KR20220143459A - 알레르기성 호흡기 질환의 진단용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 CD44 변이체 3(CD44v3) 단백질, 또는 이를 암호화하는 유전자; 또는 히알루론산(hyaluronic acid)의 발현 수준을 측정하여 알레르기성 호흡기 질환의 발병 가능성을 정확하지만 용이한 방법으로 진단할 수 있고, 그에 따라 환자가 향후 적절한 치료를 계획할 수 있어 국민 건강 수준을 보다 드높일 수 있다.
Description
본 발명은 알레르기성 호흡기 질환의 진단용 조성물, 이를 이용한 진단용 키트 및 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
비염은 바이러스, 세균 또는 자극물에 의한 코의 점막에서의 만성 또는 급성 염증에 의해 발생한다. 염증은 일반적으로 콧물, 코막힘(nasal congestion) 및 후비루(post-nasal drip)를 일으키면서, 과도한 양의 점액질 생산을 야기한다. 비염은 미국에서만 5000 만명 이상의 사람들에게 영향을 주는 것으로 보고된다.
비염에는 감염성 비염, 알레르기성 비염 및 비알레르기성 비염을 포함하여 여러 종류가 있다. 감염성 비염은 바이러스나 세균 감염에 의해 발생한다. 감염성 비염의 종류로써 감기와 축농증이 있다.
알레르기성 비염은 전 세계 사람들의 20 % 이상에서 발생하는데 유병률은 매년 증가하고 있다. 알레르기성 비염은 사회 생활, 수면, 학교 및 직장에서 문제를 야기한다. 환자의 삶의 질은 비염의 정도와 지속 시간에 의해 달라질 수 있다. 알레르기성 비염은 먼지나 꽃가루와 같은 실내외의 알레르기 항원(allergen)에 대응한 전염증성(proinflammatory) 면역 반응이다. 증상은 일년 내내 발생하거나 그 해의 특정한 시기, 보통 봄, 여름 또는 가을에 나타날 수 있다. ARIA(Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma) 가이드라인은 알레르기 항원 회피, 환자 교육, 약물 요법 및 알레르기 항원 특이적 면역 요법으로써 알레르기성 비염의 관리를 설명하고 있다. 약물 요법의 경우, ARIA는 현재 중등도 이상의 고질적질환에 대해 비강내 2 세대 H1-항히스타민 및 비강내 코르티코스테로이드(corticosteroid)의 처치를 권장한다. Bousquet등의 2001년 논문(Bousquet et al., J. Allergy Clin.Immunol., 108(Suppl 5):S147-334, 2001) 및 2008년 논문(Bousquet et al., Allergy, 63(Suppl. 86):8-160, 2008)을 참조한다.
비알레르기성 비염은 알레르기 항원이나 감염원(infectious agent)에 의해서 촉발되는 것이 아닌 비염이다. 이러한 비알레르기성 비염에 대해서는 여전히 밝혀야 할 많은 것이 있지만, 그것의 트리거(trigger)는 코의 내벽에서 혈관의 확장을 일으켜 부기 및 드레이니지(drainage)를 야기하는 것으로 생각된다. 비알레르기성 비염의 종류로는 혈관운동성, 자율신경성, 호르몬성, 약물유발성, 위축성 및 미각성비염 그리고 약물성 비염 등이 있다. 혈관운동성 비염의 트리거로는 냄새, 연기(fume), 연기(smoke), 먼지, 온도 변화등이 있으며, 혈관운동성 비염은 알레르기성 비염과 함께 나타날 수 있다. 약물성 비염은 국소소염제의 장시간 사용으로 인해 다시 코막힘이 야기된 상태이다.
한편, 만성 부비동염(CRS)의 주요 병인은 지속적인 염증이며, 만성 부비동염은 콧물, 안면통, 후각 감퇴와 질병의 내시경적 신호 또는 CT 스캔 변화 중 어느 하나와 같은 증상 중 둘 이상이 최소 8~12주로 야기되는 비강 및 부비강의 염증으로 정의된다.
