BR112021016092A2 - Produção de composições que compreendem dois ou mais anticorpos - Google Patents

Abstract

produção de composições que compreendem dois ou mais anticorpos. a invenção se refere a meios e métodos de produção de ao menos dois anticorpos. os métodos podem incluir fornecer células com ácido nucleico que codifica os anticorpos; cultivar as ditas células; coletar os anticorpos da cultura; e separar os anticorpos produzidos dos meio-anticorpos por cromatografia de troca iônica (iex). em algumas modalidades, os anticorpos apresentam tempos de retenção em iex que se desviam 10% ou menos da média dos tempos de retenção dos anticorpos individuais sob as condições da iex usadas. a invenção também se refere a composições de anticorpos assim produzidos. em alguns aspectos, a invenção se refere a composições que compreendem 2 a 10 anticorpos recombinantes caracterizados por os tempos de retenção em iex de ao menos dois dos ditos anticorpos se desviarem 10% ou menos da média dos tempos de retenção dos anticorpos individuais sob as condições da iex. ela também se refere a composições que compreendem 2 a 10 anticorpos recombinantes caracterizados por o pi de ao menos dois dos ditos anticorpos diferir em 0,4 unidade ou menos do pi médio dos ditos ao menos dois anticorpos.

Description

Relatório descritivo da patente de invenção para "PRODUÇÃO

DE COMPOSIÇÕES QUE COMPREENDEM DOIS OU MAIS ANTICORPOS."

[0001] A invenção se refere ao campo de anticorpos, em particular, ao campo de anticorpos terapêuticos. Os anticorpos podem ser usados no tratamento de seres humanos. Mais especificamente, a invenção se refere à produção e/ou à purificação de múltiplos anticorpos. Uma única célula hospedeira pode produzir os múltiplos anticorpos. Os anticorpos podem também ser produzidos por uma mistura de células hospedeiras que produzem, cada uma, um dos anticorpos. A invenção também se refere a métodos para produzir composições compreendendo tais anticorpos e a métodos para purificar tais anticorpos.

[0002] Anticorpos policlonais são tipicamente coletados do sangue de um indivíduo. Uma vantagem dos anticorpos policlonais é que os patógenos são atacados através de múltiplos alvos e epítopos. Uma vantagem dos anticorpos monoclonais ou recombinantes é a especificidade e função bem caracterizadas que permitem que tais anticorpos sejam usados como medicamentos de precisão com uma ação e espectro de toxicidade bem definidos.

[0003] A especificidade de um anticorpo monoclonal pode também ser uma desvantagem, particularmente quando múltiplos alvos precisam ser tratados. É possível reduzir essa desvantagem pela adição de mais anticorpos ao medicamento, mas considerando que mesmo um único anticorpo terapêutico pode ser caro, prevê-se que os custos para tais coquetéis multiclonais possam rapidamente se tornar proibitivos.

[0004] O desenvolvimento de anticorpos bi, tri e outros multiespecíficos tem sido bem sucedido para introduzir alguns aspectos de um anticorpo policlonal em agentes terapêuticos anticorpos. O uso de anticorpos mono ou policlonais monoespecíficos clássicos além de aumentar o número de alvos, também introduz, com sucesso, uma funcionalidade adicional não anteriormente alcançável. O uso de múltiplos anticorpos bi, tri e outros multiespecíficos no mesmo tratamento pode fornecer ainda benefícios adicionais.

[0005] A presente invenção fornece um avanço na técnica por descrever um método robusto e econômico de purificação de múltiplos agentes terapêuticos à base de anticorpos produzidos a partir de uma única célula hospedeira ou, alternativamente, uma mistura de células hospedeiras. A invenção é particularmente útil para a produção econômica de coleções de dois ou mais anticorpos, de preferência, anticorpos multiespecíficos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] A invenção fornece um método para produzir ao menos dois anticorpos multiespecíficos, que compreende: - fornecer células com ácido nucleico que codifica os anticorpos multiespecíficos; - cultivar as ditas células; - coletar os anticorpos multiespecíficos da cultura; e - separar os anticorpos multiespecíficos produzidos dos meio- anticorpos e, opcionalmente, dos anticorpos monoespecíficos e/ou das outras impurezas relacionadas aos produtos de anticorpo não desejados por cromatografia de troca iônica (IEX, "ion exchange chromatography"); sendo o método caracterizado por os anticorpos multiespecíficos apresentarem tempos de retenção da IEX que se desviam 10% ou menos da média dos tempos de retenção dos anticorpos multiespecíficos individuais sob as condições da IEX usadas. Os tempos de retenção dos respectivos meio-anticorpos e opcionalmente anticorpos monoespecíficos e/ou outras impurezas relacionadas aos produtos de anticorpo não desejados estão, de preferência, fora da faixa abrangida pelos tempos de retenção dos anticorpos multiespecíficos.

[0007] A invenção também fornece um método para produzir ao menos dois anticorpos multiespecíficos, que compreende: - fornecer uma célula com ácido nucleico que codifica os anticorpos multiespecíficos; - cultivar a dita célula; - coletar os anticorpos multiespecíficos da cultura; e - separar os anticorpos multiespecíficos produzidos dos meio- anticorpos e, opcionalmente, dos anticorpos monoespecíficos e/ou das outras impurezas relacionadas aos produtos de anticorpo não desejados por cromatografia de troca iônica (IEX, "ion exchange chromatography"); sendo o método caracterizado por os anticorpos multiespecíficos apresentarem tempos de retenção de IEX que são essencialmente iguais sob as condições da IEX usadas. Os tempos de retenção dos respectivos meio-anticorpos e opcionalmente anticorpos monoespecíficos e/ou outras impurezas relacionadas aos produtos de anticorpo não desejados estão, de preferência, fora da faixa abrangida pelos tempos de retenção dos anticorpos.

[0008] A invenção fornece adicionalmente um método de produção de pelo menos dois anticorpos, sendo que os anticorpos compreendem um anticorpo monoespecífico e/ou multiespecífico, que compreende: - fornecer células com ácido nucleico que codifica os anticorpos; - cultivar as ditas células; - coletar os anticorpos da cultura; e - separar os anticorpos produzidos dos meio-anticorpos por cromatografia de troca iônica (IEX); sendo o método caracterizado por os anticorpos apresentarem tempos de retenção de IEX que são essencialmente iguais sob as condições da IEX usadas. Os tempos de retenção dos respectivos meio- anticorpos e opcionalmente anticorpos monoespecíficos estão, de preferência, fora da faixa abrangida pelos tempos de retenção dos anticorpos.

[0009] A invenção também fornece uma composição que compreende 2 a 10 anticorpos recombinantes obteníveis por um método conforme descrito aqui.

[0010] Também é fornecida uma composição que compreende 2 a 10 anticorpos recombinantes, como anticorpos multiespecíficos, caracterizados pelo fato de que os tempos de retenção da IEX de ao menos dois dos ditos anticorpos se desviam 10% ou menos da média dos tempos de retenção dos anticorpos individuais sob as condições da IEX usadas.

[0011] É adicionalmente fornecida uma composição que compreende 2 a 10 anticorpos recombinantes caracterizados pelo fato de que os tempos de retenção da IEX de ao menos dois dos ditos anticorpos são essencialmente iguais.

[0012] Também é fornecida uma composição que compreende 2 a 10 anticorpos recombinantes caracterizados pelo fato de que o ponto isoelétrico (pI) de ao menos dois dos ditos anticorpos difere, de preferência, em 0,4 unidade, 0,3, 0,2 e, de preferência, 0,1 unidade ou menos do pI médio dos ditos ao menos dois anticorpos. O pI de cada um dos ditos pelo menos dois anticorpos difere, de preferência, em 0,25 unidade ou menos um do outro.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0013] O termo "anticorpo", para uso na presente invenção, significa uma molécula proteinácea pertencente à classe de proteínas da imunoglobulina, contendo um ou mais domínios que se ligam a um epítopo em um antígeno, em que tais domínios são derivados ou compartilham a homologia de sequência com a região variável de um anticorpo. Os anticorpos são tipicamente produzidos a partir de unidades estruturais básicas: cada uma com duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Os anticorpos para uso terapêutico são, de preferência, tão próximos dos anticorpos naturais do indivíduo a serem tratados quanto possível (por exemplo, anticorpos humanos para indivíduos humanos). Anticorpos com região variável de cadeia pesada e/ou leve estendida também estão incluídos na presente invenção. Um anticorpo de acordo com a presente invenção não se limita a qualquer formato particular ou método para produzi-lo.

[0014] Meio-anticorpos são combinações de cadeia pesada e leve que não estão associadas a uma outra combinação de cadeia pesada e leve e que não formam uma interface com uma outra região variável ou polipeptídeo semelhante à região variável. Outras impurezas relacionadas aos produtos de anticorpo não desejados podem ser cadeias leves livres que não estão associadas a uma cadeia pesada, cadeias pesadas livres que não estão associadas a uma cadeia leve ou a uma outra cadeia pesada, ou anticorpos incompletamente montados que não têm uma cadeia leve.

[0015] Células adequadas para a produção de anticorpos são conhecidas na técnica e incluem uma célula de hibridoma, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), uma célula NS0 ou uma célula PER-C6, ou uma variedade de outras linhagens celulares conhecidas das pessoas comumente versadas na técnica. Várias instituições e empresas desenvolveram linhagens celulares para a produção em larga escala de anticorpos, por exemplo, para uso clínico. Exemplos não limitadores dessas linhagens celulares são células CHO, células NS0 ou células PER.C6 ou células HEK293. Em uma modalidade particularmente preferencial, a dita célula é uma célula humana. De preferência, uma célula que é transformada por uma região E1 de adenovírus ou por um equivalente funcional da mesma. Em uma modalidade particularmente preferencial, a dita célula é uma célula CHO ou uma variante da mesma. De preferência, uma variante que faz uso de um sistema de vetor da glutamina sintetase (GS) para a expressão de um anticorpo. Em uma modalidade preferencial, a célula é uma célula CHO.

[0016] As células podem ser fornecidas com o ácido nucleico que codifica os anticorpos. As células expressarão, montarão e excretarão os anticorpos formados no sobrenadante das culturas celulares. A introdução de uma única cadeia pesada e leve (ou, ao invés disso, o ácido nucleico que a codifica) leva à produção de um anticorpo monoclonal que tem duas cadeias pesadas que estão, cada uma, associadas a uma cadeia leve.

[0017] Um método da invenção pode ser executado com misturas de células que compreendem dois ou mais tipos de células que produzem, cada uma, um anticorpo diferente. Uma vantagem do uso de tal mistura é que o processamento a jusante dos anticorpos coletados pode ser simplificado de modo mais eficiente. Uma vantagem adicional de um método é que os produtos de anticorpo são coletados e purificados como um produto. Além disso, uma mistura de dois ou mais anticorpos produzidos por um método da invenção poderia reduzir o número de testes necessários para obtenção de aprovação regulatória em comparação com o número de testes necessários para cada um dos anticorpos separadamente.

[0018] Em uma outra modalidade, as células são uma coleção homogênea de células consistindo essencialmente em réplicas de uma única célula dotada de ácido nucleico que codifica os respectivos anticorpos. A coexpressão de várias cadeias pesadas em uma célula permite várias combinações de cadeias pesadas. A combinação com cadeias leves adicionais aumenta o número de combinações. Vários métodos foram desenvolvidos para favorecer a formação de combinações específicas em relação a outros. Variantes de cadeia pesada foram produzidas que facilitam especificamente mais a formação de heterodímeros de cadeia pesada do que de homodímeros de cadeia pesada ou vice-versa mais de homodímeros de cadeia pesada do que de heterodímeros de cadeia pesada. As cadeias pesadas com domínios de homodimerização ou heterodimerização específicos reduzem o número de anticorpos que estão sendo produzidos por tais células e/ou aumentam o nível do anticorpo preferencial em relação à combinação alternativa (por exemplo, maior produção de um heterodímero do que de um homodímero).

