usada para gerar anticorpos biespecíficos (por exemplo, Labrijn et al., PNAS, 110, 5145-5150 (2013)). Também é relatado o método de troca de braço de Fab natural para garantir o pareamento correto das cadeias leves.
[0065] Moléculas baseadas em anticorpo multiespecífico também podem ser expressas de forma recombinante como proteínas de fusão, combinando os módulos naturais de IgGs para formar derivados de anticorpo multiespecíficos e multivalentes, conforme descrito na literatura. Exemplos de anticorpos de fusão são DVD-lgs, IgG-scFV, Diabodies, DARTs, etc. Tags de detecção ou purificação específicos, frações de extensão de meia-vida ou outros componentes podem ser incorporados nas proteínas de fusão. Modalidades de não-lgG adicionais também podem ser incorporadas nas proteínas de fusão. Anticorpos de comprimento total biespecíficos baseados na heterodimerização de Fc são comumente referidos como IgGs assimétricas, independentemente da metodologia de pareamento de LC.
[0066] Geralmente, anticorpos biespecíficos podem ser produzidos em uma variedade de formatos moleculares, conforme revisto por Brinkmann et al. (Brinkmann et al. The making of bispecific antibodies. MabsS, 182-212 (2017)).
[0067] Moléculas à base de anticorpo multiespecífico também podem ser produzidas por conjugação química ou acoplamento de IgGs
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21/157 de comprimento total individual ou acoplamento de fragmentos de IgGs para formar derivados de anticorpo multiespecíficos ou multivalentes, conforme descrito na literatura. Exemplos são fragmentos Fab quimicamente acoplados, dímero de IgG, etc. Tags de detecção ou purificação específicos, moléculas de extensão de meia-vida ou outros componentes podem ser incorporados nas proteínas de conjugação. Polipeptídeos não-lgG adicionais também podem ser incorporados nas proteínas de fusão. Moléculas multiespecíficas também podem ser produzidas pela combinação de métodos recombinantes e químicos, incluindo aqueles descritos acima.
[0068] Em um aspecto, um anticorpo da invenção é um anticorpo quimérico, um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado. Esse anticorpo pode ser gerado usando, por exemplo, plataformas de imunização ou exibição de anticorpo adequadas ou outras plataformas ou métodos adequados conhecidos no campo. O termo anticorpo humano, como usado neste documento, destina-se a incluir anticorpos que tenham domínios variáveis, em que pelo menos uma porção de uma região de framework e/ou pelo menos uma porção de uma região CDR sejam derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Por exemplo, um anticorpo humano pode ter domínios variáveis em que as regiões de framework e CDR sejam derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Além disso, se o anticorpo contiver uma região constante, a região constante ou uma porção desta também será derivada de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo).
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22/157 [0069] Esse anticorpo humano pode ser um anticorpo monoclonal humano. Esse anticorpo monoclonal humano pode ser produzido por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo repertórios de segmentos de gene de cadeia pesada e leve de imunoglobulina humana, fundidos a uma célula imortalizada.
[0070] Os anticorpos humanos podem ser isolados de bibliotecas de sequência construídas sobre seleções de sequências de linhagem germinativa humana, adicionalmente diversificadas com diversidade de sequência natural e sintética.
[0071] Os anticorpos humanos podem ser preparados por imunização in vitro de linfócitos humanos seguido pela transformação dos linfócitos com o vírus Epstein-Barr.
[0072] Os anticorpos humanos podem ser produzidos por métodos recombinantes conhecidos na técnica.
[0073] O termo derivado de anticorpo humano se refere a qualquer forma modificada do anticorpo humano, tal como um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo.
[0074] O termo anticorpo humanizado, como usado neste documento, refere-se a um anticorpo humano/não humano que contenha uma sequência (regiões CDR ou partes destas) derivada de uma imunoglobulina não humana. Um anticorpo humanizado é, assim, uma imunoglobulina humana (anticorpo do recebedor) em que resíduos de pelo menos uma região hipervariável do recebedor são substituídos pelos resíduos de uma região hipervariável de um anticorpo de uma espécie não humana (anticorpo do doador), tal como de um camundongo, rato, coelho ou primata não humano, que tem a especificidade, afinidade, composição de sequência e funcionalidade desejadas. Em alguns casos, resíduos de framework (FR) da
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23/157 imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Um exemplo dessa modificação é a introdução de uma ou mais assim chamadas mutações reversas (back-mutations), que são normalmente resíduos de aminoácidos derivados do anticorpo do doador. A humanização de um anticorpo pode ser realizada usando técnicas recombinantes conhecidas aos versados na técnica (vide, por exemplo, Antibody Engineering, Methods in Molecular Biology, vol. 248, editado por Benny K. Lo). Um framework do recebedor humano adequado para o domínio variável de cadeia leve e pesada pode ser identificado, por exemplo, por homologia de sequência ou estrutural. Alternativamente, frameworks de recebedor fixos podem ser usados, por exemplo, com base no conhecimento da estrutura, propriedades biofísicas e bioquímicas. Os frameworks do recebedor podem ser derivados da linhagem germinativa ou derivados de uma sequência de anticorpo maduro. As regiões CDR do anticorpo do doador podem ser transferidas por enxerto de CDR. O anticorpo humanizado enxertado com CDR pode ser ainda mais otimizado, por exemplo, em relação à afinidade, funcionalidade e propriedades biofísicas pela identificação de posições de framework críticas, onde a reintrodução (mutação reversa) do resíduo de aminoácido do anticorpo do doador tem impacto benéfico sobre as propriedades do anticorpo humanizado. Além de mutações reversas derivadas do anticorpo do doador, o anticorpo humanizado pode ser manipulado por introdução de resíduos de linhagem germinativa nas regiões CDR e de framework, eliminação de epitopos imunogênicos, mutagênese sítio-dirigida, maturação de afinidade, etc. [0075] Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo do recebedor ou no anticorpo do doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá pelo menos um - normalmente dois - domínios
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24/157 variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondam àquelas de uma imunoglobulina não humana e em que todos ou substancialmente todos os resíduos de FR sejam aqueles de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado pode, opcionalmente, compreender também pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), normalmente aquela de uma imunoglobulina humana.
[0076] O termo derivado de anticorpo humanizado se refere a qualquer forma modificada do anticorpo humanizado, tal como um conjugado do anticorpo e um agente químico ou um conjugado do anticorpo com outro anticorpo.
[0077] O termo anticorpo quimérico, como usado neste documento, refere-se a um anticorpo que compreende porções de anticorpos derivados de duas ou mais espécies. Por exemplo, os genes que codificam esse anticorpo compreendem genes que codificam domínios variáveis e genes que codificam domínios constantes originados de duas espécies diferentes. Por exemplo, os genes que codificam domínios variáveis de um anticorpo monoclonal de camundongo podem ser unidos aos genes que codificam os domínios constantes de um anticorpo de origem humana.
[0078] A região cristalizável de fragmento (região Fc/domínio Fc) de um anticorpo é a região C-terminal de um anticorpo, que compreende a dobradiça e os domínios Ch2 e Ch3 constantes. O domínio Fc pode interagir com receptores de superfície celular chamados receptores Fc, bem como algumas proteínas do sistema do complemento. A região Fc permite que anticorpos interajam com o sistema imunológico. Em um aspecto da invenção, os anticorpos podem ser manipulados para incluir modificações dentro da região Fc, normalmente para alterar uma ou mais das suas propriedades funcionais, tais como meia-vida sérica, fixação do complemento, ligação do receptor Fc, estabilidade da
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25/157 proteína e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno, ou sua falta, entre outros. Além disso, um anticorpo da invenção pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais frações químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou ser modificadas para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Um anticorpo IgG 1 pode portar um domínio Fc modificado compreendendo uma ou mais, e talvez todas as seguintes mutações que resultarão em menor afinidade a determinados receptores Fc-gama (L234A, L235E e G237A) e em fixação do complemento mediada por C1q reduzida (A330S e P331S), respectivamente (numeração de resíduos de acordo com o índice EU). Alternativamente, outras substituições de aminoácido, e suas combinações e combinações com as mencionadas acima, conhecidas na técnica para conduzir a ligação ao receptor Fc-gama alterada (reduzida ou aumentada) podem ser usadas.
[0079] O isotipo de um anticorpo da invenção pode ser IgG, tal como lgG1, tal como lgG2, tal como lgG4. Se desejado, a classe de um anticorpo pode ser trocada por técnicas conhecidas. Por exemplo, um anticorpo que foi originalmente produzido como uma molécula de IgM pode ter a classe trocada para um anticorpo IgG. Técnicas de troca de classe (switching) também podem ser usadas para converter uma subclasse de IgG em outra: de IgG 1 em lgG2 ou lgG4; de lgG2 em IgG 1 ou lgG4; ou de lgG4 em IgG 1 ou lgG2. A engenharia de anticorpos para gerar moléculas quiméricas de região constante, pela combinação de regiões de diferentes subclasses de IgG, também pode ser realizada.
[0080] Em uma modalidade, a região de dobradiça do anticorpo é modificada de tal modo que o número de resíduos de cisteína na região de dobradiça seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Esta abordagem é descrita ainda por exemplo na Patente U.S. n. 5,677,425 por Bodmer et al.
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26/157 [0081] A região constante pode ser modificada para estabilizar o anticorpo, por exemplo, para reduzir o risco de um anticorpo bivalente se separar em anticorpos pela metade. Por exemplo, em uma região constante de lgG4, o resíduo S228 (de acordo com o índice da numeração EU e S241 de acordo com Kabat) pode sofrer mutação para um resíduo de prolina (P) para estabilizar a interformação de pontes dissulfeto de cadeia pesada na dobradiça (vide, por exemplo, Angal et al. Mol Immunol. 1993; 30:105-8).
[0082] Anticorpos ou seu fragmento podem ser definidos em termos de suas regiões determinantes de complementariedade (CDRs). O termo região determinante de complementaridade ou região hipervariável, quando usado neste documento, refere-se às regiões de um anticorpo nas quais resíduos de aminoácidos envolvidos na ligação ao antígeno estão situados. A região de hipervariabilidade ou CDRs podem ser identificadas como as regiões com a maior variabilidade em alinhamentos de aminoácidos de domínios variáveis de anticorpo. Bancos de dados podem ser usados para identificação de CDR, tais como o banco de dados de Kabat, as CDRs, por exemplo, sendo definidas como compreendendo os resíduos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) do domínio variável de cadeia leve 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; (Kabat et al. 1991; Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Alternativamente, as CDRs podem ser definidas como aqueles resíduos de uma alça hipervariável (resíduos 26-33 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 1987; 196:901-917). Normalmente, a numeração de resíduos de aminoácidos nesta região é realizada pelo método descrito em Kabat et al. supra. Frases como posição Kabat,
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27/157 resíduo Kabat e de acordo com Kabat neste documento referem-se a este sistema de numeração para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve. Usando o sistema de numeração de Kabat, a sequência de aminoácidos linear real de um peptídeo pode conter menos aminoácidos ou aminoácidos adicionais correspondentes a um encurtamento, ou inserção, em uma framework (FR) ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir inserções de aminoácidos (resíduo 52a, 52b e 52c de acordo com Kabat) após o resíduo 52 da CDR H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b, e 82c, etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82 de FR de cadeia pesada. A numeração de Kabat dos resíduos pode ser determinada para um determinado anticorpo pelo alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada por Kabat padrão.
[0083] O termo região de framework ou resíduos de FR referese àqueles resíduos de aminoácidos de Vh ou Vl que não estão dentro das CDRs, conforme definido neste documento.
[0084] Um anticorpo da invenção pode compreender uma região CDR de um ou mais dos anticorpos específicos descritos neste documento.
[0085] O termo anticorpo pró-coagulante refere-se a um anticorpo que potencializa a coagulação do sangue, por exemplo, acelerando o processo de coagulação do sangue e/ou aumentando a atividade enzimática de um ou mais fatores de coagulação.
[0086] O termo atividade de pró-coagulante refere-se à capacidade de um composto, tal como um anticorpo, em potencializar a coagulação do sangue, por exemplo, acelerando o processo de coagulação do sangue e/ou aumentando a atividade enzimática de um ou mais fatores de coagulação.
[0087] O termo antígeno (Ag) refere-se à entidade molecular
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28/157 usada para imunização de um vertebrado imunocompetente para produzir o anticorpo (Ab) que reconhece o Ag. Neste documento, Ag é denominado mais amplamente e é geralmente destinado a incluir moléculas alvo que são especificamente reconhecidas pelo Ab, incluindo, assim, fragmentos ou mímicos da molécula usados no processo de imunização, ou outro processo, por exemplo, exibição em fago, usado para gerar o Ab.
[0088] O termo epitope, conforme usado neste documento, é definido no contexto de uma interação molecular entre um polipeptídeo de ligação a antígeno, tal como um anticorpo (Ab) e seu antígeno correspondente (Ag). Geralmente, epitope refere-se à área ou região em um Ag ao qual um Ab se liga, isto é, a área ou região em contato físico com o Ab. O contato físico pode ser definido usando vários critérios (por exemplo, um corte de distância de 2-6 Á, tal como 3 Á, tal como 3,5 Á, tal como 4 Á, tal como 4,5 Á, como 5Á; ou acessibilidade de solvente) para átomos nas moléculas de Ab e Ag.
[0089] FIX/FIXa e FX/FXa podem compreender um número de epitopes diferentes, que podem incluir, sem limitação, (1) epitopes de peptideo linear (2) epitopes conformacionais que consistem em um ou mais aminoácidos não contíguos localizados próximos uns aos outros na conformação de FIX/FIXa ou FX /FXa maduros; e (3) epitopes que consistem, no todo ou em parte, em estruturas moleculares ligadas de modo covalente ao FIX/FIXa ou FX/FXa, tais como grupos de carboidrato.
[0090] O epitope para um determinado par de anticorpo (Ab)/antígeno (Ag) pode ser descrito e caracterizado em diferentes níveis de detalhes usando uma variedade de métodos de mapeamento de epitope experimental e computacional. Os métodos experimentais incluem mutagênese, cristalografia de raios-X, espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (NMR), Espectrometria de Massa de
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Troca de Hidrogênio e Deutério (HDX-MS) e vários métodos de ligação por competição; métodos que são conhecidos na técnica. Uma vez que cada método depende de um princípio único, a descrição de um epitopo está intimamente ligada ao método pelo qual foi determinado. Assim, dependendo do método de mapeamento de epitopo empregado, o epitopo para um determinado par de Ab/Ag pode ser descrito de forma diferente.
[0091] No contexto de uma estrutura cristalina derivada de raios X definida pelas coordenadas espaciais de um complexo entre um Ab, por exemplo, um fragmento Fab e seu Ag, o termo epitopo é, neste documento, a menos que especificado em contrário ou contradito pelo contexto, especificamente definido como resíduos de FIX/FIXa ou FX caracterizados por ter um átomo pesado (isto é, um átomo diferente de hidrogênio) dentro de uma distância de 3,5 Á, a partir de um átomo pesado no Ab.
[0092] Os epitopos descritos no nível de aminoácido, por exemplo, determinados a partir de uma estrutura de raios-X, são considerados idênticos se contiverem o mesmo conjunto de resíduos de aminoácidos. Os epitopos se sobrepõem se pelo menos um resíduo de aminoácido for compartilhado pelos epitopos. Os epitopos são considerados separados (exclusivos) se nenhum resíduo de aminoácido for compartilhado pelos epitopos.
[0093] A definição do termo parátopo é derivada da definição acima de epitopo, invertendo-se a perspectiva. Assim, o termo parátopo refere-se à área ou região no Ab à qual um Ag se liga, isto é, com a qual faz contato físico com o Ag.
[0094] No contexto de uma estrutura cristalina derivada de raios X definida pelas coordenadas espaciais de um complexo entre um Ab, tal como um fragmento Fab e seu Ag, o termo parátopo é, neste documento, a menos que especificado em contrário ou contradito pelo
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30/157 contexto, especificamente definido como resíduos de Ab caracterizados por ter um átomo pesado (isto é, um átomo diferente de hidrogênio) dentro de uma distância de 3,5 Á, a partir de um átomo pesado no FIX/FIXa ou FX.
[0095] O epitope e parátopo para um determinado par de anticorpo (Ab)/antígeno (Ag) podem ser identificados por métodos de rotina. Por exemplo, a localização geral de um epitope pode ser determinada pela avaliação da capacidade de um anticorpo em se ligar a diferentes fragmentos ou variantes de FIX/FIXa ou FX. Os aminoácidos específicos dentro de FIX/FIXa ou FX que fazem contato com um anticorpo (epitope) e os aminoácidos específicos em um anticorpo que fazem contato com FIX/FIXa ou FX (parátopo) também podem ser determinados usando métodos de rotina. Por exemplo, o anticorpo e a molécula alvo podem ser combinados e o complexo Ab:Ag pode ser cristalizado. A estrutura cristalina do complexo pode ser determinada e usada para identificar sítios específicos de interação entre o anticorpo e seu alvo.
[0096] Os epitopes em um antígeno pode compreender um ou mais resíduos de hot-spot, isto é, resíduos que são particularmente importante para a interação com o anticorpo cognate, e em que as interações mediadas pela cadeia lateral do referido resíduo hot-spot contribuem significativamente para a energia de ligação para a interação de anticorpo/antígeno (Peng et al. (2014) PNAS111, E2656-E2665). Os resíduos hot-spot podem ser identificados por testes de variantes do antígeno (aqui, FIX/FIXa e FX), em que resíduos de epitope únicos foram substituídos, por exemplo, por alanina, para ligação ao anticorpo cognate. Se a substituição de um resíduo de epitope por alanina tiver um forte impacto na ligação ao anticorpo, o referido resíduo de epitope será considerado um resíduo de hot-spot e, portanto, de particular importância para a ligação do anticorpo ao antígeno.
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31/157 [0097] Anticorpos que se ligam ao mesmo antígeno podem ser caracterizados com relação à sua capacidade de se ligar ao seu antígeno comum simultaneamente e podem ser submetidos à ligação por competição/seleção. No presente contexto, o termo seleção refere-se a um método de agrupamento de anticorpos que se ligam ao mesmo antígeno. A seleção de anticorpos pode ser baseada na ligação por competição de dois anticorpos ao seu antígeno comum em ensaios com base em técnicas padrão.
[0098] Um compartimento de um anticorpo é definido usando um anticorpo de referência. Se um segundo anticorpo for incapaz de se ligar a um antígeno ao mesmo tempo que o anticorpo de referência, diz-se que o segundo anticorpo pertence ao mesmo compartimento que o anticorpo de referência. Neste caso, o anticorpo de referência e o segundo anticorpo se ligam competitivamente à mesma parte de um antígeno e são chamados anticorpos competitivos. Se um segundo anticorpo for capaz de se ligar a um antígeno ao mesmo tempo que o anticorpo de referência, diz-se que o segundo anticorpo pertence a um compartimento separado. Neste caso, o anticorpo de referência e o segundo anticorpo não se ligam competitivamente à mesma parte de um antígeno e são chamados anticorpos não competitivos.
[0099] A seleção do anticorpo não fornece informações diretas sobre o epítopo.
[00100] Anticorpos competitivos, isto é, anticorpos pertencentes ao mesmo compartimento podem ter epitopos idênticos, epitopos sobrepostos ou até epitopos separados. O último é o caso de se o anticorpo de referência ligado ao seu epítopo no antígeno ocupar o espaço necessário para que o segundo anticorpo entre em contato com o seu epítopo no antígeno (impedimento estérico). Anticorpos não competitivos geralmente têm epitopos separados. Assim, em algumas modalidades, os anticorpos da invenção se ligarão ao mesmo epítopo
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32/157 que pelo menos um dos anticorpos especificamente descritos neste documento.
[00101] Os ensaios de competição para determinar se um anticorpo compete pela ligação com um anticorpo anti-FIX/FIXa ou anti-X descritos neste documento são conhecidos na técnica. Ensaios de competição exemplares incluem imunoensaios (por exemplo, ensaios de ELISA, ensaios RIA), análise de ressonância plasmônica de superfície (por exemplo, usando um instrumento BIAcore™), interferometria de biocamada (ForteBio®) e citometria de fluxo.
[00102] Normalmente, um ensaio de competição envolve o uso de um antígeno ligado a uma superfície sólida ou expresso em uma superfície celular, um anticorpo de ligação a FIX ou FIXa de teste e um anticorpo de referência. O anticorpo de referência é marcado e o anticorpo de teste não é marcado. A inibição competitiva é medida pela determinação da quantidade de anticorpo de referência marcado ligado à superfície sólida ou células na presença do anticorpo de teste. Geralmente, o anticorpo de teste está presente em excesso (por exemplo, 1,5, 10, 20, 100, 1000, 10000 ou 100000 vezes). Anticorpos identificados como sendo competitivos no ensaio de competição (isto é, anticorpos competitivos) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo, ou epitopos sobrepostos, como o anticorpo de referência, e anticorpos que se ligam a um epitopo adjacente suficientemente próximo ao epitopo ligado pelo anticorpo de referência para que o impedimento estérico ocorra.
[00103] Em um ensaio de competição exemplar, um anticorpo antiFIX ou anti-FIXa de referência é biotinilado usando reagentes comercialmente disponíveis. O anticorpo de referência biotinilado é misturado com diluições em série do anticorpo de teste ou anticorpo de referência não marcado (controle de autocompetição), resultando em uma mistura de várias razões molares (por exemplo, 1, 5, 10, 20.100,
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1000, 10000 ou 100000 vezes) entre o anticorpo de teste (ou anticorpo de referência não marcado) e o anticorpo de referência marcado. A mistura de anticorpo é adicionada a uma placa de ELISA revestida com polipeptídeo FIX ou FIXa. A placa é então lavada, e a peroxidase de raiz forte (HRP)-estrepavidina é adicionada à placa como reagente de detecção. A quantidade de anticorpo de referência marcado ligado ao antígeno alvo é detectada após a adição de um substrato cromogênico (por exemplo, TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina) ou ABTS (2,2-azinodi-(3-etilbenztiazolina-6- sulfonate)), que é bem conhecido na técnica. As leituras de densidade óptica (unidades OD) são feitas usando um espectrômetro (por exemplo, espectrômetro M2 SpectraMax® (Molecular Devices)). A resposta (unidades OD) correspondente à inibição percentual zero é determinada a partir de poços sem qualquer anticorpo competitivo. A resposta (unidades OD) correspondente à inibição de 100%, isto é, a base do ensaio, é determinada a partir de poços sem qualquer anticorpo de referência marcado ou anticorpo de teste. A inibição percentual do anticorpo de referência marcado para FIX ou FIXa pelo anticorpo de teste (ou o anticorpo de referência não marcado) em cada concentração é calculada como se segue: % de inibição = (1- (unidades OD - 100% de inibição)/(0% de inibição - 100% de inibição))* 100.
[00104] Os versados na técnica entenderão que ensaios semelhantes podem ser realizados para determinar se dois ou mais anticorpos anti-FX/FXa compartilham uma região de ligação, um compartimento e/ou se liga competitivamente ao antígeno. Os versados na técnica também perceberão que o ensaio de competição pode ser realizado usando vários sistemas de detecção conhecidos na técnica.
[00105] Um anticorpo de teste compete com o anticorpo de referência pela ligação ao antígeno se um excesso de um anticorpo (por exemplo, 1, 5, 10, 20, 100, 1000, 10000 ou 100000 vezes) inibir a
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34/157 ligação do outro anticorpo, por exemplo, em pelo menos 50%, 75%, 90%, 95% ou 99%, conforme medido em um ensaio de ligação competitiva.
[00106] Salvo indicação em contrário, a competição é determinada usando um ensaio de ELISA competitivo, conforme descrito acima.
[00107] O termo afinidade de ligação é usado neste documento como uma medida da força de uma interação não covalente entre duas moléculas, por exemplo, um anticorpo, ou seu fragmento, e um antígeno. O termo afinidade de ligação é usado para descrever interações monovalentes.
[00108] A afinidade de ligação entre duas moléculas, por exemplo, um anticorpo, ou seu fragmento, e um antígeno, através de uma interação monovalente pode ser quantificada determinando-se a constante de dissociação de equilíbrio (Kd). O Kd pode ser determinado pela medição da cinética da formação e dissociação do complexo, por exemplo, pelo método de Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) ou pelo método de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC). As constantes da taxa correspondentes à associação e à dissociação de um complexo monovalente são referidas como a constante da taxa de associação ka (ou kon) e constante da taxa de dissociação kd (ou kOff), respectivamente. Kd está relacionado a ka e kd através da equação Kd = kd / ka.