만성 부비동염은 비용종의 유무에 따라 비용종을 갖는 만성 부비동염(CRSwNP)과 비용종을 갖지 않는 만성 부비동염(CRSsNP)으로 분류되며, 비용종은 울퉁불퉁한 점막과 내시경을 통한 중비도 또는 양측 유경성 병소를 통해 확인할 수 있다. 조직 분석에 따르면, CRSwNP에서는 약 80% 코카시안 용종에서 주로 호산구로 이루어진 염증세포의 과도한 침윤을 나타내는 반면, CRSsNP에서는 전형적으로 보다 많은 호중구성 염증을 나타낸다. 만성 부비동염에서 호산구 염증은 자주 약물 치료에 저항성을 나타내며, 수술과 같은 외과적 치료를 필요로 하게 된다.
이러한 비염 및 부비동염을 진단하기 위한 방법은 여러 가지가 있는데 환자에 따라 혹은 진료 환경에 따라 다양하게 적용될 수 있으며 항상 모든 검사를 시행하는 것은 아니다. 예를 들어 병력으로 연령, 직업, 증상의 종류 및 정도, 발생 연령, 유발요인, 주거환경, 알레르기 원인 물질에의 노출 여부, 합병증, 알레르기 과거력, 가족력, 치료 경력과 경과를 조사하거나, 실험실 검사로서 혈청 총 IgE 검사, 특이 IgE 검사, 혈액 호산구와 호산구 양이온단백, 비즙 도말 검사 등을 시행할 수 있고, 그 외에 생체검사로 피부반응검사, 항원유발검사 등이 있으며, 이학적 검사로 주로 비경을 이용하여 비강 내부를 관찰하게 된다.
그러나 이러한 진단 및 검사 방법들은 피검자에게 부담이 되거나 고통을 초래하는 경우가 있고, 알레르기 항원 반응에 대한 민감도와 특이도가 떨어지는 경우가 있으므로, 이러한 점을 보완한 진단 방법이 요구되는 실정이다.
본 발명의 일 목적은 알레르기성 호흡기 질환을 진단할 수 있는 바이오마커를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 알레르기성 호흡기 질환을 진단하기 위한 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 알레르기성 호흡기 질환을 진단하기 위한 키트를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 알레르기성 호흡기 질환을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 알레르기성 호흡기 질환을 치료하기 위한 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, CD44 변이체 3(CD44 variant 3; CD44v3) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 히알루론산(hyaluronic acid) 중 적어도 하나를 포함하는 알레르기성 호흡기 질환의 진단용 바이오마커에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 상기한 알레르기성 호흡기 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성(위험성)을 확인하는 것이다.
본 발명에서 상기 "CD44v3"는 다양한 성장인자 및 케모카인(chemokines)을 고정(immobilize)하는 기능을 수행하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 성장인자 및 케모카인에는 헤파린 결합 상피성장인자 유사 성장인자(heparin binding-epidermal growth factor-like growth factor), 기본 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor: HGF), RANTES(Regulated on activation, normal T cell expressed and secreted) 및 MIP-1 beta(Macrophage inflammatory protein-1 beta) 등이 포함된다. 본 발명에서 상기 CD44v3는 히알루론산(hyaluronic acid)의 수용체로서 기능하는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 CD44v에서 스플라이싱된 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바이오마커는 IL-5, 에오탁신(eotaxin), RANTES, MCP-1, MIP-1α, CD40L, 프렉탈카인(fractalkine), GM-CSF, IL-8, IL-10, EGF, bFGF, TGF-α 및 VEGF로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 IL-5는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 에오탁신(eotaxin)은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 RANTES는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 MCP-1은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 MIP-1α는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 CD40L은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 프렉탈카인(fractalkine)은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 GM-CSF는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 IL-8은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 IL-10은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 EGF는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 bFGF는 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 TGF-α는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 VEGF는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바이오마커는 HAS2 및 HAS3 중 적어도 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 HAS2 및 HAS3는 비점막에서 히알루론산을 합성하는 효소로서, 상기 HAS2는 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 상기 HAS3는 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 알레르기성 호흡기 질환은 호흡기를 통해 알레르겐이 유입되어 개체 내에 유발될 수 있는 염증 반응으로서, 알레르기성 천식, 기관지염, 알레르기성 비염, 부비동염, 하기도 감염증 및 상기도 감염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 알레르기성 비염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, CD44 변이체 3(CD44v3) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 히알루론산(hyaluronic acid) 중 적어도 하나의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 알레르기성 호흡기 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 IL-5, 에오탁신(eotaxin), RANTES, MCP-1, MIP-1α, CD40L, 프렉탈카인(fractalkine), GM-CSF, IL-8, IL-10, EGF, bFGF, TGF-α 및 VEGF로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 HAS2 및 HAS3 중 적어도 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 CD44 변이체 3(CD44v3에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 CD44 변이체 3(CD44v3)의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법, 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 상기 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다.