[0019] Um método da invenção é particularmente adequado para a produção de dois ou mais anticorpos multiespecíficos, incluindo anticorpos biespecíficos. Vários métodos para a produção de anticorpos biespecíficos existem na técnica. Uma abordagem utiliza uma cadeia leve comum que pode formar domínios variáveis funcionais com diferentes cadeias pesadas. Um método preferencial para produzir anticorpos biespecíficos inclui o uso de um animal transgênico que abriga uma cadeia comum em seu genoma, de modo que a imunização de tal animal com um antígeno resulta em um repertório de anticorpos que são específicos para o dito antígeno com base na cadeia não comum, sendo que o repertório consiste em uma variedade de anticorpos que compreendem a dita cadeia comum e uma cadeia cognata rearranjada. Um animal pode ser imunizado com antígenos diferentes, ou animais diferentes podem ser imunizados com cada um dos respectivos antígenos separadamente. Os ácidos nucleicos que codificam a cadeia não comum ou a região variável da mesma podem ser obtidos a partir dos animais, por exemplo, células B, tecido do baço ou linfático. Estes podem ser usados para gerar ácido nucleico que pode expressar as respectivas cadeias não comuns que podem, então, ser introduzidas na célula de produção. A cadeia comum pode ser introduzida ao mesmo tempo ou em um tempo diferente. O ácido nucleico pode ser incorporado no núcleo e, de preferência, no genoma da célula hospedeira, de modo que a célula hospedeira produza anticorpos multiespecíficos ou multímeros que direcionam os múltiplos antígenos, para os quais os animais transgênicos foram imunizados (consulte, por exemplo, WO2009/157771 que está aqui incorporado, a título de referência, com o propósito de geração de regiões variáveis que podem ser combinadas com uma cadeia comum para produzir domínios variáveis funcionais que são específicos para diferentes alvos e/ou diferentes epítopos).

[0020] Uma célula que produz uma cadeia leve comum e duas cadeias pesadas diferentes que podem, cada uma, formar um domínio variável funcional com a cadeia leve comum, produz, entre outros, um anticorpo biespecífico com duas combinações diferentes de cadeia pesada e leve. De modo similar, uma célula que produz uma cadeia leve comum e três ou mais cadeias pesadas diferentes pode formar anticorpos multiespecíficos capazes de direcionar três ou mais antígenos, ou uma combinação de dois ou mais anticorpos multiespecíficos capazes de direcionar três ou mais antígenos. Atualmente, é possível construir no formato padrão de anticorpos (isto é, uma parte constante e dois domínios variáveis) e adicionar domínios de ligação adicionais. Desse modo, podem ser feitos anticorpos multiespecíficos que têm uma ou mais Fv de cadeia única com especificidades de ligação adicionais fixadas à parte constante ou a um ou mais dos domínios variáveis de um anticorpo. Também é possível produzir cadeias pesadas com duas ou mais regiões variáveis. As regiões de cadeia pesada adicionais podem, vantajosamente, se associar a regiões variáveis de cadeia leve diferentes ou comuns. É feita referência ao documento US 62/650467, que está aqui incorporado a título de referência.

[0021] Quando a célula produz dois ou mais anticorpos multiespecíficos, ela pode, em alguns casos, também produzir alguma quantidade de meio- anticorpos e anticorpos com idênticas cadeias pesadas ou homodímeros. A quantidade do último pode ser reduzida pela inclusão da formação de heterodímero que promove modificações nas cadeias pesadas. Conforme indicado acima, existem vários métodos para induzir a heterodimerização de cadeias pesadas. Os respectivos domínios com as modificações são coletivamente chamados de domínios de heterodimerização. As cadeias pesadas que têm domínios de heterodimerização que favorecem a interação são consideradas como tendo domínios de heterodimerização compatíveis. Os domínios de heterodimerização compatíveis são, de preferência, domínios de heterodimerização CH3 de cadeia pesada de imunoglobulina. A técnica descreve várias maneiras pelas quais tal heterodimerização CH3 de cadeias pesadas pode ser realizada.

[0022] Um método preferencial para produzir anticorpos biespecíficos é revelado nas patentes US 9.248.181 e US 9.358.286. Especificamente, as alterações preferenciais para produzir essencialmente apenas moléculas de IgG de comprimento total são as substituições de aminoácido L351K e T366K (numeração EU) no primeiro domínio CH3 (a cadeia pesada "variante KK") e as substituições de aminoácido L351D e L368E no segundo domínio (a cadeia pesada "variante DE") ou vice-versa. Conforme anteriormente descrito, a variante DE e a variante KK preferencialmente se emparelham para formar heterodímeros (as chamadas moléculas biespecíficas "DEKK"). A homodimerização das cadeias pesadas variante DE (homodímeros DEDE) ou das cadeias pesadas variante KK (homodímeros KKKK) quase não ocorre devido à forte repulsão entre os resíduos carregados na interface CH3-CH3 entre as cadeias pesadas idênticas.

[0023] Na presente invenção, é preferencial que as células sejam dotadas de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve comum. Vários métodos estão disponíveis para a pessoa versada na técnica produzir anticorpos que têm diferentes regiões variáveis de cadeia pesada, mas a mesma região variável de cadeia leve. O documento WO2004/106375 descreve bibliotecas de fagos que usam uma região variável de cadeia leve comum. As seleções de fago produzem domínios variáveis com a mesma região variável de cadeia leve, mas diferentes regiões variáveis de cadeia pesada. Adicionalmente, animais não humanos que têm uma cadeia comum e diferentes cadeias cognatas são descritos no documento WO2009/157771. As seleções de anticorpo em tais animais produzem domínios variáveis com regiões variáveis de cadeia comuns iguais ou similares, mas diferentes regiões variáveis de cadeia cognata. Os documentos WO2004/106375 e WO2009/157771 estão aqui incorporados a título de referência. As publicações são referidas especificamente para a geração de anticorpos e ácido nucleico que codificam tais anticorpos que têm regiões variáveis de cadeia comum iguais ou similares e diferentes regiões variáveis de cadeia cognata, de preferência, uma região variável de cadeia leve comum e diferentes regiões variáveis de cadeia pesada.

[0024] Em uma modalidade preferencial, a célula produz duas ou mais cadeias pesadas e uma cadeia leve comum. As respectivas cadeias pesada e leve podem ter uma ou mais regiões variáveis associadas às respectivas cadeias. Em uma modalidade preferencial, a célula produz três ou mais cadeias pesadas. Uma das três cadeias pesadas contém, de preferência, uma parte de um domínio de heterodimerização compatível. As duas ou mais outras cadeias pesadas compreendem, de preferência, a outra parte do domínio de heterodimerização compatível. Se a primeira cadeia pesada for simbolicamente representada pela letra "A", e as outras duas cadeias pesadas pelas letras "B" e "C", a combinação específica de domínios de heterodimerização leva à formação de predominantemente as combinações AB e AC. As combinações AA, BB, CC e BC são desfavorecidas pela inclusão dos domínios de heterodimerização. Tal célula é eficaz para produzir apenas os dois anticorpos biespecíficos AB e AC (consulte a Figura 1). Na presente invenção, é preferencial que a célula produza os dois anticorpos pela produção de ao menos 3 cadeias pesadas. Em uma modalidade preferencial, uma das ditas cadeias pesadas contém uma parte de um domínio de heterodimerização compatível e as ditas duas ou mais outras cadeias pesadas compreendem, de preferência, a outra parte do domínio de heterodimerização compatível. Uma cadeia pesada que é compartilhada por dois ou mais anticorpos bi ou multiespecíficos ou multímeros em uma composição tem, de preferência, a parte CH3 DE do domínio de heterodimerização. As outras cadeias pesadas nos anticorpos bi ou multiespecíficos têm, de preferência, a parte CH3 KK.

[0025] Os ao menos dois anticorpos são, de preferência, anticorpos multiespecíficos, de preferência, anticorpos biespecíficos. Em uma modalidade preferencial, ao menos dois dos ditos anticorpos compartilham uma cadeia pesada idêntica. A célula pode produzir várias séries de anticorpos biespecíficos, incluindo diferentes domínios de heterodimerização nas cadeias pesadas. Tais implementações podem levar à produção predominante de anticorpos biespecíficos com combinações de cadeia pesada AB e CD. A combinação AB poderia ser favorecida por um domínio de heterodimerização DE/KK, conforme mencionado anteriormente neste documento, e a CD pela incorporação de um domínio de heterodimerização "knob in hole" ("botão em buraco"), ou outros recursos de heterodimerização conhecidos na técnica, por exemplo, através de engenharia de carga. Uma cadeia pesada compartilhada entre diferentes combinações de anticorpos ou multímeros bi ou multiespecíficos com a cadeia pesada compartilhada pode ser produzida fornecendo-se uma cadeia pesada compartilhada com uma parte de um domínio de heterodimerização e as várias cadeias de combinação com a parte complementar do domínio de heterodimerização. Por exemplo, a parte CH3 DE na cadeia pesada compartilhada e a parte CH3 KK nas cadeias de combinação. Uma cadeia pesada compartilhada e duas cadeias pesadas de combinação resultariam, neste cenário, na produção de multímeros ou anticorpos bi ou multiespecíficos com combinações de cadeia pesada AB e AC pela célula (ou AxBC e AxDE para multímeros multiespecíficos). Outras combinações possíveis são AB, AE, CD e CF; ou AB, AE, AG e CD etc.

[0026] Os anticorpos geralmente têm um ponto isoelétrico distinto (tipicamente na faixa de pH 6 a 10) em comparação com outras proteínas de célula hospedeira. Os anticorpos, como anticorpos multiespecíficos, bem como multímeros multiespecíficos, podem ser purificados com uma pureza relativamente alta através dos métodos aqui revelados. Os métodos podem compreender várias etapas como cultivo da célula hospedeira, submetida a clarificação da colheita, seguida de captura de proteína. A cromatografia IEX, como a cromatografia de troca aniônica, pode ser usada para remover o DNA da célula hospedeira, a cromatografia de troca catiônica (CIEX) pode ser usada para, por exemplo, remover a proteína da célula hospedeira, a proteína A lixiviada e potenciais agregados. Etapas adicionais podem ser incluídas, como filtração de vírus ou cromatografia de interação hidrofóbica.

[0027] Os anticorpos são tipicamente excretados pelas células produtoras. A coleta de tais anticorpos envolve tipicamente a coleta do sobrenadante celular seguido de várias etapas de purificação para remover restos ou agregados celulares cuja presença não é desejada. A clarificação da colheita pode envolver filtração, centrifugação ou uma combinação das mesmas do sobrenadante da cultura de células produtoras de anticorpos. A captura da proteína do anticorpo é tipicamente feita por purificação por afinidade.

Isso pode ser feito de várias maneiras.

Frequentemente, isso envolve a purificação com o uso de colunas que têm proteína A, proteína G ou proteína L recombinantes, que são proteínas bacterianas com uma alta capacidade de ligação específica conhecida com anticorpos.

Atualmente, estão disponíveis vários mutantes otimizados que se ligam mais especificamente aos anticorpos.

Por exemplo, uma proteína recombinante A está disponível, da qual domínios não essenciais foram removidos, uma proteína recombinante G está disponível com seu sítio de ligação à albumina deletado e também a proteína L modificada está disponível.

