TW202045132A - 生成包含有兩種或更多種抗體的組成物之技術 - Google Patents

Abstract

本發明係有關於用以生成至少兩種抗體的手段與方法。方法可以包含：提供帶有編碼該等抗體的核酸之細胞；培養該等細胞；從培養物來收集該等抗體；以及藉由離子交換層析法(IEX)而將被生成的抗體與半抗體分開來。在某些具體例中，在所使用的IEX條件下，該等抗體展現出IEX滯留時間係與個別的抗體之滯留時間的平均值偏差為10%或者更低。本發明亦有關於由此所生成的抗體之組成物。在某些方面中，本發明係有關於包含有2-10種重組型抗體的組成物，特徵在於：在該等IEX條件下，該等抗體之中的至少兩者的IEX滯留時間與個別的抗體之滯留時間的平均值偏差為10%或者更低。本發明亦有關於包含有2-10種重組型抗體的組成物，特徵在於：該等抗體之中的至少兩者的pI值與該至少兩種抗體的平均pI值差異為0.4單位或更少。

Description

生成包含有兩種或更多種抗體的組成物之技術

本發明係有關於抗體的領域，特別是有關於治療抗體的領域。該等抗體可以被使用在人類的治療上。更特別地，本發明係有關於多種抗體的生成和/或純化。一個單一宿主細胞可以生成該等多種抗體。該等抗體也可藉由一由宿主細胞所構成之混合物而被生成，該等宿主細胞各自生成該等抗體之中的一者。本發明亦有關於用於生成包含有這樣的抗體之組成物的方法以及用於純化這樣的抗體之方法。

多株抗體典型地係收集自一位個體的血液。多株抗體之一優點(advantage)是：病原係經由多個標靶和表位而被攻擊。單株或重組型抗體之一優點是完善特徵化的特異性與功能而允許這樣的抗體得以被使用作為具有一定義完善的作用與毒性譜相之精確藥物。

一個單株抗體的特異性也可能是一個缺點，特別是當多個標靶需要被解決之時。有可能藉由將更多的抗體加入至該藥物來減少這個不利條件，但考慮到即使一種單一治療抗體也可能是昂貴的，被預期到的是：有關這樣的多株混合物之成本可能很快就會變得令人望之卻步。

雙-、三-以及其他多特異性抗體的發展已成功地將一多株抗體的某些方面引入至抗體治療劑。除了標靶數目的增加之外，它也成功地引入以前使用傳統的單特異性單株或多株抗體無法得到的其他功能性。多種雙-、三-以及其他多特異性抗體在同一個治療當中的使用可以提供更進一步的效益。

本發明藉由描述一種用於從一個單一宿主細胞或任擇地一由宿主細胞所構成之混合物而被生成的多種抗體治療劑之純化的穩健且經濟的方法而提供了本領域之一進步。本發明對於兩種或更多種抗體的集合之經濟生產是特別有用的，優選地是多特異性抗體。

發明概要

本發明提供一種用以生成至少兩種多特異性抗體的方法，包括： –    提供帶有編碼該等多特異性抗體的核酸之細胞； –    培養該等細胞； –    從培養物來收集該等多特異性抗體；以及 –    藉由離子交換層析法(IEX)而將被生成的多特異性抗體與半抗體以及選擇性地單特異性抗體和/或其他非所欲的抗體產物相關雜質分開來； 該方法特徵在於：在所使用的IEX條件下，該等多特異性抗體展現出IEX滯留時間係與個別的多特異性抗體之滯留時間的平均值偏差為10%或者更低。該等各別的半抗體以及選擇性地單特異性抗體和/或其他非所欲的抗體產物相關雜質之滯留時間優選地係落在該等多特異性抗體的滯留時間所跨距的範圍之外。

本發明也提供一種用以生成至少兩種多特異性抗體的方法，包括： –    提供一帶有編碼該等多特異性抗體的核酸之細胞； –    培養該細胞； –    從培養物來收集該等多特異性抗體；以及 –    藉由離子交換層析法(IEX)而將被生成的多特異性抗體與半抗體以及選擇性地單特異性抗體和/或其他非所欲的抗體產物相關雜質分開來； 該方法特徵在於：在所使用的IEX條件下，該等多特異性抗體展現出基本上是相同的IEX滯留時間。該等各別的半抗體以及選擇性地單特異性抗體和/或其他非所欲的抗體產物相關雜質之滯留時間優選地係落在該等抗體的滯留時間所跨距的範圍之外。

本發明進一步提供一種用以生成至少兩種抗體的方法，其中該等抗體包含有一種單特異性和/或一種多特異性抗體，該方法包括： –    提供帶有編碼該等抗體的核酸之細胞； –    培養該等細胞； –    從培養物來收集該等抗體；以及 –    藉由離子交換層析法(IEX)而將被生成的抗體與半抗體分開來； 該方法特徵在於：在所使用的IEX條件下，該等抗體展現出基本上是相同的IEX滯留時間。該等各別的半抗體以及選擇性地單特異性抗體之滯留時間優選地係落在該等抗體的滯留時間所跨距的範圍之外。

本發明也提供一種包含有可藉由一如本文所述的方法而獲得之2-10種重組型抗體的組成物。

亦被提供的是一種包含有2-10種重組型抗體(諸如多特異性抗體)的組成物，特徵在於：在所使用的IEX條件下，該等抗體之中的至少兩者的IEX滯留時間與個別的抗體之滯留時間的平均值偏差為10%或者更低。

進一步被提供的是一種包含有2-10種重組型抗體的組成物，特徵在於：該等抗體之中的至少兩者的IEX滯留時間基本上是相同的。

亦被提供的是一種包含有2-10種重組型抗體的組成物，特徵在於：該等抗體之中的至少兩者的等電點(PI)與該至少兩種抗體的平均pI值優選地差異為0.4單位，0.3、0.2以及優選地0.1單位或更少。該至少兩種抗體的每一者之pI值優選地與另一者差異為0.25單位或更少。發明的詳細說明

如本文所使用的術語“抗體”係指屬於蛋白質的免疫球蛋白類別之蛋白質性分子，其含有結合一位在一抗原上的表位之一個或更多個領域，其中該等領域係為或者衍生自一個抗體的可變區或者共享該抗體的可變區之序列同源性。抗體典型地係由基本結構單元所構成–各個具有兩個重鏈以及兩個輕鏈。供治療用途的抗體優選地係為盡可能地接近要予以治療的個體之天然抗體 (例如供人類個體之人類抗體)。帶有被延伸的重鏈和/或輕鏈可變區的抗體亦被包含在本文中。一根據本發明的抗體不受限於用以生成它的任何特定型式或方法。

半抗體是重鏈與輕鏈組合，它們沒有被聯合以另外一種重鏈與輕鏈組合而且它們不與另外一種可變區或類可變區多肽形成一個界面。其他非所欲的抗體產物相關雜質可能是沒有被聯合以一重鏈的自由輕鏈、沒有被聯合以一輕鏈或另外一種重鏈的自由重鏈，或缺少一輕鏈之不完全組裝的抗體。

供抗體生成之合適的細胞被知曉於本技藝中，並且包含一種融合瘤細胞、一種中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、一種NS0細胞或一種PER-C6細胞，或為具有本領域之通常技藝的人士所知曉的各式各樣的其他細胞株。各種不同的機構和公司已發展出用於抗體之大規模生產的細胞株，例如供臨床應用。除了別的以外，這樣的細胞株之非限制性示範例是CHO細胞、NS0細胞或PER.C6細胞或HEK293細胞。在一個特別被偏好的具體例中，該細胞是一人類細胞。優選地，一種被一腺病毒E1區或其一功能等效物所轉形的細胞。在一個被偏好的具體例中，該細胞是一種CHO細胞或其一變異體。優選地，一種利用一麩胺醯胺合成酶(GS)載體系統來供一抗體之表現的變異體。在一個被偏好的具體例中，該細胞是一種CHO細胞。

該等細胞可被提供以編碼該等抗體的核酸。該等細胞將會表現、組裝以及排出被形成的抗體至細胞培養物的上澄液之內。一個單一重鏈與輕鏈(更確切地說，編碼他它的核酸)之引入導致一個單株抗體的生成，該單株抗體具有兩個重鏈各自被聯合以一個輕鏈。

本發明之一方法可以使用包含有各自生成一種不同抗體的兩種或更多種細胞之細胞混合物來予以執行。使用這樣一種混合物的優點是：被收集的抗體之下游加工處理可予以更有效率地精簡化。一方法之進一步的優點是：抗體產物有如一體被收集與純化。又，一含有藉由本發明之一方法而被生成的兩種或更多種抗體之混合物，當與該等抗體之每一者分別需要的試驗數量相比較，可以減少為了要獲得法定認證所需要的試驗數量。

在一個進一步的具體例中，該等細胞係為基本上由一個被提供以編碼該等各別的抗體之核酸的單一細胞之複製品所構成的一個同質性細胞集合。數種重鏈在一個細胞中的共同表現允許各種不同的重鏈組合。帶有附加的輕鏈之組合增高了組合的數目。各種不同的方法已被開發，俾以有利於特定組合的形成勝過其他者。重鏈變異體已被生成，該等重鏈變異體特別地促進重鏈異二聚體(heterodimers)勝過同質二聚體(homodimers)之形成，或者反過來促進重鏈同質二聚體勝過異二聚體之形成。帶有特定的同質-或異二聚體化領域的重鏈減少正在由這樣的細胞所生成的抗體之數目和/或增高被偏好的抗體之位準勝過替代組合 (例如，一種異二聚體勝過一種同質二聚體之較高的生產)。