본 발명에서 상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.본 발명에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다 [J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy (2006) 13, 496.502]. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.
본 발명에서 상기 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA: 올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 CD44 변이체 3(CD44v3), IL-5, 에오탁신(eotaxin), RANTES, MCP-1, MIP-1α, CD40L, 프렉탈카인(fractalkine), GM-CSF, IL-8, IL-10, EGF, bFGF, TGF-α, VEGF, HAS2 및 HAS3의 단백질이나, 이들을 암호화하는 유전자의 정보는 알려져 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명에서 상기 히알루론산의 발현 수준을 측정하는 제제는 표지되거나 표지되지 않은 히알루론산 결합 단백질(hyaluronic acid binding protein), 바람직하게는 표지된 히알루론산 결합 단백질일 수 있다.
본 발명에서 상기 "히알루론산 결합 단백질(hyaluronic acid binding protein; HABP)"은 소의 코 연골에서 분리한 것으로, 아그리칸(aggrecan)의 G1 도메인 또는 G1 및 연골 "링크(link)" 단백질의 조합으로 이루어져 있다.
본 발명에서 상기 표지의 방법은 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, 비오티닐화(biotinylation), 형광 염료, 방사성 동위 원소, 화학적 효소 등에 의한 것일 수 있으나, 바람직하게는 비오티닐화일 수 있다. 본 발명에서 상기 알레르기성 호흡기 질환은 호흡기를 통해 알레르겐이 유입되어 개체 내에 유발될 수 있는 염증 반응으로서, 알레르기성 천식, 기관지염, 알레르기성 비염, 부비동염, 하기도 감염증 및 상기도 감염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 알레르기성 비염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 알레르기성 호흡기 질환의 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에서는 상기 진단용 키트를 이용하여 알레르기성 호흡기 질환의 발병 여부, 발병 가능성 및 예후 등을 진단할 수 있다.
본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 알레르기성 호흡기 질환은 호흡기를 통해 알레르겐이 유입되어 개체 내에 유발될 수 있는 염증 반응으로서, 알레르기성 천식, 기관지염, 알레르기성 비염, 부비동염, 하기도 감염증 및 상기도 감염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 알레르기성 비염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CD44 변이체 3(CD44v3) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 히알루론산(hyaluronic acid) 중 적어도 하나의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 알레르기성 호흡기 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "목적하는 개체"란 알레르기성 호흡기 질환의 발병 여부가 불확실한 개체로, 발병 가능성이 높은 개체를 의미한다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 기관지 생검, 폐 생검, 비강 생검, 부비동 생검, 객담(sputum), 기관지 폐포세척액(bronchoalveolar lavage fluid; BALF), 비강 세척액(nasal lavage fluid), 비강 도말(nasal swap), 비강 흡인액 (nasal aspirate), 비인두 도말(nasopharyngeal swab), 비인두 흡인액(nasopharyngeal aspirate), 비인두 세척액(nasopharyngeal lavage fluid), 전혈(whole blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 눈물(tears), 점액(mucus), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있지만, 바람직하게는 발병 가능성이 높은 개체로부터 병리조직학적 검사용으로 용이하게 채취 가능한 비강 세척액, 비인두 세척액, 기관지 폐포세척액, 비강 도말, 비강 흡인액, 비인두 도말 또는 비인두 흡인액일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 열거한 비강 세척액, 비인두 세척액, 기관지 폐포세척액, 비강 도말, 비강 흡인액, 비인두 도말 또는 비인두 흡인액 내 세포로부터 유래된 코 상피 세포(Human nasal epithelial cells; HNE cells)일 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같이 분리된 생물학적 시료에서 CD44 변이체 3(CD44v3) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 히알루론산(hyaluronic acid) 중 적어도 하나의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 정보 제공 방법은 IL-5, 에오탁신(eotaxin), RANTES, MCP-1, MIP-1α, CD40L, 프렉탈카인(fractalkine), GM-CSF, IL-8, IL-10, EGF, bFGF, TGF-α 및 VEGF로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 정보 제공 방법은 HAS2 및 HAS3 중 적어도 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 단백질의 발현 수준을 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 양을 측정하는 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 히알루론산의 발현 수준을 측정하는 제제는 히알루론산 결합 단백질(hyaluronic acid binding protein), 바람직하게는 표지된 히알루론산 결합 단백질일 수 있다.