Os anticorpos ligados podem ser coletados por eluição para uma ou mais de tais colunas.

Cromatografia de troca aniônica e de troca catiônica podem ser usadas para purificar adicionalmente as preparações, por exemplo, purificar anticorpos biespecíficos ou multiespecíficos de meio-anticorpos e/ou anticorpos homodímeros e/ou outras impurezas relacionadas aos produtos de anticorpo não desejados, se houver.

A cromatografia de interação hidrofóbica (HIC, "hydrophobic interaction chromatography") é comumente usada como uma etapa de polimento alternativa nos processos de purificação de anticorpos.

A HIC oferece uma seletividade ortogonal à cromatografia de troca iônica e pode ser uma etapa eficaz para a depuração agregada e redução de proteína da célula hospedeira.

Na presente invenção, a HIC pode ser usada para propósitos analíticos, após a purificação dos dois ou mais anticorpos ou multímeros bi ou multiespecíficos é realizada, para então quantificar as duas ou mais espécies tendo tempo de retenção similar, de preferência essencialmente o mesmo tempo de retenção na IEX e/ou similar, de preferência essencialmente o mesmo pI. Dessa forma, a HIC é usada para quantificar as quantidades relativas das moléculas purificadas.

[0028] Uma resina de interação hidrofóbica é selecionada como a fase estacionária e o pH e/ou condutividade da fase móvel são modulados para alcançar a seletividade necessária. Os anticorpos atraem tipicamente carga positiva em pH mais baixo, que tem um efeito sobre sua polaridade e a hidrofobicidade de superfície geral. Podem ser selecionadas condições de pH que permitem a segregação dos dois ou mais anticorpos na preparação.

[0029] Em algumas modalidades, os anticorpos coletados são primeiro separados de outras proteínas por purificação por afinidade, de preferência, por extração de proteína A. Subsequentemente, os anticorpos purificados por afinidade são aplicados em uma coluna de troca aniônica sob condições que coletam os anticorpos na fração não adsorvida ou "flow-through". Os anticorpos podem ser subsequentemente aplicados em uma ou mais colunas de CIEX.

[0030] Um método preferencial para produzir ao menos dois anticorpos é pela produção dos mesmos por células como uma composição única que compreende os dois ou mais anticorpos.

[0031] Um método de produção de ao menos dois anticorpos compreende, de preferência, cultivar a célula hospedeira que produz os dois ou mais anticorpos, coletar o sobrenadante das células, tratar a colheita de sobrenadante em um processo de clarificação de colheita, de preferência, que compreende filtração com um corte de tamanho de poro que aprisiona agregados, como células ou restos celulares, e permite a passagem dos produtos de anticorpo. O anticorpo é coletado do fluido da cultura celular por cromatografia de afinidade com o uso de proteína A. O anticorpo ligado à resina de proteína é eluído da coluna cromatográfica após a exposição a baixo pH e o eluído é subsequentemente neutralizado com o uso de um tampão adequado.

[0032] Como usado na presente invenção, o termo "ponto isoelétrico (pI)" significa o pH no qual a carga líquida média da superfície da proteína, ou seja, o potencial da camada dupla elétrica da proteína, é 0. Em outras palavras, o termo significa o ponto no qual um grupo de proteínas é dissociado de modo que os números de cátions e ânions são iguais e, dessa forma, a carga líquida da proteína é 0.

[0033] Como usado aqui, o "pI" é calculado com base no aminoácido primário de acordo com a ferramenta ExPASy, ProtParam, usando-se os parâmetros padrão a partir da primeira data de depósito (data de prioridade) do presente pedido. O ProtParam é uma ferramenta que permite o cálculo de vários parâmetros físicos e químicos para uma dada proteína armazenada em Swiss-Prot ou TrEMBL ou para uma sequência de proteína inserida pelo usuário. Os parâmetros computados incluem o pI teórico. Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005) pp. 571-607.

[0034] A carga superficial líquida de uma proteína se altera com o pH de uma maneira que é ditada pelo pI de uma proteína. Em um pH igual ao pI de uma proteína, a proteína não terá carga líquida. Em um pH abaixo do pI, a proteína terá uma carga líquida positiva. Se o pH do tampão for elevado acima do pI de uma proteína, ela terá uma carga líquida negativa.

[0035] O pI de uma proteína pode ser determinado por sua sequência de aminoácidos primária e pode, dessa forma, ser calculado, um tampão pode então ser escolhido que assegura uma carga líquida conhecida para uma proteína de interesse. Uma resina de troca catiônica negativamente carregada é então escolhida quando a proteína de interesse carrega uma carga líquida negativa no pH de trabalho.

[0036] As proteínas com diferentes valores de pI terão diferentes graus de carga em um determinado pH e, assim, terão diferentes afinidades para os grupos de superfície positivamente carregados nas partículas do meio de troca aniônica; portanto, proteínas diferentes se ligarão à resina com diferentes resistências, facilitando sua separação. Dessa forma, ao gerar polipeptídeos heterodiméricos tendo pI distinto em relação ao homodímero e aos contaminantes do meio-anticorpo e/ou outras impurezas relacionadas aos produtos de anticorpo, os polipeptídeos heterodiméricos podem ser prontamente purificados com o uso de técnicas de eluição padrão, por exemplo, pela aplicação de um gradiente de pH, ou pela aplicação de um sal ou gradiente de condutividade em um pH fixo, ou uma combinação de um pH e um gradiente de condutividade. Nas modalidades da invenção, as partes constantes e as cadeias leves nos anticorpos têm essencialmente a mesma sequência nos diferentes anticorpos. Tais anticorpos tipicamente diferem essencialmente apenas na sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada. Para tais anticorpos, é tipicamente suficiente calcular o pI das regiões variáveis de cadeia pesada conforme indicado na presente invenção. Os cálculos e critérios são então definidos com o uso do pI das regiões variáveis da cadeia pesada em vez do pI do (meio-)anticorpo. O pI médio das regiões variáveis de cadeia pesada do anticorpo é indicativo do tempo de retenção do anticorpo em uma coluna de CIEX. Os anticorpos podem, se houver, ter domínios de heterodimerização iguais ou diferentes. Eles têm, de preferência, os mesmos domínios de heterodimerização. Os anticorpos podem, ainda, diferir um pouco na sequência de aminoácidos exata nas partes constantes.

[0037] Para as etapas de cromatografia de troca iônica (IEX), este é um processo que separa íons e moléculas polares com base em sua afinidade com o trocador de íons. Ela funciona em uma variedade de moléculas carregadas — incluindo proteínas grandes, nucleotídeos pequenos e aminoácidos. A IEX é frequentemente usada na purificação de proteínas. As proteínas solúveis em água e carregadas formam ligações iônicas com a fase estacionária insolúvel. As moléculas ligadas podem, então, ser eluídas e coletadas com o uso de um eluente com concentração mais alta de íons e/ou um pH diferente. A concentração de sal ou o pH podem ser alterados de maneira gradual; alterando-se gradualmente a fase móvel da corrida cromatográfica, ou uma combinação das mesmas. Os dois tipos de cromatografia iônica são cromatografia de troca aniônica e de troca catiônica. A cromatografia de troca catiônica (CIEX) é preferencial na presente invenção. A CIEX de anticorpos é, de preferência, realizada em um pH fisiológico. O pH está tipicamente em uma faixa de 5 a 9, de preferência, 6 a 8.

[0038] A CIEX é tipicamente usada quando a molécula de interesse é carregada positivamente sob o pH usado para cromatografia. A molécula é positivamente carregada porque o pH para a cromatografia é menor que o pI da molécula. Nesse tipo de cromatografia, a fase estacionária é negativamente carregada e moléculas positivamente carregadas são carregadas para serem atraídas pela mesma. Na cromatografia de troca aniônica, a fase estacionária é positivamente carregada e moléculas negativamente carregadas (o que significa que o pH para a cromatografia é maior que o pI) são carregadas para serem atraídas por ela.

[0039] Um anticorpo, como um anticorpo multiespecífico, é tipicamente ligado à coluna da IEX em um estágio de ligação sob condições que promovem a ligação do anticorpo, como um anticorpo multiespecífico, ao substrato. As colunas da IEX são, tipicamente, subsequentemente lavadas para remover o material não ligado. A eluição a partir da coluna é feita em um estágio de eluição. O tempo de retenção de um anticorpo, como um anticorpo multiespecífico, é tipicamente calculado a partir do início do estágio de eluição. É a quantidade de tempo que o anticorpo passa na coluna quando a fase de eluição começa. Se uma amostra contém vários compostos, cada composto na amostra tipicamente gastará uma quantidade diferente de tempo na coluna de acordo com sua composição química, isto é, cada um terá um tempo de retenção diferente. Os tempos de retenção são geralmente citados em unidades de segundos ou minutos.

[0040] Os tempos de retenção dos anticorpos, como anticorpos multiespecíficos, são, de preferência, essencialmente iguais em um método da invenção. Diferentes anticorpos podem ter diferentes tempos de retenção na mesma coluna e nas mesmas condições. Na presente invenção, descobriu-se que os anticorpos, como os anticorpos multiespecíficos, podem ser selecionados ou projetados para ter tempos de retenção na IEX que são suficientemente próximos para permitir a copurificação de dois ou mais anticorpos, como dois ou mais anticorpos multiespecíficos em uma única corrida de cromatografia IEX. Os tempos de retenção que se desviam 10% ou menos da média dos tempos de retenção dos anticorpos individuais estão tipicamente próximos o suficiente para permitir a copurificação de dois ou mais anticorpos, como dois ou mais anticorpos multiespecíficos, em uma única corrida de cromatografia IEX.

[0041] Um método de CIEX HPLC adequado para purificação e/ou análise de anticorpos de acordo com a invenção usa a série TSKgel SP- STAT (tamanho de partícula de 7 µm, diâmetro interno (I.D.) de 4,6 mM, comprimento (L) de 10 cm, Tosoh 21964) de colunas de troca iônica. As colunas são empacotadas com partículas de resina não porosa para a análise de velocidade e alta resolução, bem como isolamento, de biomoléculas. As partículas nas colunas TSKgel STAT contêm uma rede de acesso aberta de grupos de troca iônica em múltiplas camadas para capacidade de carregamento, enquanto o tamanho de partícula torna estas colunas adequadas para sistemas HPLC e FPLC.

[0042] Um método adequado envolve o equilíbrio de TSKgel SP- STAT (tamanho de partícula de 7 µm, L x I.D. de 10 cm x 4,6 mM, Tosoh 21964) com o uso de tampão A (tampão de fosfato de sódio, 25 mM, pH 6,0), após o que os anticorpos são deslocados da coluna mediante o aumento da concentração de sal e corrida de um gradiente de tampão B (25 mM de fosfato de sódio, 1 mM de NaCl, pH 6,0). A vazão é ajustada para 0,5 mL/min. A massa da amostra de injeção para as amostras de teste e controles é de 10 µg e os volumes de injeção de 10 a 100 µL. Os cromatogramas são analisados quanto aos padrões de pico, tempos de retenção e áreas de pico dos principais picos observados com base nos resultados de 220 nm. O método pode ser escalonado para quantidades maiores de anticorpo.