本發明之一方法係特別地適合供兩種或更多種多特異性抗體生成，包含雙特異性抗體。用於雙特異性抗體之生成的各種不同方法存在於本領域中。一種方法使用一個可以和不同的重鏈形成有功能的可變領域之共同輕鏈。一種用於生成雙特異性抗體之被偏好的方法包含一種在牠的基因體內藏匿有一共同鏈之基因轉殖動物的使用，而使得這樣的動物使用一抗原之免疫產生出根據非共同鏈而對該抗原具特異性的一個抗體庫，其中該抗體庫係由包含有該共同鏈以及一種重排的同源鏈之各種不同抗體所構成。一動物可以使用不同的抗原來予以免疫，或者不同的動物可以各自分別地使用各別的抗原來予以免疫。編碼該非共同鏈或其可變區的核酸可以得自於該(等)動物，例如B細胞、脾臟或淋巴組織。這些可以被用來產生表現各別的非共同鏈之核酸，該等核酸接而可被引入至生成細胞之中。該共同鏈可以在相同或不同的時間被引入。該核酸可以被併入至細胞核之內，而且優選地是宿主細胞的基因體之內，而使得該宿主細胞生成標靶多種抗原的多特異性抗體或多聚體(，該(等)基因轉殖動物已就該等抗原而被免疫(為了可被組合以一共同鏈以生成對於不同的標靶和/或不同的表位具有特異性之有功能的可變領域之可變區的產生之目的，參見舉例來說WO 2009/157771，該案在此被併入本案以作為參考)。

一個生成一種共同輕鏈以及兩種不同的重鏈(各自可和該共同輕鏈形成一個有功能之可變領域)的細胞生成，除了別的以外，一種帶有兩個不同的重鏈與輕鏈組合之雙特異性抗體。同樣地，一個生成一種共同輕鏈以及三種或更多種不同的重鏈之細胞可以形成能夠標靶三種或更多種抗原的多特異性抗體，或者能夠標靶三種或更多種抗原的兩種或更多種多特異性抗體之一組合。現今有可能來建立抗體的標準型式(亦即一個恆定部分以及兩個可變領域)以及加設進一步的結合領域。照此情形，具有被附接至一個抗體的恆定部分或可變領域之中的一者或多者之一個或更多個帶有附加的結合特異性之單鏈Fv的多特異性抗體可以被製造出。亦有可能來生成帶有兩種或更多種可變區的重鏈。附加的重鏈區有利地可以聯合以不同的或共同輕鏈可變區。請參閱US 62/650467，該專利案在此被併入本案以作為參考。

當該細胞生成兩種或更多種多特異性抗體之時，它在某些情況下也會產生若干數量的半抗體以及帶有相同重鏈的抗體或同質二聚體。後者的數量可以藉由包含促進重鏈內的修飾之異二聚體形成而被減少。如前面所提到的，用於誘發重鏈的異二聚體化之各種不同的方法存在。帶有該等修飾之各別的領域被統稱為異二聚體化領域。具有有利於相互作用的異二聚體化領域之重鏈據說係具有相容的異二聚體化領域。該等相容的異二聚體化領域優選地係為相容的免疫球蛋白重鏈CH3異二聚體化領域。本領域描述了各種不同的方法，其中重鏈之這樣的CH3異二聚體化可以被達成。

一種用於生成雙特異性抗體之被偏好的方法被揭示於US 9,248,181和US 9,358,286中。特別地，用來生成基本上僅有雙特異性全長的IgG分子之被偏好的變化係為位在該第一CH3領域(該“KK-變異體”重鏈)中的胺基酸取代L351K和T366K (EU編號)以及位在該第二領域(該“DE-變異體”重鏈)中的胺基酸取代L351D和L368E，或者反之亦然。如前面所提到的，該DE-變異體和KK-變異體優先地配對以形成異二聚體(所謂的“DEKK”雙特異性分子)。DE-變異體重鏈之同質二聚體化(homodimerization)(DEDE同質二聚體)或KK-變異體重鏈之同質二聚體化(KKKK同質二聚體)由於位在相同重鏈之間的CH3-CH3介面中的帶電荷殘基之間的強烈排斥而幾乎不會發生。

在本發明中，被偏好的是：該等細胞被提供以編碼一共同輕鏈的核酸。有各種不同的方法可供熟習此藝的人士來生成具有不同的重鏈可變區但是相同的輕鏈可變區之抗體。WO 2004/106375描述使用一種共同輕鏈可變區的噬菌體庫。噬菌體選擇得到帶有相同的輕鏈可變區但是不同的重鏈可變區之可變領域。再者，具有一共同鏈以及不相同的同源鏈之非人類動物被描述於WO 2009/157771中。在這樣的動物中之抗體選擇得到帶有相同的或類似的共同鏈可變區但是不相同的同源鏈可變區之可變領域。WO 2004/106375和WO 2009/157771在此被併入本案以作為參考。該等專利刊物(publications)特別是就抗體(具有相同或相似的共同鏈可變區以及不相同的同源鏈可變區，優選地是一共同輕鏈可變區與不相同的重鏈可變區)以及編碼這樣的抗體之核酸的產生而被參照。

在一個被偏好的具體例中，該等細胞生成兩種或更多種重鏈以及一種共同輕鏈。該等各別的重鏈和輕鏈可具有一個或更多個可變區與該等各別的鏈聯合。在一個被偏好的具體例中，該細胞生成三種或更多種重鏈。該三種重鏈之中的一者優選地含有一個相容的異二聚體化領域之一個部分。其他兩種或更多種重鏈優選地包含有該相容的異二聚體化領域之另一個部分。如果第一種重鏈係藉由字母“A”來予以象徵性地表示，而其他兩種係藉由字母“B”和“C”，異二聚體化領域的特定組合導致組合AB和AC之佔優勢地形成。該等組合AA、BB、CC和BC藉由異二聚體化領域的包含而不被青睞。這樣一種細胞生成僅有兩種雙特異性抗體AB和AC是有效的(參見圖1)。在本發明中，被偏好的是：該細胞藉由生成至少3種重鏈而生成該兩種抗體。在一個被偏好的具體例中，該等重鏈之中的一者含有一個相容的異二聚體化領域之一個部分，而該其他兩種或更多種重鏈優選地包含有該相容的異二聚體化領域之另一個部分。一種被位在一個組成物中的兩種或更多種雙-或多特異性抗體或多聚體所共享的重鏈優選地具有該異二聚體化領域的CH3 DE部分。位於該等雙-或多特異性抗體中的其他重鏈優選地具有CH3 KK部分。

該至少兩種抗體優選地係為多特異性抗體，優選地是雙特異性抗體。在一個被偏好的具體例中，該等抗體之中的至少兩者共享一相同的重鏈。該細胞可以藉由在該等重鏈中包含不同不相同的異二聚體化領域而生成幾個系列的雙特異性抗體。這樣的實施可以導致帶有重鏈組合AB和CD的抗體之佔優勢的生成。組合AB可以藉由一種如本文前面所提到的DE/KK異二聚體化領域而受青睞，而該CD係藉由一種“孔中鈕(knob in hole)”異二聚體化領域的併入，或者本領域中已知的其他異二聚體化特徵，例如經由電荷工程。一種位於不相同的雙-或多特異性抗體之間的共享重鏈或者帶有該共享重鏈的抗體組合可以藉由提供帶有一種異二聚體化領域之一個部分的一種共享重鏈以及帶有該異二聚體化領域之互補部分的各種不同組合鏈而被製造出。舉例來說，位於該共享重鏈中的CH3 DE部分以及位於該等組合鏈中的CH3 KK部分。一種共享重鏈以及兩種組合重鏈在這種情況下將會造成該細胞來生成雙-或多特異性多聚體帶有重鏈組合AB和AC (或者對於多特異性多聚體而言是AxBC和AxDE)。其他可能的組合是AB、AE、CD和CF；或者AB、AE、AG和CD，諸如此等。

相較於其他的宿主細胞蛋白質，抗體通常具有一獨特的等電點 (典型地係位在pH 6-10之範圍中)。該等抗體，諸如多特異性抗體，還有多特異性多聚體，可以經由本文所描述的方法而被純化為帶有一相對較高的純度。方法可以包括許多步驟，諸如培養該宿主細胞、經歷收穫物澄清，接續以蛋白質捕捉。諸如陰離子交換層析法的IEX層析法可以被使用以移除宿主細胞DNA，陽離子交換層析法(CIEX)可以被使用，例如用以移除宿主細胞蛋白質、淋溶蛋白質A以及潛在的聚集體。諸如病毒過濾或疏水性交互作用層析法的額外步驟可以被包含。

抗體典型地係藉由生成細胞而被排出。這樣的抗體之收穫典型地涉及到細胞上澄液的收集，接續以幾個純化步驟來移除細胞碎片或聚集體(它們的存在不被欲求)。收穫物澄清可能涉及到抗體生成細胞的培養物上澄液之過濾、離心或此等之一組合。抗體蛋白質捕捉典型地係藉由親和力純化而被完成。這可以幾種方式來予以完成。通常這涉及到使用管柱的純化，該等管柱具有重組型蛋白質A、蛋白質G或蛋白質L，該等蛋白質是對於抗體具有一已知的高特異性結合能力之細菌性蛋白質。現今，更加特異性地結合抗體之各種不同的最佳化突變體係為可獲得的。舉例來說，一種已被移除掉它的非必要領域之重組型蛋白質A係為可獲得的，一種已被刪除掉它的白蛋白結合位址之重組型蛋白質G係為可獲得的，還有經修飾的蛋白質L係為可獲得的。被結合的抗體可以藉由針對一個或多個這樣的管柱之洗提而被收集。陰離子和陽離子交換層析法可被用來進一步純化製備物，例如，從半抗體和/或同質二聚體抗體和/或其他非所欲的抗體產物相關雜質(如果有的話)來純化出雙特異性或多特異性抗體。疏水性交互作用層析法(HIC)在抗體純化過程中通常被使用作為一替代精純步驟。HIC提供一個針對離子交換層析法的正交選擇性，並且可以是一個用於聚集體清除和宿主細胞蛋白質減少的有效步驟。在本發明中，HIC可被使用以供分析目的，在該兩種或更多種雙-或多特異性抗體或者多聚體的純化被完成之後，俾以接而定量具有在IEX上係為類似的(優選地是基本上相同的)滯留時間和/或類似的(優選地是基本上相同的) pI值的該兩種或更多種物種。因此，HIC被用來定量被純化的分子之相對數量。