본 발명에서 상기 표지의 방법은 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, 비오티닐화(biotinylation), 형광 염료, 방사성 동위 원소, 화학적 효소 등에 의한 것일 수 있으나, 바람직하게는 비오티닐화일 수 있다.
본 발명에서 상기 히알루론산의 발현 수준을 측정하는 방법으로는 샌드위치 ELISA-유사 어쎄이(sandwich ELISA-like assay) 또는 막 블럿팅(membrane blotting) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 CD44 변이체 3(CD44v3) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 히알루론산(hyaluronic acid) 중 적어도 하나의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가된 경우, 알레르기성 호흡기 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 IL-5, 에오탁신(eotaxin), RANTES, MCP-1, MIP-1α, CD40L, 프렉탈카인(fractalkine), GM-CSF, IL-8, IL-10, EGF, bFGF, TGF-α 및 VEGF로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가된 경우, 알레르기성 호흡기 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 HAS2 및 HAS3 중 적어도 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가된 경우, 알레르기성 호흡기 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 알레르기성 호흡기 질환은 호흡기를 통해 알레르겐이 유입되어 개체 내에 유발될 수 있는 염증 반응으로서, 알레르기성 천식, 기관지염, 알레르기성 비염, 부비동염, 하기도 감염증 및 상기도 감염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 알레르기성 비염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 알레르기성 호흡기 질환 환자로부터 분리한 생물학적 시료 또는 알레르기성 호흡기 질환 유도 동물 모델에서 CD44 변이체 3(CD44v3) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 히알루론산(hyaluronic acid) 중 적어도 하나의 발현 수준을 측정하는 단계;
상기 생물학적 시료 또는 동물 모델에 피검 물질을 처리하는 단계; 및
상기 피검 물질의 처리 후 상기 생물학적 시료 또는 상기 동물 모델에서 CD44 변이체 3(CD44v3) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 히알루론산(hyaluronic acid) 중 적어도 하나의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 알레르기성 호흡기 질환의 예방 또는 치료제를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 생물학적 시료와 CD44 변이체 3(CD44v3) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자, 또는 히알루론산의 발현 수준을 측정하는 방법은 상기 본 발명의 정보 제공 방법에 기재된 바와 중복되어 이하 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서 상기 측정하는 단계 시 IL-5, 에오탁신(eotaxin), RANTES, MCP-1, MIP-1α, CD40L, 프렉탈카인(fractalkine), GM-CSF, IL-8, IL-10, EGF, bFGF, TGF-α 및 VEGF로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 추가로 측정할 수 있다.
본 발명에서 상기 측정하는 단계 시 HAS2 및 HAS3 중 적어도 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 추가로 측정할 수 있다.
본 발명에서 상기 피검 물질은 알레르기성 호흡기 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 것으로 예측되는 물질로, 예를 들면, 약물 후보 물질, 피검 화합물 또는 피검 조성물은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 또는 천연물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 피검 물질의 처리 후 상기 생물학적 시료 또는 상기 동물 모델에서 CD44 변이체 3(CD44v3) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 히알루론산(hyaluronic acid) 중 적어도 하나의 발현 수준이 처리 전에 비하여 감소된 경우 상기 피검 물질을 알레르기성 호흡기 질환의 예방 또는 치료제로 판별하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 생물학적 시료 또는 상기 동물 모델에서 IL-5, 에오탁신(eotaxin), RANTES, MCP-1, MIP-1α, CD40L, 프렉탈카인(fractalkine), GM-CSF, IL-8, IL-10, EGF, bFGF, TGF-α 및 VEGF로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 처리 전에 비하여 감소된 경우 상기 피검 물질을 알레르기성 호흡기 질환의 예방 또는 치료제로 판별하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 피검 물질의 처리 후 상기 생물학적 시료 또는 상기 동물 모델에서 HAS2 및 HAS3 중 적어도 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 처리 전에 비하여 