[0043] Gráficos típicos de corridas de cromatografia CIEX de preparações de anticorpo são representados na Figura 2. Os anticorpos para esta corrida foram coletados de células transfectadas conforme indicado nos exemplos e purificados a partir de muitas outras proteínas no meio através de uma coluna com proteína A. Os anticorpos foram eluídos por eluição de ácido seguido de neutralização e troca de tampão para PBS pH 7,4, conforme indicado nos exemplos. Uma amostra da preparação do anticorpo foi subsequentemente carregada na coluna de CIEX. Após a lavagem, as proteínas associadas foram eluídas pela aplicação de um gradiente de sal. As condições da CIEX foram as mesmas para a amostra na Figura 2A e na Figura 2B. O tempo de retenção é calculado para o topo do pico do anticorpo biespecífico. O tempo de retenção de dois ou mais anticorpos, como anticorpos multiespecíficos, se desvia, de preferência 10% ou menos da média dos tempos de retenção dos dois ou mais anticorpos. Um desvio de mais de 10% resulta tipicamente em separação ineficiente dos anticorpos dos meio-anticorpos e, opcionalmente, no caso de anticorpos multiespecíficos, dos homodímeros e/ou das outras impurezas relacionadas aos produtos de anticorpo. Em uma modalidade preferencial, os tempos de retenção de dois ou mais anticorpos se desviam 9% ou menos da média dos tempos de retenção dos dois anticorpos. De preferência, em 8%, 7%, 6%, ou 5% ou menos da média dos tempos de retenção dos dois ou mais anticorpos. Em uma modalidade preferencial, os tempos de retenção de dois ou mais anticorpos se desviam 4% ou menos da média dos tempos de retenção dos dois ou mais anticorpos. De preferência 3% ou menos, de preferência 2% ou menos. Tempos de retenção cada vez mais similares tipicamente permitem a separação cada vez mais eficiente dos anticorpos multiespecíficos dos meio-anticorpos e, opcionalmente, dos homodímeros e/ou das outras impurezas relacionadas aos produtos de anticorpo e, dessa forma, permitem uma coleta mais limpa dos dois anticorpos em frações da coluna de IEX.

[0044] Em meios e métodos da invenção, a média dos tempos de retenção dos dois ou mais anticorpos, como os dois ou mais anticorpos multiespecíficos, é calculada para os anticorpos a serem copurificados ou coletados. Dessa forma, nas modalidades em que os anticorpos a serem purificados são anticorpos multiespecíficos, as médias dos tempos de retenção dos dois ou mais anticorpos são calculadas com base nos anticorpos multiespecíficos. Os tempos de retenção de anticorpos que não devem ser coletados, como os anticorpos homodímeros, não são usados para o cálculo da média.

[0045] Os anticorpos, como os anticorpos multiespecíficos, podem ser selecionados para copurificação em um método da invenção pela seleção de anticorpos, como anticorpos multiespecíficos que têm essencialmente os mesmos tempos de retenção de IEX. sob as condições usadas para a IEX. Os anticorpos, como anticorpos multiespecíficos, também podem ser adaptados através da modificação adequada de uma ou mais regiões variáveis para ter essencialmente os mesmos tempos de retenção de IEX sob condições iguais ou similares usadas para a IEX.

[0046] Em uma modalidade, os anticorpos produzidos que se busca copurificar, como os anticorpos bi e/ou multiespecíficos, têm pIs similares. O ponto isoelétrico (pI) de ao menos dois dos ditos anticorpos difere, de preferência, em 0,4 unidade, 0,3, 0,2 e, de preferência, 0,1 unidade ou menos do pI médio dos ditos ao menos dois anticorpos. O pI de cada um dos ditos pelo menos dois anticorpos difere, de preferência, em 0,25 unidade ou menos um do outro.

[0047] Uma pequena ou nenhuma diferença nos pIs dos anticorpos tipicamente permite uma boa copurificação. Vantajosamente, os pIs dos respectivos meio-anticorpos em um anticorpo diferem mais da média. Esta diferença facilita uma boa separação dos meio-anticorpos dos anticorpos "co"-migradores completos na etapa de cromatografia CIEX.

[0048] Em modalidades nas quais os anticorpos que se busca copurificar são anticorpos bi ou multiespecíficos, é preferencial que os pIs dos domínios variáveis dentro de cada um dos anticorpos que se busca copurificar sejam diferentes em mais de 0,2, de preferência, 0,3, de preferência, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 1,0, 1,2, 1,4, de preferência, mais de 1,8 ou 2,0 unidades da média dos pIs dos domínios variáveis dos outros anticorpos a serem copurificados. Nesta modalidade, a diferença nos pIs dos domínios variáveis em um anticorpo é, de preferência, ao menos 0,2 unidade maior que a diferença entre "x" e "y", de preferência, é ao menos 0,3, 0,4, 0,5, de preferência ao menos 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 2,0 ou 2,5 maior que a diferença entre "x" e "y"", em que "x" é a média dos pIs dos dois domínios variáveis de um primeiro dos ditos anticorpos e "y" é a média dos pIs dos dois domínios variáveis de um segundo dos ditos anticorpos. Uma diferença, conforme mencionado nos pIs dos domínios variáveis, dentro de um anticorpo é tipicamente indicativa de uma boa separação das impurezas relacionadas aos produtos de anticorpo dos anticorpos que se busca copurificar e/ou de uma boa separação dos anticorpos monoespecíficos.

[0049] Algumas composições compreendendo dois ou mais anticorpos bi ou multiespecíficos têm regiões constantes e cadeias leves que são similares na sequência de aminoácidos, ou têm uma sequência de aminoácidos essencialmente idêntica. Esses dois ou mais anticorpos bi e/ou multiespecíficos tipicamente diferem uns dos outros essencialmente apenas na sequência de aminoácidos dos domínios variáveis, ou essencialmente apenas nas regiões variáveis de cadeia pesada. Em tais casos, frequentemente não é necessário determinar o pI de todo o anticorpo. Em vez disso, o pI dos domínios variáveis e/ou os pIs das regiões variáveis de cadeia pesada podem ser determinados. Isto fornece um meio para avaliar se os anticorpos podem migrar para perto uns dos outros em uma etapa de cromatografia CIEX, em outras palavras, se os anticorpos têm tempos de retenção que são suficientemente iguais para permitir a copurificação.

[0050] Em uma modalidade de um método ou composição conforme aqui revelado, dois ou mais anticorpos bi ou multiespecíficos têm regiões constantes e cadeias leves que têm a mesma sequência de aminoácidos, ou têm sequências de aminoácidos essencialmente idênticas.

Os dois ou mais anticorpos bi ou multiespecíficos podem ser copurificados em uma etapa de cromatografia CIEX quando a média dos pIs dos domínios variáveis em cada anticorpo difere em 0,7 unidade ou menos do pl médio dos domínios variáveis dos respectivos anticorpos que se busca copurificar.

Em uma modalidade preferencial, a média "x" dos pIs dos dois domínios variáveis de um primeiro dos ditos anticorpos e a média "y" dos pIs dos dois domínios variáveis de um segundo dos ditos anticorpos diferem em 0,6 unidade ou menos, de preferência 0,5 unidade ou menos diferente da média de "x" e "y" do primeiro e do segundo anticorpos que se busca copurificar. "x" e "y" são, de preferência, 0,4; de preferência 0,3; de preferência, 0,2 e, de preferência, 0,1 unidade ou menos diferente da média de "x" e "y" do primeiro e do segundo anticorpos que se busca copurificar.

Tais anticorpos bi e/ou multiespecíficos têm, tipicamente, tempos de retenção que são essencialmente iguais.

Nesta modalidade, as regiões constantes dos anticorpos são essencialmente iguais.

Os pIs e particularmente as médias "x" e "y" de tais anticorpos são indicativos para os pIs dos respectivos anticorpos como um todo.

Nesta modalidade, é preferencial que os pIs dos domínios variáveis dentro de cada um dos anticorpos que se busca copurificar diferem em mais de 0,2, de preferência, 0,3, de preferência, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 1,0, 1,2, 1,4, de preferência, mais de 1,8 ou 2,0 unidades da média dos pIs dos domínios variáveis no anticorpo.

Nesta modalidade, a diferença nos pIs dos domínios variáveis em um anticorpo é, de preferência, ao menos 0,2 unidade maior que a diferença entre "x" e "y", de preferência,

é ao menos 0,3, 0,4, 0,5, de preferência ao menos 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 2,0 ou 2,5 maior que a diferença entre "x" e "y". Uma diferença, conforme mencionado nos pIs dos domínios variáveis dentro de um anticorpo, é tipicamente indicativa de uma boa separação dos meio- anticorpos dos anticorpos que se busca copurificar e/ou de uma boa separação dos anticorpos monoespecíficos.

[0051] Em uma modalidade de um método ou composição conforme aqui revelado, dois ou mais anticorpos bi ou multiespecíficos têm regiões constantes e cadeias leves que têm a mesma sequência de aminoácidos, ou têm sequências de aminoácidos essencialmente idênticas. Os dois ou mais anticorpos bi ou multiespecíficos podem ser copurificados em uma etapa de cromatografia CIEX quando os pIs médios das regiões variáveis de cadeia pesada em cada anticorpo diferem em 0,7 unidade ou menos do pI médio das regiões variáveis de cadeia pesada dos respectivos anticorpos que se busca copurificar. Em uma modalidade preferencial, a média "m" dos pIs das duas regiões variáveis de cadeia pesada de um primeiro dos ditos anticorpos e a média "n" dos pIs das duas regiões variáveis de cadeia pesada de um segundo dos ditos anticorpos diferem em 0,6 unidade ou menos, de preferência, 0,5 unidade ou menos diferente da média de "m" e "n" do primeiro e do segundo anticorpos que se busca copurificar. "m" e "n" são de preferência 0,4; de preferência 0,3; de preferência, 0,2 e, de preferência, 0,1 unidade ou menos diferente da média de "m" e "n" do primeiro e do segundo anticorpos que se busca copurificar. Tais anticorpos bi e/ou multiespecíficos têm, tipicamente, tempos de retenção que são essencialmente iguais. Nesta modalidade, as regiões constantes dos anticorpos são essencialmente iguais. Os pIs e particularmente as médias "m" e "n" de tais anticorpos são indicativos para os pIs dos respectivos anticorpos como um todo. Nesta modalidade, é preferencial que os pIs das regiões variáveis de cadeia pesada dentro de cada um dos anticorpos que se busca copurificar diferem em mais de 0,2, de preferência, 0,3, de preferência, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 1,0, 1,2, 1,4, de preferência, mais de 1,8 ou 2,0 unidades da média dos pIs das regiões variáveis de cadeia pesada no anticorpo. Nesta modalidade, a diferença nos pIs das regiões variáveis de cadeia pesada em um anticorpo é, de preferência, ao menos 0,2 unidade maior que a diferença entre "x" e "y", de preferência, é ao menos 0,3, 0,4, 0,5, de preferência ao menos 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 2,0 ou 2,5 maior que a diferença entre "m" e "n". Uma diferença, conforme mencionado nos pIs das regiões variáveis de cadeia pesada dentro de um anticorpo, é tipicamente indicativa de uma boa separação dos meio-anticorpos dos anticorpos que se busca copurificar e/ou de uma boa separação dos anticorpos monoespecíficos.