一種疏水性交互作用樹脂被選擇作為固定相，而移動相的pH值和/或傳導性被調變以達成所要求的選擇性。抗體典型地在較低的pH值下吸引正電荷，這會影響其極性以及整體表面疏水性。允許位在該製備物中的該兩種或更多種抗體的析離之pH條件可以被選擇。

在某些具體例中，被收集的抗體首先藉由親和力純化而從其他蛋白質被分開來，優選地是藉由蛋白質A萃取。隨後，在收集位在流出分餾物中的該等抗體之條件下，被親和力純化的抗體在一種陰離子交換管柱上被運行。抗體可以隨後在一種或更多種CIEX管柱上被運行。

一種用於生成至少兩種抗體之被偏好的方法係藉由細胞來生成如同一種包含有該兩種或更多種抗體之單一組成物的它們而被完成。

一種用以生成至少兩種抗體的方法優選地包括培養生成該兩種或更多種抗體的宿主細胞，該等細胞的上澄液之收集，在一個收穫物澄清過程中處理上澄液收穫物，該收穫物澄清過程優選地包括使用一個捕集諸如細胞或細胞碎片的聚集體並且允許抗體產物的通過之孔徑門檻的過濾。該抗體係藉由使用蛋白質A的親和力層析法而從細胞培養物流體(被收集到。被結合至蛋白質樹脂的抗體在暴露於低pH值之後從層析管柱被洗提出，而洗出液隨後使用一合適的緩衝液來予以中和。

如本文所使用的，術語“等電點(pI)”係指蛋白質表面的平均淨電荷(亦即蛋白質的電雙層之電勢)係為0之時的pH值。換言之，該術語係指蛋白質的一個基團被解離之點，而使得陽離子和陰離子的數目是相等的，因此該蛋白質的淨電荷係為0。

如本文所使用的，“pI”係根據ExPASy ProtParam工具，使用截至本件申請案的最早申請日(優先權日)的系統內定參數而根據一級胺基酸來予以計算。ProtParam是一種工具，它允許針對一被儲存於Swiss-Prot或TrEMBL中的給定蛋白質或者一使用者輸入的蛋白質序列之各種不同的物理和化學參數的運算。被運算的參數包含理論的pI值。Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005) pp. 571-607。

一個蛋白質的淨表面電荷係以一取決於蛋白質的pI值之方式而隨著pH值來變化。在一個相等於一個蛋白質的pI值之pH值下，該蛋白質將不攜帶淨電荷。在一個低於該pI值之pH值下，該蛋白質將攜帶一淨正電荷。如果緩衝液pH值被升高至高於一個蛋白質的pI值，它將會攜帶一淨負電荷。

一個蛋白質的pI值可以藉由它的一級胺基酸序列來予以測定並且因此可以被計算，而一確保一感興趣的蛋白質之一已知淨電荷的緩衝液接而可以被選取。當該感興趣的蛋白質在操作pH值下係攜帶一淨正電荷時，一個帶負電荷的陽離子交換樹脂因此可被選取出。

具有不同pI數值的蛋白質在一給定pH值下將會具有不同程度的電荷而因此對於位在陰離子交換介質之粒子上的帶正電荷之表面基團具有不同的親和力；因此，不同的蛋白質將會以不同的強度結合至該樹脂，促進它們的分離。因此，藉由產生具有相對於該等同質二聚體與半抗體和/或其他抗體產物相關雜質之獨特的pI值之異二聚體多肽，該等異二聚體多肽可以使用標準洗提技術而被容易地純化，例如，藉由施用pH梯度，或藉由在一固定的pH值下施用一鹽或導電梯度，或者一pH值與一導電梯度之一組合。在本發明的具體例中，位在該等抗體中的恆定部分以及輕鏈基本上在不同的抗體中係具有相同的序列。這樣的抗體典型地基本上只有在重鏈可變區的胺基酸序列中有差異。對於這樣的抗體，通常足以來計算如本文所示的重鏈可變區之pI值。計算和標準接而係藉由使用該重鏈可變區的pI值而非該(半)抗體的pI值來予以設定。該抗體的重鏈可變區之平均pI值係表示該抗體在一個CIEX-管柱中的滯留時間。該等抗體(如果有的話)可以具有相同的或不同的異二聚體化領域。它們優選地具有相同的異二聚體化領域。該等抗體可以進一步地在該等恆定部分之正確胺基酸序列中有所差異。

有關於該(等)離子交換層析法(IEX)步驟，這是根據離子和極性分子對於離子交換劑的親和力來分離它們的過程。它作用於各種不同的帶電荷分子—包含大型蛋白質、小型核苷酸以及胺基酸。IEX通常在蛋白質純化上被使用。水溶性並且帶電荷的蛋白質與不溶性固定相形成離子鍵。被結合的分子接而可以使用一具有較高濃度的離子和/或一不同pH值的洗提劑來予以洗提和收集。鹽的濃度或者pH值可以呈一逐步方式來予以變化；藉由逐漸改變層析運行的移動相，或者此等之一組合。兩種型式的離子層析法係為陰離子交換以及陽離子交換。陽離子交換層析法(CIEX)在本發明中被偏好。抗體CIEX優選地係在一生理pH值之下被執行。該pH值典型地係處於一為5-9的範圍中，優選地是6-8。

當該感興趣的分子在被使用於層析的pH值之下係為帶正電荷之時，CIEX典型地被使用。該分子是帶正電荷的，因為用於層析的pH值係低於該分子的pI值。在這種型式的中，該固定相是帶負電荷的，而帶正電荷的分子被裝填俾以被吸引至該固定相。陰離子交換層析法係為當該固定相是帶正電荷的，而帶負電荷的分子(意指用於層析的pH值係高於pI值)被裝填俾以被吸引至該固定相。

在促進抗體(諸如一多特異性抗體)對基質之結合的條件下，一抗體(諸如一多特異性抗體)典型地係在一結合階段中被結合至該IEX管柱。IEX管柱典型地隨後被清洗以移除未結合的物質。從該管柱的洗提係在一洗提階段中被完成。一抗體(諸如一多特異性抗體)的滯留時間典型地係從該洗提階段的開始來予以計算。它係為在洗提相被起始之時該抗體花費在該管柱上的時間數量。如果一個樣品含有數種化合物，該樣品中的每一個化合物典型地將會根據它的化學組成而在該管柱上花費一個不相同的時間數量，亦即每一者將會具有一個不相同的滯留時間。滯留時間通常係以秒或分鐘的單位被引用。

在本發明之一方法中，該等抗體(諸如多特異性抗體)的滯留時間優選地基本上是相同的。不同的抗體在相同的管柱和條件可具有不相同的滯留時間。在本發明中，已被發現到的是：諸如多特異性抗體的抗體可以被選擇或設計以具有係為足夠接近的IEX滯留時間，俾以允許兩種或更多種抗體(諸如兩種或更多種多特異性抗體)在一個單一的IEX層析運行中的共純化。與該等個別的抗體之滯留時間的平均值偏差為10%或者更低的滯留時間典型的係為足夠接近的，俾以允許兩種或更多種抗體(諸如兩種或更多種多特異性抗體)在一個單一的IEX層析運行中的共純化。

根據本發明的一種用於抗體純化和/或分析之合適的CIEX HPLC方法使用TSKgel SP-STAT (7 µm粒徑, 4.6 mM I.D. x 10 cm L, Tosoh 21964)系列的離子交換管柱。該等管柱被填充以用於生物分子的速度與高解析分析還有分離之無孔樹脂粒子。位於TSKgel STAT管柱中的粒子含有一由多層離子交換基團所構成的開放式出入網狀結構來供裝載容量，而該粒徑使得這些管柱適合於供HPLC和FPLC系統之用。

一種合適的方法涉及到TSKgel SP-STAT (7 µm粒徑, 4.6 mM I.D x 10 cm L, Tosoh 21964)使用緩衝液A (磷酸鈉緩衝液, 25 mM, pH 6.0)之平衡，在這之後抗體係藉由提高鹽濃度以及運行緩衝液B (25 mM磷酸鈉, 1 mM NaCl, pH 6.0)之一梯度而從該管柱被排出。流速被設定在0.5 mL/分鐘。關於測試樣品以及對照組之注入樣品質量係為10 µg，而注入體積是10-100 µL。層析圖係根據220 nm的結果就所觀察到的波峰型態(peak patterns)、滯留時間以及主要波峰的波峰面積來予以分析。對於更大量的抗體，該方法可以是成比例的。

抗體製備物的CIEX層析運行之典型圖被描繪於圖2中。用於這個運行的該等抗體係從如示範例中所示之被轉染的細胞來予以收集，以及藉由使用一種蛋白質A管柱而從位於培養基中的許多其他蛋白質被純化出。如示範例中所示的，抗體係藉由酸洗提而被洗提出，接續以中和作用以及緩衝液交換成為PBS pH 7.4。該抗體製備物之一樣品隨後被裝填至該CIEX 管柱上。在清洗之後，被聯合的蛋白質係藉由施用一鹽梯度而被洗提出。對於圖2A和圖2B中的樣品，該等CIEX條件是相同的。滯留時間係就雙特異性抗體的波峰之頂端來予以計算。兩種或更多種抗體(諸如多特異性抗體)的滯留時間優選地係與該兩種或更多種抗體的滯留時間之平均值偏差為10%或者更低。一個大於10%的偏差典型地導致該等抗體從半抗體以及選擇性地就多特異性抗體而言從同質二聚體和/或其他抗體產物相關雜質之低效分離。在一個被偏好的具體例中，兩種或更多種抗體的滯留時間係與該兩種抗體的滯留時間之平均值偏差為9%或者更低。優選地係與該兩種或更多種抗體的滯留時間之平均值偏差為8%、7%、6%或5% 或者更低。在一個被偏好的具體例中，兩種或更多種抗體的滯留時間係與該兩種或更多種抗體的滯留時間之平均值偏差為4%或者更低。優選地是3%或者更低，優選地是2%或者更低。越來越相似的滯留時間典型地允許該等多特異性抗體從半抗體以及選擇性地同質二聚體和/或其他抗體產物相關雜質之越來越有效率的分離，而因此允許位於該IEX管柱之分餾物中的該兩種抗體之更乾淨的收集。