[00109] Seguindo a definição acima, as afinidades de ligação associadas a diferentes interações moleculares, tais como comparação da afinidade de ligação de anticorpos diferentes por um determinado antígeno, podem ser comparadas pela comparação dos valores de Kd para complexos individuais de anticorpo/antígeno.
[00110] O valor da constante de dissociação pode ser determinado diretamente por métodos bem conhecidos. Ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação dos ligantes, tais como anticorpos em relação
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35/157 a alvos, são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, análises por ELISAs, Western blots, RIAs e citometria de fluxo. A cinética de ligação e afinidade de ligação do anticorpo também podem ser avaliadas por ensaios padrão conhecidos na técnica, tais como SPR. Preferencialmente, no entanto, a calorimetria de titulação isotérmica (ITC) pode ser usada para medir as afinidades por uma interação de anticorpo/alvo, bem como para derivar parâmetros termodinâmicos para a interação.
[00111] Um ensaio de ligação competitiva pode ser conduzido em que a ligação do anticorpo ao alvo é comparada com a ligação do alvo por outro ligante daquele alvo, tal como outro anticorpo.
[00112] Um anticorpo da invenção pode ter um Kd por seu alvo de 1 x 10’4M ou menor, 1 x 10’5M ou menor, 1 x 10’6M ou menor, 1 x 10’7M ou menor, 1 x 10’8M ou menor, ou 1 x 10’9M ou menor, ou 1 x 10’1°M ou menor, 1 x 10’11M ou menor, 1 x 10’12M ou menor, 1 x 10’13M ou menor ou 1 x 10’14M ou menor.
[00113] O Kd de um anticorpo da invenção pode ser menor que 100 μΜ, tal como menor que 10μΜ, tal como menor que 1 μΜ, tal como menor que 0,9 μΜ, tal como menor que 0,8 μΜ, tal como menor que 0,7 μΜ, tal como menor que 0,6 μΜ, tal como menor que 0,5 μΜ, tal como menor que 0,4 μΜ, tal como menor que 0,3 μΜ, tal como menor que 0,2 μΜ, tal como menor que 0,1 μΜ.
[00114] Em uma modalidade dessa, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que compreende um braço anti-FX com um Kd em relação ao FX menor que 100 μΜ, tal como menor que 10μΜ, tal como menor que 1 μΜ, tal como menor que 0,9 μΜ, tal como menor que 0,8 μΜ, tal como menor que 0,7 μΜ, tal como menor que 0,6 μΜ, tal como menor que 0,5 μΜ, tal como menor que 0,4 μΜ, tal como menor que 0,3 μΜ, tal como menor que 0,2 μΜ, tal como menor que 0,1 μΜ, tal como menor que 0,09 μΜ, tal como menor que 0,08 μΜ, tal como menor que 0,07
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36/157 μΜ, tal como menor que 0,06 μΜ, tal como menor que 0,05 μΜ, tal como menor que 0,04 μΜ, tal como menor que 0,03 μΜ, tal como menor que 0,02 μΜ, tal como menor que 0,01 μΜ, tal como menor que 9 nM, tal como menor que 8 nM, tal como menor que 7 nM, tal como menor que 6 nM, tal como menor que 5 nM, tal como menor que 4 nM, tal como menor que 3 nM, tal como menor que 2 nM, tal como menor que 1 nM, tal como menor que 0,5 nM.
[00115] Os anticorpos e seu fragmento de anticorpo conforme descrito neste documento podem ser combinados com outros anticorpos e fragmentos de anticorpos conhecidos na técnica, criando moléculas de anticorpo biespecíficas, triespecíficas ou multiespecíficas. Compostos que imitam a função do cofator FVIII foram anteriormente criados usando outros domínios de ligação a FIX/IXa e FX/Xa, que podem substituir potencialmente cada um dos domínios de ligação a FIX/IXa e/ou FX/Xa descritos neste documento. É, assim, claro que os domínios de ligação a FIX/IXa e FX/Xa da presente invenção são de interesse separado como moléculas individuais, bem como intermediários como parte de um anticorpo bi-, tri- ou multiespecífico que compreende pelo menos um domínio de ligação a FIX/IXa e/ou FX/Xa.
[00116] A atividade de anticorpos pró-coagulantes incluindo anticorpos bi-, tri e multiespecíficos pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica. Os ensaios padrão incluem o Teste de Geração de Trombina sanguínea (TGT), medição do tempo de coagulação por ensaios de tromboelastografia (TEG) e de geração de FXa.
Identidade [00117] O termo identidade, conforme conhecido na técnica, referese a uma relação entre as sequências de dois ou mais polipeptídeos, conforme determinado pela comparação das sequências. Na técnica, identidade também significa o grau de relação de sequência entre
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37/157 polipeptídeos, conforme determinado pelo número de correspondências entre séries de dois ou mais resíduos de aminoácidos. A identidade mede a porcentagem de correspondências idênticas entre a menor das duas ou mais sequências com alinhamentos de lacuna (se houver) indicadas por um modelo matemático ou programa de computador específico (isto é, algoritmos). A identidade de polipeptídeos relacionados pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos. Esses métodos incluem, mas não estão limitados àqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nova York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nova York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nova Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nova York, 1991; e Carillo etal. SIAM J. Applied Math.1988; 48:1073. [00118] Métodos preferenciais para determinar a identidade são projetados para dar a maior correspondência entre as sequências testadas. Métodos de determinação de identidade são descritos em programas de computador publicamente disponíveis. Métodos de programa de computador preferenciais para a determinação de identidade entre duas sequências incluem o pacote de programa GCG, incluindo GAP (Devereux etal. Nucl. Acid. Res. 1984; 12:387); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul etal. J. Mol. Biol. 1990; 215:403-410). O programa BLASTX está publicamente disponível pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al. supra). O algoritmo de Smith Waterman bem conhecido também pode ser usado para determinar identidade.
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38/157 [00119] Por exemplo, usando o algoritmo de computador GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), dois polipeptídeos para os quais a identidade de sequência percentual deve ser determinada são alinhados para uma correspondência ideal de seus respectivos aminoácidos (o intervalo correspondente, conforme determinado pelo algoritmo). Uma penalidade de abertura de lacuna (que é calculada como 3 vezes a média diagonal; a média diagonal é a média da diagonal da matriz de comparação sendo usada; a diagonal é a pontuação ou número atribuído a cada aminoácido perfeito correspondente pela matriz de comparação específica) e uma penalidade de extensão de lacuna (que é geralmente {fração (1/10)} vezes a penalidade de abertura de lacuna), bem como uma matriz de comparação, tal como PAM 250 ou BLOSUM 62 são usadas em conjunto com o algoritmo. Uma matriz de comparação padrão (vide Dayhoff et al. 1978; Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, complemento 3 para a matriz de comparação PAM 250; Henikoff et al. PNAS 1992; 89:10915-10919 para a matriz de comparação BLOSUM 62) também é usada pelo algoritmo.
[00120] Os parâmetros preferenciais para uma comparação de sequência peptídica incluem o seguinte: Algoritmo: Needleman et al. J. Mol. Biol. 1970; 48:443-453; Matriz de comparação: BLOSUM 62 de Henikoff et al. PNAS 1992; 89:10915-10919; Penalidade de lacuna: 12, Penalidade de comprimento de lacuna: 4, Limiar de similaridade: 0.
[00121] O programa GAP é útil com os parâmetros acima. Os parâmetros acima mencionados são os parâmetros padrão para comparações de peptídeo (com sem penalidades para lacunas finais) usando o algoritmo GAP.
[00122] O termo similaridade é um conceito relacionado, mas em contraste com identidade, refere-se a uma relação de sequência que inclui correspondências idênticas e correspondências de substituição
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39/157 conservativa. Se duas sequências polipeptídicas tiverem, por exemplo, aminoácidos idênticos (fração (10/20)), e o restante forem todas substituições não conservativas, então, a identidade percentual e a similaridade seriam, ambas, de 50%. Se, no mesmo exemplo, houver mais 5 posições onde existirem substituições conservativas, então a identidade percentual será de 25% e a similaridade percentual será de 75% ((fração (15/20))). Portanto, nos casos em que houver substituições conservativas, o grau de similaridade entre dois polipeptídeos será maior do que a identidade percentual entre esses dois polipeptídeos.
Formulações Farmacêuticas [00123] Em outro aspecto, a presente invenção fornece composições e formulações que compreendem compostos da invenção, tais como os anticorpos descritos neste documento. Por exemplo, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um ou mais anticorpos da invenção, formulados juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00124] Consequentemente, um objeto da invenção é fornecer uma formulação farmacêutica compreendendo esse anticorpo que esteja presente em uma concentração de 0,25 mg/ml a 250 mg/ml, e em que a referida formulação tenha um pH de 2,0 a 10,0. A formulação pode compreender ainda um ou mais dentre um sistema tampão, um conservante, um agente de tonicidade, um agente quelante, um estabilizante, ou um surfactante, bem como várias combinações destes. O uso de conservantes, agentes isotônicos, agentes quelantes, estabilizantes e surfactantes em composições farmacêuticas é bem conhecido para os versados na técnica. Pode-se fazer referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.
[00125] Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é uma formulação aquosa. Essa formulação é normalmente uma solução ou uma suspensão, mas também pode inclui coloides, dispersões,
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40/157 emulsões e materiais multifásicos. O termo formulação aquosa é definido como uma formulação compreendendo pelo menos 50% p/p de água. Da mesma forma, o termo solução aquosa é definido como uma solução compreendendo pelo menos 50% p/p de água, e o termo suspensão aquosa é definido como uma suspensão compreendendo pelo menos 50% p/p de água.
[00126] Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é uma formulação liofilizada, à qual o médico ou o paciente adiciona solventes e/ou diluentes antes do uso.
[00127] Em um outro aspecto, a formulação farmacêutica compreende uma solução aquosa desse anticorpo e um tampão, em que o anticorpo está presente em uma concentração de 1 mg/ml ou acima, e em que a referida formulação tem um pH de cerca de 2,0 a cerca de 10,0.
Administração [00128] Um composto da invenção, tal como um anticorpo, pode ser administrado por via parenteral, tal como por via intravenosa, tal como por via intramuscular, tal como por via subcutânea. Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser administrado através de uma via não parenteral, tal como por via perioral ou por via tópica. Um anticorpo da invenção pode ser administrado profilaticamente. Um anticorpo da invenção pode ser administrado terapeuticamente (sob demanda).
Dosagens [00129] A dose dos compostos a serem distribuídos pode ser de cerca de 0,01 mg a 500 mg do composto por dia, preferencialmente, de cerca de 0,1 mg a 250 mg por dia, e mais preferencialmente de cerca de 0,5 mg a cerca de 250 mg por dia, por semana, a cada duas semanas ou por mês, como doses de ataque e de manutenção, dependendo da gravidade da condição. Uma dose adequada também pode ser ajustada para um composto específico com base nas propriedades daquele
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41/157 composto, incluindo sua meia-vida in vivo ou tempo de permanência médio e de sua atividade biológica. Por exemplo, os compostos a serem distribuídos poderíam, em uma modalidade, ser administrados uma vez por semana ou, em outra modalidade, uma vez a cada duas semanas ou, em outra modalidade, uma vez por mês e, em qualquer uma das referidas modalidades, em uma dose de, por exemplo, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 ou 10 mg por kg de peso corporal.
[00130] As composições contendo os compostos conforme descrito neste documento podem ser administradas para profilaxia e/ou, em algumas modalidades, para tratamentos terapêuticos. Em aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um sujeito que já sofre de uma doença, tal como qualquer distúrbio hemorrágico conforme descrito acima, em uma quantidade suficiente para curar, aliviar ou interromper parcialmente a doença e suas complicações. Uma quantidade adequada para realizar isto é definida como quantidade terapeuticamente eficaz. Como será compreendido pelos versados na técnica, as quantidades eficazes para esta finalidade dependerão da gravidade da doença ou dos danos, bem como do peso e estado geral do sujeito.
Modalidades [00131] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitope compreendendo o resíduo H256 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00132] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitope compreendendo o resíduo H257 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada, FIXa.
[00133] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitope compreendendo o resíduo N258 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
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42/157 [00134] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo o resíduo K293 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00135] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo o resíduo K301 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00136] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo o resíduo D332 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00137] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo o resíduo R333 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00138] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo o resíduo A334 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00139] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo o resíduo T335 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00140] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo o resíduo L337 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00141] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo o resíduo R338 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00142] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo o resíduo S339 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00143] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo o resíduo T340 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
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43/157 [00144] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitope compreendendo o resíduo K341 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00145] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitope compreendendo o resíduo T343 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00146] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitope compreendendo o resíduo N346 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00147] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitope compreendendo o resíduo R403 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00148] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitope compreendendo o resíduo Y404 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00149] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitope compreendendo o resíduo N406 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00150] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitope compreendendo o resíduo W407 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00151] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitope compreendendo o resíduo E410 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00152] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitope compreendendo o resíduo K411 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00153] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitope compreendendo os resíduos L337, R338, S339, T340, K341 e T343 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
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44/157 [00154] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo o resíduo K301, D332, R333, A334, T335, R338 e N346 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00155] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo os resíduos H256, H257, N258, K293, R403, Y404, N406, W407, E410 e K411 de FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa).
[00156] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar ao FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa), em que o anticorpo compete com Fab7236 pela ligação ao FIX.
[00157] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar ao FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa), em que o anticorpo compete com Fab7237 pela ligação ao FIX.
[00158] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar ao FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa), em que o anticorpo compete com Fab7238 pela ligação ao FIX.
[00159] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção se liga ao FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa), em que o anticorpo pertence ao mesmo compartimento que Fab7236.
[00160] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção se liga ao FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa), em que o anticorpo pertence ao mesmo compartimento que Fab7237.
[00161] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção se liga ao FIX (SEQ ID NO:1) ou a sua forma ativada (FIXa), em que o anticorpo pertence ao mesmo compartimento que Fab7238.
[00162] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar ao FX (SEQ ID NO:2) ou a sua forma ativada, FXa, em que o anticorpo compete com um anticorpo compreendendo as CDRs de mAb1-6723.
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45/157 [00163] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo compreende os domínios variáveis de mAb1-6723 de acordo com a SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22.
[00164] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar especificamente a FX/FXa, em que o anticorpo compreende as CDRs de mAb1 -6723 de acordo com a SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22. [00165] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo pertence ao mesmo compartimento que um Fab que compreende os domínios variáveis de mAb1-6723 de acordo com a SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22.
[00166] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar especificamente a FX/FXa, em que o anticorpo pertence ao mesmo compartimento que mAb1-6723 de acordo com a SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22.
[00167] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar especificamente a FX/FXa, em que o anticorpo pertence ao mesmo compartimento que um anticorpo ou Fab que compreende o domínio de ligação a antígeno de acordo com a SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22.
[00168] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar ao FX/FXa, em que o anticorpo compete com um anticorpo compreendendo as CDRs de mAb1-1371.
[00169] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo compreende os domínios variáveis de mAb1-1371 de acordo com a SEQ ID NO:65 e SEQ ID NO:66.
[00170] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo compreende as CDRs de mAb11371 de acordo com a SEQ ID NO:65 e SEQ ID NO:66.
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46/157 [00171] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo pertence ao mesmo compartimento, neste documento referido como Compartimento A, que um Fab que compreende os domínios variáveis de mAb1-1371 de acordo com a SEQ ID NO:65 e SEQ ID NO:66.
[00172] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo pertence ao mesmo compartimento que mAb1-1371 de acordo com a SEQ ID NO:65 e SEQ ID NO:66.
[00173] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo pertence ao mesmo compartimento que um anticorpo ou Fab que compreende o domínio de ligação a antígeno de acordo com a SEQ ID NO:65 e SEQ ID NO:66. [00174] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar especificamente ao FX/FXa, em que o anticorpo compete com um anticorpo compreendendo as CDRs de mAb1-1376, mAb1-6705, mAb1-7388 ou mAb1-7563. Esses anticorpos são referidos neste documento como pertencentes ao Compartimento B.
[00175] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo compreende os domínios variáveis de mAb1-1376, mAb1-6705, mAb1-7388 ou mAb1-7563 conforme identificado pelas SEQ ID NO:67 e 68, SEQ ID NO:23 e 24, SEQ ID NO:39 e 40, e SEQ ID NO:59 e 60, respectivamente.
[00176] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo compreende as CDRs de mAb11376, mAb1-6705, mAb1-7388 ou mAb1-7563 conforme identificado pelas SEQ ID NO:67 e 68, SEQ ID NO:23 e 24, SEQ ID NO:39 e 40, e SEQ ID NO:59 e 60, respectivamente.
[00177] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo pertence ao mesmo
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47/157 compartimento que um Fab que compreende os domínios variáveis de mAb1-1376, mAb1-6705, mAb1-7388 ou mAb1-7563 conforme identificado pelas SEQ ID NO:67 e 68, SEQ ID NO:23 e 24, SEQ ID NO:39 e 40, e SEQ ID NO:59 e 60, respectivamente.
[00178] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo pertence ao mesmo compartimento que mAb1-1376, mAb1-6705, mAb1-7388 ou mAb17563 conforme identificado pelas SEQ ID NO:67 e 68, SEQ ID NO:23 e 24, SEQ ID NO:39 e 40, e SEQ ID NO:59 e 60, respectivamente.
[00179] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo pertence ao mesmo compartimento que um anticorpo ou Fab que compreende o domínio de ligação a antígeno de acordo com a SEQ ID NO:67 e 68, SEQ ID NO:23 e 24, SEQ ID NO:39 e 40, ou SEQ ID NO:59 e 60.
[00180] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo compreende as CDRs ou domínios variáveis de um anticorpo selecionado do grupo consistindo em: mAb1-6723, 1-6716, 1-6721, 1-6730, 1-6731, 1-6737, 1-6754, 17378, 1-7413, 1-7424, 1-7466, 1-7481, 1-7483 e mAb1 -7591.
[00181] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo compreende as CDRs ou domínios variáveis de um anticorpo selecionado do grupo consistindo em: mAb1-6723, 1-6716, 1-6721, 1-6730, 1-6731, 1-6737, 1-6754, 17378, 1-7413, 1-7424, 1-7466, 1-7481,1-7483,1-7591,1-7388, 1-7563, 1 -7462 e mAb1 -7571.
[00182] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo pertence ao mesmo compartimento que um mAb selecionado do grupo de mAbs que compreendem as sequências variáveis ou suas CDRs selecionadas dentre: SEQ ID NO:21 e 22, SEQ ID NO:25 e 26, SEQ ID NO:27 e 28,
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SEQ ID NO:29 e 30, SEQ ID NO:31 e 32, SEQ ID NO:33 e 34, SEQ ID NO:35 e 36, SEQ ID NO:37 e 38, SEQ ID NO:39 e 40, SEQ ID NO:41 e 42, SEQ ID NO:43 e 44, SEQ ID NO:45 e 46, SEQ ID NO:51 e 52, SEQ ID NO:53 e 54, SEQ ID NO:55 e 56, SEQ ID NO:57 e 58, SEQ ID NO:59 e 60, SEQ ID NO:61 e 62, e SEQ ID NO:63 e 64. Este compartimento de anticorpos foi referido neste documento como Compartimento C e exemplificado com um grande número de anticorpos individuais, tais como mAb1-6723, 1-6716, 1-6721, 1-6730, 1-6731, 1-6737, 1-6754, 17378, 1-7413, 1-7424, 1-7466, 1-7481,1-7483,1-7591,1-7388, 1-7563, 1 -7462 e mAb1 -7571.
[00183] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo compete pela ligação ao FX, zimógeno de FX ou FXa com um anticorpo de referência selecionado do grupo de anticorpos consistindo em mAbs compreendendo as sequências variáveis ou suas CDRs selecionadas dentre: SEQ ID NO:21 e 22, SEQ ID NO:25 e 26, SEQ ID NO:27 e 28, SEQ ID NO:29 e 30, SEQ ID NO:31 e 32, SEQ ID NO:33 e 34, SEQ ID NO:35 e 36, SEQ ID NO:37 e 38, SEQ ID NO:41 e 42, SEQ ID NO:43 e 44, SEQ ID NO:53 e 54, SEQ ID NO:55 e 56, SEQ ID NO:57 e 58, e SEQ ID NO:63 e 64.
[00184] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a invenção, compete pela ligação ao FX/FXa com um fragmento de ligação a antígeno compreendendo as CDRs da SEQ ID NO:21 e 22, SEQ ID NO:25 e 26, SEQ ID NO:27 e 28, SEQ ID NO:29 e 30, SEQ ID NO:31 e 32, SEQ ID NO:33 e 34, SEQ ID NO:35 e 36, SEQ ID NO:37 e 38, SEQ ID NO:41 e 42, SEQ ID NO:43 e 44, SEQ ID NO:53 e 54, SEQ ID NO:55 e 56, SEQ ID NO:57 e 58, ou SEQ ID NO:63 e 64.
[00185] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar ao FX/FXa, em que o anticorpo compete com um anticorpo compreendendo as CDRs de mAb1-7447, 1-7441, 1-7571 ou 1-7462.
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Esses são mencionados neste documento como anticorpos do Compartimento D.
[00186] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo compreende os domínios variáveis de mAb1-7447, 1-7441, 1-7571 ou 1-7462 de acordo com as SEQ ID NO:47 e 48, SEQ ID NO:45 e 46, SEQ ID NO:51 e 53 ou SEQ ID NO:61 e 62, respectivamente.
[00187] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo compreende os domínios variáveis de mAb1-7447 ou 1-7441, de acordo com a SEQ ID NO:47 e 48, SEQ ID NO:45 e 46, respectivamente.
[00188] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo compreende as CDRs de mAb17447, 1 -7441, 1 -7571 ou 1 -7462 de acordo com as SEQ ID NO:47 e 48, SEQ ID NO:45 e 46, SEQ ID NO:51 e 53 ou SEQ ID NO:61 e 62, respectivamente.
[00189] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa de acordo com a SEQ ID NO:2, em que o anticorpo pertence ao mesmo compartimento que um Fab que compreende os domínios variáveis de mAb1-7447, 1-7441, 1-7571 ou mAb1-7462 de acordo com a SEQ ID NO:47 e 48, SEQ ID NO:45 e 46, SEQ ID NO:51 e 53 ou SEQ ID NO:61 e 62, respectivamente.
[00190] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo pertence ao mesmo compartimento que mAb1-7447, 1-7441, 1-7571 ou mAb1-7462 de acordo com as SEQ ID NO:47 e 48, SEQ ID NO:45 e 46, SEQ ID NO:51 e 53 ou SEQ ID NO:61 e 62, respectivamente.
[00191] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar a FX/FXa, em que o anticorpo pertence ao mesmo compartimento que um anticorpo ou Fab que compreende o domínio
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[00192] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é um anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo se liga especificamente ao zimógeno de FX.
[00193] Nessa modalidade, o anticorpo se liga especificamente ao zimógeno de FX de acordo com os resíduos de aminoácidos 1 -139,143448 da SEQ ID NO:2.
[00194] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é um anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo se liga ao FX.
[00195] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é um anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo se liga ao FXa.
[00196] Em uma dessas modalidades, o anticorpo se liga especificamente ao FXa de acordo com os resíduos de aminoácidos 1139, 195-448 da SEQ ID NO:2.
[00197] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo monoespecífico. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico. Em uma dessas modalidades, o anticorpo é um anticorpo biespecífico. Em uma dessas modalidades, o anticorpo biespecífico é capaz de se ligar ao FIX ou a sua forma ativada (FIXa) e FX/FXa. Em uma dessas modalidades, o anticorpo biespecífico é capaz de se ligar especificamente a FIX/FIXa e FX/FXa.
[00198] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico capaz de se ligar a FIX/FIXa e FX/FXa, em que o domínio de ligação a FIX/FIXa é derivado de um anticorpo do Compartimento 1 e o domínio de ligação a FX/FXa é derivado de um anticorpo do Compartimento A.
[00199] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que se liga a FIX/FIXa e FX/FXa, em que o domínio de ligação a
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FIX/FIXa é derivado de um anticorpo do Compartimento 2 e o domínio de ligação a FX/FXa é derivado de um anticorpo do Compartimento A. [00200] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que se liga a FIX/FIXa e FX/FXa, em que o domínio de ligação a FIX/FIXa é derivado de um anticorpo do Compartimento 2 e o domínio de ligação a FX/FXa é derivado de um anticorpo do Compartimento B. [00201 ] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que se liga a FIX/FIXa e FX/FXa, em que o domínio de ligação a FIX/FIXa é derivado de um anticorpo do Compartimento 2 e o domínio de ligação a FX/FXa é derivado de um anticorpo do Compartimento B. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que se liga a FIX/FIXa e FX/FXa, em que o domínio de ligação a FIX/FIXa é derivado de um anticorpo do Compartimento 1 e o domínio de ligação a FX/FXa e derivado de um anticorpo do Compartimento C ou D.