감소된 경우 상기 피검 물질을 알레르기성 호흡기 질환의 예방 또는 치료제로 판별하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 알레르기성 호흡기 질환은 호흡기를 통해 알레르겐이 유입되어 개체 내에 유발될 수 있는 염증 반응으로서, 알레르기성 천식, 기관지염, 알레르기성 비염, 부비동염, 하기도 감염증 및 상기도 감염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 알레르기성 비염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 비강 세척액, 비인두 세척액, 기관지 폐포세척액, 비강 도말, 비강 흡인액, 비인두 도말 또는 비인두 흡인액 등과 같은 생물학적 시료에 대하여 CD44 변이체 3(CD44v3) 단백질, 또는 이를 암호화하는 유전자; 또는 히알루론산의 발현 수준을 측정하여 알레르기성 호흡기 질환의 발병 가능성을 정확하지만 용이한 방법으로 진단할 수 있고, 그에 따라 환자가 향후 적절한 치료를 계획할 수 있어 국민 건강 수준을 보다 드높일 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 인간 비점막에서 CD44의 면역조직화학 위치화(localization) 결과를 나타낸 것으로, 건강한 대조군(위) 또는 알레르기성 비염 환자(아래) 유래의 비점막 시료를 panCD44 항체 또는 대조군 IgG로 면역 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 2의 상단 부분은 본 발명의 일 실시예에서 인간 코 상피세포에서 CD44의 발현 및 분포를 나타낸 것으로, 술잔 세포는 AB-PAS 염색으로 시각화 하였고, 헤마톡실린(파란색)으로 대비 염색을 하였으며, 건강한 대조군(위) 또는 알레르기성 비염 환자(아래) 유래의 비점막 시료를 panCD44 항체 또는 대조군 IgG로 면역 염색한 결과를 나타낸 것이다. 도 2의 중간 및 하단 부분은 본 발명의 일 실시예에서 인간 비점막에서 CD44의 면역조직화학 위치화한 결과를 나타낸 것으로, 건강한 대조군(위) 또는 알레르기성 비염 환자(아래) 유래의 비점막 시료를 panCD44 항체 또는 대조군 IgG로 면역 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자 및 건강한 대조군 유래 비점액의 추출물에 대하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 인-비보(in vivo) 인간 비점막 상피 세포(기저, 전구, 술잔, 섬모세포로 구성됨)와 유사한 구조로 분화시키기 위하여, 1차 코 상피 세포의 배양에 사용되는 ALI 모델의 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 ALI 배양 시 인-비트로(in vitro)에서 알레르기 상태를 모사하기 위하여 IL-4를 3일 동안 0 내지 10 ng/ml의 다양한 농도로 처리한 후 얻어진 추출물에 대하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 ALI 배양 시 5 ng/ml의 IL-4를 1 내지 7일 동안 처리한 후 얻어진 추출물에 대하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 CD44 유전자 구조의 모식도를 나타낸 것으로, 흑색의 박스는 구성요소인 엑손을 나타내고, 실선의 박스는 스플라이싱된 변이체 엑손 v1-10을 나타낸다. 화살표는 엑손 특이적 프라이머 중복 전체 변형 영역을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 코 상피(HNE) 세포로부터 분리한 RNA에 IL-4로 3일 동안 처리 후 프라이머의 AB, AD, AE, CB 또는 CE 조합으로 RT-PCR 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에서 CD44 스플라이싱 변이체의 유전자 구조를 나타낸 것이다. 회색 박스에서 엑손 v1은 정지 코돈을 포함하고 있어 인간에서 발현되지 않는다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서 IL-4가 1 내지 7일간 처리된 세포 또는 미처리된 세포 사이에서 CD44v3, CD44v6, 및 CD44v9 mRNA 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서 엑손 v3-, v6-, 또는 v9- 특이적 항체를 이용하여 각기 다른 시점에서 CD44v3, CD44v6, 및 CD44v9 단백질의 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에서 IL-4가 1 내지 7일간 처리된 세포 또는 미처리된 세포 사이에서 중요한 계통 마커 단백질(증식세포 마커: Ki-67; 기저세포와 전구세포 마커: KRT5; 기저세포 마커: TP63; 전구세포 마커: SOX2; 술잔세포로 분화되기로 운명이 결정된 분비세포 마커: CA2, 및 SPDEF)의 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에서 IL-4 처리 후 1일 또는 3일 경과 후 ALI 배양의 포르말린 고정 파라핀-삽입 절편에서 CD44v3와; Ki-67, TP63, KRT5, 또는 SOX2의 이중 면역형광염색 결과를 나타낸 것이다. 