在本發明的手段和方法中，該兩種或更多種抗體(諸如該兩種或更多種多特異性抗體)的平均滯留時間係就要被共純化或收集的該等抗體來予以計算。因此在其中要被純化的該等抗體係為多特異性抗體之具體例中，該兩種或更多種抗體的平均滯留時間係根據該等多特異性抗體來予以計算。不要予以收集的抗體(諸如同質二聚體抗體)之滯留時間沒有被使用於該平均值的計算。

藉由選擇在被使用於IEX的條件下具有基本上相同的IEX滯留時間之抗體(諸如多特異性抗體)，諸如多特異性抗體的抗體可以被選擇以供本發明之一方法中的共純化。該等抗體(諸如多特異性抗體)也可以經由一個或更多個可變區之適當修飾而被特製，俾以在被使用於IEX的相同或相似條件下具有基本上相同的IEX滯留時間。

在一個具體例中，被尋求要予以共純化之被生成的抗體(諸如雙-和/或多特異性抗體)係具有相似的pI值。該等抗體之中的至少兩者之等電點(pI)與該至少兩種抗體的平均pI值優選地差異為0.4單位，0.3、0.2以及優選地0.1單位或更少。該至少兩種抗體的每一者之pI值優選地與另一者差異為0.25單位或更少。

在該等抗體的pI值之中的一個微小至沒有差異典型地允許一良好的共純化。有利地，位於一個抗體內之各別的半抗體的pI值與平均值的差異更大。這個差異在該CIEX層析步驟中促進了該等半抗體從“共”-徙動的完整抗體之一良好的分離。

在其中被尋求要予以共純化的該等抗體係為雙-或多特異性抗體的具體例中，被偏好的是：位於被尋求要予以共純化之該等抗體的每一者之中的可變領域之pI值與要予以共純化的其他抗體(們)的可變領域之pI值的平均值差異為大於0.2 (優選地0.3，優選地0.4、0.5、0.6、0.7、1.0、1.2、1.4，優選地是大於1.8或 2.0)單位。在這個具體例中，位於一個抗體之中的可變領域之pI值的差異優選地要比“x”和“y”之間的差異大至少0.2單位，優選地它係為要比“x”和“y”之間的差異大至少0.3、0.4、0.5 (優選地至少0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、2.0或2.5)，其中“x”是該等抗體之一第一者的兩個可變領域之pI值的平均值，而“y”是該等抗體之一第二者的兩個可變領域之pI值的平均值。如在位於一個抗體中的可變領域之pI值中所提及的一個差異典型地係表示該等抗體產物相關雜質從被尋求要予以共純化之該等抗體之一良好分離和/或從單特異性抗體之一良好分離。

包含有兩種或更多種雙-或多特異性抗體的某些組成物具有胺基酸序列係為相似的或者具有一基本上相同的胺基酸序列之恆定區以及輕鏈。這樣的兩種或更多種雙-和/或多特異性抗體典型地基本上只有在該等可變領域的胺基酸序列上或者基本上只有在該等重鏈可變區的胺基酸序列上係彼此不相同。在這樣的情況下，通常有需要來測定整個抗體的pI值。相反地，該等可變領域的pI值和/或該等重鏈可變區的pI值可以被測定。這提供一種用以估量該等抗體在一個CIEX層析步驟中是否可以緊靠在一起徙動(換言之該等抗體是否具有滯留時間係為足夠相同的而允許共純化)的手段。

在如本文所揭示的一種方法或組成物之一具體例中，兩種或更多種雙-或多特異性抗體具有恆定區以及輕鏈係具有相同的胺基酸序列或具有基本上相同的胺基酸序列。當位於每個抗體中的可變領域之平均pI值與被尋求要予以共純化之各別的抗體的可變領域之平均pI值差異為0.7單位或更少之時，該兩種或更多種雙-或多特異性抗體可以在一個CIEX層析步驟中來予以共純化。在一個被偏好的具體例中，該等抗體之一第一者的兩個可變領域之pI值的平均值“x”以及該等抗體之一第二者的兩個可變領域之pI值的平均值“y”差異為0.6單位或更少，優選地與被尋求要予以共純化的該第一和第二抗體的“x”和“y”之平均值差異為0.5單位或更少。“x”和“y”與被尋求要予以共純化的該第一和第二抗體的“x”和“y”之平均值差異優選地係為0.4 (優選地0.3，優選地0.2以及優選地0.1)單位或更少。這樣的雙-和/或多特異性抗體典型地具有基本上係為相同的滯留時間。在這個具體例中，該等抗體的恆定區基本上係為相同的。這樣的抗體之pI值而且特別是平均值“x”和“y”整體上係表示各別的抗體之pI值。在這個具體例中，被偏好的是：位於被尋求要予以共純化之該等抗體的每一者之中的可變領域之pI值與位於該等抗體中的可變領域之pI值的平均值差異為大於0.2 (優選地0.3，優選地0.4、0.5、0.6、0.7、1.0、1.2、1.4，優選地是大於1.8或 2.0)單位。在這個具體例中，位於一個抗體之中的可變領域之pI值的差異優選地要比“x”和“y”之間的差異大至少0.2單位，優選地它係為要比“x”和“y”之間的差異大至少0.3、0.4、0.5 (優選地至少0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、2.0或2.5)。如在位於一個抗體中的可變領域之pI值中所提及的一個差異典型地係表示半抗體從被尋求要予以共純化之該等抗體之一良好分離和/或從單特異性抗體之一良好分離。

在如本文所揭示的一種方法或組成物之一具體例中，兩種或更多種雙-或多特異性抗體具有恆定區以及輕鏈係具有相同的胺基酸序列或具有基本上相同的胺基酸序列。當位於每個抗體中的重鏈可變區之平均pI值與被尋求要予以共純化之各別的抗體的重鏈可變區之平均pI值差異為0.7單位或更少之時，該兩種或更多種雙-或多特異性抗體可以在一個CIEX層析步驟中來予以共純化。在一個被偏好的具體例中，該等抗體之一第一者的兩個重鏈可變區之pI值的平均值“m”以及該等抗體之一第二者的兩個重鏈可變區之pI值的平均值“n”差異為0.6單位或更少，優選地與被尋求要予以共純化的該第一和第二抗體的“m”和“n”之平均值差異為0.5單位或更少。“m”和“n”與被尋求要予以共純化的該第一和第二抗體的“m”和“n”之平均值差異優選地係為0.4 (優選地0.3，優選地0.2以及優選地0.1)單位或更少。這樣的雙-和/或多特異性抗體典型地具有基本上係為相同的滯留時間。在這個具體例中，該等抗體的恆定區基本上係為相同的。這樣的抗體之pI值而且特別是平均值“m”和“n”整體上係表示各別的抗體之pI值。在這個具體例中，被偏好的是：位於被尋求要予以共純化之該等抗體的每一者之中的重鏈可變區之pI值與位於該等抗體中的重鏈可變區之pI值的平均值差異為大於0.2 (優選地0.3，優選地0.4、0.5、0.6、0.7、1.0、1.2、1.4，優選地是大於1.8或 2.0)單位。在這個具體例中，位於一個抗體之中的重鏈可變區之pI值的差異優選地要比“m”和“n”之間的差異大至少0.2單位，優選地它係為要比“m”和“n”之間的差異大至少0.3、0.4、0.5 (優選地至少0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、2.0或2.5)。如在位於一個抗體中的重鏈可變區之pI值中所提及的一個差異典型地係表示半抗體從被尋求要予以共純化的該等抗體之一良好分離和/或從單特異性抗體之一良好分離。

該等抗體(諸如多特異性抗體)可以具有或被選擇以具有重鏈與輕鏈組合(半抗體)或同質二聚體(例如，單特異性抗體)或其他抗體產物相關雜質，此等在所使用的IEX條件下具有滯留時間係明顯地不同於該等完整抗體或所欲的抗體(諸如多特異性抗體)的滯留時間。在其中該細胞表現一種共同輕鏈之一具體例中，該選擇典型地係落在該重鏈上。該重鏈可以被修飾而使得該等半抗體或同質二聚體具有極為不同的滯留時間。在一個被偏好的具體例中，該等半抗體和/或同質二聚體的滯留時間與該等各別的抗體或多特異性抗體的滯留時間之平均值差異係大於10%。在一個被偏好的具體例中，一個被尋求不要予以共純化的抗體之個別的重鏈與輕鏈組合的pI值之平均值與要予以共純化的該至少兩種抗體的重鏈與輕鏈之pI值的平均值差異係大於0.5單位。

本發明進一步提供一種包含有可藉由一如本文所描述的方法而得到的2-10種重組型抗體之組成物。亦被提供的是一種包含有2-10種重組型抗體的組成物，特徵在於：該等抗體之中的至少兩者的IEX滯留時間基本上是相同的。

本發明進一步提供一種包含有2-10種重組型抗體的組成物，特徵在於：該等抗體之中的至少兩者的pI值與該至少兩種抗體的平均pI值差異為0.4單位，0.3、0.2以及優選地0.1單位或更少。該至少兩種抗體的每一者之pI值優選地與另一者差異為0.25單位或更少。