[00202] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que se liga a FIX/FIXa e FX/FXa, em que os domínios de ligação são derivados dos pares de mAb consistindo em: mAb1-1371/mAb1-1307, mAb1-6705/mAb1-1307, mAb1-1371/mAbO-1886, mAb1-7441/mAbO1886, mAb1-7447/mAb0-1886, mAb1 -7481 /mAb0-1886, mAb11371/mAbO-1998, mAb1-6716/mAb0-1998, mAb1-6723/mAb0-1998, mAb1-6730/mAb0-1998, mAb1 -6731 /mAb0-1998, mAb1-6737/mAbO1998, mAb1-6754/mAb0-1998, mAb1-7378/mAb0-1998, mAb17441/mAb0-1998, mAb1-7447/mAb0-1998, mAb1 -7481 /mAb0-1998, mAb1-1371/mAb1-4707, mAb1-6705/mAb1-4707, mAb1-1371/mAb14071, mAb1 -7441 /mAb1 -5788, mAb1-7447/mAb1-5788, mAb17481/mAb1-5788, mAb1-1371/mAb1-4857, mAb1 -6716/mAb1 -4857, mAb1-6723/mAb1-4857, mAb1-6730/mAb1-4857, mAb1-6731/mAb14857, mAb1-6737/mAb1-4857, mAb1-6754/mAb1-4857, mAb17378/mAb1-4857, mAb1 -7441 /mAb1 -4857, mAb1-7447/mAb1-4857 ou mAb1 -7481 /mAb1 -4857.
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52/157 [00203] Em uma modalidade, um anticorpo biespecífico da invenção compreende um braço de anticorpo que se liga ao FX q um braço de anticorpo que se liga ao FIX/FIXa. Nessa modalidade, o braço de anticorpo que se liga ao FX se liga a um epitope que compreende um ou mais resíduos no peptideo de ativação de FX e o braço de anticorpo que se liga a FIX/FIXa se liga a um epitope que compreende um ou mais resíduos no domínio de protease do FIX.
[00204] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é um anticorpo multiespecífico, tal como anticorpo bi- ou triespecífico.
[00205] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção está no formato de IgG, tal como lgG4 de comprimento total.
[00206] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é um conjugado químico de dois fragmentos de anticorpo, tal como um conjugado de dois fragmentos Fab ou fragmentos scFv, ou combinações destes.
[00207] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é um anticorpo humano ou humanizado.
[00208] Em uma modalidade, os anticorpos descritos neste documento são intermediários para uso na fabricação de um anticorpo biespecífico.
[00209] Em uma modalidade, a invenção inclui anticorpos que competem pela ligação ao FIX/FIXa com os anticorpos descritos neste documento.
[00210] Um anticorpo da presente invenção pode ser usado para tratar um sujeito com uma coagulopatia e, em particular, a hemofilia A. Assim, a invenção também se refere ao uso de um anticorpo monoclonal, que é capaz de se ligar ao domínio de protease do FIX/FIXa, para o tratamento de um sujeito em necessidade; bem como ao uso do referido anticorpo para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um sujeito em necessidade. Além disso, a invenção
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53/157 inclui um método de tratamento de um sujeito em necessidade com um anticorpo monoclonal que seja capaz de se ligar ao domínio de protease do FIX/FIXa.
[00211] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de se ligar ao FIXa com uma afinidade maior do que com a qual se liga ao FIX.
[00212] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de aumentar a atividade enzimática do FIXa em relação ao FX.
[00213] Nessa modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de aumentar a atividade enzimática do FIXa em relação ao FX, conforme medido em um ensaio de geração de FXa usando anticorpos de um braço monovalentes, conforme descrito neste documento.
[00214] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção é capaz de aumentar a atividade enzimática do FIXa em relação ao FX, conforme medido em um ensaio de geração de FXa usando anticorpos bivalentes, conforme descrito neste documento.
[00215] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção não é o anticorpo anti-FIX CLB-FIX 13 conforme descrito em Rohlena et al. (2003) J. Biol. Chem. 278(11):9394-9401. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção não é o anticorpo anti-FIX HIX-1 (lgG1 murino) (Merck KGaA, SigmaAldrich). Em uma modalidade, um anticorpo da invenção não é o anticorpo anti-FIX AHIX-5041 (lgG1) (Haematologic Technologies, Inc.).
[00216] Em uma modalidade, um anticorpo da invenção reduziu a imunogenicidade em comparação aos anticorpos pró-coagulantes da técnica.
[00217] Em uma modalidade, um anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende um primeiro sítio de ligação a antígeno que reconhece FIX (SEQ ID NO:1) ou sua forma ativada (FIXa), e um segundo sítio de ligação a antígeno que reconhece
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FX (SEQ ID N0:2) ou sua forma ativada (FXa), em que [00218] o primeiro sítio de ligação a antígeno compreende as seguintes sequências de CDR:
[00219] Vh-CDR1: DYAMH [00220] Vh-CDR2: GISWRGDIIGYVDSVKG [00221] Vh-CDR3: SYGSGSFYNAFDS [00222] Vl-CDR1 : RASQSISSWLA [00223] Vl-CDR2: KASRLDR [00224] Vl-CDR3: LEYSSYIRT [00225] e [00226] b) o segundo sítio de ligação a antígeno compreende as seguintes sequências de CDR:
[00227] Vh-CDR1 : TSWIV [00228] Vh-CDR2: MIDPSDSFTSYSPSFQG [00229] Vh-CDR3: LHYYHSEEFDV [00230] Vl-CDR1 : RASQSVSSSYLA [00231] Vl-CDR2: GASSRAR [00232] Vl-CDR3: QQFGSSRLFT [00233] Em uma modalidade, um anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende um primeiro sítio de ligação a antígeno que reconhece FIX (SEQ ID NO:1) ou sua forma ativada (FIXa), e um segundo sítio de ligação a antígeno que reconhece FX (SEQ ID NO:2) ou sua forma ativada (FXa), em que [00234] o primeiro sítio de ligação a antígeno compreende as seguintes sequências de CDR:
[00235] Vh-CDR1: DYAMH [00236] Vh-CDR2: GISWRGDIIGYVDSVKG [00237] Vh-CDR3: SYGSGSFYNAFDS [00238] Vl-CDR1 : RASQSISSWLA [00239] Vl-CDR2: KASRLDR
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55/157 [00240] Vl-CDR3: LEYSSYIRT [00241] e [00242] b) o segundo sítio de ligação a antígeno compreende as seguintes sequências de CDR:
[00243] Vh-CDR1 : TSWIV [00244] Vh-CDR2: MIDPSDSFTSYSPSFQG [00245] Vh-CDR3: LHYYHSEEFDV [00246] Vl-CDR1 : RASQSVSSSYLA [00247] Vl-CDR2: GASSRTR [00248] Vl-CDR3: QQFGSSRLFT [00249] A invenção é descrita ainda pelas seguintes modalidades: [00250] Um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno capaz de se ligar ao Fator IX (FIX) de acordo com a SEQ ID NO:1 ou a sua forma ativada (FIXa).
[00251] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é parte do Compartimentol.
[00252] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compete com um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende [00253] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:15 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:16ou [00254] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:19 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NQ:20.
[00255] O anticorpo, de acordo com a modalidade anterior, em que o anticorpo de referência é um Fab.
[00256] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de
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56/157 acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00257] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:15 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:16, [00258] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:19 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NQ:20, [00259] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:69 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NQ:70, [00260] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:71 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:72, [00261] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:73 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:74, [00262] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:83 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:84, [00263] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:81 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:82,
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57/157 [00264] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:75 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:76, [00265] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:77 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:78, ou [00266] domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:177 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:178.
[00267] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 5, em que o domínio variável de cadeia pesada é pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idêntico às SEQ IDs identificadas.
[00268] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 5, em que o domínio variável de cadeia leve é pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idêntico às SEQ IDs identificadas.
[00269] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 6 e 7, em que o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve são pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idênticos às SEQ IDs identificadas.
[00270] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00271] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:15e
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58/157 [00272] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:16, [00273] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:19e [00274] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NQ:20 [00275] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:69 e [00276] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NQ:70, [00277] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:71 e [00278] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:72, [00279] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:73 e [00280] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR
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59/157 do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:74, [00281] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:83 e [00282] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:84, [00283] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:81 e [00284] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:82, [00285] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:75 e [00286] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:76 ou [00287] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:77 e [00288] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:78 ou [00289] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo
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60/157 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:177e [00290] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:178.
[00291] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 9, em que as três sequências de CDR de cadeia pesada têm, no máximo 9, tal como 8, tal como 7, ou tal como 6 alterações de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00292] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 9, em que as três sequências de CDR de cadeia pesada têm, no máximo 5, tal como 4, tal como 3, tal como 2 ou no máximo 1 alteração de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00293] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 9, em que as três sequências de CDR de cadeia leve têm, no máximo 9, tal como 8, tal como 7, ou tal como 6 alterações de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00294] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 9, em que as três sequências de CDR de cadeia leve têm, no máximo 5, tal como 4, tal como 3, tal como 2 ou no máximo 1 alteração de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00295] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00296] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia
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61/157 pesada identificadas pela SEQ ID N0:15 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:16, ou [00297] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:19 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NQ:20, ou [00298] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:3 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:4, ou [00299] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NQ:109 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:110, ou [00300] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:153 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:154, ou [00301] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:171 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:172, ou [00302] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:177 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:178, ou [00303] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:187 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:188.
[00304] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00305] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:15 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:16, ou [00306] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ
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ID N0:19 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NQ:20, ou [00307] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:3 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:4, ou [00308] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NQ:109 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:110, ou [00309] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:153 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:154, ou [00310] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:171 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:172, ou [00311 ] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:177 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:178, ou [00312] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:187 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:188.
[00313] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epítopo compreendendo um ou mais dos resíduos de aminoácidos L337, R338, S339, T340, K341 e T343 da SEQ ID NO:1.
[00314] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epítopo compreendendo o resíduo de aminoácido R338 da SEQ ID NO:1.
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63/157 [00315] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácidos R338 e K341 da SEQ ID NO:1.
[00316] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epítopo compreendendo dois ou três dos resíduos de aminoácidos L337, R338, S339, T340, K341 e T343 da SEQ ID NO:1.
[00317] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epítopo compreendendo quatro ou cinco dos resíduos de aminoácidos L337, R338, S339, T340, K341 e T343 da SEQ ID NO:1.
[00318] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epítopo compreendendo [00319] R338, S339, T340, K341 e T343, [00320] L337, S339, T340, K341 e T343, [00321] L337, R338, T340, K341 e T343, [00322] L337, R338, S339, K341 e T343, [00323] L337, R338, S339, T340 e T343 ou [00324] L337, R338, S339, T340 e K341 [00325] daSEQIDNO:1.
[00326] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácidos L337, R338,
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S339, T340, K341 e T343 da SEQ ID N0:1.
[00327] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que ο anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epítopo compreendendo um ou mais dos resíduos de aminoácidos K301, D332, R333, A334, T335, R338 e N346 da SEQ ID NO:1.
[00328] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácidos L337, R338, S339, T340, K341 e T343 da SEQ ID NO:1.
[00329] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epítopo compreendendo dois ou três dos resíduos de aminoácidos K301, D332, R333, A334, T335, R338 e N346 da SEQ ID NO:1.
[00330] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epítopo compreendendo quatro ou cinco dos resíduos de aminoácidos K301, D332, R333, A334, T335, R338 e N346 da SEQ ID NO:1.
[00331] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epítopo compreendendo cinco ou seis dos resíduos de aminoácidos K301, D332, R333, A334, T335, R338 e N346 da SEQ ID NO:1.
[00332] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a
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65/157 um epitopo compreendendo [00333] D332, R333, A334, T335, R338 eN346 [00334] K301, R333, A334, T335, R338 eN346 [00335] K301, D332, A334, T335, R338 eN346 [00336] K301, D332, R333, T335, R338 eN346 [00337] K301, D332, R333, A334, R338 eN346 [00338] K301, D332, R333, A334, T335 e N346 ou [00339] K301, D332, R333, A334, T335 eR338 [00340] daSEQIDNO:1.
[00341] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo os resíduos de aminoácidos D332, R333, L337 e R338 da SEQ ID NO:1.
[00342] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo os resíduos de aminoácidos K301, D332, R333, A334, T335, R338 e N346 da SEQ ID NO:1.
[00343] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno pertence ao Compartimento2.
[00344] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compete com um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende um domínio variável de cadeia pesada identificado pela sequência da SEQ ID NO:17 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela sequência da SEQ ID NO:18.
[00345] O anticorpo, de acordo com a modalidade anterior, em que o anticorpo de referência é um Fab.
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66/157 [00346] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00347] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:17 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:18.
[00348] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:85 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:86 ou [00349] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:79 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NQ:80.
[00350] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 34, em que o domínio variável de cadeia pesada é pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idêntico às SEQ IDs identificadas.
[00351] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 34, em que o domínio variável de cadeia leve é pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idêntico às SEQ IDs identificadas.
[00352] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 35 e 36, em que o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve são pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idênticos às SEQ IDs identificadas.
[00353] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00354] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo
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67/157 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:17e [00355] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:18, [00356] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:85 e [00357] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:86 ou [00358] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:79 e [00359] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NQ:80. [00360] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 38, em que as três sequências de CDR de cadeia pesada têm, no máximo 9, tal como 8, tal como 7, ou tal como 6 alterações de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00361] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 38, em que as três sequências de CDR de cadeia pesada têm, no máximo 5, tal como 4, tal como 3, tal como 2 ou no máximo 1 alteração de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
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68/157 [00362] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 38, em que as três sequências de CDR de cadeia leve têm, no máximo 9, tal como 8, tal como 7, ou tal como 6 alterações de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00363] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 38, em que as três sequências de CDR de cadeia leve têm, no máximo 5, tal como 4, tal como 3, tal como 2 ou no máximo 1 alteração de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00364] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00365] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:17 e [00366] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:18.
[00367] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00368] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:17 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:18.
[00369] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epítopo compreendendo um ou mais dos resíduos de aminoácidos H256, H257, N258, K293, R403, Y404, N406, W407, E410 e K411 da SEQ ID NO:1.
[00370] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de
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69/157 acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo os resíduos de aminoácidos H256, H257, N258, K293, R403, Y404, N406, W407, E410 e K411 da SEQ ID NO:1. [00371] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo dois, três ou quatro dos resíduos de aminoácidos H256, H257, N258, K293, R403, Y404, N406, W407, E410 e K411 da SEQ ID NO:1.
[00372] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo cinco, seis ou sete dos resíduos de aminoácidos H256, H257, N258, K293, R403, Y404, N406, W407, E410 e K411 da SEQ ID NO:1.
[00373] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo oito, nove ou dez dos resíduos de aminoácidos H256, H257, N258, K293, R403, Y404, N406, W407, E410 e K411 da SEQ ID NO:1.
[00374] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epitopo compreendendo os resíduos de aminoácidos [00375] H257, N258, K293, R403, Y404, N406, W407, E410 e K411, [00376] H256, N258, K293, R403, Y404, N406, W407, E410 e K411, [00377] H256, H257, K293, R403, Y404, N406, W407, E410 e K411, [00378] H256, H257, N258, R403, Y404, N406, W407, E410 e K411,
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70/157 [00379] H256, H257, N258, K293, Y404, N406, W407, E410 eK411, [00380] H256, H257, N258, K293, R403, N406, W407, E410 eK411, [00381 ] H256, H257, N258, K293, R403, Y404, W407, E410 eK411, [00382] H256, H257, N258, K293, R403, Y404, N406, E410 eK411, [00383] H256, H257, N258, K293, R403, Y404, N406, W407 e K411 ou [00384] H256, H257, N258, K293, R403, Y404, N406, W407 e E410 [00385] daSEQIDNO:1.
[00386] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que ο anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epitope compreendendo os resíduos de aminoácidos H256, H257, N258, K293, R403, Y404, N406, W407, E410 e K411 da SEQ ID NO:1. [00387] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epitope compreendendo os resíduos de aminoácidos H257, K293 e N406 da SEQ ID NO:1.
[00388] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo é um anticorpo pró-coagulante.
[00389] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de aumentar a atividade de pró-coagulante de FIXa.
[00390] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo é capaz de aumentar a atividade enzimática de FIXa em relação ao FX.
[00391] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de
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71/157 acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo é capaz de substituir funcionalmente pelo FVIII e/ou FVIIIa.
[00392] Um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno capaz de se ligar a FX (SEQ ID NO:2) ou a sua forma ativada (FXa).
[00393] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 57, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é parte do Compartimento A.
[00394] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 57, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compete com um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:65 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:66.
[00395] O anticorpo, de acordo com a modalidade anterior, em que o anticorpo de referência é um Fab.
[00396] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epítopo compreendendo um ou mais dos resíduos de aminoácidos H101, E103, R113, T116, L117, A118, T127, S227, E228, F229, Y230, E266, R287, L303, P304, E305, L419, K420, D423, R424, M426, K427 e T428 de FX/FXa.
[00397] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácidos H101, E103, R113, T116, L117, A118, T127, S227, E228, F229, Y230, E266, R287, P304, L303, P304, E305, L419, K420, D423, R424, M426, K427 e T428 de FX/FXa.
[00398] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de
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72/157 acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epítopo compreendendo um ou mais dos resíduos de aminoácidos R113, Y230, K420, D423, R424 e K427 de FX/FXa.
[00399] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar a um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácidos R113, Y230, K420, D423, R424 e K427 de FX/FXa.
[00400] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:65 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:66.
[00401] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 65, em que o domínio variável de cadeia pesada é pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idêntico às SEQ IDs identificadas.
[00402] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 65, em que o domínio variável de cadeia leve é pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idêntico às SEQ IDs identificadas.
[00403] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 66 e 67, em que o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve são pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idênticos às SEQ IDs identificadas.
[00404] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende
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73/157 [00405] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:65 e [00406] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:66.
[00407] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 69, em que as três sequências de CDR de cadeia pesada têm, no máximo 9, tal como 8, tal como 7, ou tal como 6 alterações de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00408] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 69, em que as três sequências de CDR de cadeia pesada têm, no máximo 5, tal como 4, tal como 3, tal como 2 ou no máximo 1 alteração de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00409] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 69, em que as três sequências de CDR de cadeia leve têm, no máximo 9, tal como 8, tal como 7, ou tal como 6 alterações de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00410] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 69, em que as três sequências de CDR de cadeia leve têm, no máximo 5, tal como 4, tal como 3, tal como 2 ou no máximo 1 alteração de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00411] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as
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74/157 sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:65 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:66.
[00412] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:65 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:66.
[00413] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 57, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é parte do Compartimento B.
[00414] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 57, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compete com um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:67 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:68.
[00415] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo de referência é um Fab.
[00416] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00417] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:67 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:68, [00418] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:23 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência
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75/157 identificada pela SEQ ID NO:24, [00419] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:39 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NQ:40 ou [00420] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:59 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NQ:60.
[00421] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 79, em que o domínio variável de cadeia pesada é pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idêntico às SEQ IDs identificadas.
[00422] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 79, em que o domínio variável de cadeia leve é pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idêntico às SEQ IDs identificadas.
[00423] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 80 e 81, em que o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve são pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idênticos às SEQ IDs identificadas.
[00424] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00425] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:67 e [00426] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:68,
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76/157 [00427] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:23 e [00428] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:24, [00429] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:39 e [00430] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NQ:40 ou [00431] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:59 e [00432] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NQ:60. [00433] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 83, em que as três sequências de CDR de cadeia pesada têm, no máximo 9, tal como 8, tal como 7, ou tal como 6 alterações de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00434] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 83, em que as três sequências de CDR de cadeia pesada têm, no máximo 5, tal como 4, tal como 3, tal como 2 ou no máximo 1 alteração de aminoácido em comparação com as CDRs
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77/157 das SEQ IDs identificadas.
[00435] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 83, em que as três sequências de CDR de cadeia leve têm, no máximo 9, tal como 8, tal como 7, ou tal como 6 alterações de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00436] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 83, em que as três sequências de CDR de cadeia leve têm, no máximo 5, tal como 4, tal como 3, tal como 2 ou no máximo 1 alteração de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00437] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00438] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:67 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:68, [00439] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:23 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:24, [00440] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:39 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NQ:40 ou [00441] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:59 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NQ:60.
[00442] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00443] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ
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ID NO:67 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:68, [00444] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:23 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:24, [00445] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:39 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NQ:40 ou [00446] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:59 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NQ:60.
[00447] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 57, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno é parte do Compartimento C.
[00448] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 57, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compete com um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:21 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:22.
[00449] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo de referência é um Fab.
[00450] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00451] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:21 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:22,
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79/157 [00452] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:25 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:26.
[00453] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:27 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:28, [00454] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:29 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NQ:30, [00455] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:31 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:32, [00456] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:33 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:34.
[00457] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:35 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:36, [00458] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:37 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:38, [00459] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:39 e um domínio
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80/157 variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NQ:40, [00460] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:41 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:42, [00461] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:43 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:44, [00462] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência de um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:51 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:52, [00463] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:53 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:54, [00464] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:55 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:56, [00465] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:57 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:58, [00466] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:59 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência
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81/157 identificada pela SEQ ID NQ:60, [00467] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:61 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:62 ou [00468] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:63 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:64.
[00469] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 93, em que o domínio variável de cadeia pesada é pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idêntico às SEQ IDs identificadas.
[00470] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 93, em que o domínio variável de cadeia leve é pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idêntico às SEQ IDs identificadas.
[00471] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 94 e 95, em que o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve são pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idênticos às SEQ IDs identificadas.
[00472] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00473] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:21 e [00474] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:22,
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82/157 [00475] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:25 e [00476] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:26, [00477] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:27 e [00478] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:28 ou [00479] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:29 e [00480] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NQ:30, [00481] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:31 e [00482] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:32, [00483] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de
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CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:33 e [00484] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:34, [00485] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:35 e [00486] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:36 ou [00487] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:37 e [00488] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:38 [00489] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:39 e [00490] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NQ:40, [00491] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:41 e
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84/157 [00492] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:42, [00493] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:43 e [00494] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:44 ou [00495] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:51 e [00496] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:52 ou [00497] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:53 e [00498] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:54 [00499] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:55 e [00500] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR
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85/157 do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:56 [00501] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:57 e [00502] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:58, [00503] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:59 e [00504] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NQ:60, [00505] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:61 e [00506] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:62 ou [00507] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:63 e [00508] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:64. [00509] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de
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86/157 acordo com a modalidade 97, em que as três sequências de CDR de cadeia pesada têm, no máximo 9, tal como 8, tal como 7, ou tal como 6 alterações de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00510] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 97, em que as três sequências de CDR de cadeia pesada têm, no máximo 5, tal como 4, tal como 3, tal como 2 ou no máximo 1 alteração de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00511] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 97, em que as três sequências de CDR de cadeia leve têm, no máximo 9, tal como 8, tal como 7, ou tal como 6 alterações de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00512] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 97, em que as três sequências de CDR de cadeia leve têm, no máximo 5, tal como 4, tal como 3, tal como 2 ou no máximo 1 alteração de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00513] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00514] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:21 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:22, [00515] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:25 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:26, [00516] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:27 e as sequências de CDR do
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87/157 domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:28, [00517] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:29 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NQ:30, [00518] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:31 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:32, [00519] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:33 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:34, [00520] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:35 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:36, [00521] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:37 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:38, [00522] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:39 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NQ:40, [00523] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:41 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:42, [00524] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:43 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:44, [00525] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:51 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:52, [00526] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:53 e as sequências de CDR do
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88/157 domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:54, [00527] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:55 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:56, [00528] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:57 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:58, [00529] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:59 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NQ:60, [00530] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:61 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:62 ou [00531] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:63 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:64. [00532] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve identificados por [00533] SEQ ID NO:21 e 22, [00534] SEQ ID NO:25 e 26, [00535] SEQ ID NO:27 e 28, [00536] SEQ ID NO:29 e 30, [00537] SEQ ID NO:31 e 32, [00538] SEQ ID NO:33 e 34, [00539] SEQ ID NO:35 e 36, [00540] SEQ ID NO:37 e 38, [00541] SEQ ID NO:39 e 40,
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89/157 [00542] SEQ ID NO:41 e 42, [00543] SEQ ID NO:43 e 44, [00544] SEQ ID NO:51 e 52, [00545] SEQ ID NO:53 e 54, [00546] SEQ ID NO:55 e 56, [00547] SEQ ID NO:57 e 58, [00548] SEQ ID NO:59 e 60, [00549] SEQ ID NO:61 e 62 ou [00550] SEQ ID NO:63 e 64, respectivamente.