[0052] Os anticorpos, como os anticorpos multiespecíficos, podem ter ou ser selecionados para ter combinações de cadeia pesada e leve (meio-anticorpos) ou homodímeros (por exemplo, anticorpos monoespecíficos) ou outras impurezas relacionadas aos produtos de anticorpo que têm tempos de retenção que são significativamente diferentes dos tempos de retenção dos anticorpos completos ou anticorpos desejados, como os anticorpos multiespecíficos, sob as condições da IEX usadas. Em modalidades nas quais a célula expressa uma cadeia leve comum, a seleção é tipicamente na cadeia pesada. As cadeias pesadas podem ser modificadas de modo que os meio- anticorpos ou os homodímeros tenham tempos de retenção muito diferentes. Em uma modalidade preferencial, os tempos de retenção dos meio-anticorpos e/ou dos homodímeros diferem em mais de 10% da média dos tempos de retenção dos respectivos anticorpos ou anticorpos multiespecíficos. Em uma modalidade preferencial, a média dos pls de combinações individuais de cadeia pesada e leve de um anticorpo que não se busca copurificar difere em mais de 0,5 unidade da média dos pls das ditas cadeias pesada e leve dos ao menos dois anticorpos a serem copurificados.

[0053] A invenção fornece adicionalmente uma composição que compreende 2 a 10 anticorpos recombinantes obteníveis por um método conforme descrito aqui. Também é fornecida uma composição que compreende 2 a 10 anticorpos recombinantes, caracterizados pelo fato de que os tempos de retenção da IEX de ao menos dois dos ditos anticorpos são essencialmente iguais.

[0054] A invenção fornece adicionalmente uma composição que compreende 2 a 10 anticorpos recombinantes, caracterizados pelo fato de que o pI de ao menos dois dos ditos anticorpos difere em 0,4 unidade, 0,3, 0,2 e, de preferência, 0,1 unidade ou menos do pI médio dos ditos ao menos dois anticorpos. O pI de cada um dos ditos pelo menos dois anticorpos difere, de preferência, em 0,25 unidade ou menos um do outro.

[0055] A invenção fornece adicionalmente uma composição que compreende 2 a 10 anticorpos recombinantes caracterizados pelo fato de que a média "x" dos pIs dos dois domínios variáveis do primeiro anticorpo e a média "y" dos pIs dos dois domínios variáveis do segundo anticorpo são 0,7, 0,6 e, de preferência, 0,5 unidade ou menos diferente da média de "x" e "y" do primeiro e do segundo anticorpos que se busca copurificar. "x" e "y" são, de preferência, 0,4; de preferência 0,3; de preferência, 0,2 e, de preferência, 0,1 unidade ou menos diferente da média de "x" e "y" do primeiro e do segundo anticorpos que se busca copurificar. Tais anticorpos, como os anticorpos multiespecíficos, tipicamente têm tempos de retenção que são essencialmente iguais. Nesta modalidade, as regiões constantes dos anticorpos são essencialmente iguais. Os pIs e particularmente a média dos pIs dos diferentes domínios variáveis do anticorpo, cada um compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, são indicativos do pI do anticorpo como um todo.

[0056] A invenção fornece adicionalmente uma composição que compreende 2 a 10 anticorpos recombinantes caracterizados pelo fato de que a média "m" dos pIs das duas regiões variáveis de cadeia pesada dos dois domínios variáveis do primeiro anticorpo e a média "n" dos pIs das duas regiões variáveis de cadeia pesada do dois domínios variáveis do segundo anticorpo são 0,7, 0,6 e, de preferência, 0,5 unidade ou menos diferente da média de "m" e "n" do primeiro e do segundo anticorpos que se busca copurificar. "m" e "n" são de preferência 0,4; de preferência 0,3; de preferência, 0,2 e, de preferência, 0,1 unidade ou menos diferente da média de "m" e "n" do primeiro e do segundo anticorpos que se busca copurificar. Tais anticorpos, como os anticorpos multiespecíficos, tipicamente têm tempos de retenção que são essencialmente iguais. Nesta modalidade, as regiões constantes e as regiões variáveis da cadeia leve dos anticorpos são essencialmente iguais. Os pIs e particularmente a média dos pIs das diferentes regiões variáveis de cadeia pesada do anticorpo são indicativos do pI do anticorpo como um todo.

[0057] Em uma modalidade preferencial, os tempos de retenção de IEX e/ou o pI são, de preferência, essencialmente iguais para todos os anticorpos a serem coletados na composição. Em uma modalidade preferencial, ao menos dois dos anticorpos são anticorpos biespecíficos. De preferência, ao menos dois dos ditos anticorpos compartilham uma cadeia pesada idêntica.

[0058] Em algumas modalidades, a região variável da cadeia leve comum de uma ou ambas as regiões de ligação VH/VL compreende um segmento V da região variável IgVκ1-39*01 da linhagem germinativa. Em certas modalidades, a região variável de cadeia leve de uma ou ambas as regiões de ligação VH/VL compreende o segmento V de cadeia leve kappa IgVκ1-39*01. IgVκ1-39 é uma forma abreviada de gene 1-39 da imunoglobulina variável kappa. O gene também é conhecido como imunoglobulina kappa variável 1-39; IGKV139; IGKV1-39. IDs externos do gene são HGNC: 5740; Gene Entrez: 28930; Ensembl: ENSG00000242371. A sequência de aminoácidos para a região V é fornecida na SEQ ID NO: 25. A região V pode ser combinada com uma de cinco regiões J. As regiões J preferenciais são jk1 e jk5, e as sequências unidas são indicadas como IGKV1-39/jk1 e IGKV1-39/jk5; nomes alternativos são IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 ou IgVκ1-39*01/IGJκ5*01 (nomenclatura de acordo com o banco de dados IMGT www@imgt.org). Em certas modalidades, a região variável de cadeia leve de uma ou ambas as regiões de ligação VH/VL compreende a cadeia leve kappa IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 ou IgVκ1-39*01/IGJκ1*05 (SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27, respectivamente).

[0059] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve de uma ou ambas as regiões de ligação VH/VL de um anticorpo biespecífico compreende um LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos QSISSY (SEQ ID NO: 22), um LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos AAS, e um LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos QQSYSTP (SEQ ID NO: 24) (isto é, as CDRs de IGKV1-39 de acordo com IMGT). Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve de uma ou ambas as regiões de ligação VH/VL de um anticorpo biespecífico compreende um LCDR1 que compreende a sequência de aminoácidos QSISSY (SEQ ID NO: 22), um LCDR2 que compreende a sequência de aminoácidos AASLQS (SEQ ID NO: 23), e um LCDR3 que compreende a sequência de aminoácidos QQSYSTP (SEQ ID NO: 24).

[0060] Em algumas modalidades, uma ou ambas as regiões de ligação VH/VL de um anticorpo biespecífico compreendem uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, de preferência pelo menos 95%, com mais preferência pelo menos 97%, com mais preferência pelo menos 98%, com mais preferência pelo menos 99 idêntica ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, uma ou ambas as regiões de ligação VH/VL de um anticorpo biespecífico compreendem uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, de preferência pelo menos 95%, com mais preferência pelo menos 97%, com mais preferência pelo menos 98%, com mais preferência pelo menos 99 idêntica ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 27.

[0061] Por exemplo, em algumas modalidades, a cadeia leve variável de uma ou ambas as regiões de ligação VH/VL de um anticorpo biespecífico pode ter de 0 a 10, de preferência de 0 a 5 inserções, deleções, substituições, adições de aminoácidos ou uma combinação delas em relação à SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 27. Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve de uma ou ambas as regiões de ligação VH/VL de um anticorpo biespecífico compreende de 0 a 9, de 0 a 8, de 0 a 7, de 0 a 6, de 0 a 5, de 0 a 4, de preferência de 0 a 3, de preferência de 0 a 2, de preferência de 0 a 1 e de preferência 0 inserções, deleções, substituições, adições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos indicada, ou uma combinação delas.

[0062] Em outras modalidades, a região variável de cadeia leve de uma ou ambas as regiões de ligação VH/VL de um anticorpo biespecífico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 27. Em certas modalidades, ambas as regiões de ligação VH/VL de um anticorpo biespecífico compreendem regiões VL idênticas. Em uma modalidade, a VL de ambas as regiões de ligação VH/VL de um anticorpo biespecífico compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26. Em uma modalidade, a VL de ambas as regiões de ligação VH/VL de um anticorpo biespecífico compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 27.

[0063] Os anticorpos biespecíficos, como aqueles revelados nos métodos da presente invenção, podem ser fornecidos em vários formatos. Muitos formatos diferentes de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Por exemplo, formatos de anticorpos biespecíficos que não são anticorpos clássicos com duas combinações de VH/VL, têm ao menos um domínio variável que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve. Esse domínio variável pode ser ligado a um fragmento Fv de cadeia simples, monobloco, um VH e um fragmento Fab que fornece a segunda atividade de ligação.

[0064] Os anticorpos biespecíficos, como aqueles revelados nos métodos aqui fornecidos, são geralmente da subclasse de IgG humana (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4). Em certas modalidades, os anticorpos são da subclasse de IgG1 humano. Anticorpos IgG de comprimento total são preferenciais por causa de sua meia-vida favorável e por razões de baixa imunogenicidade. Consequentemente, em certas modalidades, os anticorpos biespecíficos são moléculas de IgG de comprimento total. Em uma modalidade, os anticorpos biespecíficos são moléculas de IgG1 de comprimento total.

[0065] Em certas modalidades, os anticorpos compreendem um fragmento cristalizável (Fc). O Fc dos anticorpos biespecíficos são, de preferência, compreendidos de uma região constante humana. A região constante ou Fc dos anticorpos biespecíficos pode conter uma ou mais,

de preferência, não mais que 10, de preferência, não mais que 5 diferenças de aminoácidos em relação à região constante de um anticorpo humano de ocorrência natural. Por exemplo, em certas modalidades, cada braço de Fab dos anticorpos biespecíficos pode incluir adicionalmente uma região Fc que compreende modificações que promovem a formação do anticorpo biespecífico, modificações que afetam funções efetoras mediadas por Fc e/ou outros recursos aqui descritos.

[0066] Em um aspecto, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende dois ou mais anticorpos conforme aqui definido e um veículo farmaceuticamente aceitável. Para uso na presente invenção, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora governamental ou listado na Farmacopeia Americana ou em outra geralmente reconhecida para uso em animais, particularmente em seres humanos, e inclui qualquer e todos os solventes, sais, meios de dispersão, revestimentos, agentes bactericidas e fungicidas, agentes isotônicos e retardantes de absorção, e similares que sejam fisiologicamente compatíveis. O termo "veículo" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o composto é administrado. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como água e óleos, inclusive aqueles derivados de petróleo, de origem animal, vegetal ou sintéticos, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim, glicerol polietileno glicol ricinoleato, e similares. Água ou solução aquosa de solução salina e dextrose aquosa e soluções de glicerol podem ser usadas como veículos, particularmente para soluções injetáveis. As composições líquidas para administração parenteral podem ser formuladas para administração por injeção ou infusão contínua. As vias de administração por injeção ou infusão incluem via intravesical, intratumoral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratecal e subcutânea. Dependendo da via de administração (por exemplo, por via intravenosa, subcutânea, intra-articular e similares), o composto ativo pode ser revestido com um material para proteger o composto contra a ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.

[0067] As composições farmacêuticas adequadas para a administração a pacientes humanos são tipicamente formuladas para administração parenteral, por exemplo, em um veículo líquido ou adequado para reconstituição em solução ou suspensão líquida para administração intravenosa. As composições podem ser formuladas em forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem.

[0068] Também estão incluídas preparações sólidas que se destinam a conversão, pouco antes do uso, em preparações líquidas para administração oral ou parenteral. Tais formas líquidas incluem soluções, suspensões e emulsões.