本發明進一步提供一種包含有2-10種重組型抗體的組成物，特徵在於：該第一抗體的兩個可變領域之pI值的平均值“x”以及該第二抗體的兩個可變領域之pI值的平均值“y”與被尋求要予以共純化的該第一和第二抗體的“x”和“y”之平均值差異為0.7、0.6以及優選地0.5單位或更少。“x”和“y”與被尋求要予以共純化的該第一和第二抗體的“x”和“y”之平均值差異優選地係為0.4 (優選地0.3，優選地0.2以及優選地0.1)單位或更少。這樣的抗體(諸如多特異性抗體)典型地具有基本上係為相同的滯留時間。在這個具體例中，該等抗體的恆定區基本上係為相同的。該抗體之各自包含有一個重鏈可變區與一個輕鏈可變區的不同可變領域之pI值而且特別是該等pI值的平均值整體上係表示該抗體的pI值。

本發明進一步提供一種包含有2-10種重組型抗體的組成物，特徵在於：該第一抗體的兩個可變領域之兩個重鏈可變區的pI值之平均值“m”以及該第二抗體的兩個可變領域之兩個重鏈可變區的pI值之平均值“n”與被尋求要予以共純化的該第一和第二抗體的“m”和“n”之平均值差異為0.7、0.6以及優選地0.5單位或更少。“m”和“n”與被尋求要予以共純化的該第一和第二抗體的“m”和“n”之平均值差異優選地係為0.4 (優選地0.3，優選地0.2以及優選地0.1)單位或更少。這樣的抗體(諸如多特異性抗體)典型地具有基本上係為相同的滯留時間。在這個具體例中，該等抗體的恆定區以及輕鏈可變區基本上係為相同的。該抗體之不同重鏈可變區的pI值而且特別是該等pI值的平均值整體上係表示該抗體的pI值。

在一個被偏好的具體例中，對於要被收集在該組成物中的所有該等抗體，該等IEX滯留時間和/或該等pI值優選地基本上是相同的。在一個被偏好的具體例中，該等抗體之中的至少兩者係為雙特異性抗體。優選地，該等抗體之中的至少兩者共享一個相同的重鏈。

在某些具體例中，一個或兩個V_H /V_L 結合區的共同輕鏈可變區包含有一個生殖系IgVκ1-39*01可變區V-節段。在特定的具體例中，一個或兩個V_H /V_L 結合區的輕鏈可變區包含有κ輕鏈V-節段IgVκ1-39*01。IgVκ1-39是免疫球蛋白可變κ1-39基因的簡寫。該基因也被稱為免疫球蛋白κ可變1-39、IGKV139、IGKV1-39。關於該基因的外部識別碼是：HGNC: 5740；Entrez Gene: 28930；Ensembl: ENSG00000242371。關於該V-區的胺基酸序列被提供於序列辨識編號：25之中。該V-區也可被組合以5個J-區之中的一者。被偏好的J-區是jk1和jk5，而被連接的序列被表示為IGKV1-39/jk1和IGKV1-39/jk5，替代名稱為IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01 (根據位在imgt.org的IMGT資料庫全球網站之命名)。在某些具體例中，一個或兩個V_H /V_L 結合區的輕鏈可變區包含有κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ1*05 (分別為序列辨識編號：26和序列辨識編號：27)。

在某些具體例中，一個雙特異性抗體的一個或兩個V_H /V_L 結合區之輕鏈可變區包含有：一個包含有胺基酸序列QSISSY的LCDR1 (序列辨識編號：22)、一個包含有胺基酸序列AAS的LCDR2以及一個包含有胺基酸序列QQSYSTP的LCDR3 (序列辨識編號：24)(亦即根據IMGT，IGKV1-39的該等CDRs)。在某些具體例中，一個雙特異性抗體的一個或兩個V_H /V_L 結合區之輕鏈可變區包含有：一個包含有胺基酸序列QSISSY的LCDR1 (序列辨識編號：22)、一個包含有胺基酸序列AASLQS的LCDR2 (序列辨識編號：23)以及一個包含有胺基酸序列QQSYSTP的LCDR3 (序列辨識編號：24)。

在某些具體例中，一個雙特異性抗體的一個或兩個V_H /V_L 結合區包含有一個輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含有一個胺基酸序列係為至少90% (優選地至少95%，更加優選地至少97%，更加優選地至少98%，更加優選地至少99%)相同於或100%相同於被闡述於序列辨識編號：26中的胺基酸序列。在某些具體例中，一個雙特異性抗體的一個或兩個V_H /V_L 結合區包含有一個輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含有一個胺基酸序列係為至少90% (優選地至少95%，更加優選地至少97%，更加優選地至少98%，更加優選地至少99%)相同於或100%相同於被闡述於序列辨識編號：27中的胺基酸序列。

舉例來說，在某些具體例中，相對於序列辨識編號：26或序列辨識編號：27，一個雙特異性抗體的一個或兩個V_H /V_L 結合區之可變輕鏈可以具有從0至10個(優選地從0至5個)胺基酸插入、刪除、取代、加入或者此等之一組合。在某些具體例中，相對於被指明的胺基酸序列，一個雙特異性抗體的一個或兩個V_H /V_L 結合區之輕鏈可變區包含有從0至9個、從0至8個、從0至7個、從0至6個、從0至5個、從0至4個，優選地從0至3個，優選地從0至2個，優選地從0至1個以及優選地0個胺基酸插入、刪除、取代、加入或者此等之一組合。

在其他的具體例中，一個雙特異性抗體的一個或兩個V_H /V_L 結合區之輕鏈可變區包含有序列辨識編號：26或序列辨識編號：27的胺基酸序列。在某些具體例中，一個雙特異性抗體的兩個V_H /V_L 結合區包含有相同的V_L 區。在一個具體例中，一個雙特異性抗體的兩個V_H /V_L 結合區之V_L 包含有被闡述於序列辨識編號：26中的胺基酸序列。在一個具體例中，一個雙特異性抗體的兩個V_H /V_L 結合區之V_L 包含有被闡述於序列辨識編號：27中的胺基酸序列。

雙特異性抗體(諸如被揭露於本文的方法中的那些)可呈許多的型式被提供。許多不同型式的雙特異性抗體被知曉於本技藝中。舉例來說，非為帶有兩個V_H /V_L 組合的典型抗體之雙特異性抗體型式具有至少一個可變領域係包含有一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區。這個可變領域可以被連接至提供第二結合活性的一個單鏈Fv-片段、單體、一個VH以及一個Fab-片段。

雙特異性抗體(諸如被揭露於本文所提供的方法中的那些)一般地是屬於人類IgG次型 (例如，舉例來說IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。在某些具體例中，該等抗體是屬於人類IgG1次型。全長的IgG抗體因為它們的有利的半衰期以及為了低免疫原性的緣故而被偏好。於是，在某些具體例中，該等雙特異性抗體係為全長的IgG分子。在一個具體例中，該等雙特異性抗體係為全長的IgG1分子。

在某些具體例中，抗體包含有一個可結晶的片段(Fc)。雙特異性抗體的Fc區優選地係由一個人類恆定區所構成。雙特異性抗體之一恆定區或Fc對於一個天然存在的人類抗體之恆定區可以含有一個或更多個(優選地不超過10個，優選地不超過5個)胺基酸差異。舉例來說，在某些具體例中，該等雙特異性抗體的各個Fab-臂可以進一步地包含一個Fc-區包含有促進該雙特異性抗體的形成之修飾、影響Fc-媒介的效應子功能之修飾和/或本文所描述的其他特點。

在一個方面中，被提供的是一種藥學組成物，其包含有如本文所界定的兩種或更多種抗體以及一藥學上可接受的載體。如本文所使用的，術語“藥學上可接受的”意指由一政府管理機構所批准或者被條列於美國藥典或另一種公認的藥典之內以供動物(特別是人類)的使用，並且包含其係為生理上相容的任何以及所有的溶劑、鹽類、分散介質、塗層、抗細菌和抗真菌劑、等滲劑與吸收延遲劑，諸如此等。術語“載體”意指伴隨化合物被投藥的一種稀釋劑、佐劑、賦形劑或載劑。這樣的藥學載體可以是無菌的液體，諸如水以及油，包含係為石油、動物、植物或合成來源的那些，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油、甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯(glycerol polyethylene glycol ricinoleate)，諸如此等。水或水性食鹽溶液以及水性葡萄糖和甘油溶液可以被使用作為載體，特別是用於可注射的溶液。用於不經腸投藥的液體組成物可予以配方來供注射或連續輸注的投藥。藉由注射或輸注的投藥途徑包含膀胱內、腫瘤內、靜脈內、腹膜內、肌肉內、鞘內以及皮下的。端視投藥途徑(例如，靜脈內地、皮下地、關節內地(intra articularly)，諸如此等)而定，活性化合物可以被包覆在一物質內，俾以保護該化合物免受酸以及其他可能使該化合物失活的自然狀況之作用。

適合於供投藥給人類病患的藥學組成物典型地被配方以供不經腸投藥，例如，位在一液體載體中，或者適合於供回溶成為液體溶液或懸浮液來供靜脈內投藥。為了投藥的容易性以及劑量的均一性，該組成物可呈劑量單位形式來予以配方。

亦被包含的是固體製備物，它們被意圖在使用前不久被轉化為供口服或不經腸投藥的液體製備物。這樣的液體形式包含溶液、懸浮液以及乳液。

一個“雙特異性抗體”是一個如本文所描述的抗體，其中該抗體的一個領域結合至一個第一抗原，而該抗體的一個第二領域結合至一個第二抗原，其中該第一和第二抗原不是相同的。術語“雙特異性抗體”亦涵蓋抗體，其中一個重鏈可變區/輕鏈可變區(V_H /V_L )組合結合一個位在一抗原上之第一表位，以及一個第二V_H /V_L 組合結合一個第二表位。該術語進一步包含抗體，其中一個V_H 能夠特異性地辨識一個第一抗原，而在一免疫球蛋白可變區中被配對以該V_H 的V_L 能夠特異性地辨識一個第二抗原。所形成的V_H /V_L 配對(pair)將會結合抗原1或者抗原2。這種所謂的“二合一抗體”，被描述於例如WO 2008/027236、WO 2010/108127以及Schaefer等人(Cancer Cell 20, 472-486, October 2011)之中。一種根據本發明的雙特異性抗體不受限於用以生成它的任何特定型式或方法。