[00551] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 57, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno pertence ao Compartimento D.
[00552] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 57, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compete com um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:47 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:48.
[00553] O anticorpo, de acordo com a modalidade anterior, em que o anticorpo de referência é um Fab.
[00554] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00555] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:47 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:48, [00556] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:45 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência
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90/157 identificada pela SEQ ID NO:46, [00557] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:51 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:52 [00558] ou [00559] um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:61 e um domínio variável de cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:62.
[00560] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 107, em que o domínio variável de cadeia pesada é pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idêntico às SEQ IDs identificadas.
[00561] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 107, em que o domínio variável de cadeia leve é pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idêntico às SEQ IDs identificadas. [00562] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 108 e 109, em que o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve são pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idênticos às SEQ IDs identificadas.
[00563] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00564] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:47 e [00565] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR
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91/157 do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:48, [00566] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:45 e [00567] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:46, [00568] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:51 e [00569] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:52 ou [00570] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:61 e [00571] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:62. [00572] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 111, em que as três sequências de CDR de cadeia pesada têm, no máximo 9, tal como 8, tal como 7, ou tal como 6 alterações de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00573] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 111, em que as três sequências de CDR de cadeia pesada têm, no máximo 5, tal como 4, tal como 3, tal como 2 ou
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92/157 no máximo 1 alteração de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00574] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 111, em que as três sequências de CDR de cadeia leve têm, no máximo 9, tal como 8, tal como 7, ou tal como 6 alterações de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00575] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 111, em que as três sequências de CDR de cadeia leve têm, no máximo 5, tal como 4, tal como 3, tal como 2 ou no máximo 1 alteração de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00576] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00577] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:47 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:48, [00578] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:45 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:46, [00579] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:51 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:52 [00580] ou [00581] as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:61 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NO:62.
[00582] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o
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93/157 anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00583] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:47 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:48, [00584] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:45 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:46, [00585] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:51 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:52 [00586] ou [00587] um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:61 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:62.
[00588] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 57, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno pertence ao Compartimento E.
[00589] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 57, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compete com um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:49 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NQ:50.
[00590] O anticorpo, de acordo com a modalidade anterior, em que o anticorpo de referência é um Fab.
[00591] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NO:49 e um domínio variável de
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94/157 cadeia leve pelo menos 90% idêntico à sequência identificada pela SEQ ID NQ:50.
[00592] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 121, em que o domínio variável de cadeia pesada é pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idêntico à SEQ ID identificada. [00593] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 121, em que o domínio variável de cadeia leve é pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idêntico à SEQ ID identificada.
[00594] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 122 e 123, em que o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve são pelo menos 92, 94, 96 ou 98% idênticos às SEQ IDs identificadas.
[00595] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende [00596] três sequências de CDR de cadeia pesada com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificadas pela SEQ ID NO:49 e [00597] três sequências de CDR de cadeia leve com no máximo 10 alterações de aminoácidos em comparação com as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificadas pela SEQ ID NQ:50.
[00598] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 125, em que as três sequências de CDR de cadeia pesada têm, no máximo 9, tal como 8, tal como 7, ou tal como 6 alterações de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00599] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 125, em que as três sequências de CDR de cadeia pesada têm, no máximo 5, tal como 4, tal como 3, tal como 2 ou
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95/157 no máximo 1 alteração de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00600] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 125, em que as três sequências de CDR de cadeia leve têm, no máximo 9, tal como 8, tal como 7, ou tal como 6 alterações de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00601] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade 125, em que as três sequências de CDR de cadeia leve têm, no máximo 5, tal como 4, tal como 3, tal como 2 ou no máximo 1 alteração de aminoácido em comparação com as CDRs das SEQ IDs identificadas.
[00602] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:49 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NQ:50.
[00603] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:49 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NQ:50.
[00604] Um anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno capaz de se ligar a FIX/FIXa e FX/FXa.
[00605] O anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade [00604], em que o anticorpo compreende um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00250]-131.
[00606] O anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação a
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96/157 antígeno, de acordo com a modalidade [00604], em que o anticorpo compreende um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00251 ]-30.
[00607] O anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade [00604], em que o anticorpo compreende um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00343]-52.
[00608] O anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade [00604], em que o anticorpo compreende um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00392]-[00603].
[00609] O anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade [00604], em que o anticorpo compreende um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00393]-[00412].
[00610] O anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade [00604], em que o anticorpo compreende um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00413]-[00442].
[00611] O anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade [00604], em que o anticorpo compreende um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00447]-[00532].
[00612] O anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade [00604], em que o anticorpo compreende um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00551 ]-[00582].
[00613] O anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno de acordo com a modalidade [00604], em que o anticorpo compreende um fragmento de ligação a antígeno de acordo com
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97/157 qualquer uma das modalidades anteriores [00588]-[00603] [00614] O anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade [00604], em que o anticorpo compreende um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00250]-[00391], e um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00392]-[00603].
[00615] O anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade [00604], em que o anticorpo compreende um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00251 ]-30, e um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00393]-[00412].
[00616] O anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade [00604], em que o anticorpo compreende um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00251 ]-30, e um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00413]-[00442].
[00617] O anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade [00604], em que o anticorpo compreende um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00251 ]-30, e um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00447]-[00532].
[00618] O anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade [00604], em que o anticorpo compreende um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00343]-52, e um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades
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98/157 anteriores [00393]-[00412].
[00619] O anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade [00604], em que o anticorpo compreende um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00343]-52, e um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00413]-[00442].
[00620] O anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade [00604], em que o anticorpo compreende um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00343]-52, e um fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores [00447]-[00532].
[00621] O anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a modalidade [00604], em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico capaz de se ligar especificamente a FIX/FIXa e FX/FXa, em que os domínios de ligação são derivados dos pares de mAbs consistindo em: mAb1-1371/mAb1-1307, mAb1-6705/mAb11307, mAb1-1371/mAbO-1886, mAb1 -7441 /mAb0-1886, mAb17447/mAb0-1886, mAb1 -7481 /mAb0-1886, mAb1-1371/mAbO-1998, mAb1-6716/mAb0-1998, mAb1-6723/mAb0-1998, mAb1-6730/mAb01998, mAb1-6731/mAb0-1998, mAb1-6737/mAb0-1998, mAb16754/mAb0-1998, mAb1-7378/mAb0-1998, mAb1 -7441 /mAb0-1998, mAb1-7447/mAb0-1998, mAb/mAbO-1998, mAb1-6723/mAb1-1307, mAb1-6723/mAb0-1886, mAb1-6705/mAb0-1886, mAb1-7481/mAbO1998 e mAb1-6705/mAb0-1998.
[00622] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades [00604] a [00621], em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico pró-coagulante.
[00623] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de
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99/157 acordo com qualquer uma das modalidades [00604] a [00621], em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico capaz de aumentar a atividade de pró-coagulante de FIXa.
[00624] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades [00604] a [00621], em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico capaz de aumentar a atividade enzimática de FIXa em relação ao FX.
[00625] O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades [00604] a [00621], em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico capaz de substituir funcionalmente pelo FVIII e/ou FVIIIa.
[00626] Um anticorpo multiespecífico capaz de estimular a atividade enzimática de FIXa em relação ao FX compreendendo um primeiro sítio de ligação a antígeno que reconhece FIX (SEQ ID NO:1) ou sua forma ativada (FIXa), e um segundo sítio de ligação a antígeno que reconhece FX (SEQ ID NO:2) ou sua forma ativada (FXa), em que [00627] o primeiro sítio de ligação a antígeno compreende as CDRs de um anticorpo selecionado do grupo consistindo em: mAb1-5743, mAb1-6584, mAb1-8768, mAb1-6037, mAb1-6081, mAb1-4857, mAb18780, mAb1-9016, mAb1-9015, mAb1-8467, mAb1-5783, ou mAb15781,e [00628] o segundo sítio de ligação a antígeno compreende as CDRs de um anticorpo selecionado do grupo consistindo em: mAb1-6738, mAb1-6463, mAb1-6723, mAb1-7503, ou mAb1-6097.
[00629] Um anticorpo multiespecífico capaz de estimular a atividade enzimática de FIXa em relação ao FX compreendendo [00630] um primeiro polipeptídeo que reconhece FIX/FIXa, e [00631] um segundo polipeptídeo que reconhece FX/FXa, em que [00632] o primeiro polipeptídeo compreende o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve de mAb1-5743,
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100/157 mAb1-6584, mAb1-8768, mAb1-6037, mAb1-6081, mAb1-4857, mAb18780, mAb1-9016, mAb1-9015, mAb1-8467, mAb1-5783, ou mAb15781,e [00633] o segundo polipeptídeo compreende o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve de mAb1-6738, mAb1-6463, mAb1-6723, mAb1-7503, ou mAb1-6097.
[00634] O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades [00626] ou [00629], em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico.
[00635] O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades [00622]-[00634], em que a estimulação da atividade enzimática de FIXa em relação a FX é determinada em um ensaio de geração de FXa conforme descrito neste documento usando um anticorpo anti-FIX/FIXa de um braço monovalente, onde o índice de estimulação é de pelo menos 94, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 3000, 4000 ou 5000 vezes quando medido usando uma concentração de anticorpo de um braço, resultando em pelo menos 80% de saturação de FIXa.
[00636] Um anticorpo multiespecífico capaz de estimular a atividade enzimática de FIXa em relação ao FX compreendendo [00637] um primeiro sítio de ligação a antígeno que reconhece FIX (SEQ ID NO:1) ou sua forma ativada (FIXa), e um segundo sítio de ligação a antígeno que reconhece FX (SEQ ID NO:2) ou sua forma ativada (FXa), em que [00638] o primeiro sítio de ligação a antígeno é capaz de se ligar especificamente a um epítopo compreendendo o resíduo de aminoácido R338 de FIX/FIXa, e [00639] em que o segundo sítio de ligação a antígeno é capaz de se ligar no domínio EGF-2 e/ou na subunidade catalítica de FX/FXa.
[00640] O anticorpo multiespecífico, de acordo com a modalidade
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158, em que [00641] o primeiro sítio de ligação a antígeno é capaz de se ligar especificamente a um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácido R338 e K341 de FIX/FIXa.
[00642] O anticorpo multiespecífico, de acordo com a modalidade
159, em que [00643] o primeiro sítio de ligação a antígeno é capaz de se ligar especificamente a um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácido L337, R338, S339, T340, K341 e T343 de FIX/FIXa.
[00644] Um anticorpo multiespecífico capaz de estimular a atividade enzimática de FIXa em relação ao FX compreendendo um primeiro sítio de ligação a antígeno que reconhece FIX (SEQ ID NO:1) ou sua forma ativada, FIXa, e um segundo sítio de ligação a antígeno que reconhece FX (SEQ ID NO:2) ou sua forma ativada (FXa), [00645] em que [00646] o primeiro sítio de ligação a antígeno é capaz de se ligar especificamente a um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácido D332, R333, L337 e R338 de FIX/FIXa, e [00647] em que o segundo sítio de ligação a antígeno é capaz de se ligar no domínio EGF-2 e/ou na subunidade catalítica de FX/FXa.
[00648] O anticorpo multiespecífico, de acordo com a modalidade 161, em que [00649] o primeiro sítio de ligação a antígeno é capaz de se ligar especificamente a um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácido K301, D332, R333, A334, T335, R338, N346 de FIX/FIXa.
[00650] Um anticorpo multiespecífico capaz de estimular a atividade enzimática de FIXa em relação ao FX compreendendo [00651] um primeiro sítio de ligação a antígeno que reconhece FIX/FIXa, e [00652] um segundo sítio de ligação a antígeno que reconhece
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FX/FXa, [00653] em que [00654] o primeiro sítio de ligação a antígeno é capaz de se ligar especificamente a um epítopo compreendendo os resíduos de aminoácido H257, K293 e N406 de FIX/FIXa, e [00655] em que o segundo sítio de ligação a antígeno é capaz de se ligar no domínio EGF-2 e/ou na subunidade catalítica de FX/FXa.
[00656] O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades [00250]-[00391] e [00604]-[00634], em que a estimulação da atividade enzimática de FIXa em relação a FX é medida em um ensaio de geração de FXa conforme descrito neste documento usando um anticorpo antiFIX/FIXa de um braço monovalente, onde o índice de estimulação é de pelo menos 94, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 3000, 4000 ou 5000 vezes quando medido usando uma concentração de anticorpo de um braço, resultando em pelo menos 80% de saturação de FIXa.
[00657] O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades [00250]-[00391] e [00604]-[00634], em que a estimulação da atividade enzimática de FIXa em relação a FX é medida em um ensaio de geração de FXa conforme descrito neste documento usando um anticorpo antiFIX/FIXa de um braço monovalente, em que o índice de estimulação é entre 50 e 5000 vezes, tal como 94 a 2500 vezes, tal como 100 a 2500 vezes, tal como 200 a 2500 vezes, tal como 300 a 2500 vezes, tal como 400 a 2500 vezes, tal como 500 a 2500 vezes, tal como 600 a 2500 vezes, tal como 700 a 2500 vezes, tal como 800 a 2500 vezes, tal como 500 a 2500 vezes, tal como 600 a 2500 vezes, tal como 700 a 2500 vezes, tal como 800 a 2500 vezes, tal como 900 a 2500 vezes, tal como 1000 a 2500 vezes ou tal como 1500 a 2500 vezes quando medido usando uma concentração de anticorpo de um braço, resultando em
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103/157 pelo menos 80% de saturação de FIXa.
[00658] O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo é um anticorpo pró-coagulante.
[00659] O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o referido anticorpo substitui funcionalmente pelo FVIII e/ou FVIIIa.
[00660] O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o anticorpo é um anticorpo biespecífico.
[00661] O anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o isotipo do anticorpo é IgG 1, lgG2, lgG3 ou lgG4 ou uma combinação destes.
[00662] Um anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades [00392]-131, em que o domínio variável de cadeia leve do referido anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende os resíduos de aminoácido R57, R96 (SEQ ID NO:22) e em que o domínio variável de cadeia pesada do referido anticorpo compreende os resíduos de aminoácido W33, D52, D55, H100, Y101, Y102, H103 (SEQ ID NO:21).
[00663] Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que é para uso em um método de tratamento de uma coagulopatia ou distúrbio de coagulação do sangue.
[00664] Composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, para o tratamento de uma coagulopatia ou distúrbio de coagulação do sangue.
[00665] Método de tratamento de um sujeito que sofre de uma coagulopatia ou distúrbio de coagulação do sangue, que compreende a administração, ao referido sujeito, de um anticorpo ou de seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das modalidades
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104/157 anteriores.
[00666] Um método, de acordo com a modalidade 173, em que a
coagulopatia ou distúrbio de coagulação do sangue é a hemofilia A ou hemofilia A com inibidores.
EXEMPLOS
Lista de Abreviações
[00667] [00668] ACN: Acetonitrila CDR: Região Determinante de
Complementariedade
[00669] [00670] EGR-CK: EGR-clorometilcetona LC-MS Cromatografia líquida acoplada à
Espectrometria de massa
[00671] FACS: Separação de células ativadas por
fluorescência
[00672] [00673] [00674] [00675] [00676] [00677] FIX: Fator IX de Coagulação FIXa: Fator IXa de Coagulação FX: Fator X de Coagulação FXa: Fator Xa de Coagulação HA: Hemofilia A HA-PPP: Plasma humano deficiente em plaquetas
induzido por HA
[00678] HA HA-PRP: Plasma humano rico em plaquetas induzido por
[00679] [00680] [00681] hFIXa: Fator IXa de Coagulação humano ITC: Calorimetria de Titulação Isotérmica MACS: Classificação de células ativadas por
magnetismo
[00682] [00683] [00684] OA: Com um braço PCR: Reação em Cadeia da Polimerase SPR: Ressonância Plasmônica de Superfície
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Exemplo 1: Desenvolvimento de plasmídeos de expressão de Fab e mAb para o Fator IX/FIXa [00685] Anticorpos de ligação a FIX/FIXa conforme descritos neste documento foram identificados usando vários métodos de desenvolvimento de anticorpos. A fim de gerar um conjunto diversificado de anticorpos direcionados a FIXa e FX, imunizações de camundongos e coelhos, bem como seleções de exibição em fago e exibição em levedura Adimab foram realizadas.
Exibição em levedura Adimab [00686] A plataforma de Adimab é um sistema de exibição em levedura que abrange uma biblioteca de lgG1/kappa naive totalmente humana com uma diversidade de 1010 e cobrindo 20 de 42 famílias de VH. A plataforma de exibição em fago de anticorpos utilizada é uma biblioteca de exibição de Fab totalmente humana proprietária. A biblioteca tem um tamanho de 1010 e foi construída por uma abordagem combinatória utilizando síntese química da cadeia leve, bem como a CDR1 e CDR2 da cadeia pesada, complementada com amplificação por PCR da CDR3 da cadeia pesada de células mononucleares de sangue periférico humano. O processo de seleção de anticorpos é direcionado usando métodos baseados em MACS e FACS que permitem o monitoramento dos critérios de seleção aplicados em tempo real. Uma vez que as seleções são baseadas em MACS e FACS, os antígenos marcados (por exemplo, biotina) são necessários. As campanhas de seleção foram realizadas usando hFIXa inibido com sítio ativo marcado com biotina (FIXa-EGR-biotina), ou imobilização de hFIXa mediada por anticorpo. Os hits foram avaliados para a ligação usando interferometria de biocamada (Octet fortebio systems).
Exibição em Fago [00687] Para maximizar a cobertura da diversidade de epitopes, diferentes estratégias de panoramização foram exploradas, incluindo
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106/157 panoramização usando FIXa-EGR biotinilado, FX, FXa inibido com sítio ativo, ou captura de antígeno usando anticorpos anti-FIXa. Os hits iniciais foram identificados por ELISA com fago. Após a análise da sequência, os hits exclusivos foram clonados, expressos como lgG1 e classificados usando SPR (Biacore) ou interferometria de biocamada (Octet fortebio systems).
Plataformas in vivo [00688] Para geração de anticorpos totalmente humanos em camundongos, camundongos HK e HL 1.0 Kymouse™ (utilizando cadeias kappa e lambda, respetivamente) foram usados. Imunizações adicionais foram realizadas em camundongos e coelhos do tipo selvagem a fim de maximizar a diversidade de anticorpos.
Geração de Anticorpos anti-FIXa [00689] Camundongos ou coelhos foram imunizados com FIXa, FIXa-EGR ou FX usando protocolos padrão. Os anticorpos gerados nos camundongos ou coelhos foram selecionados em ELISA. Células B de coelhos que ligaram o FIXa foram selecionadas por FACS usando FIXaEGR biotinilado aleatoriamente. Os hits de anticorpos dos coelhos e camundongos foram expressos de forma recombinante (mAbs de coelho) ou propagados (hibridomas de camundongo) e os anticorpos foram subsequentemente purificados em pequena escala.
Geração de Anticorpos anti-FX [00690] Camundongos e coelhos Kymouse foram imunizados com FX usando protocolos padrão ou de Imunização Repetitiva em Múltiplos Sítios (RIMMS). Células B de coelho foram isoladas por seleção por FACS usando FX biotinilado aleatoriamente. Os mAbs anti-FX de fusões e seleções foram triados usando ELISA e Octet fortebio systems.
Sequenciamento de Anticorpos Derivados de Camundongo wt e Kymouse [00691] Hibridomas produtores de anticorpos anti-FIXa e anti-FX
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107/157 derivados de camundongos Kymouse ou camundongos wt foram sequenciados e expressos em células HEK293 usando técnicas padrão. Os anticorpos expressos foram avaliados para a ligação usando Octet fortebio systems.
[00692] O domínio variável resultando (Vh e Vl) que codifica sequências de DNA de anticorpos selecionados foi inserido em um vetor de expressão de mamífero baseado em pTT (Durocher et al (2002) Nucleic Acid Res. 30: E9) ou em um vetor de expressão de mamífero pcDNA3.4 (Invitrogen) contendo sequências de DNA codificantes da região constante do anticorpo. Para os vetores de expressão pTT/pcDNA3.4 mAb, as sequências de DNA de Vh e Vl foram inseridas in-frame com S228P de lgG1 ou lgG4 humana (Ch1Ch2Ch3) ou sequências de DNA codificantes da região constante kappa de Cl humano, respectivamente. Para os vetores de expressão pTT/pcDNA3.4 Fab correspondentes, as sequências de DNA de Vh foram inseridas in-frame com as sequências de DNA codificantes de Ch1 de IgG 1 humana.
[00693] Para o composto de referência 224F3 usado no Exemplo 6, 8 e 18 abaixo, as sequências de Vh e Vl de 224F3 foram obtidas de EP1660536 B1 (SEQ ID NO:1 e 2, respectivamente). As sequências de DNA codificantes de Vh e Vl de 224F3 foram inseridas em um vetor de expressão de mamífero baseado em pTT5/pcDNA3.4 in-frame com sequências de DNA codificantes da região constante kappa (Ch1Ch2Ch3) de lgG1 humana ou Cl humana, respectivamente.
[00694] Todos os vetores de expressão incluíram uma sequência de DNA de extremidade 5’ contendo uma sequência de kozak e uma sequência de DNA que codifica um peptídeo sinal in-frame com as sequências de DNA codificantes de anticorpo.
Exemplo 2: Expressão Recombinante de Anticorpos e Fragmentos Fab de Anticorpo
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108/157 [00695] Anticorpos e fragmentos Fab de anticorpo foram expressos usando transfecção transitória de células HEK293 em suspensão (293Expi, Invitrogen) seguindo-se essencialmente as instruções do fabricante. As células 293Expi foram normalmente subcultivadas a cada 3-4 dias em meio de expressão Expi293F (Invitrogen, número de catálogo A1435104) complementado com 1% P/S (número de catálogo GIBCO 15140-122). As células Expi293F foram transfectadas em uma densidade celular de 2,5-3 mill/mL usando Expifectamine. Para cada litro de células Expi293F, a transfecção foi realizada diluindo-se um total de 1 mg de DNA plasmidial (Vh-Ch1 (para Fab) ou Vh-Ch1-Ch2-Ch3 (para mAb) e plasmídeos LC em razão de 1:1) em 50 ml_ Optimem (GIBCO, cat. n. 51985-026, diluição A) e por diluição de 2,7 ml_ de Expifectamine em 50 ml_ Optimem (diluição B). Para co-transfecções produtoras de Fab e mAb, Vh-Ch1 e plasmídeos LC e (Fab) e Vh-Ch1Ch2-Ch3 e plasmídeos LC (mAb), respectivamente, foram usados em uma razão de 1:1. A diluição A e B foram misturadas e incubadas em temperatura ambiente por 10-20 minutos. A mistura de transfecção foi depois adicionada às células Expi293F e as células foram incubadas em 37°C em uma incubadora umidificada com rotação orbital (85-125 rpm). Um dia após a transfecção, as células transfectadas foram complementadas com 5 ml de ExpiFectamine 293, Potenciador de Transfecção 1 e 50 ml de ExpiFectamine 293, Potenciador de Transfecção 2. Os sobrenadantes da cultura celular foram normalmente colhidos 4-5 dias após a transfecção por centrifugação seguida filtração.