흰색 화살표는 기저위층에서 약하게 양성인 TP63-발현 세포를 나타낸다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에서 IL-4가 1 내지 7일간 처리된 세포 또는 미처리된 HNE 세포 유래 mRNA에서 술잔세포 마커인 MUC5AC와 섬모세포의 마커인 FOXJ1 발현 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에서 IL-4 처리 후 1일 또는 3일 경과 후 ALI 배양의 절편에서 CD44v3, MUC5AC, 및 Ac-Tub의 3중 면역형광염색 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에 IL-4 처리 후 1일 또는 3일 경과하였을 때 항-CD44v3 항체와 FACS를 이용한 CD44v3- 및 CD44v3+ 세포의 분리 모식도를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에서 IL-4 처리된 HNE 세포를 항-CD44v3 및 항-KRT5로 이중 면역형광염색 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에 IL-4를 1일 또는 3일간 처리 후 CD44v3의 FACS 분석 점 플롯을 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에 IL-4를 1일 또는 3일간 처리 후 CD44v3- 세포 및 CD44v3+ 세포의 공초점 형광 사진을 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에서 CD44v3- 세포 및 CD44v3+ 세포에서 CD44v3, Ki-67, KRT5, TP63, SOX2, CA2, 및 SPDEF 단백질의 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에 대하여 IL-4의 존재 하에서 7일 동안 항-CD44 항체(10 μg/mL) 또는 항-IgG 대조군(10 μg/mL)으로 블러킹하는 과정의 모식도를 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에, IL-4 존재 하에서 항-CD44 처리 후 qRT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에, IL-4 존재 하에서 항-CD44 처리 후 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에서 ALI 배양 시 IL-4 존재 하에서 항-CD44 처리 후 술잔 세포를 AB-PAS 염색으로 시각화한 사진을 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자와 건강한 대조군 유래 비점액 추출물에 대하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자와 건강한 대조군 유래 비점막 시료의 파라핀 삽입 절편에서 항-CD44v3 항체를 이용하여 CD44v3의 면역조직화학 위치화를 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자 유래 비점막 시료의 파라핀 삽입 절편에서 CD44v3, MUC5AC, 및 Ac-Tub의 면역형광염색 결과와 CD44v3와, KRT5, TP63, 또는 SOX2의 면역형광염색 결과를 나타낸 것이다.
도 28 및 29는 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자 유래 비점막 시료의 파라핀 삽입 절편에 대하여 CD44v3 (흰색), MUC5AC (적색), 및 Ac-Tub (녹색)의 3중 면역형광염색을 수행한 결과와, CD44v3 (흰색) 및 KRT5, TP63, 또는 SOX2 (녹색)의 2중 면역형광염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자 유래 코 브러쉬된 상피 세포에서 대조군 IgG와 CD44v3; 및 KRT5, TP63, 또는 SOX2의 항체로 면역염색된 공초점 형광 사진을 나타낸 것이다.
도 31은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자와 건강한 대조군 유래 비점막 시료의 파라핀 삽입 절편에 대하여 비오티닐화된 히알루로난 결합 단백질을 이용하여 히알루론산의 분포를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자(33명)와 건강한 대조군(11명)에 대하여 연령 수준, 혈액 호산구, 총 혈청 IgE 및, 내벽 액체(ELF)에 존재하는 히알루론산(ELF 히알루론산)의 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 33은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자와 건강한 대조군 유래 코 브러쉬된 상피 세포에서 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 34 내지 37은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자와 건강한 대조군 유래 ELF에 대하여 인간 사이토카인 패널 다중 어쎄이를 이용하여 각 사이토카인의 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 38은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자 유래 ELF에서 히알루론산과 사이토카인 발현 수준 사이의 스피어만 상관 관계의 r 및 P 값을 계산한 결과를 나타낸 것이다.
도 39는 본 발명의 일 실시예에서 1차 HNE 세포를 배양하기 위한 ALI 모델의 모식도를 나타낸 것이다.
도 40은 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에 IL-4를 처리한 뒤 mRNA 시료에서 HAS1, HAS2, HAS3, 및 CD44v3에 대한 qRT-PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 41은 본 발명의 일 실시예에서 ALI 배양 시 5 ng/mL IL-4를 1 내지 7일간 처리 후 ALI 배양 추출물에 대하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 42는 본 발명의 일 실시예에서 ALI 배양 시 IL-4를 1일 내지 7일간 처리한 뒤 ALI 배양의 포르말린 고정된 파라핀 삽입 절편에서 히알루론산 및 CD44v3 이중 면역형광염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 43은 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에 IL-4의 존재 하에서 히알루론산의 합성을 억제하는 4-MU를 다양한 농도(0 내지 1.0 mM)로 3일간 처리하여 분화를 유도하는 모식도를 나타낸 것이다.