[0069] Um "anticorpo biespecífico" é um anticorpo conforme descrito aqui, em que um domínio do anticorpo se liga a um primeiro antígeno enquanto um segundo domínio do anticorpo se liga a um segundo antígeno, em que os ditos primeiro e segundo antígenos não são idênticos. O termo "anticorpo biespecífico" também abrange anticorpos em que uma combinação de região variável de cadeia pesada/região variável de cadeia leve (VH/VL) se liga a um primeiro epítopo em um antígeno e uma segunda combinação de região VH/VL que se liga a um segundo epítopo. O termo inclui adicionalmente anticorpos nos quais um VH é capaz de reconhecer especificamente um primeiro antígeno e o VL, emparelhada com o VH em uma região variável de imunoglobulina, é capaz de reconhecer especificamente um segundo antígeno. O par VH/VL resultante se ligará ao antígeno 1 ou ao antígeno 2. Os denominados "anticorpos dois em um", descritos, por exemplo, em WO 2008/027236, WO 2010/108127 e Schaefer et al (Cancer Cell 20, 472 a 486, outubro de 2011). Um anticorpo biespecífico, de acordo com a presente invenção, não é limitado a qualquer formato biespecífico ou método para produzi-lo em particular.

[0070] "Porcentagem (%) de identidade", em relação às sequências de ácidos nucleicos ou de aminoácidos da presente invenção, é definida como a porcentagem de resíduos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos em uma sequência selecionada, após o alinhamento das sequências para propósitos de comparação ótima. A porcentagem de identidade de sequência comparando-se sequências de ácidos nucleicos é determinada usando a aplicação AlignX do software Vector NTI Program Advance 10.5.2 usando as configurações padrão, que empregam um algoritmo ClustalW modificado (Thompson, J.D., Higgins, D.G., e Gibson T.J. (1994) Nuc. Acid Res. 22: 4673-4680), a matriz de escore swgapdnarnt, uma penalidade por abertura de lacuna de 15 e uma penalidade por extensão de lacuna de 6,66. As sequências de aminoácidos são alinhadas com a aplicação AlignX do software Vector NTI Program Advance 11.5.2 usando as configurações padrão que empregam um algoritmo ClustalW modificado (Thompson, J.D., Higgins, D.G., e Gibson T.J., 1994), a matriz de escore blosum62mt2, uma penalidade por abertura de lacuna de 10 e uma penalidade por extensão de lacuna de 0,1.

[0071] O termo "cadeia leve comum" como usado aqui se refere às duas cadeias leves (ou a parte de VL delas) no anticorpo biespecífico. As duas cadeias leves (ou a parte de VL delas) podem ser idênticas ou ter algumas diferenças na sequência de aminoácidos, enquanto a especificidade da ligação do anticorpo de comprimento total não é afetada. Os termos "cadeia leve comum", "VL comum", "cadeia leve simples", "VL simples", com ou sem a adição do termo "rearranjado", são todos usados aqui de forma intercambiável. "Comum" também se refere aos equivalentes funcionais da cadeia leve da qual a sequência de aminoácidos não é idêntica. Existem muitas variantes da dita cadeia leve, em que mutações (deleções, substituições, inserções e/ou adições) estão presentes e que não influenciam a formação de regiões de ligação funcional. A cadeia leve da presente invenção pode também ser uma cadeia leve, conforme especificado neste documento, que tem de 0 a 10, de preferência, de 0 a 5 inserções, deleções, substituições ou adições de aminoácidos, ou uma combinação deles. Por exemplo, dentro do escopo da definição de cadeias leves comuns, como usado aqui, está a preparação ou descoberta de cadeias leves que não são idênticas, mas que ainda assim são funcionalmente equivalentes, por exemplo, pela introdução e teste de alterações conservadoras de aminoácidos, alterações de aminoácidos em regiões que não contribuem ou que contribuem apenas parcialmente para a especificidade de ligação quando emparelhadas com a cadeia pesada, e similares. O termo "IgG de comprimento total" ou "anticorpo de comprimento total", de acordo com a invenção, é definido como compreendendo essencialmente um IgG completo, que, entretanto, não tem necessariamente todas as funções de um IgG intacto. Para evitar dúvidas, um IgG de comprimento total contém duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Cada cadeia contém as regiões constante (C) e variável (V), que podem ser decompostas em domínios designados CH1, CH2, CH3, VH e CL, VL. Um anticorpo IgG se liga ao antígeno através dos domínios da região variável contidos na porção Fab, e após a ligação, pode interagir com moléculas e células do sistema imune através dos domínios constantes, principalmente através da porção Fc. Anticorpos de comprimento total de acordo com a invenção abrangem moléculas de IgG em que podem estar presentes mutações que fornecem as características desejadas. O IgG de comprimento total não deve ter deleções de porções substanciais de qualquer uma das regiões. Entretanto, as moléculas de IgG em que um ou vários resíduos de aminoácidos são deletados, sem alterar essencialmente as características de ligação da molécula de IgG resultante, são abrangidas pelo termo "IgG de comprimento total". Por exemplo, tais moléculas de IgG podem ter uma deleção entre 1 e 10 resíduos de aminoácidos, de preferência em regiões não CDR, sendo que os aminoácidos deletados não são essenciais para a especificidade de ligação da IgG.

[0072] Como um anticorpo reconhece tipicamente um epítopo de um antígeno, e tal epítopo também pode estar presente em outros compostos, os anticorpos de acordo com a presente invenção, que "reconhecem especificamente" um antígeno podem também reconhecer outros compostos, se tais outros compostos contiverem o mesmo tipo de epítopo. Portanto, os termos "reconhece especificamente", em relação a um antígeno e interação com anticorpo, não excluem a ligação dos anticorpos a outros compostos que contêm o mesmo tipo de epítopo.

[0073] O termo "epítopo" ou "determinante antigênico" se refere a um sítio em um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo se liga especificamente. Os epítopos podem ser formados tanto a partir de aminoácidos contíguos como de aminoácidos não contíguos justapostos pelo enrolamento terciário de uma proteína (chamados epítopos lineares e conformacionais). Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos lineares são tipicamente mantidos sob exposição a solventes desnaturantes, enquanto epítopos formados por enovelamento terciário, a conformação é tipicamente perdida sob tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo pode tipicamente incluir 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos em uma conformação espacial exclusiva. Os métodos de determinação da conformação espacial de epítopos são conhecidos dos versados na técnica e incluem técnicas do estado da técnica, por exemplo, cristalografia de raio X, HDX-MS e ressonância magnética nuclear bidimensional, pepscan, e varredura de alanina em função da natureza do epítopo (consulte, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).

[0074] Com o propósito de clareza e de uma descrição concisa, as características são descritas na presente invenção como parte de modalidades iguais ou separadas; entretanto, será entendido que o escopo da invenção pode incluir modalidades que têm combinações de todas ou algumas das características descritas.

[0075] Para que a presente descrição possa ser mais facilmente compreendida, certos termos são definidos primeiramente. Definições adicionais são apresentadas ao longo de toda a descrição detalhada. Exceto quando especificado em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado comumente compreendido pelo versado na técnica, e são empregados métodos convencionais de imunologia, química de proteínas, bioquímica, técnicas de DNA recombinante e farmacologia.

[0076] Como usado aqui, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referências no plural a menos que o contexto determine claramente o contrário. O uso do termo "incluir" bem como outras formas, como "incluem", "inclui" e "incluído" não é limitador.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1

[0077] Uma representação esquemática de modalidades em que a composição compreende dois anticorpos biespecíficos que compartilham um braço comum. A figura mostra anticorpos com cadeias pesadas (1) e cadeias leves (4). As quatro cadeias pesadas têm três regiões variáveis diferentes (5, 6 e 7). A cadeia pesada que tem a região variável compartilhada (5) tem uma parte (3) de um domínio de heterodimerização. As cadeias pesadas com regiões variáveis (6) e (7) têm a parte compatível do domínio de heterodimerização (2). O pareamento preferencial das regiões de heterodimerização (2) e (3) pode direcionar a formação de anticorpos biespecíficos. Figura 2

[0078] Painel A: Perfil da CIEX a 220 nm do anticorpo biespecífico PB4516, número de produção 8 (p08). Painel B: Perfil da CIEX a 220 nm do anticorpo biespecífico PB6892, número de produção 4 (p04). Figura 3

[0079] Figura 3a: Perfil da CIEX a 220 nm do anticorpo biespecífico PB4516, número de produção 10 (p10).

[0080] Figura 3b: Perfil da CIEX a 220 nm do anticorpo biespecífico PB11244, número de produção 1 (p01).

[0081] Figura 3c: Dois anticorpos biespecíficos por caixa são identificados na coluna PB (PBXXXX(X)). A região variável de cadeia pesada para PB11244 e PB4516 é indicada nas colunas Alvo 1 e Alvo 2. A sequência da cadeia leve é a mesma para todos os anticorpos e tem a sequência de aminoácidos da cadeia leve comum IgKV1*39/jk1 da SEQ ID NO: 26. O pI calculado com a ferramenta ExPASy, ProtParam é indicado para cada região variável de cadeia pesada nas colunas pI. A diferença de pI entre as duas regiões variáveis de cadeia pesada é indicada na última coluna, demonstrando que a média do diferencial de pI de VH entre PB11244 e PB4516 é 0,08. Figura 4

[0082] Perfil da CIEX a 220 nm de uma preparação de anticorpo da colônia individual cp12 do grupo FST2. O perfil da CIEX mostra um pico agudo de anticorpos que coeluíram PB4516 e PB11244. O perfil mostra que a amostra contém uma quantidade limitada de impurezas relacionadas ao produto. E também mostra a boa separação entre os anticorpos biespecíficos que eluíram juntos e as impurezas relacionadas ao produto que migraram separadamente. Figura 5

[0083] Perfil da CIEX a 220 nm de uma preparação de anticorpo da colônia CP07. A colônia foi escolhida a partir de uma coleção de colônias individuais de colônia única FST2cp09. A segunda subclonagem foi feita para assegurar que a linhagem celular FST2cp09-cp07 era uma linhagem celular clonal. O ELISA específico para o anticorpo biespecífico indicou a presença de 743 µg/mL do anticorpo biespecífico para EGFR/HER2, PB11244 e 1134 µg/mL do anticorpo biespecífico para EGFR/HER3, PB4516. Figura 6

[0084] Tempo de retenção de homodímeros de anticorpo (PGXXXX) tendo dois domínios variáveis idênticos. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada tem a sequência indicada para o MF na Figura 8 e uma cadeia leve comum IgKV1*39/jk1 da SEQ ID NO: 26.

[0085] Figura 7. Dois anticorpos biespecíficos por caixa são identificados na coluna PB (PBXXXX(X)). A região variável de cadeia pesada (MFXXXX) de cada um dos anticorpos biespecíficos é indicada nas colunas Alvo 1 e Alvo 2. A sequência da cadeia leve é a mesma para todos os anticorpos e tem a sequência de aminoácidos da cadeia leve comum IgKV1*39/jk1 da SEQ ID NO: 26. O pI calculado com a ferramenta ExPASy, ProtParam é indicado para cada região variável de cadeia pesada nas colunas pI. A diferença de pI entre as duas regiões variáveis de cadeia pesada e o tempo de retenção medido é indicada nas duas últimas colunas. Os tempos de retenção medidos e o pI calculado e o pI médio indicam que o par de anticorpos biespecíficos pode coeluir eficientemente em cromatografia CIEX. Os anticorpos têm IgG1 com regiões constantes e uma cadeia leve comum. A cadeia pesada com a região variável da cadeia pesada compartilhada (MF idêntica) com a cadeia pesada CH3 DE ou a cadeia pesada KK é indicada. Os tempos de retenção são indicados para cromatografia CIEX realizada em cada anticorpo biespecífico, com uma condição exemplificadora para cromatografia CIEX descrevendo a seção de materiais e métodos. Muitas outras condições de cromatografia CIEX resultarão em tempos de retenção adequados entre os pares de anticorpos biespecíficos mencionados que têm os valores de pI fornecidos. Figura 8

[0086] Sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada (MFXXXX) dos respectivos anticorpos e CDRs de regiões variáveis de cadeia leve e sequência de aminoácidos de regiões variáveis de cadeia leve comuns. Exemplos Exemplo 1 Materiais e métodos Linhagens celulares

[0087] HEK293 e CHO-K1 foram mantidas em meio de crescimento.