Exemplo 3: Purificação e Caracterização de Fab e Anticorpo
Purificação e Caracterização de Fab [00696] A purificação de moléculas de Fab foi realizada como um processo de 2 etapas composto por cromatografia de afinidade usando uma resina kappaSelect (GE Healthcare, cat. η. 17-5458-11) e cromatografia por exclusão de tamanho usando uma resina
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Superdex200 (GE Healthcare, cat. n. 17-1043-04). As purificações foram realizadas usando um sistema de cromatografia ÃktaExplorer(GE Healthcare, cat. η. 18-1112-41). Os sistemas tampão usados para a etapa de purificação de afinidade foram um tampão de equilíbrio composto por 20 mM Fosfato de Na pH 7,2, 150 mM NaCI e tampão de eluição composto por 10 mM ácido fórmico pH 3,5 e um tampão de ajuste de pH composto por 0,4 M Fosfato de Na pH 9,0. Os sobrenadantes celulares foram aplicados diretamente sem quaisquer ajustes em uma coluna kappaSelect SuRe pré-equilibrada. A coluna foi lavada com 10 volumes de coluna de tampão de equilíbrio e as moléculas de Fab foram eluídas isocraticamente em aproximadamente 5 volumes de coluna de tampão de eluição. O pH das frações agrupadas foi ajustado para neutro usando o tampão de ajuste de pH descrito imediatamente após a eluição. As moléculas de Fab foram ainda purificadas e o tampão foi trocado usando a referida resina de filtração de gel pré-embalada em uma coluna. O tampão de corrida usado para a cromatografia por exclusão de tamanho foi 25 mM HEPES e 150 mM NaCI, pH 7,4. As moléculas Fab eluíram como picos únicos em aproximadamente 0,5 volume de coluna. As frações que cobriam o pico foram analisadas usando um método de cromatografia líquida de alta eficiência por exclusão de tamanho (SE-HPLC) configurado em um sistema Agilent LC 1100/1200 e usando uma coluna BIOSep-SECS3000 300x7,8mm (Phenomenex, cat. η. 00H-2146-K0) e um tampão de corrida composto por 200 mM Fosfato de Na pH 6,9, 300 mM NaCI e 10% isopropanol. Com base nesta análise, as frações foram agrupadas para se obter uma preparação de proteína homogênea. A preparação final eluída como um pico simétrico único em um tempo de retenção de aproximadamente 10 min a uma vazão de 1 ml/min.
[00697] As moléculas de Fab purificadas foram ainda caracterizadas usando análises por SDS-PAGE/Coomassie e cromatografia líquida
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110/157 acoplada à espectrometria de massas. A análise por SDSPAGE/Coomassie foi realizada usando géis NuPage 4-12% Bis-Tris (Invitrogen, cat. η. NP0321BOX). Todas as moléculas de Fab exibiram os componentes esperados de cadeia leve e cadeia pesada. Determinações de massa molecular intacta foram realizadas usando um método de Espectrometria de Massa por Tempo de Voo com lonização por Electrospray e Cromatografia Líquida configurado em um instrumento Agilent 6210 e uma coluna de dessalinização MassPREP (Waters, cat. n. USRM10008656). O sistema tampão usado em um tampão de equilíbrio composto por 0,1% ácido fórmico em H2O graduado em LC-MS e um tampão de eluição composto por 0,1% ácido fórmico ACN graduado em LC-MS. Todas as moléculas de Fab exibiram massas moleculares intactas esperadas de acordo com a sequência. A pureza final foi determinada com base na análise de SE-HPLC. As estimativas de pureza foram todas entre 95-99% para os diferentes fragmentos Fab. Para determinar as concentrações finais de proteína, a medição de absorbância em 280 nm usando um espectrofotômetro NanoDrop (Thermo Scientific) foi realizada e as concentrações foram calculadas usando coeficientes de extinção específicos para cada uma das moléculas de Fab.
Purificação e Caracterização de Anticorpo [00698] A purificação dos anticorpos foi realizada por cromatografia de afinidade usando uma resina Protein A MabSelect SuRe (GE Healthcare, cat. η. 17-5438-01). As purificações foram realizadas usando um sistema de cromatografia ÃktaExplorer(GE Healthcare, cat. η. 18-1112-41). Os sistemas tampão usados para a etapa de purificação de afinidade foram um tampão de equilíbrio que era composto por 20 mM Fosfato de Na pH 7,2, 150 mM NaCI e tampão de eluição composto por 10 mM ácido fórmico pH 3,5 e um tampão de ajuste de pH composto por 0,4 M Fosfato de Na pH 9,0. Os sobrenadantes celulares foram
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111/157 aplicados diretamente sem quaisquer ajustes em uma coluna MabSelect SuRe pré-equilibrada. A coluna foi lavada com 10 volumes de coluna de tampão de equilíbrio e os anticorpos foram eluídos isocraticamente em aproximadamente 2-5 volumes de coluna de tampão de eluição. O pH das frações agrupadas foi ajustado para neutro usando o tampão de ajuste de pH descrito imediatamente após a eluição.
[00699] Os anticorpos purificados foram caracterizados usando análises por SDS-PAGE/Coomassie, cromatografia líquida de alta pressão por exclusão de tamanho (SE-HPLC) e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS). A análise por SDSPAGE/Coomassie foi realizada usando géis NuPage 4-12% Bis-Tris (Invitrogen, cat. η. NP0321BOX). Aqui, todos os anticorpos exibiram os componentes esperados de cadeia leve e cadeia pesada. Determinações de massa molecular intacta foram realizadas usando um método de Espectrometria de Massa por Tempo de Voo com lonização por Electrospray e Cromatografia Líquida configurado em um instrumento Agilent 6210 e uma coluna de dessalinização MassPREP (Waters, cat. n. USRM10008656). O sistema tampão usado em um tampão de equilíbrio composto por 0,1% ácido fórmico em H2O graduado em LC-MS e um tampão de eluição composto por 0,1% ácido fórmico ACN graduado em LC-MS. As análises foram realizadas cm e sem N-Glicosidase F (Roche Diagnostics, cat. η. 11365177001) e agente redutor (isto é, mercaptoetanol ou DTT). Todos os anticorpos exibiram massas moleculares intactas esperadas de acordo com a sequência e um N-glicano de cadeia pesada. A pureza foi determinada com base em SE-HPLC. A pureza de proteína final foi analisada com base no método SE-HPLC configurado em um sistema Agilent LC 1100/1200 e usando uma coluna BIGSep-SEC-S3000 300x7,8mm (Phenomenex, cat. η. 00H-2146-K0) e um tampão de corrida composto
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112/157 por 200 mM Fosfato de Na pH 6,9, 300 mM NaCI e 10% isopropanol. UV280 e detectores de fluorescência (Ex 280nm / Em 354nm) foram usados para detecção. Os anticorpos foram eluídos como picos simétricos únicos com tempos de retenção refletindo o tamanho dos anticorpos. As estimativas de pureza foram todas entre 95-99% para os diferentes anticorpos. Para medir as concentrações de proteína final, um espectrofotômetro NanoDrop (Thermo Scientific) foi usado juntamente com coeficientes de extinção específicos para cada um dos anticorpos.
Exemplo 4: Seleção de Anticorpos Estimulantes Anti-FIXa [00700] Anticorpos selecionados como capazes de estimular a atividade enzimática de FIXa em relação a FX foram analisados em experimentos de seleção para determinar as características de ligação para os anticorpos identificados usando o método descrito abaixo.
Método para a seleção de anticorpos [00701] Experimentos de seleção foram realizados usando Octet fortebio systems (HTX, Red384) equipados com sensores de IgG antihumana (Pall Life Sciences, Menlo Park, CA) e usando modo de 8 ou 32 canais (Red384 e HTX). Os ensaios de seleção foram realizados usando a configuração de seleção de epitopo tipo sanduíche clássica. Resumidamente, (1) o primeiro anticorpo foi capturado por ponteiras AHC anti-humanas (ponteiras de captura de Fc de IgG anti-humana (AHC Parte NO:18-5064), (2) os sítios de ligação de IgG não bloqueados nas ponteiras AHC foram bloqueados por IgG policlonal humana (I4506 SIGMA), (3) FIXa foi ligado ao primeiro anticorpo, (4) o anticorpo competitivo foi oferecido ao complexo anticorpo-antígeno nas ponteiras e, se nenhuma ligação do anticorpo secundário fosse detectada, os anticorpos seriam pontuados como pertencentes aos mesmo compartimento.
[00702] A análise identificou dois compartimentos diferentes,
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Compartimento 1 e 2, definidos pelos anticorpos mAbO-1886 e mAb11307, respectivamente.
Seleção de Anticorpos anti-FIX.
[00703] Anticorpos anti-FIX selecionados foram selecionados uns contra os outros e dois compartimentos diferentes (Compartimento 1 e
2) foram identificados. Os números referem-se a mAb ID, por exemplo, 0-1998 denota mAbO-1998.
Compartimento 1 mAbO-1886 Compartimento 2 mAb1-1307
0-1998
0-2000
0-2001
0-2003
1-0985
1-0982
1-0072 1-0072
1-0073 1-0073
1-1448
1-0970
[00704] A visão geral mostra que vários anticorpos foram encontrados como pertencendo ao Compartimento 1, incluindo mAbO1886 e mAbO-1998. O Compartimento 2 inclui quatro anticorpos além de mAb1-1307. Dois anticorpos, mAb1-0072 e mAb1-0073, foram comuns aos Compartimentos 1 e 2.
Variantes de anticorpos parentais (linhagens) conforme descrito neste documento compartilham compartimentos e resíduos de epítopo (hotspot) com anticorpos parentais [00705] Uma vez que as variantes do anticorpo para o qual os dados são fornecidos no presente exemplo não contêm substituições de aminoácidos nas posições mostradas como sendo cruciais para o reconhecimento do epítopo com base nas estruturas de cristal dos complexos de anticorpo parental-FIXa fornecidos no Exemplo 5, um versado na técnica entendería que as variantes, como um ponto de
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114/157 partida, pertenceríam ao mesmo compartimento, competiríam pelo compartimento e reconheceríam pelo menos os mesmos resíduos de hot-spot no epítopo de FIX/FIXa que o anticorpo do qual elas se originaram, isto é, mAbO-1998, mAbO-1886, ou mAb1-1307.
Exemplo 5: Cristalização e Mapeamento de Epítopo de Anticorpos anti-FIX/FIXa Usando Cristalografia de Raios X [00706] A proteína FIXa usada para cristalização (Cambridge ProteinWorks, Código de Produto 10316) é composta por uma cadeia leve truncada (resíduos 85-142 da SEQ ID NO:1) com um resíduo de metionina não natural ligado ao terminal N como resultado de expressão bacteriana, e uma cadeia pesada contendo os resíduos 181-415 da SEQ ID NO:1. O sítio ativo da protease é bloqueado por EGRclorometilcetona.
Cristalização [00707] Fab0-7237:FIXa [00708] Os cristais de FabO-7237 (fragmento Fab correspondente a mAbO-1886) misturados em uma razão molar de 1:1 com a proteína FIXa foram cultivados usando a técnica de difusão por vapor de gota suspensa a 18Ό. Uma solução de proteína de 0,8 pl 7,5 mg/ml em 20 mM de Tris-HCI, pH 7,4, 50 mM NaCI, e 2,5 mM CaChfoi misturado com um volume igual de 4 M de formiato de sódio como precipitante e incubado sobre 1 ml de precipitante.
[00709] Fab0-7238:FIXa [00710] Os cristais de FabO-7238 (fragmento Fab correspondente a mAbO-1998) misturados em uma razão molar de 1:1 com a proteína FIXa foram cultivados usando a técnica de difusão por vapor de gota depositada em 18Ό. Uma solução de proteína de 0,1 μί 6,2 mg/ml em 20 mM de Tris-HCI, pH 7,4, 50 mM NaCI e 2,5 mM CaCÍ2 foi misturado com 0,1 μί de 100 mM de cacodilato de sódio, pH 6,5 e 1 M de citrato trissódico como precipitante e incubado em 60 μί de precipitante.
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115/157 [00711] FabO-7236:FIXa [00712] Os cristais de FabO-7236 (fragmento Fab correspondente ao mAb1-1307) misturados em uma razão molar de 1:1 com a proteína FIXa foram cultivados usando a técnica de difusão por vapor de gota depositada em 18Ό. Uma solução de proteína de 0,1 pl 6,4 mg/ml em 20 mM de Tris-HCI, pH 7,4, 50 mM NaCI e 2,5 mM CaCh foi misturado com um volume igual de 0,2 M de sulfato de lítio, 40% (v/v) de PEG400, e 0,1 M de Tris pH 8,5 como precipitante e incubado sobre 1 ml de precipitante.
Coleta de dados de difracão [00713] Fab0-7237:FIXa [00714] O cristal foi crioprotegido em uma solução consistindo em 3 M de formiato de sódio, 4% de glicerol, 4% de etilenoglicol, 4,5% de sacarose e 1% de glicose antes do resfriamento instantâneo em nitrogênio líquido. Os dados de difração foram coletados a 100K na linha de luz Swiss Light Source X06DA (comprimento de onda de 1,0000 Á) usando um detector de pixel Pilatus2M da Dectris. A autoindexação, integração e dimensionamento dos dados foram realizados com programas a partir da pacote XDS (as estatísticas de dados de difração estão resumidas na Tabela 1).
[00715] Fab0-7238:FIXa [00716] O cristal foi crioprotegido em uma solução consistindo em 75 mM de cacodilato de sódio, pH 6,5 e 0,75 M de citrato trissódico, 4% de glicerol, 4% de etilenoglicol, 4,5% de sacarose e 1% de glicose antes do resfriamento instantâneo em nitrogênio líquido. Os dados de difração foram coletados a 100K na linha de luz Swiss Light Source X06DA (comprimento de onda de 1,0000 Á) usando um detector de pixel Pilatus2M da Dectris. A autoindexação, integração e dimensionamento dos dados foram realizados com programas a partir da pacote XDS (as estatísticas de dados de difração estão resumidas na Tabela 1).
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116/157 [00717] FabO-7236:FIXa [00718] Três cristais foram crioprotegidos em uma solução consistindo em 0,15 M de sulfato de lítio, 30% (v/v) de PEG400, e 0,075 M de Tris pH 8,5, 4% de glicerol, 4% de etilenoglicol, 4,5% de sacarose e 1 % de glicose antes do resfriamento instantâneo em nitrogênio líquido. Os dados de difração foram coletados a 100K na linha de luz Swiss Light Source X06DA (comprimento de onda de 1,0000 Á) usando um detector de pixel Pilatus2M da Dectris. A autoindexação, integração, fusão e dimensionamento dos dados foram realizados com programas a partir da pacote XDS (as estatísticas de dados de difração estão resumidas na Tabela 1).
Determinação e refinamento da estrutura [00719] Fab0-7237:FIXa [00720] A estrutura foi determinada por substituição molecular usando Phaser conforme implementado no conjunto de programa Phenix com as cadeias H e L da entrada do banco de dados de proteína 4NP4 e cadeias H e L da entrada do banco de dados de proteína 3KCG. A unidade assimétrica contém dois complexos Fab:FIXa. O modelo foi refinado usando as etapas de refinamento Phenix e reconstrução manual em COOT. As estatísticas de refinamento são encontradas na Tabela 1.
[00721] Fab0-7238:FIXa [00722] A estrutura foi determinada por substituição molecular usando Phaser conforme implementado no conjunto de programa Phenix com as cadeias H e L da entrada do banco de dados de proteína 4PUB e cadeias H e L da entrada do banco de dados de proteína 3KCG. A unidade assimétrica contém dois complexos Fab:FIXa. O modelo foi refinado usando as etapas de refinamento Phenix e reconstrução manual em COOT. As estatísticas de refinamento são encontradas na Tabela 1.
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117/157 [00723] FabO-7236:FIXa [00724] A estrutura foi determinada por substituição molecular usando Phaser conforme implementado no conjunto de programa Phenix com a parte Fab da estrutura complexa do complexo de FabO7238:FIXa descrito acima e cadeias H e L a partir da entrada do banco de dados de proteína 3KCG. A unidade assimétrica contém um complexo Fab:FIXa. O modelo foi refinado usando as etapas de refinamento Phenix e reconstrução manual em COOT. As estatísticas de refinamento são encontradas na Tabela 1.
Tabela 1 - Coleta de Dados e Estatísticas de Refinamento
FabO-7237 em complexo com Gla-sem domínio FIXa (WT) EGRCK inibido FabO-7238 em complexo com Gla-sem domínio FIXa (WT) EGRCK inibido FabO-7236 em complexo com Gla-sem domínio FIXa (WT) EGRCK inibido
Comprimento de onda (Á) 1,0000 1,0000 1,0000
Faixa de resolução (Á) 48,36 - 2,45 (2,538 - 2,45) 45,71 - 2,05 (2,123 -2,05) 43,64 - 2,0 (2,071 -2,0)
Grupo espacial P6i C2 I222
Célula unitária (À, 243,41 243,41 72,29 90 90 120 369,38 94,42 60,93 90 98,868 90 87,18 96,86 201,38 90 90 90
Reflexões totais 927423 (88310) 443072 (43104) 1167939 (113684)
Número de cristais 1 1 3
Reflexões únicas 90260 (8982) 128149 (12523) 57871 (5716)
Multiplicidade 10,3 (9,8) 3,5 (3,4) 20,2 (19,9)
Completude (%) 99,96 (99,94) 98,73 (97,31) 99,89 (99,79)
Média l/sigma(l) 9,98 (1,10) 13,50 (1,12) 9,06 (1,26)
Fator B de Wilson 39,05 30,10
R-merge 0,2704 (2,638) 0,08249 (1,269) 0,3714 (3,07)
R-meas 0,2847 (2,784) 0,09768(1,503) 0,381 (3,151)
R-pim 0,08848 (0,8856) 0,05184 (0,7982) 0,08447 (0,7044)
CC1/2 0,991 (0,348) 0,998 (0,571) 0,995 (0,595)
CC* 0,998 (0,718) 1 (0,853) 0,999 (0,864)
Reflexões usadas no refinamento 90261 (8984) 128040 (12521) 57825 (5715)
Reflexões usadas para Rfree 1928 (199) 1611 (157) 1461 (143)
R-work 0,2013 (0,3016) 0,2242 (0,4200) 0,1971 (0,3096)
R-free 0,2411 (0,3533) 0,2607 (0,4969) 0,2454 (0,3350)
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FabO-7237 em complexo com Gla-sem domínio FIXa (WT) EGRCK inibido FabO-7238 em complexo com Gla-sem domínio FIXa (WT) EGRCK inibido FabO-7236 em complexo com Gla-sem domínio FIXa (WT) EGRCK inibido
CC(work) 0,904 (0,507) 0,949 (0,654) 0,964 (0,755)
CC(free) 0,884 (0,269) 0,954 (0,435) 0,938 (0,663)
Número de átomos não hidrogênio 11731 11849 6132
macromolécula s 11219 11196 5579
ligantes 52 2 61
solvente 460 651 492
Resíduos de proteína 1465 1456 720
RMS(ligações) 0,015 0,008 0,008
RMS(ângulos) 1,22 1,15 1,13
Valores favorecidos de Ramachandran (%) 90,91 95,28 96,20
Valores permitidos de Ramachandran (%) 7,70 4,65 3,38
Valores atípicos de Ramachandran (%) 1,39 0,07 0,42
Valores atípicos de rotâmeros (%) 6,46 0,40 0,81
Clashscore 8,48 6,71 5,39
Fator B médio 46,41 49,46 38,01
macromolécula s 46,59 49,64 37,38
ligantes 56,40 79,63 69,03
solvente 41,00 46,15 41,27
Número de grupos TLS 40
Refinamento duplo h,-h-k,-l
00725] Estatísticas para a cobertura de resolução mais alta são mostradas entre parênteses.
Determinação de Epitopes [00726] Com base no mAbO-1998 acima, constatou-se que mAb11307 e mAbO-1886 se ligam a diferentes epitopes em FIXa onde o epitope é definido como resíduos tendo pelo menos um átomo pesado
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119/157 dentro de uma distância de < 3,5 Á de um átomo pesado no anticorpo. [00727] O epítopo mAbO-1998 está localizado na alça 170 e compreende os seguintes resíduos no domínio de protease: L337, R338, S339, T340, K341 e T343.
[00728] O epítopo mAb1-1307 compreende os seguintes resíduos: H256, H257, N258, K293, R403, Y404, N406, W407, E410 e K411.
[00729] O epítopo mAbO-1886 está localizado na hélice 170 e compreende os seguintes resíduos no domínio de protease: K301, D332, R333, A334, T335, R338 e N346.
[00730] Descobriu-se que os epitopos de mAbO-1998 e mAbO-1886 eram sobrepostos, o que corresponde bem à observação de que os dois anticorpos competem pela ligação ao FIX/FIXa (Exemplo 4).
Variantes de anticorpos parentais (linhagens) conforme descrito neste documento compartilham compartimentos e resíduos de epítopo (hotspot) com anticorpos parentais [00731 ] Uma vez que as variantes do anticorpo para o qual os dados são fornecidos no Exemplo 4 acima e em certos exemplos abaixo não contêm substituições de aminoácidos nas posições mostradas como sendo cruciais para o reconhecimento do epítopo com base nas estruturas de cristal dos complexos de anticorpo parental-FIXa fornecidos no presente exemplo, um versado na técnica entendería que as variantes, como um ponto de partida, pertenceríam ao mesmo compartimento, competiríam pelo compartimento e reconheceríam pelo menos os mesmos resíduos de hot-spot no epítopo de FIX/FIXa que o anticorpo do qual elas se originaram, isto é, mAbO-1998, mAbO-1886, ou mAb1-1307.
Exemplo 6: Atividade de Anticorpos anti-FIX/FIXa Bivalentes em um Ensaio de Geração de FXa [00732] O efeito estimulador na atividade enzimática de FIXa em relação a FX de anticorpos anti-FIX/FIXa bivalentes foi determinado a
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120/157 partir de sua capacidade em promover a ativação de FX pelo FIXa na presença de uma membrana fosfolipídica pró-coagulante de acordo com os princípios descritos por Scheiflinger et al. (2008) J Thromb Haemost, 6:315-322. Dada a alta atividade do anticorpo anti-FIXa 224F3 entre os anticorpos identificados por Scheiflinger et al. 224F3 foi escolhido como referência nos seguintes experimentos (cf. Exemplo 1 para informações sobre a construção de 224F3).
[00733] O efeito estimulante de anticorpos anti-FIXa sobre a ativação mediada por FIXa do FX em FXa foi medido em um ensaio bioquímico de alto rendimento automatizado em placas de 384 poços. Em resumo, o FIXa foi misturado com anticorpo purificado em uma resposta à dose de 5 vezes em quatro pontos. A mistura de FX/fosfolipídio (PL) foi adicionada e a geração de FXa foi medida pela adição de substrato de FXa (Pefaflour) e a taxa de hidrólise do substrato foi determinada pela detecção de fluorescência por cinco minutos em um leitor de multidetecção (PheraSTAR). A atividade estimuladora de FIXa relativa foi calculada como a taxa de geração de FXa a partir do complexo de FIXa-anticorpo versus FIXa sozinho.
[00734] Cada anticorpo foi testado em uma faixa de concentração de 0-200 nM por pré-incubação com 3 nM de FIXa derivado de plasma humano (Haematologic Technologies Inc, EUA) e 10 μΜ 25:75 de vesículas fosfolipídicas de fosfatidilserina:fosfatidilcolina (Haematologic Technologies Inc, EUA) em tampão de ensaio (50 mM HEPES, 100 mM NaCI, 5 mM CaCL, 0,1% (p/v) PEG8000, pH 7,3 + 1 mg/ml BSA) por 10 min antes da adição de FX derivado de plasma humano (Haematologic Technologies Inc, EUA) a uma concentração de 150 nM. Após 10 min de ativação em temperatura ambiente, a reação (50 μΙ) foi suprimida pela adição de 25 μΙ de tampão de resfriamento (50 mM HEPES, 100 mM NaCI, 60 mM EDTA, 0,1% PEG8000, pH 7,3 + 1 mg/ml BSA). A quantidade de FXa gerada foi então determinada pela adição de 25 μΙ
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121/157 de 2 mM de substrato cromogênico S-2765 (Chromogenix, Suécia) e medição de conversão do substrato cromogênico pela medição da absorbância em 405 nm (AOD/min) em um leitor de microplaca. A taxa de geração de FXa em cada concentração de anticorpo foi determinada a partir de uma curva padrão feita com as quantidades conhecidas de FXa derivado de plasma humano (Haematologic Technologies Inc, EUA).
[00735] A Tabela 2 lista as taxas de geração de FXa medidas para cada anticorpo nas concentrações testadas. Desta forma, as atividades estimuladoras de pico foram calculadas para cada anticorpo como a taxa de geração de FXa máxima observada em relação a de 224F3. Estes dados estão apresentados na Tabela 3, que mostra que os anticorpos pertencentes a cada uma das três famílias (0-1886, 0-1998 e 1-1307, respectivamente) têm atividades que são 10-67 vezes maiores que aquelas observadas para 224F3 (Scheiflinger etal.). Tabela 2 - Taxas de Geração de FXa [00736] Taxas de Geração de FXa em pM/min (média ± SD, n = 2) para os Anticorpos anti-FIX/FIXa Listados. Cada anticorpo foi testado em uma faixa de concentração de 0-200 nM conforme indicado na primeira coluna.