當在本文提及核酸或胺基酸序列時，“百分比(%)相同性”被定義為：在排比序列以供最佳比較目的之後，一候選序列中的殘基與一選定序列中的殘基係為相同的百分比。比較核酸序列的百分比序列相同性係使用Vector NTI Program Advance 10.5.2軟體的AlignX應用程式使用預設值來予以測定，該等預設值使用一種改良的ClustalW演算法 (Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J. (1994) Nuc. Acid Res. 22: 4673-4680)、swgapdnarnt得分矩陣(swgapdnarnt score matrix)、一為15的空位開放罰分(gap opening penalty)以及一為6.66的空位延伸罰分(gap extension penalty)。胺基酸序列係使用Vector NTI Program Advance 11.5.2軟體的AlignX應用程式使用預設值來予以排比，該等預設值使用一種改良的ClustalW演算法(Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J., 1994)、blosum62mt2得分矩陣(blosum62mt2 score matrix)、一為10的空位開放罰分以及一為0.1的空位延伸罰分。

如本文所使用的術語“共同輕鏈”意指位於雙特異性抗體中的兩個輕鏈(或其V_L 部分)。該兩個輕鏈(或其V_L 部分)可以是相同的或者具有某些胺基酸序列差異而全長的抗體之結合特異性未被影響。術語“共同輕鏈”、“共同V_L ”、“單一輕鏈”、“單一V_L ”，有或無術語“重排的”的加入，在本文被互換地使用。“共同”也意指該輕鏈之胺基酸序列不是相同的功能等效物。該等輕鏈的許多變異體存在，其中不影響有功能的結合區之形成的突變 (刪除、取代、插入和/或加入)是存在的。本發明的輕鏈也可以是一個如本文上面所指明的輕鏈，具有從0至10個(優選地從0至5個)胺基酸插入、刪除、取代、加入或者此等之一組合。舉例來說，製備或發現非為相同的但仍為功能上等效的輕鏈係落在如本文所使用的共同輕鏈之定義的範圍之內，例如，藉由引入以及測試守恆的胺基酸變化、位在當被配對以該重鏈之時不會或僅部分地有助於結合特異性之區域內的胺基酸之變化，諸如此類。根據本發明的術語“全長的IgG”或“全長的抗體”被定義為包含有一個基本上完整的IgG，但是它不必然地具有一個完整的IgG之所有功能。為了避免疑問，一個全長的IgG含有兩個重鏈和兩個輕鏈。各個鏈含有恆定區(C)和可變區(V)，它們可被分解成被指派為CH1、CH2、CH3、V_H 以及C_L 、V_L 的領域。一個IgG抗體經由被包含在Fab部分中的可變區領域而結合至抗原，並且在結合之後可以透過該等恆定領域(大多數係透過Fc部分)而與免疫系統的分子和細胞相互作用。根據本發明之全長的抗體涵蓋IgG分子，其中提供所欲求的特徵之突變可能是存在的。全長的IgG不應具有該等區域之任何一者的實質部分之刪除。但是，當中的一個或數個胺基酸殘基被刪除而基本上不改變所形成的IgG分子之結合特徵的IgG分子被包羅在術語“全長的IgG”之內。舉例來說，這樣的IgG分子可以具有一介於1個和10個胺基酸殘基之間的刪除，優選地係位在非-CDR區中，其中該等被刪除的胺基酸對於該IgG的抗原或表位結合特異性而言不是必需的。

由於一抗體典型地辨識一抗原之一表位，而這樣的一個表位可能也存在於其他的化合物中，“特異性地辨識”一抗原之根據本發明的抗體可能也辨識其他的化合物，如果該等其他的化合物含有同一種的表位。因此，術語“特異性地辨識”，就一抗原與抗體相互作用而言，不排除該等抗體對含有同一種的表位之其他的化合物之結合。

術語“表位”或“抗原決定位”意指一個位在一抗原上的位址，一個免疫球蛋白或抗體特異性地結合至該位址。表位可以從相連胺基酸或藉由一個蛋白質之三級摺疊而被並置的非相連胺基酸而被形成(所謂的線形或構形表位)。從相連直鏈胺基酸而被形成的表位在暴露於變性溶劑之下典型地被保留，而藉由三級摺疊而被形成的表位在使用變性溶劑的處理之下典型地會喪失構形。一個表位典型地可以在一個獨特的空間構形中包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸。用以測定表位的空間構形之方法係為具有本領域之通常技藝的人士所知曉的，並且包含本領域中的技術，例如X射線晶體學、氫氘交換質譜法(HDX-MS)以及二維核磁共振(2-dimensional nuclear magnetic resonance)、肽掃描(pepscan)以及根據表位的本質之丙胺酸掃描(alanine scan)(參見，例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996))。

為了明確性以及一個簡潔的發明說明之目的，特徵在此被描述以作為相同的或獨立的具體例之部分，然而，將會被理解的是：本發明的範圍可以包含具有全部的或者一些的所述特徵之組合的具體例。

為了讓本發明可以被更容易地瞭解，某些術語首先予以界定。附加定義被闡述於整個詳細說明之中。除非另有說明，被使用於本文的所有的技術性和科學性術語具有通常為一具有本領域之通常技藝的人士所瞭解的意義，而且免疫學、蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術與藥理學之傳統方法被使用。

如本文所使用的，單數形式“一個(a)”、“一個(an)”以及“該”包含複數指示物，除非上下文另有明確規定。術語“包含(including)”還有其他形式(諸如動詞原形的“include”、第三人稱單數動詞的“includes”和動詞過去式的“included”)的使用是沒有限制的。

示範例 示範例1 材料與方法細胞株

HEK293和CHO-K1被維持於生長培養基中。雙特異性抗體 的產生

雙特異性抗體係使用專有的CH3技術(而被產生，俾以確保一雙特異性抗體之有效異二聚體化與形成。如先前所述的(PCT/NL2013/050294；被公告為WO 2013/157954 A1)，該CH3技術利用位於該CH3區中的以電荷為基礎的點突變，俾以允許兩個不相同的重鏈分子之有效配對。

一個VH基因被選殖至兩個不相同架構的IgG1載體之中的一者內。端視結合夥伴而定，該VH被選殖至一個包含有帶有異二聚體化變異體“DE”的CH3變異體之IgG1架構或者包含有互補的CH3異二聚體化變異體“KK”的IgG1架構中。在其中的兩種或更多種抗體共享一個重鏈之雙-或多特異性抗體的情況下，該共享鏈優選地具有該CH3異二聚體化變異體“DE”(亦被稱為該DE-重鏈)，而該兩種或更多種獨特的重鏈具有該CH3異二聚體化變異體“KK”(亦被稱為該KK-重鏈)。

HEK293細胞被短暫轉染以DNA-FUGENE混合物並且被進一步的培養。在轉染之後7天，上澄液被收穫，而培養基被更新。在轉染之後14天，上澄液被合併並且予以過濾通過0.22 µM。無菌上澄液被儲存在4℃下。經懸浮調適的293F細胞被培養於位在一個振盪器盤上的T125培養瓶內直到一為3.0x10⁶ 個細胞/mL的密度。細胞在一為0.3-0.5x10⁶ 個活細胞/mL的密度之下被播種至一個24深孔培養盤的每一個孔之內。該等細胞被短暫轉染以個別的無菌DNA:PEl-MIX並且被進一步的培養。在轉染之後7天，上澄液被收穫並且予以過濾通過0.22 µM。無菌上澄液被儲存在4℃下。共表現兩種雙特異性抗體之安定的細胞株池的產生

CHO細胞被轉染以3種重鏈建構物以及一種共同輕鏈建構物，呈一共同輕鏈建構物(cLC)：EGFR重鏈：HER2重鏈：HER3重鏈的莫耳比係為2.5：2：1：1。10個由被安定地轉染的細胞所構成之池(A-J)被獲得。抗-EGFR、抗-HER2以及抗- HER3抗體的ELISA分析係於該10個池的第3天與第6天的上澄液來予以執行。全部3種特異性可以在所有的池中被測定出。共表現兩種雙特異性抗體之安定的細胞株選殖株的產生

該等池被平板接種於半固體培養基中，並且被允許生長歷時7-10天。單一群落被挑選並且被播種至24井培養盤之內。在從培養物的上澄液收集抗體之前，群落被再播種。抗體力價(antibody titers) 的測定

含有一種單一雙特異性抗體的樣品之抗-HER2抗體力價係藉由針對Erbb-2 Fc蛋白質(R&D systems)的ELISA來予以測定。含有一種單一雙特異性抗體的樣品之抗-HER3力價係藉由針對人類Erbb-3-Fc蛋白質(R&D systems)的ELISA來予以測定。含有一種單一雙特異性抗體的樣品之抗-EGFR抗體力價係藉由針對人類EGFR ECD-Fc蛋白質(R&D systems)的ELISA來予以測定。該等抗原的連續2倍稀釋物被用來塗覆一個ELISA盤之孔，從5 µg/mL開始。

用以定量包含有該兩種雙特異性抗體的組成物之中的EFGRxHER2和EGFR x HER3雙特異性抗體之ELISA分析係藉由以EGFR-Fc (R&D systems)來塗覆ELISA盤而被進行的。在清洗之後，該等盤使用樣品來予以培育。在清洗之後，帶有一個EFGR臂以級一個HER2臂之被結合的雙特異性抗體之存在係藉由以經標示的HER2-Fc來進行培育而被偵測。帶有一個EFGR臂以級一個HER3臂之被結合的雙特異性抗體之存在係藉由以經標示的HER3-Fc來進行培育而被偵測。IgG 純化