Geração de anticorpos biespecíficos

[0088] Anticorpos biespecíficos foram gerados com o uso da tecnologia proprietária CH3 para assegurar a heterodimerização e a formação eficientes de um anticorpo biespecífico. A tecnologia CH3 usa mutações pontuais baseadas em carga na região CH3 para permitir o pareamento eficiente de duas moléculas de cadeia pesada diferentes, conforme anteriormente descrito (PCT/NL2013/050294; publicado como WO 2013/157954 A1).

[0089] Um gene VH foi clonado em um de dois vetores IgG1 de cadeia principal diferentes. Dependendo do parceiro de ligação, a VH é clonada em uma cadeia principal de IgG1 que compreende a variante CH3 com a variante de heterodimerização "DE" ou na cadeia principal de IgG1 que compreende a variante CH3 com a variante de heterodimerização "KK" complementar. No caso de anticorpos bi ou multiespecíficos em que dois ou mais anticorpos compartilham uma cadeia pesada. A cadeia compartilhada tem, de preferência, a variante de heterodimerização CH3 "DE" (também chamada de cadeia pesada de DE) e as duas ou mais cadeias pesadas únicas têm a variante de heterodimerização CH3 "KK" (também chamada de cadeias pesadas KK).

[0090] Células HEK293 foram transientemente transfectadas com as misturas de DNA-FUGENE e adicionalmente cultivadas. Sete dias após a transfecção, o sobrenadante foi coletado e o meio foi renovado. Quatorze dias após os sobrenadantes de transfecção foram combinados e filtrados através de 0,22 µM. O sobrenadante estéril foi armazenado a 4°C. Células 293F adaptadas para cultura em suspensão foram cultivadas em frascos

T125 em um platô agitador até uma densidade de 3,0 x 10e6 células/mL. As células foram semeadas a uma densidade de 0,3 a 0,5 x 10e6 células viáveis/mL em cada poço de uma placa de 24 poços profundos. As células foram transientemente transfectadas com o DNA estéril individual: PEl-MIX e adicionalmente cultivadas. Sete dias após a transfecção, o sobrenadante foi coletado e filtrado através de um filtro de 0,22 µM. O sobrenadante estéril foi armazenado a 4°C. Geração de grupos de linhagens celulares estáveis que coexpressam dois anticorpos biespecíficos

[0091] Células CHO foram transfectadas com os três construtos de cadeia pesada e um construto de cadeia leve comum em uma razão molar entre o construto de cadeia leve comum (cLC): e a cadeia pesada de EGFR: e a cadeia pesada de HER2: e a cadeia pesada de HER3 = 2,5 : 2 : 1 : 1. Dez grupos de células estavelmente transfectadas foram obtidos (A a J). A análise por ELISA dos anticorpos anti-EGFR, anti-HER2 e anti-HER3 foi feita com os sobrenadantes dos 10 grupos no dia 3 e no dia 6. Todas as 3 espécies puderam ser detectadas em todos os grupos. Geração de clones estáveis de linhagem celular que coexpressam dois anticorpos biespecíficos.

[0092] Os grupos foram colocados em placas em meio semissólido e deixados para crescer durante 7 a 10 dias. Colônias únicas foram escolhidas e semeadas em placas de cultura de 24 poços. As colônias foram semeadas antes da coleta de anticorpos do sobrenadante das culturas.

Determinação dos títulos de anticorpo

[0093] Os títulos de anticorpos anti-HER2 de amostras contendo um único anticorpo biespecífico foram determinados por ELISA contra a proteína Erbb-2-Fc (R&D Systems). Os títulos de anti-HER3 de amostras contendo um único anticorpo biespecífico foram determinados por ELISA contra a proteína Erbb-3-Fc humano (R&D Systems). Os títulos de anticorpos anti-EGFR de amostras contendo um único anticorpo biespecífico foram determinados por ELISA contra a proteína ECD-Fc de EGFR humano (R&D Systems). Diluições seriais de 2 vezes dos antígenos foram usadas para revestir os poços de uma placa ELISA, começando a 5 µg/mL.

[0094] Ensaios ELISA para quantificar anticorpos biespecíficos EFGR x HER2 e EGFR x HER3 em composições compreendendo misturas dos dois anticorpos biespecíficos foram feitos pelo revestimento de placas ELISA com EGFR-Fc (R&D Systems). Após a lavagem, as placas foram incubadas com a amostra. Após a lavagem, a presença de anticorpo biespecífico ligado com um braço EFGR e um braço HER2 foi detectada pela incubação com HER2-Fc marcado. A presença de anticorpo biespecífico ligado com um braço EFGR e um braço HER3 foi detectada pela incubação com HER3-Fc marcado. Purificação de IgG

[0095] A purificação da IgG foi realizada com o uso de cromatografia de afinidade. As purificações foram realizadas sob condições estéreis com o uso de filtração a vácuo. Primeiro, o pH do meio foi ajustado para 8,0 e, posteriormente, as produções foram incubadas com microesferas de proteína A-Sepharose CL-4B (50% v/v) (Pierce) durante 2 horas a 25°C em uma plataforma de agitação a 600 rpm. Em seguida, as microesferas foram coletadas por filtração a vácuo. As microesferas foram lavadas duas vezes com PBS em pH 7,4. A IgG ligada foi eluída em pH 3,0 com tampão citrato 0,1 M e a fração de IgG foi imediatamente neutralizada com Tris pH 8,0. A troca de tampão foi realizada por centrifugação usando-se Ultracel (Millipore). As amostras terminaram em um tampão final de PBS, pH 7,4. Cromatografia de troca catiônica (CIEX)

[0096] A cromatografia CIEX-HPLC foi feita usando-se a série TSKgel SP-STAT (tamanho de partícula de 7 µm, I.D. x L de 4,6 mM x 10 cm, Tosoh 21964) de colunas de troca iônica. As colunas são empacotadas com partículas de resina não porosa para a análise de velocidade e alta resolução, bem como isolamento, de biomoléculas. As partículas nas colunas TSKgel STAT contêm uma rede de acesso aberta de grupos de troca iônica em múltiplas camadas para capacidade de carregamento, enquanto o tamanho de partícula torna estas colunas adequadas para sistemas HPLC e FPLC.

[0097] O TSKgel SP-STAT (tamanho de partícula de 7 µm, L x I.D. de 10 cm x 4,6 mM, Tosoh 21964) com o uso de tampão A (tampão de fosfato de sódio, 25 mM, pH 6,0), após o que os anticorpos são deslocados da coluna mediante o aumento da concentração de sal e corrida de um gradiente de tampão B (25 mM de fosfato de sódio, 1 mM de NaCl, pH 6,0). A vazão foi ajustada para 0,5 mL/min. A massa da amostra de injeção para todas as amostras de teste e controles (em PBS) foi de 10 µg e os volumes de injeção de 10 a 100 µL. Os cromatogramas são analisados quanto aos padrões de pico, tempos de retenção e áreas de pico dos principais picos observados com base nos resultados de 220 nm. Resultados

[0098] Os perfis da CIEX dos anticorpos biespecíficos PB4516p08 e PB6892p04 foram comparados (consulte a Figura 2). Observou-se que a produção de PB6892 continha uma quantidade significativa de impurezas. Além disso, o tempo de retenção da fração do anticorpo biespecífico de PB6892 foi significativamente menor que o tempo de retenção da fração do anticorpo biespecífico de PB4516. Para a coprodução pela mesma célula e subsequente copurificação usando-se CIEX, o tempo de retenção dos dois anticorpos biespecíficos estão, de preferência, mais próximos um do outro. Por essa razão, a região variável do braço HER2 para PB6892 foi substituída por uma região variável diferente. A cadeia pesada com a região variável MF2032 foi selecionada e usada para produzir o anticorpo biespecífico EGFR x HER2, PB11244. Os perfis de CIEX de PB4516p10 e PB11244p01 são mostrados na Figura 3. Os tempos de retenção das frações de anticorpo biespecífico são 16,310 e 16,950, respectivamente. Esses tempos de retenção são suficientemente iguais para permitir a copurificação com o uso de CIEX sob as condições indicadas. Além disso, a figura mostra que os tempos de retenção das impurezas são suficientemente diferentes para permitir a separação eficiente em colunas analíticas e preparatórias. As preparações dos anticorpos biespecíficos acima foram produzidas em células HEK293.

[0099] Para a coprodução, foram usadas células CHO-K1. As células CHO foram transfectadas com construtos contendo as três cadeias pesadas com as respectivas regiões variáveis de MF3755 (EGFR), M2032 (HER2) e MF3178 (HER3) foram transfectadas em células CHO- K1 juntamente com uma expressão de construto da região variável da cadeia leve da SEQ ID: NO: 26. As células positivas para vetor foram selecionadas e agrupadas. Dez grupos separados de células CHO-K1 transfectadas (identificadas como A a J) foram gerados.

[0100] A Tabela 1 mostra as quantidades de anticorpo biespecífico PB4516 (EGFR x HER3) e PB11244 (EGFR x HER2) produzidas pelos respectivos grupos. Além disso, a razão entre as quantidades e a quantidade total de IgG produzida é mostrada. Os grupos F e J foram selecionados para subclonagem.

[0101] A Tabela 2 mostra a quantidade de anticorpo biespecífico PB4516 (EGFR x HER3) e PB11244 (EGFR x HER2) produzido pelos respectivos clones.

[0102] O anticorpo produzido pelo clone FST2cp12 foi usado para analisar o perfil da CIEX (consulte a Figura 4). É claro que os dois anticorpos biespecíficos coeluem eficientemente nas mesmas frações da eluição da CIEX.

[0103] O clone FST2cp09 foi adicionalmente subclonado para assegurar que a linhagem celular era clonal e um perfil da CIEX adicional foi determinado dos anticorpos produzidos. A Figura 5 mostra o perfil da CIEX. É claro que os dois anticorpos biespecíficos coeluem eficientemente nas mesmas frações da eluição da CIEX. A contribuição relativa dos dois anticorpos biespecíficos na coeluição é analisada por ELISA e/ou por colunas de interação hidrofóbica. O ELISA específico para o anticorpo biespecífico indicou a presença de 743 µg/mL do anticorpo biespecífico para EGFR/HER2, PB11244 e 1134 µg/mL do anticorpo biespecífico para EGFR/HER3, PB4516. Exemplo 2 Geração de grupos de linhagens celulares estáveis que coexpressam dois anticorpos biespecíficos

[0104] As linhagens celulares que expressam os dois por dois anticorpos biespecíficos mencionados na Figura 7 são produzidas da forma a seguir. Células CHO são transfectadas com três construtos de cadeia pesada e um construto de cadeia leve comum. As três cadeias pesadas são identificadas pelas regiões variáveis da cadeia pesada (MFXXXX) indicadas na caixa. A cadeia leve compreende a sequência da região variável da cadeia leve de IgVk1*39/jk1 da SEQ ID NO: 26. Os dois anticorpos biespecíficos têm uma cadeia pesada em comum e uma cadeia pesada diferente cada. Por exemplo, o primeiro par especificado na Figura 7 compartilha uma cadeia pesada comum compreendendo o mesmo braço de ligação HER3 compreendendo uma região variável de cadeia pesada (MF3178) e um segundo braço de ligação diferente. O PB4528 tem um braço de ligação ao EGFR com uma região variável de cadeia pesada (MF4003) e o PB4188 tem um braço de ligação ao HER2 com uma região variável de cadeia pesada (MF3958). A cadeia pesada compartilhada tem a região KK CH3 do domínio compatível DE/KK de heterodimerização. O braço de cadeia pesada compartilhado também pode ter a região DE CH3. Por exemplo, nas Figuras 3 a 5, dois anticorpos biespecíficos são PB11244 e PB4516 copurificados. Conforme mostrado na Figura 3c, o PB11244 e o

PB4516 compartilham o mesmo braço de ligação ao EGFR com uma região variável de cadeia pesada (MF3755) e o PB11244 tem um braço de ligação ao HER2 com uma região variável de cadeia pesada (MF2032) e o PB4516 tem um braço de ligação ao HER3 com uma região variável de cadeia pesada (MF3178). O braço de cadeia pesada compartilhado nesse par de anticorpos biespecíficos tem a região DE CH3, enquanto os diferentes braços de ligação HER2 e HER3 têm a região de CH3 KK.