Concentração de mAb (nM) 1-4857 14861 14707 14763 14071 1-4624 224F3
200 1300 ± 136 411 ± 39 586 ± 23 401 ± 25 208 ± 1 960 ± 10 5,5 ± 0,2
100 1262 ± 1 364 ± 18 581 ± 13 375 ± 1 198 ± 4 1001 ± 28 7,2 ± 0,5
50 1192 ± 37 352 ± 4 629 ± 8 369 ± 2 173 ± 2 989 ± 21 9,0 ± 0,2
25 1004 ± 42 382 ± 14 685 ± 20 373 ± 1 131 ± 4 851 ± 72 9,0 ± 3,6
12,5 685 ± 18 385 ± 7 697 ± 14 381 ± 10 97 ± 3 752 ± 1 14,7 ± 0,3
6,3 491 ±6 415 ± 12 714 ± 34 390 ± 17 65 ± 4 550 ±5 17,4 ± 0,1
3,2 302 ±3 434 ± 15 662 ± 37 370 ± 15 43 ± 3 383 ±3 20,0 ± 0,4
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Tabela 3 - Atividades Estimuladoras de Pico [00737] Atividades estimuladoras de pico (média ± SD, n = 2) de anticorpos anti-FIX/FIXa em relação a 224F3 (Scheiflinger et al.) no ensaio de geração de FXa.
mAb ID Família de anticorpos Atividade estimuladora de pico em relação a 224F3
1-4857 0-1998 66,5 ±6,1
1-4861 0-1998 21,7 ±1,2
1-4707 1-1307 35,9 ±2,1
1-4763 1-1307 20,0 ±1,7
1-4071 0-1886 10,4 ±0,2
1-4624 0-1886 50,1 ±2,4
224F3 1,0
Exemplo 7: Preparação de Anticorpos Monovalentes (de Um Braço) [00738] Para evitar quaisquer potenciais efeitos de avidez associados a anticorpos convencionais monoespecíficos e bivalentes, por exemplo, em ensaios de geração de FXa (Exemplo 8) e em certos experimentos de SPR (exemplos 14 e 15), foi usado um formato de anticorpo de um braço (OA) monovalente, conforme descrito por Martens et al: A Novel One-Armed Anti-c-Met Antibody Inhibits Glioblastoma Growth In vivo. Clin. Cancer Res. 12, 6144-6152 (2006), onde uma cadeia pesada completa, uma cadeia pesada truncada (sem a região Fab) e uma cadeia leve são co-expressas. Em vez da coexpressão das três cadeias descritas por Martens et al., os anticorpos monovalentes, na presente invenção, foram preparados usando o princípio Duobody® conforme descrito para anticorpos biespecíficos (Exemplo 10). Assim, os anticorpos monovalentes foram preparados pela mistura de um anticorpo monoespecífico e bivalente completos e um dímero de cadeia pesada truncada (derivado formalmente de um anticorpo completo, removendo-se a região Fab) e permitindo a troca de cadeias para prosseguir sob as mesmas condições experimentais conforme descrito no Exemplo 10. A formação do anticorpo
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123/157 monovalente requer que o anticorpo e o dímero de cadeia pesada truncada portem mutações complementares adequadas para promover a heterodimerização, isto é, F405L/K409R para lgG1 e F405L+R409K/WT para lgG4, conforme descrito no Exemplo 10. [00739] No caso de anticorpos monovalentes do subtipo lgG1, o truncamento da cadeia pesada pode ser do terminal N para uma posição entre Cys 220 e a dobradiça superior Cys 226 (numeração EU). Um exemplo específico de uma cadeia pesada de IgG 1 truncada é aquele onde os resíduos 1-220 são truncados.
[00740] No caso de anticorpos monovalentes do subtipo lgG4, o truncamento da cadeia pesada pode ser do terminal N para uma posição entre Cys 200 e a dobradiça superior Cys 226 (numeração EU). Um exemplo específico de uma cadeia pesada de lgG4 truncada é aquele onde os resíduos 1-214 são truncados.
Exemplo 8: Atividade de Anticorpos anti-FIX/FIXa Monovalentes em um Ensaio de Geração de FXa [00741] Para evitar quaisquer potenciais efeitos de avidez decorrentes como consequência da bivalência do formato de anticorpo convencional, a atividade estimuladora de anticorpos anti-FIX/FIXa sobre a atividade enzimática de FIXa em relação a FX foi determinada após a reformatação em um formato de anticorpo de um braço (OA) monovalente (vide o Exemplo 8). Os anticorpos testados estão listados na Tabela 4 abaixo. A versão OA monovalente do anticorpo anti-FIXa 224F3 (denotado mAb1-1582), também referido no Exemplo 7, foi incluída para comparação.
[00742] A atividade estimuladora de anticorpos OA foi medida em tampão de ensaio (50 mM HEPES, 100 mM NaCI, 5 mM CaCL, 0,1% (p/v) PEG8000, pH 7,3 + 1 mg/ml BSA) em concentrações fixadas de vesículas fosfolipídicas de fosfatidilserina (PS):fosfatidilcolina (PC) (concentração final de 500 μΜ; Haematologic Technologies Inc, EUA) e
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FIXa derivado de plasma (concentrações finais de 0,17, 0,5 ou 1 nM; Haematologic Technologies Inc, EUA). A concentração de FIXa foi escolhida para garantir que menos de 15% do FX substrato fosse convertido em FXa. Após a pré-incubação na presença do anticorpo OA monovalente (concentrações finais listadas na Tabela 1), 150 nM de FX derivado de plasma foram adicionados para gerar um volume de reação final de 50 μΙ, e a ativação foi deixada proceder por 20 min em temperatura ambiente. A reação foi então suprimida pela adição de 25 μΙ de tampão de resfriamento (50 mM HEPES, 100 mM NaCI, 60 mM EDTA, 0,1% PEG8000, pH 7,3 + 1 mg/ml BSA) e a quantidade de FXa gerado foi determinada pela adição adicional de 25 μΙ de 2 mM de substrato cromogênico S-2765 (Chromogenix, Suécia) e medição da conversão do substrato cromogênico pela medição da absorbância em 405 nm (AOD/min) em um leitor de microplaca. A atividade medida foi corrigida para atividade basal pela subtração do sinal medido no mesmo ensaio, mas com FIXa e anticorpo substituído por tampão de ensaio e, em seguida, normalizada de acordo com a concentração de FIXa presente no ensaio ([FIXa]totai). Dividindo este número pela taxa de geração de FXa similarmente normalizada na ausência de anticorpo (AFixa.norm), um índice de estimulação de anticorpo foi calculado, fornecendo a estimulação, em vezes, da atividade de FIXa pelo anticorpo na concentração usada. Devido à taxa lenta de geração de FXa por FIXa livre, as reações de ativação na ausência de anticorpo foram realizadas conforme descrito acima, mas com 5, 10 ou 20 nM de FIXa presentes. As atividades medidas foram então subtraídas e normalizadas em segundo plano de acordo com a concentração de FIXa no ensaio. Para o cálculo do índice de estimulação, foi usada a média das três atividades normalizadas de FIXa livre.
Determinação do índice de Estimulação [00743] Em resumo, o cálculo do índice de estimulação pode ser
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125/157 descrito como se segue [00744] índice de estimulação = ((Afixh+oa - Abckg) / [FIXa]totai) / ApiXa.norm [00745] onde Afixh+oa é a atividade medida na presença do anticorpo OA, Abckg é a atividade basal medida na ausência de FIXa e do anticorpo monovalente, [FIXa]totai é a concentração de FIXa no ensaio, e AFixa,norm é a atividade normalizada média de FIXa livre.
Determinação da Saturação de FIXa [00746] A fração de FIXa saturado com anticorpo OA no ensaio é determinada pelas concentrações de FIXa e do anticorpo OA, e a constante de dissociação de equilíbrio (Ká) que comanda sua interação. A última pode ser medida por técnicas conhecidas na técnica, tais como calorimetria de titulação isotérmica (ITC).
[00747] Uma vez que o índice de estimulação aumentará conforme a concentração de anticorpo OA for aumentada até que a saturação de FIXa seja atingida, a concentração do anticorpo OA no ensaio deve ser escolhida para garantir pelo menos 80% de saturação de FIXa no ensaio para fornecer uma estimativa adequada do índice de estimulação em saturação total de FIXa.
[00748] A fração de FIXa ligada ao anticorpo OA em equilíbrio (ÍFixa+oA), pode ser calculada a partir das concentrações totais de FIXa ([FIXa]totai) e OA ([OA]totai) no ensaio e a constante de dissociação de equilíbrio (Ká) para sua interação usando a equação de ligação quadrática conforme descrito por Krishnaswamy et al. (1992) J. Biol. Chem., 267:23696-23706 e detalhado na Eq. 1 e 2 abaixo, em que [00749] [FIXa + OA]assay representa a concentração calculada do complexo de FIXa-anticorpo OA em equilíbrio no ensaio [00750] ÍFixa+oA representa a fração calculada (em porcentagem) de FIXa, que está ligada a anticorpo OA em equilíbrio no ensaio [00751] Eq. 1:
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[FIXa + OA]assay
([F/Xa]totnf + [OA]totai + Kd) — y/([FIXa]total + [O4]totnf + Kd)2 - 4 x [FIXa]total x [O4]totnf
[00752] 2 Eq. 2: f _ -1 ΛΛ0/ [FIXa + OA]assay fFIXa+OA - Ιθθ /o X |rjyn| [FIXa]totai
[00753] O índice de estimulação para cada anticorpo OA
monovalente é fornecido na Tabela 4. Para todos os anticorpos testados, constatou-se que o índice de estimulação medido foi maior do que aquele medido para o anticorpo de um braço monovalente 224F3 (mAb1-1582).
[00754] Com uma concentração de um anticorpo de um braço 224F3
de 3260 nM no ensaio e um Kd para a interação com FIXa de 0,477 nM conforme relatado por Kerschbaumer et al. (US7297336-B2), mais de
95% de FIXa estava ligado ao anticorpo de um braço 224F3 no ensaio. Tabela 4 - Estimulação da Atividade de FIXa por Anticorpos anti-FIXa de Um Braço (OA) Monovalentes [00755] O mAb anti-FIX ID refere-se à ID do anticorpo usada para a reformatação no formato do OA. As colunas rotuladas concentração de anticorpo OA (nM) e índice de estimulação listam a concentração do anticorpo OA (nM) usada no ensaio e a estimulação correspondente da atividade de FIXa medida em relação ao FIXa livre.
mAb anti-FIX ID Linhagem Concentração de anticorpo OA (nM) índice de estimulação
1-7977 0-1998 800 850
1-8785 0-1998 800 621
1-8782 0-1998 1600 417
1-8780 0-1998 1600 1651
1-8543 0-1998 1600 283
1-8679 0-1998 1600 918
1-9016 0-1998 1600 4319
1-9015 0-1998 1600 1334
1-9002 0-1998 800 567
1-9058 0-1998 1600 531
1-9134 0-1998 1600 320
1-8467 0-1998 1600 1020
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mAb anti-FIX ID Linhagem Concentração de anticorpo OA (nM) índice de estimulação
1-9285 0-1998 800 732
1-8459 0-1998 1600 799
1-5797 0-1886 474 382
1-5796 0-1886 900 239
1-5783 0-1886 264 1036
1-5781 0-1886 564 1219
1-5754 0-1886 1478 615
1-6609 0-1886 800 94
1-6606 0-1886 800 133
1-6592 0-1886 800 916
1-6590 0-1886 800 1287
1-6586 0-1886 800 94
1-6584 0-1886 800 580
1-6582 0-1886 800 692
1-6566 0-1886 204 690
224F3 (1-1582) - 3260 <10
Exemplo 9: Desenvolvimento de plasmídeos de expressão de Fab e mAb anti FX/FXa [00756] Anticorpos anti-FX/FXa, conforme descritos neste documento, foram desenvolvidos usando métodos de desenvolvimento de anticorpos padrão e plasmídeos de expressão foram preparados conforme descrito no Exemplo 1 para os plasmídeos de expressão de Fab e mAb anti-FIX/FIXa. A expressão, purificação e caracterização de anticorpos anti-FX/Xa foram realizadas da mesma forma conforme descrito para os anticorpos anti-FIX/FIXa nos Exemplos 2 e 3.
Exemplo 10: Anticorpos Biespecíficos Preparados por Montagem
In Vitro [00757] Os anticorpos biespecíficos são gerados por montagem in vitro de um primeiro e um segundo anticorpo pelo método Duobody® (Genmab) descrito (Labrijn et al. PNAS 2013, vol. 110, pp. 5145-5150) para anticorpos IgG 1 biespecíficos e usando uma variante ligeiramente modificada para anticorpos lgG4 biespecíficos conforme detalhado conforme se segue.
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128/157 [00758] Para IgG 1, a região constante de cadeia pesada do primeiro anticorpo é IgG 1 K409R (anti-FIX/FIXa) e a região constante de cadeia pesada do segundo anticorpo é IgG 1 F405L (anti-FX/FXa). A IgG 1 pode ser uma variante de lgG1 com funções efetoras reduzidas, conforme referido anteriormente.
[00759] Para lgG4, a região constante de cadeia pesada do primeiro anticorpo é lgG4 S228P (anti-FIX/FIXa) e a região constante de cadeia pesada do segundo anticorpo é lgG4 S228P F405L R409K (anti-FX). Os dois anticorpos parentais são produzidos conforme descrito nos Exemplos 1-3. A reação de troca de braço de Fab é realizada em tampão HEPES (pH 7,4) em condições redutoras usando 75 mM 2mercaptoetilamina (2-MEA) e incubação a 30 O por 3 horas.
Exemplo 11: Atividades Pró-coagulantes de Anticorpos Biespecíficos [00760] Pares de anticorpos anti-FIXa e anti-hFX foram feitos em anticorpos biespecíficos por meio da tecnologia Duobody® conforme descrito acima (Exemplo 10). Os anticorpos biespecíficos foram testados para atividade pró-coagulantes em diversos ensaios, tais como ensaios de geração de FXa descritos acima (Exemplo 6) e em um teste de Geração de Trombina (TGT) conforme descrito no seguinte parágrafo.
Ensaio de geração de trombina (TGT) [00761 ] O TGT foi realizado em uma configuração de 384 poços HTP automatizada usando acionamento por caulim (Haemonetics Corporation, #6300). Resumidamente, os anticorpos foram adicionados em uma concentração de 111 nM (exceto pelo mAb1-1371 que foi adicionado a 55 nM e mAb1-0021 que foi adicionado a 166 nM) para plasma de hemofilia A (HA) (George King). Em seguida, caulim misturado com fosfolipídios (Rossix, #PL604T) foi adicionado, seguido pela adição de substrato de Fila (FluCa, Thrombinoscope, #TS50.00).
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A fluorescência foi medida em um leitor de placas de multidetecção Perkin Elmer EnVision em intervalos de 1 minuto por 2 horas. A altura do pico foi calculada como o valor máximo observado no trombograma e, em seguida, normalizada para a altura de pico observada para um anticorpo anti-FIXa e anti-FX. A referência sempre incluía um domínio de ligação a partir do anticorpo anti-FX mAb1-2375 (identificado pela SEQ ID NO:93 e 94), em combinação com os domínios de FIX a partir de cada uma das três famílias, representadas por mAb1-4707, mAb15788 e mAb1-4857. Os anticorpos foram agrupados de acordo com sua atividade de TGT relativa como baixa (0-24%), + (24-50%), ++ (50-75%) e +++ (>75%), onde + é preferencial, ++ é mais preferencial +++ é ainda mais preferencial.
Seleção de combinações preferenciais de anticorpos antiFIXa/anti-FX biespecíficos [00762] Um grande número de anticorpos anti-FX foi testado como anticorpos biespecíficos em combinação com variantes de anticorpo anti-FIXa pertencentes a três linhagens mAb1-1307, mAbO-1886 e mAbO-1998. As combinações selecionadas de pares de anti-FIXa/antiFX mostrando atividade significativa no ensaio de TGT são mostradas na Tabela 5.
Tabela 5 - Atividade Pró-Coaqulante de Anticorpos Biespecíficos [00763] Pares selecionados de anticorpos biespecíficos antiFIXa/anti-FX são listados juntamente com sua atividade no ensaio de TGT (conforme descrito acima). Os anticorpos biespecíficos (Duobody) foram do subtipo lgG4, exceto pelo mAb1-0021, mAb1-1335 e mAb10985, que foram lgG1.
mAb de FX Família de mAb de FIXa Atividade mAb de FIXa
1-6705 1-1307 +++ 1-4707
1-6716 1-1307 + 1-4707
1-6721 1-1307 + 1-4707
1-6723 1-1307 + 1-4707
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mAb de FX Família de mAb de FIXa Atividade mAb de FIXa
1-6731 1-1307 baixa 1-4707
1-6737 1-1307 + 1-4707
1-1371 1-1307 +++ 1-4707
1-6705 0-1886 ++ 1-5788
1-6716 0-1886 ++ 1-5788
1-6723 0-1886 + 1-5788
1-6731 0-1886 ++ 1-5788
1-6737 0-1886 ++ 1-5788
1-7378 0-1886 ++ 1-5788
1-7413 0-1886 ++ 1-5788
1-7441 0-1886 +++ 1-5788
1-7447 0-1886 +++ 1-5788
1-7449 0-1886 ++ 1-5788
1-7462 0-1886 ++ 1-5788
1-7466 0-1886 + 1-5788
1-7481 0-1886 +++ 1-5788
1-1371 0-1886 +++ 1-4071
1-0021 0-1886 baixa 1-1335
1-6705 0-1998 ++ 1-4857
1-6716 0-1998 +++ 1-4857
1-6723 0-1998 +++ 1-4857
1-6730 0-1998 +++ 1-4857
1-6731 0-1998 +++ 1-4857
1-6737 0-1998 +++ 1-4857
1-6754 0-1998 +++ 1-4857
1-7378 0-1998 +++ 1-4857
1-7388 0-1998 + 1-4857
1-7413 0-1998 ++ 1-4857
1-7424 0-1998 ++ 1-4857
1-7441 0-1998 +++ 1-4857
1-7447 0-1998 +++ 1-4857
1-7449 0-1998 ++ 1-4857
1-7462 0-1998 ++ 1-4857
1-7466 0-1998 ++ 1-4857
1-7481 0-1998 +++ 1-4857
1-7483 0-1998 ++ 1-4857
1-7563 0-1998 ++ 1-4857
1-7571 0-1998 ++ 1-4857
1-7591 0-1998 ++ 1-4857
1-1371 0-1998 +++ 1-4857
1-0021 0-1998 baixa 1-0985
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131/157 [00764] Conforme evidente a partir da Tabela 5, o nível de atividade exibido pelo anticorpo biespecífico é depende da combinação antiFIXa/anti-FX específica. Por exemplo, o anticorpo anti-FX mAb1-6723 em combinação com o anticorpo anti-FIXa mAbO-1998 exibe forte atividade (+++), enquanto que a atividade de mAb1-6723 é mais baixa em combinação com mAbO-1886 (+) e com mAb1-1307 (+).
Exemplo 12: Seleção de Anticorpos anti-FX [00765] Certos anticorpos anti-FX que mostram atividade de TGT significativa em um formato de anticorpo biespecífico em combinação com um anticorpo anti-hFIXa (Exemplo 11) foram selecionados um contra o outro usando o Octet fortebio systems usando a mesma configuração conforme descrito para os anticorpos anti-FIXa (Exemplo 4), exceto para a substituição do FIXa pelo FX.
[00766] A análise identificou cinco compartimentos diferentes, Compartimento A-E, definidos pelos anticorpos mAb1-1371, mAb11376, mAb1-6723, mAb1-7447 e mAb1-7449, respectivamente. Dois compartimentos, Compartimento A e Compartimento E, são, cada um, representados apenas por um único anticorpo anti-FX (vide a Tabela 6). [00767] Um grande número de clones foi identificado no Compartimento C como competindo com mAb1-6723.
Tabela 6 - Seleção de Anticorpos anti-FX [00768] Uma seleção de anticorpos anti-FX foi selecionada uma contra a outra, e cinco compartimentos diferentes (Compartimento A-E) foram identificados. Os números se referem à ID de anticorpo, por exemplo, 1-6723 denota mAb1-6723.
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Compartim ento A (1-1371) Compartim ento B (1-1376) Compartim ento C (1-6723) Compartim ento D (1-7447) Compartim ento E (1-7449)
1-6705
1-7388 1-7388
1-7563 1-7563
1-6716
1-6721
1-6730
1-6731
1-6737
1-6754
1-7378
1-7413
1-7424
1-7466
1-7481
1-7483
1-7591
1-7462 1-7462
1-7571 1-7571
1-7441
Exemplo 13: Cristalização e Mapeamento de Epítopo de Anticorpo anti-FX Usando Cristalografia de Raios X
Cristalização [00769] Tentativas de cristalizar FabO-8954 (fragmento Fab correspondente ao mAb1-6723) em complexo com FX não foram bem sucedidas, enquanto que cristais de boa qualidade com sítio ativo inibiram FXa foram obtidos. Assim, cristais de FabO-8954 misturados em uma razão molar de 1:1 com sítio ativo inibiram des-gla FXa (EGR humano inibiu expressão bacteriana de Fator Xa gla-sem domínio (tipo selvagem), Lote# hGDFXAEGR-022 , Cambridge ProteinWorks) e foram cultivados usando a técnica de difusão por vapor de gota depositada a 18 Ό. Uma solução de proteína de 150 nl 6,7 mg/ml do complexo em 20mM Tris-HCI, pH 7,4, 50mM NaCI, e 2,5mM CaCh foi misturada com 50 nl de 0,2 M acetato de magnésio, 0,1 M de cacodilato
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133/157 de sódio, pH 6,5, 20 % (p/v) PEG 8000 como precipitante e incubada sobre 60 μΙ de precipitante.
Coleta de dados de difracão [00770] O cristal foi crioprotegido por adição de 1 μΙ de precipitante adicionado 20% de etilenoglicol à gota de cristalização antes do resfriamento instantâneo em nitrogênio líquido. Os dados de difração foram coletados a 100K na linha de luz Swiss Light Source X06DA (comprimento de onda de 1,0000 Á) usando um detector de pixel Pilatus2M da Dectris. A autoindexação, integração e dimensionamento dos dados foram realizados com programas a partir da pacote XDS (as estatísticas de dados de difração estão resumidas na Tabela 7). Determinação e refinamento da estrutura [00771] A unidade assimétrica contém quatro complexos de Fab:FXa conforme julgado a partir da análise de coeficiente de Matthews. A estrutura foi determinada por reposição molecular. O Phaser, conforme implementado no conjunto de programas Phenix, foi usado com as cadeias H e L da entrada do banco de dados de proteína 511K como modelo de busca, localizando quatro Fabs. Esses foram modelos construídos com a sequência de aminoácidos correta usando COOT e, depois, refinados usando refinamento Phenix. O modelode Fab refinado foi fixado ao aplicar a reposição molecular em Molrep a partir do conjunto CCP4 com cadeias A e B a partir da entrada do banco de dados de proteína 1G2L como modelo de busca. Quatro fragmentos de FXa foram encontrados. O modelo foi refinado usando as etapas de refinamento Phenix e reconstrução manual em COOT. As estatísticas de refinamento são encontradas na Tabela 7.
Tabela 7 - Coleta de Dados e Estatísticas de Refinamento
Comprimento de onda (À) 1,0000
Faixa de resolução (À) 78,09 - 2,873 (2,976 - 2,873)
Grupo espacial P2i
Célula unitária (À, graus) 123,391,9 156,290 90,590
Reflexões totais 269989 (27782)
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Reflexões únicas 78735 (7779)
Multiplicidade 3,4 (3,6)
Completude 98,44 (98,49)
Média l/siqma(l) 9,66 (1,23)
Fator B de Wilson (À2) 58,38
R-merge 0,1398 (1,152)
R-meas 0,166 (1,355)
R-pim 0,0885 (0,7084)
CC1/2 0,994 (0,519)
CC* 0,999 (0,826)
Reflexões usadas no refinamento 78688 (7778)
Reflexões usadas para R-free 2000 (201)
R-work 0,2093 (0,3449)
R-free 0,2780 (0,4405)
CC(work) 0,929 (0,712)
CC(free) 0,911 (0,270)
Número de átomos não hidrogênio 22125
macromoléculas 22021
ligantes 104
Resíduos de proteína 2868
RMS(ligações) (À) 0,012
RMS(ângulos) (graus) 1,64
Valores favorecidos de Ramachandran (%) 95,04
Valores permitidos de Ramachandran (%) 4,11
Valores atípicos de Ramachandran (%) 0,85
Valores atípicos de rotâmeros (%) 0,16
Clashscore 12,20
Fator B médio (À2) 60,54
macromoléculas 60,55
ligantes 59,50
[00772] Estatísticas para a cobertura de resolução mais alta são mostradas entre parênteses.