IgG的純化係使用親和力層析法來予以執行。純化係在無菌條件下使用真空過濾來予以執行。首先，培養基的pH值被調整至pH 8.0，而生成物隨後於25℃之下、在一設為600 rpm的平板搖動儀上，以蛋白質A Sepharose CL-4B珠粒 (50% v/v)(Pierce)予以培育歷時2小時。其次，該等珠粒藉由真空過濾而被收穫。珠粒以PBS pH 7.4予以清洗2次。IgG係在pH 3.0之下使用0.1 M檸檬酸鹽緩衝液來予以洗提，而IgG分餾物立即藉由Tris pH 8.0來予以中和。緩衝液交換係藉由使用Ultracel (Millipore)的離心法來予以執行。該等樣品最後係處於一為PBS pH 7.4的最終緩衝液中。陽離子交換層析法(CIEX)

CEX-HPLC層析法係使用TSKgel SP-STAT (7 µm粒徑, 4.6 mM I.D. x 10 cm L, Tosoh 21964)系列的離子交換管柱而被完成。該等管柱被填充以用於生物分子的速度與高解析分析還有分離之無孔樹脂粒子。位於TSKgel STAT管柱中的粒子含有一由多層離子交換基團所構成的開放式出入網狀結構來供裝載容量，而該粒徑使得這些管柱適合於供HPLC和FPLC系統之用。

TSKgel SP-STAT (7 µm粒徑, 4.6 mM I.D x 10 cm L, Tosoh 21964)係使用緩衝液A (磷酸鈉緩衝液, 25 mM, pH 6.0)來予以平衡，在這之後抗體係藉由提高鹽濃度以及運行緩衝液B (25 mM磷酸鈉, 1 mM NaCl, pH 6.0)之一梯度而從該管柱被排出。流速被設定在0.5 mL/分鐘。關於所有的測試樣品以及對照組(配於PBS中)之注入樣品質量係為10 µg，而注入體積是10-100 µL。層析圖係根據220 nm的結果就所觀察到的波峰型態、滯留時間以及主要波峰的波峰面積來予以分析。 結果

雙特異性抗體PB4516p08和PB6892p04的CIEX曲線圖被比較(參見圖2)。被觀察到的是：PB6892的生成含有一明顯數量的雜質。又，PB6892的雙特異性抗體分餾物之滯留時間是明顯地低於PB4516的雙特異性抗體分餾物之滯留時間。為了藉由同一細胞之共同生成以及隨後使用CIEX之共純化，該兩種雙特異性抗體的滯留時間優選地是靠得更近。為此原因，PB6892的HER2臂之可變區被替換為一個不相同的可變區。帶有可變區MF2032的重鏈被選擇和使用，俾以生成EGFR x HER2雙特異性抗體PB11244。PB4516p10和PB11244p01的CIEX曲線圖被顯示於圖3中。該等雙特異性抗體分餾物的滯留時間分別為16.310和16.950。這些滯留時間係足夠相同以允許在所示的條件下之使用CIEX之共純化。此外，該圖顯示：雜質的滯留時間係充分地不相同以允許在分析級和製備級管柱中的有效分離。上述的雙特異性抗體製備物係在HEK293細胞中被生成。

為了共同生成，CHO-K1細胞被使用。CHO細胞被轉染以含有三種重鏈建構物，該三種重鏈帶有MF3755 (EGFR)、M2032 (HER2)和MF3178 (HER3)之各別的可變區，連同以一表現具有序列辨識編號：26的輕鏈可變區之建構物來轉染CHO-K1細胞。載體陽性細胞被選擇與匯集。由被轉染的CHO-K1細胞所構成之10個獨立池 (被識別為A-J)被產生。

表1顯示由各別的池所生成的雙特異性抗體PB4516 (EGFR x HER3)和PB11244 (EGFR x HER2)之數量。又，該等數量之比值還有被生成的IgG之總量被顯示。F池和J池被選擇以供次選殖。

表2顯示由各別的選殖株所生成的雙特異性抗體PB4516 (EGFR x HER3)和PB11244 (EGFR x HER2)之數量。

由選殖株FST2cp12所生成的抗體被使用，俾以分析CIEX 曲線圖(參見圖4)。清楚可見的是：該兩種雙特異性抗體有效地共洗提於相同的CIEX洗提分餾物中。

選殖株FST2cp09被進一步地次選殖，俾以確保該細胞株是單源性，而一個進一步的CIEX曲線圖確定了被生成的該等抗體。圖5顯示該CIEX曲線圖。清楚可見的是：該兩種雙特異性抗體有效地共洗提於相同的CIEX洗提分餾物中。該兩種雙特異性抗體在該共洗提中的相對貢獻係藉由ELISA和/或藉由疏水性交互作用管柱來予以分析。雙特異性抗體特異性ELISA表明743 µg/mL的EGFR/HER2雙特異性抗體PB11244以及1134 µg/mL的EGFR/HER3雙特異性抗體PB4516之存在。 示範例2共表現兩種雙特異性抗體之安定的細胞株池的產生

表現圖7中所條列之成雙成對的(two by two)雙特異性抗體之細胞株係如下述來予以生成。CHO細胞被轉染以3種重鏈建構物以及1種共同輕鏈建構物。該3種重鏈係藉由被表明於該框中的重鏈可變區(MFXXXX)來予以識別。該輕鏈包含有具有序列辨識編號：26的IgVκ1*39/jk1之輕鏈可變區序列。該兩種雙特異性抗體具有一個係為共同的重鏈以及一個各自不同的重鏈。舉例來說，被指明於圖7中的第一對共享一個共同重鏈(包含有相同的HER3結合臂係包含有一個重鏈可變區(MF3178))以及一個不相同的第二結合臂。PB4528具有一個EGFR結合臂帶有一個重鏈可變區(MF4003)，而PB4188具有一個HER2結合臂帶有一個重鏈可變區(MF3958)。該共享重鏈具有相容的DE/KK異二聚體化領域之KK CH3區。該共享重鏈臂也可以具有DE CH3區。舉例來說，在圖3-5處，兩種雙特異性抗體被共純化，PB11244和PB4516。如圖3c處所顯示的，PB11244和PB4516共享該相同的EGFR結合臂帶有一個重鏈可變區(MF3755)，以及PB11244具有一個HER2結合臂帶有一個重鏈可變區(MF2032)，而PB4516具有一個HER3結合臂帶有一個重鏈可變區(MF3178)。在這一對的雙特異性抗體之中的共享重鏈臂具有DE CH3區，而該等不相同的HER2和HER3結合臂具有KK CH3區。

共同輕鏈建構物(cLC)：共享重鏈建構物：不相同的重鏈建構物1：不相同的重鏈建構物2之莫耳比 = 2.5：2：1：1。由被安定地轉染的細胞所構成之池被獲得。抗原的ELISA分析係在從該等池所收集的上澄液來予以執行。全部3種抗原結合物種在該等池中被測定出。位在圖7的每一對之中的雙特異性抗體之CIEX滯留時間係在相似的CIEX條件下來予以測定並且被表明於第8個直行中。與平均滯留時間的偏差係使用公式100x((A-B)/(A+B))來予以計算，其中A係為具有最長的滯留時間之雙特異性抗體的滯留時間。舉例來說，有關於第一對的偏差係為100x((16.46-16.24)/(16.46+16.24)) = 0.67或0.7%。

位於被收集的上澄液中的抗體首先藉由蛋白質A萃取，接續以酸洗提與快速中和，而從該上澄液中的其他蛋白質被分離出。被收集的抗體之緩衝液隨後被交換為PBS。該等樣品隨後被裝填至CIEX管柱上，並且藉由給予一增高的鹽梯度來予以清洗和洗提。洗出液的吸收係在220 nm下來予以測量，而滯留時間係從該鹽梯度的起始以及雙特異性抗體的波峰之觀察來予以計算。該等雙特異性抗體被收集，而位於被收集的洗出液中之各別的雙特異性抗體係藉由ELISA來予以驗證(verified)。各別的雙特異性抗體之滯留時間被表明於最後一個直行中。清楚可見的是：許多的配對係具有在一個CIEX管柱中有效地共洗提之滯留時間。亦清楚可見的是：該CIEX層析法提供共洗提的雙特異性抗體和各別的同質二聚體(如果有的話)之一良好分離。圖6條列出存在於共洗提的雙特異性抗體之中的帶有重鏈(包含有重鏈可變區)之同質二聚體的各種不同抗體之滯留時間。清楚可見的是：該等同質二聚體的滯留時間係充分地不同於各別的雙特異性抗體。舉例來說，在圖7的第一個框中，該等同質二聚體PG3178、PG3958和PG4003可以存在於一個生成物中。該等各別的同質二聚體之滯留時間係為大約22、12和13 (圖6，橫列1-3)，而包含有該重鏈可變區的該等雙特異性抗體之滯留時間係為大約19和19.5 (圖7，橫列1和2)。表1

池	濃度 α-EGFR x α-HER2 (μg/mL)	濃度 α-EGFR x α-HER3 (μg/mL)	比值 (α-EGFR x α-HER2: α-EGFR x α-HER3)	總IgG (μg/mL)
A	153.6	162.0	1:1.1	315.6
B	120.2	336.3	1:2.8	456.3
C	325.5	741.6	1:2.3	167.1
D	510.6	856.8	1.1.7	1367.4
E	273.0	526.5	1:1.9	799.6
F	1824.7	1024.9	1:0.6	2849.6
G	704.2	849.8	1:1.2	1554.0
H	951.1	467.5	1:0.5	1418.6
I	450.7	691.0	1:1.5	1141.7
J	1288.9	1572.1	1:1.2	2861.0

表1：細胞池中的EGFRxHER2與EGFRxHER3雙特異性抗體生成之定量。10個池(A-J)的培養物上澄液被估量。ELISA分析係根據EGFR-Fc塗覆、被生成的抗體之結合以及使用經標示的HER2-Fc或者經標示的HER3-Fc之偵測。A-J池係使用該兩種ELISA分析來予以分析。雙特異性抗體PB4516和PB11244係為帶有相容的DE/KK異二聚體化領域之IgG1重鏈抗體。該等重鏈被組合以該共同輕鏈。該等雙特異性抗體在一個重鏈上共享該MF3755重鏈可變區，並且各自在另一個IgG1重鏈上具有一個不相同的重鏈可變區(對於PB4516係為MF3178，以及對於PB11244係為MF2032)。表2