[0105] A razão molar entre o construto de cadeia leve comum (cLC) e o construto de cadeia pesada compartilhado e o construto de cadeia pesada diferente 1 e o construto de cadeia pesada diferente 2 = 2,5 : 2 : 1 : 1. Grupos de células estavelmente transfectadas são obtidos. A análise ELISA dos antígenos é realizada em sobrenadantes coletados dos grupos. Todas as 3 espécies de ligação ao antígeno são detectadas nos grupos. Os tempos de retenção em CIEX dos anticorpos biespecíficos em cada par da Figura 7 são determinados sob condições da CIEX similares e indicados na 8ª coluna. O desvio do tempo de retenção médio é calculado com a fórmula 100x((A-B)/(A+B)), onde A é o tempo de retenção do anticorpo biespecífico com o tempo de retenção mais longo. Por exemplo, o desvio para o primeiro par é 100x((16,46-16,24)/(16,46+16,24))= 0,67 ou 0,7%.

[0106] Os anticorpos nos sobrenadantes coletados são primeiro separados das outras proteínas no sobrenadante por extração de proteína A seguido de eluição com ácido e neutralização rápida. O tampão dos anticorpos coletados é subsequentemente trocado para PBS. As amostras são subsequentemente carregadas em colunas de CIEX,

lavadas e eluídas com um gradiente crescente de sal.

A absorção do eluído é medida a 220 nm e os tempos de retenção são calculados a partir do início do gradiente de sal e da observação dos picos para os anticorpos biespecíficos.

Os anticorpos biespecíficos são coletados e os respectivos anticorpos biespecíficos no eluído coletado são verificados por ELISA.

Os tempos de retenção dos respectivos anticorpos biespecíficos são indicados na última coluna.

Fica claro que muitos dos pares têm tempos de retenção que coeluem eficientemente em uma coluna de CIEX.

Também é claro que a cromatografia CIEX fornece uma boa separação dos anticorpos biespecíficos coeluentes e dos respectivos homodímeros (se houver). A Figura 6 mostra os tempos de retenção de vários anticorpos com homodímeros de cadeias pesadas que compreendem as regiões variáveis de cadeia pesada presentes em anticorpos biespecíficos coeluentes.

Fica claro que o tempo de retenção dos homodímeros é suficientemente diferente dos tempos de retenção dos respectivos anticorpos biespecíficos.

Por exemplo, na primeira caixa da Figura 7, os homodímeros PG3178, PG3958 e PG4003 poderiam estar presentes em uma produção.

Os tempos de retenção dos respectivos homodímeros são de cerca de 22, 12 e 13 (Figura 6, fileiras 1 a 3), enquanto os tempos de retenção dos anticorpos biespecíficos que compreendem as regiões variáveis de cadeia pesada são de cerca de 19 e 19,5 (Figura 7, fileiras 1 e 2).

Tabela 1 Razão (α- Conc. α-EGFR Conc. α-EGFR EGFR x α- IgG total Grupo x α-HER2 x α-HER3 HER2: α- (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) EGFR x α- HER3) A 153,6 162,0 1 : 1,1 315,6 B 120,1 336,3 1 : 2,8 456,3 C 325,5 741,6 1 : 2,3 1067,1 D 510,6 856,8 1 : 1,7 1367,4 E 273,0 526,5 1 : 1,9 799,6 F 1824,7 1024,9 1 : 0,6 2849,6 G 704,2 849,8 1 : 1,2 1554,0 H 951,1 467,5 1 : 0,5 1418,6 I 450,7 691,0 1 : 1,5 1141,7 J 1288,9 1572,1 1 : 1,2 2861,0

[0107] Tabela 1: Quantificação da produção de anticorpos biespecíficos EGFRxHER2 e EGFRxHER3 em grupos de células. Os sobrenadantes de cultura de dez grupos (A a J) foram avaliados. Os ensaios ELISA foram baseados em revestimento com EGFR-Fc, ligação do anticorpo produzido e detecção com HER2-Fc marcado ou HER3-Fc marcado. Os grupos A a J foram analisados usando-se os dois ensaios ELISA. Os anticorpos biespecíficos PB4516 e PB11244 são anticorpos da IgG1 de cadeia pesada com domínios de heterodimerização DE/KK compatíveis. As cadeias pesadas são combinadas com a cadeia leve comum. Os anticorpos biespecíficos compartilham a região variável de cadeia pesada MF3755 em uma cadeia pesada e cada um tem uma região variável de cadeia pesada diferente na outra cadeia pesada IgG1, MF3178 para PB4516 e MF2032 para PB11244.

Tabela 2 # HER2 [µg/mL] HER3 [µg/mL] HER2/HER3 FST1cp02 48,7 1449,2 0,03 FST1cp03 103,4 488,9 0,21 FST1cp04 131,4 1675,0 0,08 FST1cp14 259,1 214,6 1,21 FST1cp24 372,3 817,0 0,46 FST1cp26 92,2 706,7 0,13 FST2cp09 1026,2 1509,0 0,68 FST2cp12 725,7 1334,2 0,54 FST2cp13 737,4 1173,0 0,63 FST2cp20 617,6 1759,3 0,35 FST2cp21 993,0 1852,3 0,54 FST2cp23 937,4 1095,5 0,86 JST1cp01 121,3 490,6 0,25 JST1cp04 239,8 383,7 0,62 JST1cp05 187,2 759,0 0,25 JST1cp09 828,6 718,5 1,15 JST1cp13 103,5 175,8 0,59 JST1cp24 481,5 423,7 1,14

[0108] Tabela 2: Os grupos selecionados foram usados para clonagem de célula única. 18 colônias foram colhidas de três grupos. Dois grupos independentes F (FST1 e FST2) e um grupo J (JST1) foram usados para clonagem de célula única. A indicação "cp" seguida de um número identifica colônias individuais de um grupo.

As colônias escolhidas foram cultivadas e usadas para a coleta de anticorpos.

Colônias individuais dos mesmos grupos produziram diferentes quantidades e diferentes proporções dos respectivos anticorpos biespecíficos.

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir ao menos dois anticorpos, que compreende: - fornecer células com ácido nucleico que codifica os anticorpos; - cultivar as ditas células; - coletar os anticorpos da cultura; e - separar os anticorpos produzidos dos meio-anticorpos por cromatografia de troca iônica (IEX); sendo que o método é caracterizado por os anticorpos apresentarem tempos de retenção de IEX que se desviam 10% ou menos da média dos tempos de retenção dos anticorpos individuais sob as condições da IEX usadas.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a coleta dos anticorpos da cultura compreender a purificação do anticorpo a partir de outras proteínas por purificação por afinidade de anticorpo, de preferência por extração de proteína A.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender adicionalmente submeter anticorpos purificados por afinidade à cromatografia de exclusão por tamanho (cromatografia de filtração em gel e/ou cromatografia de troca aniônica.

4. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado por, após a IEX, os anticorpos coletados serem quantitativamente analisados quanto aos níveis de expressão relativa por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC).

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a especificidade dos anticorpos coletados ser verificada por ELISA.

6. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado por os tempos de retenção dos respectivos meio-anticorpos estarem fora do intervalo abrangido pelos tempos de retenção dos anticorpos.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelas células produzirem 3 cadeias pesadas.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por as ditas cadeias pesadas compreenderem domínios para a heterodimerização eficiente das cadeias pesadas.

9. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 8, caracterizado por ao menos dois dos ditos anticorpos serem anticorpos biespecíficos.

10. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 9, caracterizado por ao menos dois dos ditos anticorpos compartilharem uma cadeia pesada idêntica.

11. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 10, caracterizado por os ditos anticorpos terem pontos isoelétricos (pI) que diferem em 0,4 unidade ou menos do pI médio dos ditos ao menos dois anticorpos.

12. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 11, caracterizado por os anticorpos serem selecionados para ter combinações de cadeia pesada e leve que têm tempos de retenção que são significativamente diferentes dos tempos de retenção dos anticorpos completos sob as condições da IEX usadas.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o pI das combinações de cadeia pesada e leve diferir em mais de 0,4 unidade do pI médio dos ditos ao menos dois anticorpos.

14. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 13, caracterizado por as cadeias pesadas compreenderem um domínio CH3 que favorece a heterodimerização de cadeias pesadas.

15. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 14, caracterizado por as cadeias pesadas dos ditos anticorpos serem cadeias pesadas de IgG.

16. Método, de acordo com as reivindicações 7 a 15, caracterizado por uma cadeia pesada compreender as substituições de aminoácido L351K e T366K (numeração EU) na região CH3 e uma outra cadeia pesada compreender as substituições de aminoácido L351D e L368E na região CH3.

17. Método para produzir ao menos dois anticorpos, que compreende: - fornecer células com ácido nucleico que codifica os anticorpos; - cultivar as ditas células; - coletar os anticorpos da cultura; e - separar os anticorpos produzidos dos meio-anticorpos por cromatografia de troca iônica (IEX); sendo o método caracterizado por os anticorpos apresentarem tempos de retenção de IEX que se desviam 10% ou menos da média dos tempos de retenção dos anticorpos individuais sob as condições da IEX usadas e sendo que, subsequente à IEX, os anticorpos coletados são quantitativamente analisados quanto aos níveis de expressão relativa por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) e a especificidade dos anticorpos coletados é verificada por ELISA.

18. Composição caracterizada por compreender 2 a 10 anticorpos recombinantes obteníveis por um método conforme definido nas reivindicações 1 a 17.

19. Composição que compreende 2 a 10 anticorpos recombinantes caracterizada por os tempos de retenção de IEX de ao menos dois dos ditos anticorpos se desviarem 10% ou menos da média dos tempos de retenção dos anticorpos individuais sob as condições da IEX.

20. Composição que compreende 2 a 10 anticorpos recombinantes, caracterizada por o pI de ao menos dois dos ditos anticorpos diferir em 0,4 unidade ou menos do pI médio dos ditos ao menos dois anticorpos.

21. Composição, de acordo com a reivindicação 18 a 20, caracterizada por os tempos de retenção de IEX e/ou o pI serem essencialmente iguais para todos os anticorpos.

22. Composição, de acordo com a reivindicação 18 a 21, caracterizada por ao menos dois dos anticorpos serem anticorpos biespecíficos.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por ao menos dois dos ditos anticorpos compartilharem uma cadeia pesada idêntica.