Determinação de Epitopo [00773] A estrutura de cristal do complexo de FabO-8954:FXa tem quatro cópias do complexo na unidade assimétrica e estas foram analisadas separadamente para identificar o epitopo e o parátopo usando uma distância de corte de 3,5 Á.
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135/157 [00774] Os resíduos estão incluídos no epítopo para mAb1-6723 se satisfizer os critérios de distância de 3,5 Á em pelo menos uma das quatro cópias do complexo de FabO-8954:FXa na célula unitária. Os resíduos de epítopo e parátopo para mAb1-6723 estão listados na tabela 8.
Tabela 8 - Epítopo e Parátopo para mAb1-6723 [00775] Resíduos de epítopo para mAb1-6723 no domínio EGF-2 e no domínio de protease de FX/FXa (SEQ ID NO:2) estão listados na primeira e na segunda colunas, respectivamente. Resíduos de parátopo na Vh (SEQ ID NO:21) e Vl do anticorpo (SEQ ID NO:22) estão listados nas colunas três e quatro, respectivamente.
Resíduos no domínio EGF-2 Resíduos no domínio de protease Vh Vl
H101, E103, R113, T116, L117, A118e T127 S227, E228, F229, Y230, E266, R287, L303, P304, E305, L419, K420, D423, R424, M426, K427 e T428 S25, G26, Y27, S28, F29, T31, W33, D52, S54, D55, F57, S77, H100, Y101, Y102, H103, S104e E106 S30, S31, S32, Y33, Y50, S54, R55, R57 e R96
Variantes de anticorpos parentais (linhagens) conforme descrito neste documento compartilham compartimentos e resíduos de epítopo (hotspot) com anticorpos parentais.
[00776] Uma vez que as variantes do anticorpo para o qual os dados são fornecidos nos exemplos neste documento não contêm substituições de aminoácidos nas posições mostradas como sendo cruciais para o reconhecimento do epítopo com base nas estruturas de cristal dos complexos de anticorpo parental-FXa fornecidos no presente exemplo, um versado na técnica entendería que as variantes, como um ponto de partida, pertenceríam ao mesmo compartimento, competiríam pelo compartimento e reconheceríam pelo menos os mesmos resíduos
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136/157 de hot-spot no epítopo de FX/FXa que o anticorpo do qual elas se originaram, isto é, mAb1-6723.
Exemplo 14: Identificação de Resíduos de Hot-Spots em FX [00777] De forma similar ao mapeamento de resíduos de epitopo de hot-spot em FIX para mAb1-1307, mAbO-1886 e mAbO-1998, conforme descrito no exemplo 15, os dados fornecidos no presente exemplo determinam os resíduos de epitopo de hot-spot em FX para mAb1 -6723. As variantes de FX usadas eram variantes de alanina de sítio único (exceto pela posição 118, que é alanina no tipo selvagem, onde uma substituição de alanina para serina foi introduzida) de desGla-desEGFI FX, correspondendo aos resíduos 86-448 da SEQ ID NO:2 com um Histag N-terminal (HHHHHH, para purificação por afinidade) ligados através de um peptídeo de ligação de GS curto (GGGGSGGGGS). As variantes que cobrem resíduos de epitopo conforme definido no exemplo 13 estão listadas na tabela 9.
Tabela 9 - Lista de Variantes de desGla-desEGF1-FX Geradas
Posição1) Variante Domínio
101 H101A EGF2
103 E103A EGF2
113 R113A EGF2
116 T116A EGF2
117 L117A EGF2
118 A118S EGF2
127 T127A EGF2
227 S227A PD
228 E228A PD
229 F229A PD
230 Y230A PD
266 E266A PD
287 R287A PD
303 L303A PD
304 P304A PD
305 E305A PD
419 L419A PD
420 K420A PD
423 D423A PD
424 R424A PD
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Posição1) Variante Domínio
426 M426A PD
427 K427A PD
428 T428A PD
00778] De acordo com a SEQ ID NO:2 [00779] EGF2 e PD referem-se a segundos domínios semelhantes ao fator de crescimento epidérmico e de protease, respectivamente [00780] O desGla-desEGF1-FX do tipo selvagem e as variantes listadas na tabela 9 foram expressos no sistema de HEK293 e purificados através de cromatografia de afinidade. Nenhuma expressão ou pouca pureza foi observada para as variantes L117A, L303A, P304A e M426A, e a avaliação da ligação não foi possível para essas quatro variantes.
[00781] A identificação de resíduos de epitope de hot-spot foi feita usando um instrumento Biacore T200 a 25 Ό. O anticorpo Fc anti-hlgG do kit Human Antibody Capture Kit (GE Healthcare, # de catálogo BR100839) a 2 pg/ml foi imobilizado em um chi de sensor Series S Sensor Chip CM5 (GE Healthcare, # de catálogo BR100530) usando química de acoplamento de amina padrão. O anticorpo anti-FX mAb46934 (variante monovalente de mAb1-6723) foi injetado a uma vazão de 5 pL/min por 30 seg e capturado pelo anticorpo Fc anti-hlgG imobilizado. Subsequentemente, 5 pM (com diluições em série de 2 ou 3 vezes) das variantes T116A, A118S, T127A, F229A e E226A, 10 pM (com diluições em série de 5 vezes) da variante Y230A e 10 pM (com diluições em série de 2 ou 3 vezes) WT e variantes H101A, E103A, R113A, S227A, E228A, R287A, E305A, L419A, K420A, D423A, R424A, K427AeT428A foram injetados a uma vazão de 5 pL/min por 90 seg para permitir a ligação ao anticorpo anti-FX capturado seguido por uma injeção de tampão por 90 seg para permitir a dissociação das variantes desGLAdesEGF1-FX. O tampão de corrida (também usado para diluir o anticorpo anti-FX e as variantes desGLA-desEGF1-hFX) continha 10 mM HEPES, 150 mM NaCI, 1 mg/mL BSA e 5 mM CaCI2 (pH 7,4). A
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138/157 regeneração do chip sensor foi obtida usando 1 M de ácido fórmico. Os dados de ligação foram analisados usando ajuste de estado estacionário de acordo com o modelo de 1:1 no Biacore Evaluation Software 2.0 fornecido pela GE Healthcare. Os dados de ligação foram relatados como o % de ligação das variantes de FX ao anticorpo antiFX (mAb1-6723 monovalente) em relação à ligação do FX do tipo selvagem ao anticorpo anti-FX nas variantes de FX de 5 ou 10 μΜ injetadas e foram calculados de acordo com a fórmula:
Ligação (%) = 100% x [(Rmax_FXvar,Ab)/(Rmax_Ab)] / [(Rmax_FXwt,Ab)/(Rmax_Ab)] [00782] onde Rmax_Abrepresenta o nível de captura (RU) do anticorpo anti-FX, e Rmax_FXvar,Ab e Rmax_FXwt,Ab representam a ligação (RU) das variantes de FX e do tipo selvagem na mesma concentração (5 pM para todos, exceto para a variante Y230A, em que a concentração era de 10 pM) para o anticorpo anti-FX, respectivamente. Os resultados são mostrados na tabela 10.
Tabela 10 - Resultados da Análise por SPR [00783] Resultados da análise por SPR da variante monovalente de ligação de mAb1-6723 a variantes de FX selecionadas cobrindo resíduos de epitopo para mAb1-6723.
Variante Ligação (%)
WT 100
H101A 51
E103A 71
R113A 28
T116A 114
A118S 102
T127A 113
S227A 66
E228A 80
F229A 99
Y230A 1
E266A 112
R287A 66
E305A 97
L419A 50
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Variante Ligação (%)
K420A 23
D423A <1
R424A <1
K427A <1
T428A 81
Resíduos de hot-spot para mAb 1-6723 [00784] Os resíduos de hot-spot para mAb1-6723 são definidos como posições onde a substituição do resíduo do tipo selvagem por alanina (ou para substituição da posição 118 de alanina por serina) reduz a ligação do anticorpo em 30% ou menos em relação à ligação do anticorpo ao FX do tipo selvagem em uma concentração de 5 μΜ de desGLA-desEGF1-FX WT (ou variante).
[00785] Resíduos de hot-spot para mAb1-6723 (experimentalmente representados por sua contraparte monovalente, mAb 4-6934):
R113, Y230, K420, D423, R424 e K427
Exemplo 15: Identificação de Resíduos de Hot-Spot em FIX/FIXa [00786] A fim de determinar os resíduos críticos para a interação (referidos como hot-spot) entre os Abs anti-FIX/FIXa, mAbO-1886, mAbO-1998 e mAb1-1307 e FIX, um conjunto de variantes de FIX foi selecionado com base na estrutura de cristal de FIXa no complexo com os fragmentos Fab correspondentes (Fab7237, Fab7238 e Fab7236, respectivamente). Conforme detalhado abaixo, as variantes de FIX selecionadas foram transitoriamente expressas em células de mamíferos, purificadas e caracterizadas em relação a sua ligação a variantes monovalentes de mAbO-1886, mAbO-1998 e mAb1-1307 usando Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR).
Geração de Mutantes de FIX [00787] Um plasmídeo de DNA, adequado para expressão transitória em mamífero, foi construído com um cassete de expressão que codifica os resíduos de aminoácidos 1-461 do FIX humano (uniprot P00740,
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140/157 exceto por uma mutação T194A de acordo com a numeração UNIPROT, correspondente a T148A da SEQ ID NO:1) diretamente seguido por seis Histidinas (6xHis-tag, para purificação por afinidade). A cadeia de proteína FIX madura secretada produzida usando este construto é idêntica à forma alélica A148 do FIX humano (Anson et al. EMBO J. 1984 3:1053-1060, McGraw et al, Proc Natl Acad Sei USA. 1985 82:2847-2851) exceto pela adição do His-tag C-terminal.
[00788] Usando o construto como modelo, as mutações selecionadas foram introduzidas por PCR. Para cada mutação de ponto único listada na Tabela 11, um primer forward contendo a alteração de aminoácido desejada e um primer reverse sem mutações de aminoácidos foram projetados. Esses primers foram usados em uma reação de PCR padrão com o vetor descrito acima como modelo para amplificar toda a sequência do vetor. Clonagem livre de ligação foi usada para unir as extremidades do fragmento de DNA amplificado resultante em um plasmídeo de expressão circular usando sequências de sobreposição introduzidas pelos primers à frente e reverso.
[00789] Os plasmídeos circularizados foram transformados em células de E. coli, cultivados em placas de ágar seletivas para formar colônias e as colônias foram usadas para iniciar culturas líquidas de E. coli. Após o crescimento durante a noite das culturas de E. coli, as preparações de plasmídeo foram realizadas e os mutantes identificados por sequenciamento de DNA.
[00790] A produção de proteína recombinante foi realizada por transfecção de células expi293F que cresciam na cultura em suspensão no meio Expi293 Expression™ (ThermoFisher Scientific, cat# A1435101) usando o kit de transfecção ExpiFectamine™ 293 (ThermoFisher Scientific, cat# A14525) e o DNA plasmidial que codificava cada uma das variantes desejadas, bem como o FIX do tipo selvagem (correspondente à SEQ ID NO:1 com His-tag C-terminal).
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Vitamina K foi adicionada a uma concentração final de 5 mg/mL no momento da transfecção. Potenciadores de transfecção 1 e 2 do kit de transfecção ExpiFectamine™ 293 foram adicionados no dia após a transfecção. As culturas celulares foram coletadas 5 dias após a transfecção por centrifugação.
[00791] O His-tag C-terminal em cada variante de FIX foi usado para purificação de proteína em lotes em uma configuração robótica de múltiplos poços. Resumidamente, os sobrenadantes da cultura celular colhida foram ajustados para condições de ligação, misturados com resina de purificação por afinidade Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare, cat# 17-5318-02, 50 μί de resina sedimentada/ml de meio de cultura celular) e incubados em agitação por 20 minutos. As misturas de resina/sobrenadante foram então transferidas para uma placa de filtro e o líquido foi retirado através da placa de filtro por aplicação de vácuo. A resina restante na placa de filtro foi lavada três vezes antes da eluição em um tampão com alto teor de imidazol.
[00792] A determinação da concentração das soluções de proteína purificada foi realizada por ELISA, usando um anticorpo anti-FIX para detecção e FIX do tipo selvagem recombinante de alta pureza para curvas padrão.
Tabela 11 - Lista de Mutantes de FIX Gerados
Posição1) Mutação Domínio2)
84 L84K EGF2
84 L84M EGF2
84 L84E EGF2
85 D85Q EGF2
85 D85K EGF2
85 D85N EGF2
87 T87E EGF2
87 T87I EGF2
89 N89M EGF2
89 N89Q EGF2
90 I90Y EGF2
90 I90A EGF2
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Posição1) Mutação Domínio2)
101 N101D* EGF2
102 S102A EGF2
102 S102E EGF2
102 S102R EGF2
256 H256F PD
256 H256A PD
257 H257F PD
257 H257A PD
258 N258Q PD
258 N258A PD
263 I263A PD
292 D292N PD
292 D292S PD
293 K293A PD
294 E294A PD
294 E294Q PD
301 K301A PD
330 L330A PD
331 V331A PD
331 V331I PD
332 D332A PD
332 D332S PD
333 R333A PD
334 A334L PD
335 T335A PD
337 L337A PD
338 R338A PD
339 S339L PD
339 S339A* PD
340 T340A PD
341 K341A PD
341 K341E PD
342 F342A PD
343 T343I PD
343 T343A PD
346 N346A PD
346 N346Q PD
354 H354Y PD
354 H354A PD
392 K392E PD
392 K392A PD
392 D292A PD
393 G393I PD
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Posição1) Mutação Domínio2)
395 Y395A PD
400 K400M PD
400 K400A PD
402 S402A PD
403 R403Q PD
403 R403A PD
404 Y404A* PD
404 Y404F PD
405 V405A PD
406 N406Q PD
406 N406A PD
410 E410Q PD
411 K411A PD
[00793] De acordo com a SEQ ID NO:1 [00794] EGF2 e PD referem-se a segundos domínios semelhantes ao fator de crescimento epidérmico e de protease, respectivamente [00795] Variantes marcadas com um asterisco exibiram níveis de expressão muito baixos e não puderam ser avaliadas em estudos de ligação
Estabilidade Térmica das Variantes de FIX [00796] Para testar se a introdução das substituições de aminoácido nas variantes de FIX leva à desestabilização e ao dobramento incorreto, o ponto médio (Tm) da transição de desdobramento térmico foi determinada para as variantes.
[00797] As variantes de FIX purificadas foram introduzidas em capilares padrão (Prometheus NT.48 nanoDSF Grade Standard capillaries, Nanotemper Technologies GmbH, Munique) e inseridas no Prometheus NT.48 (Nanotemper Technologies GmbH, Munique). Uma intensidade de excitação de 70% foi usada e o desdobramento térmico foi seguido de 20-90Ό com um salto de aquecimento de 1,5Ό/ιτιίη. A fluorescência de triptofano foi medida por excitação a 280 nm e registro da emissão a 330 nm e 350 nm. A Tm das variantes de FIX podería ser determinada (exceto onde a concentração de proteína estivesse abaixo de 20 pg/mL, que foi o caso para FIX N101D, H256A, L330A S339A,
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G393I, Y404A e N406Q) a partir da razão de fluorescência medida em 350 nm e 330 nm (F350/F330). Em todos os casos, o programa PR.ThermControl v2.0.4 (NanoTemper Technologies GmbH, Munique) podería ajustar automaticamente a Tm, determinando o máximo da primeira derivada da curva do desdobramento de F350/F330. A Tm para o FIX do tipo selvagem foi encontrado como sendo 51 °C e a Tm para as variantes variou de 47 a 54 °C, demonstrando que nenhuma grande desestabilização foi induzida pelas substituições de aminoácidos. Análise por SPR [00798] As variantes de FIX foram caracterizadas em relação a sua ligação a mAbO-1886, mAbO-1998 e mAb1-1307 usando ressonância plasmônica de superfície (SPR) por captura da variante de FIX através do His-tag C-terminal. Para evitar potenciais efeitos de avidez associados a um anticorpo bivalente convencional, isto é, garantir uma interação de 1:1, as variantes monovalentes mAbO-1886, mAbO-1998 e mAb1-1307, denotadas como mAb4-0673, mAb4-0004 e mAb3-3279, respectivamente (preparadas conforme descrito no Exemplo 7), foram usadas como analitos.
[00799] As análises por SPR foram realizadas nos instrumentos Biacore 4000 ou Biacore T200 (Biacore AB, Uppsala, Suécia). Para os experimentos no instrumento T200, as seguintes condições foram aplicadas: as medições foram realizadas em uma temperatura de 25 Ό. Anticorpo anti-His a 25 pg/ml (R&D Systems, # de catálogo MAB050) foi imobilizado em um chip de sensor CM5 usando química de acoplamento de amina padrão. As variantes de anti-FIX a 25 nM foram injetadas a uma vazão de 10 μΙ/min por 1 min e foram capturadas através de Histag pelo anticorpo anti-His imobilizado. Subsequentemente, 200 nM (com diluições em série de 4 vezes), 1600 nM (com diluições em série de 3 vezes), e 2000 nM (com diluição em série de 3 vezes) de mAb40004, mAb3-3279 e mAb4-0673, respectivamente, foram injetadas a
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145/157 uma vazão de 50 μΙ/min por 5 min para permitir a ligação à variante de FIX capturada seguido por uma injeção de tampão por 10 min, permitindo a dissociação dos anticorpos anti-FIX monovalentes. O tampão de corrida usado foi 20 mM Tris, 150 mM NaCI, 5 mM CaCh, 0,05 % Tween-20, 1 mg/ml BSA, pH 7,4. Isto também foi usado para diluição do anticorpo anti-FIX e amostras de FIX. A regeneração do chip foi obtida usando 10 mM de Glicina pH 2,0. Os dados de ligação foram analisados de acordo com um modelo de 1:1 usando BiaEvaluation 4.1 fornecido pelo fabricante (Biacore AB, Uppsala, Suécia). Uma configuração experimental similar foi usada para o instrumento Biacore 4000.
[00800] Inicialmente, todas as variantes de FIX listadas na tabela 11 foram tríadas usando o instrumento Biacore 4000 para ligação a todos os três anticorpos monovalentes, mAb4-0004, mAb3-3279 e mAb40673. A ligação dos anticorpos às variantes de FIX compreendendo mutações nas posições correspondentes a seus respectivos resíduos de epitopo (definidos por um critério de distância conforme descrito no exemplo 6) foi, conforme esperado, ao alcance da variável perturbada. Nenhum impacto significativo sobre a ligação do anticorpo foi observado para variantes de FIX compreendendo mutações na posição não correspondente a seus respectivos resíduos de epitopo. Em particular, nenhuma das substituições feitas no domínio EGF2 teve qualquer influência sobre a ligação a qualquer um dos anticorpos (dados não mostrados).
[00801] Uma análise de ligação mais detalhada foi realizada para os resíduos definidos como resíduos de epitopo (ver exemplo 6) usando o instrumento Biacore T200. Os resultados são mostrados na tabela 12.
[00802] Os dados de ligação foram relatados como o % de ligação do anticorpo à variante de FIX em relação à ligação do anticorpo ao FIX do tipo selvagem calculada de acordo com a fórmula:
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Ligação (%) — 100% x [(fímax_Ab.FIX_var)/(Flmax_FIXvar)] / [(Rmax_Ab, FIX_wt)/(Rmax_FIXwt)] [00803] onde Rmax_Fixvar e Rmax_Fixwt representam o nível de captura (RU) da variante de FIX e FIX do tipo selvagem, respectivamente, e onde Rmax_Ab,Fix_var e Rmax_Ab,Fix_wt representam a ligação (RU) do anticorpo à variante de FIX capturada e FIX do tipo selvagem, respectivamente. Os resultados são mostrados na tabela 12.
Tabela 12 - Resultados da Análise por SPR [00804] Resultados da análise por SPR da ligação de mAb3-3279, mAb4-0004 e mAb4-0673 (variantes monovalentes de mAb1-1307, mAbO-1998 e mAbO-1886, respectivamente) a variantes de FIX selecionadas cobrindo resíduos de epitopos para mAb1-1307, mAbO1998 e mAbO-1886.
Linhagem Posição Variante Anticorpo Ligação (%)
1-1307 256 H256A mAb3-3279 32
1-1307 257 H257A mAb3-3279
1-1307 258 N258A mAb3-3279 82
1-1307 293 K293A mAb3-3279 23
1-1307 403 R403A mAb3-3279 94
1-1307 404 Y404F mAb3-3279 76
1-1307 406 N406A mAb3-3279 12
1-1307 410 E410Q mAb3-3279 39
1-1307 411 K411A mAb3-3279 71
1-1307 WT WT mAb3-3279 100
0-1998 301 K301A mAb4-0004 66
0-1998 332 D332S mAb4-0004 66
0-1998 332 D332A mAb4-0004 50
0-1998 333 R333A mAb4-0004 66
0-1998 334 A334L mAb4-0004 51
0-1998 335 T335A mAb4-0004 62
0-1998 337 L337A mAb4-0004 52
0-1998 338 R338A mAb4-0004 2
0-1998 339 S339L mAb4-0004 66
0-1998 340 T340A mAb4-0004 37
0-1998 341 K341E mAb4-0004 2
0-1998 341 K341A mAb4-0004 ÍÉMI1ÍIÍIÍIÍIÍIÍIÍI
0-1998 343 T343I mAb4-0004 48
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Linhagem Posição Variante Anticorpo Ligação (%)
0-1998 343 T343A mAb4-0004 38
0-1998 346 N346A mAb4-0004 73
0-1998 WT WT mAb4-0004 100
0-1886 301 K301A mAb4-0673 93
0-1886 332 D332A mAb4-0673 17
0-1886 333 R333A mAb4-0673
0-1886 334 A334L mAb4-0673 44
0-1886 335 T335A mAb4-0673 71
0-1886 337 L337A mAb4-0673 7
0-1886 338 R338A mAb4-0673 lie
0-1886 339 S339L mAb4-0673 73
0-1886 340 T340A mAb4-0673 67
0-1886 341 K341E mAb4-0673 53
0-1886 341 K341A mAb4-0673 96
0-1886 343 T343I mAb4-0673 90
0-1886 343 T343A mAb4-0673 63
0-1886 346 N346Q mAb4-0673 94
0-1886 346 N346A mAb4-0673 51
0-1886 WT WT mAb4-0673 100
[00805] Posição de acordo com a SEQ ID NO:1
00%x[(Rmax_Ab,FIX_var)/(R max_FIXvar)] I [(Rmax_Ab,FIX_wt)/(Rmax_FIXwt)]
Resíduos de hot-spot para mAb1-1307, mAb0-1998 e mAbO-1886 [00806] Resíduos de hot-spot para mAb1 -1307, mAb0-1998 e mAbO1886 são definidos como posições onde a substituição do resíduo do tipo selvagem por alanina reduz a ligação do anticorpo em 30% ou menos em relação à ligação do anticorpo ao FIX do tipo selvagem.
[00807] Resíduos de hot-spot para mAb1-1307 (representados experimentalmente por mAb3-3279):
H257, K293 e N406 [00808] Resíduos de hot-spot para mAbO-1998 (representados experimentalmente por mAb4-0004):
R338 e K341 [00809] Resíduos de hot-spot para mAbO-1886 (representados experimentalmente por mAb4-0673):
D332, R333, L337 e R338
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148/157 [00810] Para mAbO-1998 e mAbO-1886, o resíduo que mais contribui para a ligação é R338; a substituição de R338 por alanina (R338A) em FIX apresentou o maior impacto sobre a ligação do anticorpo, o que foi bem reduzido para 2% e 3% para mAbO-1998 e mAbO-1886, respectivamente, em relação à ligação do anticorpo ao FIX do tipo selvagem.
Exemplo 16: Atividade de Anticorpos Biespecíficos antiFIX(a)/FX(a) em um Ensaio de Geração de FXa [00811] A atividade pró-coagulante de anticorpos biespecíficos antiFIXa/FX foi determinada com base em sua capacidade de promover a ativação de FX por FIXa na presença de uma membrana fosfolipídica pró-coagulante. Os anticorpos biespecíficos (BiAb) testados estão listados na tabela 13 e ACE910 foi incluído para comparação.