#	HER2 (μg/mL)	HER3 (μg/mL)	HER2/HER3
FST1cp02	48.7	1449.2	0.03
FST1cp03	103.4	488.9	0.21
FST1cp04	131.4	1675.0	0.08
FST1cp14	259.1	214.6	1.21
FST1cp24	372.3	817.0	0.46
FST1cp26	92.2	706.7	0.13
FST2cp09	1026.2	1509.0	0.68
FST2cp12	725.7	1334.2	0.54
FST2cp13	737.4	1173.0	0.63
FST2cp20	617.6	1759.3	0.35
FST2cp21	993.0	1852.3	0.54
FST2cp23	937.4	1095.5	0.86
JST1cp01	121.3	490.6	0.25
JST1cp04	239.8	387.7	0.62
JST1cp05	187.2	759.0	0.25
JST1cp09	828.6	718.5	1.15
JST1cp13	103.5	175.8	0.59
JST1cp24	481.5	423.7	1.14

表2：被選擇的池被使用於單一細胞選殖。18個群落從3個池被挑選出。兩個獨立的F池(FST1和FST2)以及一個J池(JST1)被使用於單一細胞選殖。指示“cp”接續以一個數字辨識一個池之個別的群落。讓被挑選的群落生長並且予以使用於抗體的收集。來自相同的池之個別的群落生成不同數量的以及不同比例之各別的雙特異性抗體。

1:重鏈 2:異二聚體化領域之相容的部分 3:異二聚體化領域的一個部分 4:輕鏈、共同輕鏈 5:重鏈可變區 6:重鏈可變區 7:重鏈可變區

圖 1 為具體例之一示意圖示，其中該組成物包含有兩個雙特異性抗體係共享一共同臂。該圖描繪帶有重鏈(1)以及輕鏈(4)的抗體。4個重鏈具有3個不相同的可變區(5、6以及7)。具有該共享的可變區(5)之重鏈具有一個異二聚體化領域的一個部分(3)。帶有可變區(6)以及(7)的該等重鏈具有該異二聚體化領域之相容的部分(2)。異二聚體化區(2)以及(3)之被偏好的配對可以引導雙特異性抗體的形成。

圖 2 顯示圖片A：雙特異性抗體PB4516生成編號8 (p08)在220 nm之下的CIEX-曲線圖；圖片B：雙特異性抗體PB6892生成編號4 (p04)在220 nm之下的CIEX-曲線圖。

圖 3 顯示圖3a：雙特異性抗體 PB4516生成編號10 (p10)在220 nm之下的CIEX-曲線圖；圖3b：雙特異性抗體PB11244生成編號1 (p01)在220 nm之下的CIEX-曲線圖；圖3c：每個框有兩種雙特異性抗體被識別於直行PB (PBXXXX(X))中。關於PB11244和PB4516的重鏈可變區被表明於直行標靶1和標靶2中。輕鏈的序列對於所有的抗體係為相同的並且具有序列辨識編號：26的共同輕鏈IgKV1*39/jk1之胺基酸序列。對於每一個重鏈可變區，以ExPASy ProtParam工具予以計算的pI值被表明於直行pI中。該兩種重鏈可變區之間的pI值差異被表明於最後的直行中，證明了PB11244和PB4516之間的平均V_H pI值差異係為0.08。

圖 4 顯示池FST2之個別的群落cp12之一抗體製備物在220 nm之下的CIEX-曲線圖。該CIEX-曲線圖顯示共洗提抗體PB4516和PB11244之一銳峰。該曲線圖顯示：該樣品含有一有限數量的產物相關雜質。它亦顯示共洗提雙特異性抗體和各自徙動的產物相關雜質之間的良好分離。

圖 5 顯示群落CP07之一抗體製備物在220 nm之下的CIEX-曲線圖。該群落係從單一群落FST2cp09的個別群落之一收集而被挑選出。第二次的次選殖被完成，俾以確保FST2cp09-cp07細胞株是一個單源性細胞株。雙特異性抗體特異性ELISA表明743 µg/mL的EGFR/HER2雙特異性抗體PB11244以及1134 µg/mL的EGFR/HER3雙特異性抗體PB4516之存在。

圖 6 顯示具有兩個相同的可變領域之抗體同質二聚體(PGXXXX)的滯留時間。該重鏈可變區的胺基酸序列具有圖8中針對MF所出示的序列以及一為序列辨識編號：26的共同輕鏈IgKV1*39/jk1。

圖 7 顯示每個框有兩種雙特異性抗體被識別於直行PB (PBXXXX(X))中。該等雙特異性抗體的每一者之重鏈可變區(MFXXXX)被表明於直行標靶1和標靶2中。輕鏈的序列對於所有的抗體係為相同的並且具有序列辨識編號：26的共同輕鏈IgKV1*39/jk1之胺基酸序列。對於每一個重鏈可變區，以ExPASy ProtParam工具予以計算的pI值被表明於直行pI中。兩個重鏈可變區之間的pI值差異以及被測量的滯留時間被表明於最後兩個直行中。被測量的滯留時間以及被計算的pI值和平均pI值表明：一對的雙特異性抗體在CIEX層析中可以有效地共洗提。該等抗體具有IgG1恆定區以及一個共同輕鏈。具有共享重鏈可變區(相同的MF)之帶有CH3 DE重鏈或KK重鏈的重鏈被表明。關於在每個特異性抗體上所執行的CIEX層析之滯留時間被表明，有一個用於CIEX層析的例示性條件被描述於材料與方法章節中。許多其他的CIEX層析條件將會導致合適的滯留時間係介於被條列之具有所提供的pI數值之雙特異性抗體配對之間。

圖8 顯示各別的抗體之重鏈可變區(MFXXXX)和輕鏈可變區的CDRs之胺基酸序列以及共同輕鏈可變區的胺基酸序列。

(無)

Claims (23)

1. 一種用以生成至少兩種抗體的方法，包括： –  提供帶有編碼該等抗體的核酸之細胞； –  培養該等細胞； –  從培養物來收集該等抗體；以及 –  藉由離子交換層析法(IEX)而將被生成的抗體與半抗體分開來； 該方法特徵在於：在所使用的IEX條件下，該等抗體展現出IEX滯留時間係與個別的抗體之滯留時間的平均值偏差為10%或者更低。
2. 如請求項1的方法，其中從該培養物來收集該等抗體包括藉由抗體親和力純化而從其他蛋白質純化出抗體，優選地是藉由蛋白質A萃取。
3. 如請求項2的方法，其中進一步包括將親和力純化的抗體引至粒徑篩析層析法(size-exclusion chromatography)(凝膠過濾層析法和/或陰離子交換層析法)。
4. 如請求項1-3的方法，其中在該IEX之後，被收集的抗體係藉由疏水性交互作用層析法(HIC)來予以定量分析相對的表現位準。
5. 如請求項4的方法，其中被收集的抗體之特異性係藉由ELISA來予以驗證。
6. 如請求項1-5的方法，其中各別的半抗體之滯留時間係落在該等抗體的滯留時間所跨距的範圍之外。
7. 如請求項6的方法，其中該等細胞生成3種重鏈。
8. 如請求項7的方法，其中該等重鏈包含有供重鏈之有效異二聚體化的領域。
9. 如請求項1-8的方法，其中該等抗體之中的至少兩者係為雙特異性抗體。
10. 如請求項1-9的方法，其中該等抗體之中的至少兩者共享一個相同的重鏈。
11. 如請求項1-10的方法，其中該等抗體具有等電點(pI)，其係與該至少兩種抗體的平均pI值差異為0.4單位或更少。
12. 如請求項1-11的方法，其中該等抗體被選擇以供具有重鏈與輕鏈組合，該等重鏈與輕鏈組合在所使用的IEX條件下具有滯留時間係明顯地不同於完整抗體的滯留時間。
13. 如請求項12的方法，其中重鏈與輕鏈組合的pI值與該至少兩種抗體的平均pI值差異為0.4單位或更少。
14. 如請求項1-13的方法，其中該等重鏈包含有一個有利於重鏈之異二聚體化的CH3領域。
15. 如請求項1-14的方法，其中該等抗體的重鏈係為IgG重鏈。
16. 如請求項7-15的方法，其中一個重鏈包含有位在CH3區中的胺基酸取代L351K和T366K (EU編號)，而另一個重鏈包含有位在CH3區中的胺基酸取代L351D和L368E。
17. 一種用以生成至少抗體的方法，包括： –  提供帶有編碼該等抗體的核酸之細胞； –  培養該等細胞； –  從培養物來收集該等抗體；以及 –  藉由離子交換層析法(IEX)而將被生成的抗體與半抗體分開來； 該方法特徵在於：在所使用的IEX條件下，該等抗體展現出IEX滯留時間係與個別的抗體之滯留時間的平均值偏差為10%或者更低，以及其中在該IEX之後，被收集的抗體係藉由疏水性交互作用層析法(HIC)來予以定量分析相對的表現位準，以及被收集的抗體之特異性係藉由ELISA來予以驗證。
18. 一種組成物，其包含有可藉由請求項1-17之一方法而獲得的2-10種重組型抗體。
19. 一種包含有2-10種重組型抗體的組成物，特徵在於：在該等IEX條件下，該等抗體之中的至少兩者的IEX滯留時間與個別的抗體之滯留時間的平均值偏差為10%或者更低。
20. 一種包含有2-10種重組型抗體的組成物，特徵在於：該等抗體之中的至少兩者的pI值與該至少兩種抗體的平均pI值差異為0.4單位或更少。
21. 如請求項18-20的組成物，特徵在於：對於所有的該等抗體，該等IEX滯留時間和/或該等pI值基本上是相同的。
22. 如請求項18-21的組成物，其中該等抗體之中的至少兩者係為雙特異性抗體。
23. 如請求項22的組成物，其中該等抗體之中的至少兩者共享一個相同的重鏈。

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