[00812] A atividade de pró-coagulante de cada anticorpo biespecífico é relatada como a quantidade de vezes de estimulação em relação à ativação de FX por FIXa livre a uma determinada concentração de anticorpo. Os anticorpos biespecíficos foram testados em 8 concentrações (feitas por diluições em séries de três vezes em tampão de ensaio) por pré-incubação com 125 pM de FIXa derivado de plasma humano (Haematologic Technologies Inc, EUA) e 500 μΜ 25:75 de vesículas fosfolipídicas de fosfatidilserina:fosfatidilcolina (Haematologic Technologies Inc, EUA) em tampão de ensaio (50 mM HEPES, 100 mM NaCI, 5 mM CaCL, 0,1% (p/v) PEG8000, pH 7,3 + 1 mg/ml BSA) por 10 min. A ativação foi então iniciada por adição de FX derivado de plasma humano (Haematologic Technologies Inc, EUA) em uma concentração de 25 nM. Após 15 min de ativação em temperatura ambiente, a reação (50 μΙ) foi suprimida pela adição de 25 μΙ de tampão de resfriamento (50 mM HEPES, 100 mM NaCI, 60 mM EDTA, 0,1% PEG8000, pH 7,3 + 1 mg/ml BSA). A quantidade de FXa gerada foi determinada pela adição de 25 μΙ de 2 mM de substrato cromogênico S-2765 (Chromogenix,
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Suécia) e medição de conversão do substrato cromogênico pela medição da absorbância em 405 nm (AOD/min) em um leitor de microplaca. Da mesma forma, a ativação de FX por FIXa livre foi determinada em uma concentração de FIXa de 25 nM e um tempo de reação de 60 min.
[00813] A atividade medida foi normalizada de acordo com a concentração de FIXa presente no ensaio e com o tempo de reação. Dividindo este número pela taxa similarmente normalizada de geração de FXa na ausência de anticorpo, calculou-se estimulação, em vezes, pelo anticorpo em uma determinada concentração.
[00814] Em resumo, o cálculo da estimulação de biAb pode ser descrito conforme se segue [00815] Estimulação de BiAb = (Apixa+biAb / ([FIXa]ensaio χ treação)) / ApiXa.norm [00816] onde Apixa+biAb é a atividade medida na presença de anticorpo biespecífico, [FIXa]ensaio é a concentração de FIXa no ensaio, treação é o tempo de reação, e AFixa,norm é a atividade normalizada do FIXa livre.
[00817] A Tabela 13 lista a estimulação máxima determinada para cada anticorpo biespecífico entre as 8 concentrações de anticorpo testadas, bem como a concentração em que a estimulação máxima foi observada. Para todos os anticorpos biespecíficos testados, constatouse que a estimulação máxima foi maior que a medida para ACE910, que foi testado em um intervalo de concentração de 0 a 15300 nM.
Tabela 13 - Estimulação Máxima por Anticorpos anti-FIXa/FX Biespecíficos
Anticorpo biAb ID Anticorpo para FIXa ID (linhagem) Anticorpo para FX ID (linhagem) Concentração amplitude testada (nM) Concentração de biAb na estimulação máxima (nM) Estimulação máxima (vezes)
ACE910 7,5-15300 15300 808
5-0057 1-8768 (0-1998) 1-6723 (1-6723) 1,7-3654 1218 10754
5-1409 1-8768 (0-1998) 1-7503 (1-6723) 1,5-3346 1115 11041
4-7687 1-6037 1-6723 1,6-3300 1650 2493
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Anticorpo biAb ID Anticorpo para FIXa ID (linhagem) Anticorpo para FX ID (linhagem) Concentração amplitude testada (nM) Concentração de biAb na estimulação máxima (nM) Estimulação máxima (vezes)
(0-1998) (1-6723)
4-7756 1-6584 (0-1886) 1-6723 (1-6723) 0,7-1520 1520 2597
4-7758 1-6584 (0-1886) 1-6097 (1-2375) 0,6-1266 633 2807
4-7762 1-6584 (0-1886) 1-6738 (1-2375) 0,1-109,2 109 3194
4-7786 1-6081 (0-1998) 1-6463 (1-2375) 2,0-4060 4060 1267
4-7789 1-6584 (0-1886) 1-6463 (1-2375) 1,0-2020 253 3529
4-5925 1-4857 (0-1998) 1-6723 (1-6723) 0,7-1600 533 5195
Exemplo 17: Atividade de Anticorpos anti-F X(a)/FX(a)
Biespecíficos em um Teste de Geração de Trombina (TGT) em Plasma Humano de Hemofilia A Mímico Deficiente em Plaquetas e
Rico em Plaquetas [00818] A atividade pró-coagulante dos anticorpos biespecíficos mAb4-7761, mAb4-7762, mAb4-7789, mAb5-0057 e mAb5-1409 (vide a Tabela 14) foi determinada com base em sua capacidade em promover a geração de trombina na presença de uma membrana fosfolipídica sintética pró-coagulante ou plaquetas de acordo com os princípios descritos por Hemker et al. (Pathophysiol Haemost Thromb, 2002;32:249-253). ACE910 foi incluído para comparação. Cada anticorpo (composto de teste) foi testado em um teste de geração de trombina (TGT) em plasma deficiente em plaquetas agrupado de pacientes com hemofilia A (HA) (HA-PPP) e/ou em plasma humano rico em plaquetas induzido por HA (HA-PRP).
Tabela 14 - Anticorpos anti-FIX(a)/FX(a) Biespecíficos
Anticorpo biAb ID Anticorpo anti-FIX ID (linhagem) Anticorpo anti-FX ID (linhagem)
4-7761 1-5743 (0-1886) 1-6738 (1-2375)
4-7762 1-6584 (0-1886) 1-6738 (1-2375)
4-7789 1-6584 (0-1886) 1-6463 (1-2375)
5-0057 1-8768 (0-1998) 1-6723 (1-6723)
5-1409 1-8768 (0-1998) 1-7503 (1-6723)
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Plasma humano rico em plaquetas induzido por hemofilia A (HA-PRP) [00819] O sangue foi obtido pelo consentimento de doadores saudáveis por venipuntura. Seis volumes de sangue foram coletados em 1 volume de citrato ácido dextrose (ACD; 85 mM de citrato de sódio, 110 mM de dextrose e 62,3 mM de ácido cítrico, pH 4,9), pH final 6,5 e centrifugados por 20 min em 220 g em temperatura ambiente (TA). O plasma rico em plaquetas (PRP) foi coletado e as concentrações de plaquetas foram determinadas com um analisado de hematologia Medonic CA 620 (Boule Diagnostics AB, Spánga, Suécia). As células sanguíneas vermelhas contendo parte do plasma foram centrifugadas por mais 10 min a 600 g em TA. O plasma deficiente em plaquetas (PPP) foi coletado e usado para o PRP diluído a 300.000 plaquetas/μΙ. As condições de HA foram induzidas pela adição de um anticorpo anti-FVI11 humano neutralizante de FVIII (anti-Fator VIII humano de ovelha - 5 mg, Haematologic Technologies, VT, EUA) em uma concentração final de 0,1 mg/ml e rotacionado gentilmente a 2 rpm por 30 minutos em TA. Teste de Geração de Trombina [00820] Os testes de geração de trombina (TGT) em HA-PRP e HAPPP (George King Bio-Medical Inc, KS, EUA) foram realizados por trombografia automatizada calibrada padrão usando um fluorômetro de placa com 96 poços (Fluoroscan Ascent FL, Thermolabsystems, Helsinki, Finlândia). As misturas de reação continham 70 μΙ de HA-PRP (300.000 plaquetas/μΙ) ou HA-PPP, 10 μΙ de diluição do composto de teste (diluído em 20 mM HEPES, 140 mM NaCI, pH 7,4, 2 % BSA), 20 μΙ de reagentes CAT contendo fator tecidual (TF) (reagente PRP; TF sem fosfolipídios sintéticos, reagente LOW de PPP; TF com fosfolipídios sintéticos, 1 pM TF final, Thrombinoscope BV, Maastricht, Países Baixos) ou Thrombin Calibrator (Thrombinoscope BV), e 20 μΙ de uma mistura contendo o substrato de trombina marcado de forma fluorescente z-Gly-Gly-Arg-AMC (3 mM) e CaCL (90 mM)
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152/157 (Thrombinoscope BV). O TGT foi realizado em até oito concentrações do composto de teste (0,3, 1,0, 3, 10, 30, 100, 300 e 900 nM, concentração de plasma final) ou tampão adicionado (20 mM HEPES, 140 mM NaCI, pH 7,4, 2 % BSA) apenas (representando controle de HA). Os intervalos de concentração foram testados em pelo menos três experimentos independentes em HA-PPP do mesmo estoque ou no sangue de quatro doadores diferentes. Os níveis de controle normais em TGT foram medidos usando plasma PRP humano não tratado ou PPP humano normal agrupado CRYOcheck™ (Precision Biologic Inc., Dartmouth, Canadá) com tampão adicionado (20 mM HEPES, 140 mM NaCI, pH 7,4, 2 % BSA) apenas. O TGT foi deixado prosseguir por um total de 90 minutos e o parâmetro de TGT de Altura de Trombina de Pico (nM) foi analisado por software Thrombinoscope (Thrombinoscope BV).
[00821] A Figura 2/Tabela 15 mostram as taxas de geração de trombina de pico medidas para cada anticorpo biespecífico nas concentrações testadas em HA-PPP. Os dados mostram que todos os compostos de teste aumentam a formação de trombina de pico acima do nível observado na ausência de anticorpo, isto é, apresentam atividade de pró-coagulante. Além disso, os níveis de geração de trombina entre 30 e 300 nM para mAb4-7761, mAb4-7762, mAb4-7789, mAb5-0057 e mAb5-1409 são mais altos que os observados para ACE910, demonstrando uma potência superior. Além disso, os níveis de geração de trombina em 300 a 900 nM de mAb5-0057 e mAb5-1409 são mais altos que os observados com 900 nM ACE910, demonstrando maiores potências e eficácias desses compostos em comparação a ACE910.
[00822] A Figura 3/Tabela 16 mostram os níveis de geração de trombina de pico medidos para mAb5-0057 e mAb5-1409 nas concentrações testadas em HA-PRP. Nessas condições, mAb5-0057 e
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153/157 mAb5-1409 também exibem melhores potências e eficácias em comparação a ACE910.
Tabela 15 - Teste de Geração de Trombina (TGT) dos Anticorpos Biespecíficos mAb4-7761, mAb4-7762, mAb4-7789, mAb5-0057, mAb5-1409e ACE910 [00823] Teste de geração de trombina (TGT) dos anticorpos biespecíficos mAb4-7761, mAb4-7762, mAb4-7789, mAb5-0057, mAb51409 e ACE910 no plasma humano de paciente com hemofilia A deficiente em plaquetas com fator tecidual ativado (PPP). Média dos níveis de geração de trombina de pico ± desvio padrão medido em cada uma das concentrações de composto testado em pelo menos três experimentos independentes em HA-PPP. Exp. A - D referem-se a experimentos independentes conforme descrito na legenda da figura 2.
Exp. A Concentração de composto (nM) Pico de trombina (média ± SD em nM) para ACE910 Pico de trombina (média ± SD em nM) para mAb47761
0 19,4 ±2,3 19,4 ±2,3
0,3 17,2 ±0,4 18,1 ±2,4
1 18,3 ±1,4 18,9 ±0,9
3 17,9 ±2,1 21,8 ±3,7
10 19,3 ±1,0 22,4 ±1,6
30 20,5 ±2,3 34,0 ±1,9
100 24,6 ±2,0 51,7 ±3,7
300 35,9 ±3,0 57,9 ±1,4
900 54,0 ±4,7
Exp. B Concentração de composto (nM) Pico de trombina (média ± SD em nM) para ACE910 Pico de trombina (média ± SD em nM) para mAb47762
0 8,5 ± 1,2 8,5 ± 1,2
0,3 7,7 ± 1,0 8,5 ± 1,1
1 7,8 ± 1,0 8,9 ±0,8
3 8,3 ±1,2 9,1 ±1,2
10 9,8 ±2,2 10,6 ±0,9
30 9,6 ± 1,0 16,4 ±0,5
100 13,6 ±1,1 31,8 ±7,0
300 19,5 ±4,7 38,1 ±0,8
900 39,0 ±3,1
Exp. C Concentração de composto (nM) Pico de trombina (média ± SD em nM) para ACE910 Pico de trombina (média ± SD em nM) para mAb4-
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7789
0 7,4 ±0,1 7,4 ±0,1
0,3 6,6 ±0,6 7,9 ±0,5
1 8,6 ±2,1 8,0 ± 1,1
3 7,1 ±0,5 8,6 ±0,5
10 9,2 ±2,2 10,6 ±0,8
30 9,5 ±0,9 18,6 ±4,5
100 12,1 ±1,5 28,2 ±1,4
300 20,7 ±7,9 31,5 ±1,9
900 34,5 ±3,4 19,5 ±1,2
Exp. D Concentração de composto (nM) Pico de trombina (média ± SD em nM) para ACE910 Pico de trombina (média ± SD em nM) para mAb50057 Pico de trombina (média ± SD em nM) para 5-1409
0 20,7 ±7,8 20,7 ±7,8 20,7 ±7,8
0,3 26,6 ± 13,2 21,7 ±7,9 18,3 ±7,1
1 21,3 ±8,9 24,5 ±8,5 20,1 ±8,7
3 23,4 ±9,9 28,7 ±1,8 23,2 ±10,1
10 25,6 ±8,6 31,2 ± 11,3 22,6 ±5,5
30 26,4 ±9,3 42,9 ± 13,9 32,2 ±12,7
100 32,0 ±9,9 82,6 ±23,4 68,5 24,5
300 46,1 ±12,3 112,3 ±29,0 99,5 27,3
900 71,6 ±18,4 119,7 ±26,7 104,0 30,2
Tabela 16 - Teste de Geração de Trombina (TGT) dos Anticorpos Biespecíficos mAb5-0057, mAb5-1409 e ACE910 [00824] Teste de geração de trombina (TGT) dos anticorpos biespecíficos mAb5-0057, mAb5-1409 e ACE910 no plasma humano de paciente com hemofilia A rico em plaquetas com fator tecidual ativado (PRP). Média da geração de trombina de pico ± desvio padrão em cada uma das concentrações de composto testado a partir de quatro experimentos independentes em HA-PRP.
Concentração de composto (nM) Pico de trombina (média ± SD em nM) para ACE910 Pico de trombina (média ± SD em nM) para mAb50057 Pico de trombina (média ± SD em nM) para mAb51409
0 15,5 ±6,6 15,5 ±6,6 15,5 ±6,6
0,3 17,2 ±7,7 16,1 ±9,2 17,2 ±6,6
1 15,7 ±5,3 19,9 ± 11,4 17,4 ±5,6
3 17,5 ±6,4 21,8 ±6,5 23,7 ±8,7
10 17,6 ±6,4 36,4 ±4,9 35,6 ±4,5
30 22,1 ±6,5 65,0 ±7,1 58,8 ±5,2
100 34,9 ±9,9 87,4 ± 25,3 86,0 ±10,5
300 60,3 ±16,1 100,4 ± 17,6 98,6 ±18,8
900 80,7 ±11,0 105,3 ±23,8 105,3 ±21,9
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155/157
Exemplo 18: Atividade de Anticorpos anti-FIX/FIXa de Um Braço (OA) Monovalentes em um Teste de Geração de Trombina (TGT) em Plasma Humano de Hemofilia A Deficiente em Plaquetas [00825] A atividade pró-coagulante da versão de mAb1-9016 de um braço (OA) monovalente foi determinada com base em sua capacidade em promover a geração de trombina na presença de uma membrana fosfolipídica pró-coagulante de acordo com os princípios descritos por Hemker et al. (2002) Pathophysiol Haemost Thromb, 32:249-253. A versão de um braço do anticorpo 224F3 (mAb1-1582) foi incluída para comparação. Cada anticorpo (composto de teste) foi testado em um teste de geração de trombina (TGT) em plasma de paciente com hemofilia A (HA) deficiente em plaquetas agrupado (HA-PPP) (George King Bio-Medical Inc, KS, EUA) por trombografia automatizada calibrada padrão usando um fluorômetro de placa com 96 poços (Fluoroscan Ascent FL, Thermolabsystems, Helsinki, Finlândia). As misturas de reação continham 70 μΙ de HA-PPP, 10 μΙ do composto de teste (diluído em 20 mM HEPES, 140 mM NaCI, pH 7,4, 2 % BSA), 20 μΙ de reagentes PRP (fosfolipídios sintéticos, Thrombinoscope BV, Maastricht, Países Baixos) contendo Fator XI derivado de plasma humano ativado (hFXIa, 8,3 mU/mL final) (Enzyme Research Laboratories, IN, EUA) ou Thrombin Calibrator (Thrombinoscope BV), e 20 μΙ de uma mistura contendo o substrato de trombina marcado fluorescente Z-Gly-Gly-Arg-AMC (3 mM) e CaCh (90 mM) (Thrombinoscope BV). O TGT foi realizado em cinco concentrações do composto de teste (30, 100, 300, 600 e 900 nM, concentração de plasma final) ou tampão adicionado (20 mM HEPES, 140 mM NaCI, pH 7,4, 2 % BSA) apenas (representando controle de HA). O intervalo de concentração foi testado em dois experimentos independentes em HAPPP a partir do mesmo estoque. O TGT foi deixado prosseguir por um total de 90 minutos e o parâmetro de TGT de Altura de Trombina de
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Pico (nM) foi analisado por software Thrombinoscope (Thrombinoscope BV). A Figura 4 e a Tabela 17 mostram/listam as taxas de geração de trombina de pico medidas para cada anticorpo de um braço monovalente nas concentrações testadas. Os dados mostram que a versão de mAb1-9016 do anticorpo OA aumenta a formação de trombina de pico acima do nível observado na ausência de anticorpo, isto é, apresentam atividade de pró-coagulante. Além disso, a geração de trombina induzida pela versão de mAb1-9016 do anticorpo OA é maior que a observada para a versão de OA monovalente do anticorpo 224F3 (mAb1-1582).
Tabela 17 - Taxas de Geração de Trombina de Pico Medidas para Cada Anticorpo de Um Braço Monovalente nas Concentrações Testadas. É listada a média de trombina de pico ± desvio padrão de dois experimentos independentes em HA-PPP
Concentração de composto (nM) Pico de trombina (média ± SD em nM) para OA de 224F3 (mAb1-1582) Pico de trombina (média ± SD em nM) para O A de mAb19016
0 111,6 ± 19,0 111,6 ± 19
30 121,0 ±33,5 138,5 ±34,9
100 106,2 ± 10,7 156,4 ±37,8
300 100,1 ± 18,9 184,0 ±27,7
600 94,4 ± 16,1 210,2 ±26,1
900 104,0 ±2,7 223,5 ± 37,7
Exemplo 19: Afinidades de Ligação Determinadas por Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) [00826] As afinidades de ligação para os anticorpos anti-FIX/FIXa e anti-FX/FXa que se ligam a FIX/FIXa e FX/FXa, respectivamente, são medidas por calorimetria de titulação isotérmica (ITC) usando um calorímetro PEAQ-ITC (Malvern, Reino Unido). Os experimentos são realizados a 37 Ό e pH 7,4 usando 25 mM Tris, 150 mM NaCI, 5 mM CaCh (tampão Tris). A célula de amostra (200 μΙ) contém FIX, FIXa, FX ou FXa e os anticorpos anti-FIX/FIXa e anti-FX/FXa são injetados
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157/157 através da seringa. Todas as proteínas são dialisadas extensivamente em tampão Tris antes das medições para assegurar as condições de tampão correspondentes. Uma etapa de equilíbrio térmico foi seguida por um atraso de 60 segundos e, posteriormente, por uma injeção inicial de 0,2 μΙ de anticorpo, seguida por 14 injeções de 2,5 μΙ de anticorpo em um intervalo de 120 s. A velocidade de agitação é mantida a 750 rpm, e a energia de referência é mantida constante em 5-10 pcal/s. O calor associado a cada injeção de anticorpo é integrado e representado graficamente contra a razão molar entre o ligante e a macromolécula. A curva isotérmica resultante é ajustada a um modelo de ligação de sítio único para obter a afinidade (KD), estequiometria (n) e entalpia de interação (ΔΗ) usando o software fornecido pelo fabricante. Os experimentos foram realizados em duplicatas ou triplicatas.
[00827] Embora certas características da invenção tenham sido ilustradas e descritas neste documento, muitas modificações, substituições, alterações e equivalentes ocorrerão aos versados na técnica. Deve-se entender, portanto, que as reivindicações anexas se destinam a cobrir todas essas modificações e alterações que estejam dentro do verdadeiro espírito da invenção.

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo multiespecífico ou seu fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que é capaz de estimular a atividade enzimática de FIXa em direção a FX, compreendendo um primeiro sítio de ligação a antígeno capaz de se ligar a FIX (SEQ ID NO:1) e/ou a sua forma ativada (FIXa), e um segundo sítio de ligação a antígeno capaz de se ligar a FX (SEQ ID NO:2) e/ou a sua forma ativada (FXa).
  2. 2. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno é capaz de ligar um epitopo compreendendo o resíduo de aminoácido R338 de FIX/FIXa, e o segundo sítio de ligação ao antígeno é capaz de se ligar no domínio EGF-2 e/ou na subunidade catalítica de FX/FXa.
  3. 3. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno é capaz de ligar um epitopo compreendendo os resíduos de aminoácidos R338 e K341 de FIX/FIXa.
  4. 4. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno é capaz de ligar um epitopo compreendendo os resíduos de aminoácidos L337, R338, S339, T340, K341 e T343 de FIX/FIXa.
  5. 5. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno é capaz de ligar um epitopo compreendendo os resíduos de aminoácidos D332, R333, L337 e R338 de FIX/FIXa, e o segundo sítio de ligação ao antígeno é capaz de se ligar no domínio EGF-2 e/ou na subunidade catalítica de FX/FXa.
  6. 6. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de
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    2/4 acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio de ligação ao antígeno é capaz de ligar um epitopo compreendendo os resíduos de aminoácidos K301, D332, R333, A334, T335, R338 e N346 de FIX/FIXa.
  7. 7. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno é capaz de ligar um epitopo compreendendo os resíduos de aminoácidos Y230, D423 e K427 de FX/FXa.
  8. 8. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o segundo sítio de ligação ao antígeno é capaz de ligar um epitopo compreendendo um ou mais dos resíduos de aminoácidos H101, E103, R113, T116, L117, A118, T127, S227, E228, F229, Y230, E266, R287, P304, E305, L333, L419, K420, D423, R424, M426, K427 e T428 de FX/FXa.
  9. 9. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compete com um anticorpo de referência pela ligação a FIX/FIXa, em que o anticorpo de referência compreende
    a) um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:15 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:16, ou
    b) um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:17 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NO:18, ou
    c) um domínio variável de cadeia pesada identificado pela SEQ ID NO:19 e um domínio variável de cadeia leve identificado pela SEQ ID NQ:20.
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    3/4
  10. 10. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é um anticorpo biespecífico.
  11. 11. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende
    a. as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada do anticorpo anti-FIX/FIXa identificadas pela SEQ ID NO:177 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve do anticorpo anti-FIX/FIXa identificadas pela SEQ ID NO:178, e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada de anti-FX/FXa identificadas pela SEQ ID NO:179 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve de anti-FX/FXa identificadas pela SEQ ID NQ:180,
    b. as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada do anticorpo anti-FIX/FIXa identificadas pela SEQ ID NO:181 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve do anticorpo anti-FIX/FIXa identificadas pela SEQ ID NO:182, e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada de anti-FX/FXa identificadas pela SEQ ID NO:183 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve de anti-FX/FXa identificadas pela SEQ ID NO:184,
    c. as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada do anticorpo anti-FIX/FIXa identificadas pela SEQ ID NO:187 e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia leve do anticorpo anti-FIX/FIXa identificadas pela SEQ ID NO:188, e as sequências de CDR do domínio variável de cadeia pesada de anti-FX/FXa identificadas pela SEQ ID NO:185 e as sequências de CDR de domínio variável de cadeia leve de anti-FX/FXa identificadas pela SEQ ID NO:186.
  12. 12. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo
    Petição 870190072683, de 29/07/2019, pág. 195/361
    4/4 fato de que é para uso em um método de tratamento de uma coagulopatia ou distúrbio de coagulação do sangue.
  13. 13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, para o tratamento de uma coagulopatia ou distúrbio de coagulação do sangue, tal como hemofilia A ou hemofilia A com inibidores.
  14. 14. Uso de um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um sujeito que sofre de uma coagulopatia ou distúrbio de coagulação do sangue, tal como hemofilia A ou hemofilia A com inibidores.
  15. 15. Invenção, caracterizada por qualquer uma de suas modalidades ou categorias reivindicatórias abrangidas pelo objeto inicialmente divulgado no pedido de patente ou em seus exemplos apresentados neste documento.
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