도 44는 본 발명의 일 실시예에서 IL-4의 존재 하에서 HNE 세포에 4-MU를 처리한 뒤 HNE 세포의 추출물에서 HAS2, HAS3 및 중요한 계통 마커 단백질(Ki-67, KRT5, p63, SOX2, SPDEF, 및 대표적인 알레르기 마커인 POSTN)의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 45는 본 발명의 일 실시예에서 IL-4의 존재 하에서 HNE 세포에 4-MU를 처리한 뒤 HNE 세포로부터 얻어진 mRNA에서 HAS2, HAS3 및 중요한 계통 마커의 발현 수준을 qPCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 46은 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에 IL-4의 존재 하에서 0.5 mM 4-MU를 1일 내지 7일간 처리하여 분화를 유도하는 모식도를 나타낸 것이다.
도 47은 본 발명의 일 실시예에서 IL-4의 존재 하에서 HNE 세포에 4-MU를 처리한 뒤 HNE 세포의 추출물에서 HAS2, HAS3 및 중요한 계통 마커 단백질(Ki-67, KRT5, p63, SOX2, SPDEF, 및 POSTN)의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 48은 본 발명의 일 실시예에서 IL-4의 존재 하에서 HNE 세포에 4-MU를 처리한 뒤 HNE 세포로부터 얻어진 mRNA에서 HAS2, HAS3 및 중요한 계통 마커의 발현 수준을 qPCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 49는 본 발명의 일 실시예에서 ALI 배양 시 IL-4를 7일간 처리한 뒤 절편에서 CD44v3, MUC5AC, 및 Ac-Tub의 3중 면역형광염색 결과(왼쪽 패널) 및 CD44v3, MUC5AC, 및 HA의 3중 면역형광염색 결과(가운데 패널)와, AB-PAS 염색으로 술잔 세포를 시각화한 결과(오른쪽 패널)를 나타낸 것이다.
도 50은 본 발명의 일 실시예에서 IL-4 존재 하에서 HNE 세포에 4-MU를 처리한 뒤 HAS2, HAS3, CD44v3, MUC5AC, 및 FOXJ1 mRNAs 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 51은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 마우스 모델을 유도하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 52는 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 마우스 모델의 비점막 파라핀 삽입 절편에서 히알루론산 및 Muc5ac의 이중 면역형광염색 결과를 나타낸 것이다.
도 53은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 마우스 모델에서 Muc5ac-양성 세포, 혈청 총 IgE 및 HDM-특이적 IgE의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2의 상단 부분은 본 발명의 일 실시예에서 인간 코 상피세포에서 CD44의 발현 및 분포를 나타낸 것으로, 술잔 세포는 AB-PAS 염색으로 시각화 하였고, 헤마톡실린(파란색)으로 대비 염색을 하였으며, 건강한 대조군(위) 또는 알레르기성 비염 환자(아래) 유래의 비점막 시료를 panCD44 항체 또는 대조군 IgG로 면역 염색한 결과를 나타낸 것이다. 도 2의 중간 및 하단 부분은 본 발명의 일 실시예에서 인간 비점막에서 CD44의 면역조직화학 위치화한 결과를 나타낸 것으로, 건강한 대조군(위) 또는 알레르기성 비염 환자(아래) 유래의 비점막 시료를 panCD44 항체 또는 대조군 IgG로 면역 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자 및 건강한 대조군 유래 비점액의 추출물에 대하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 인-비보(in vivo) 인간 비점막 상피 세포(기저, 전구, 술잔, 섬모세포로 구성됨)와 유사한 구조로 분화시키기 위하여, 1차 코 상피 세포의 배양에 사용되는 ALI 모델의 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 ALI 배양 시 인-비트로(in vitro)에서 알레르기 상태를 모사하기 위하여 IL-4를 3일 동안 0 내지 10 ng/ml의 다양한 농도로 처리한 후 얻어진 추출물에 대하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 ALI 배양 시 5 ng/ml의 IL-4를 1 내지 7일 동안 처리한 후 얻어진 추출물에 대하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 CD44 유전자 구조의 모식도를 나타낸 것으로, 흑색의 박스는 구성요소인 엑손을 나타내고, 실선의 박스는 스플라이싱된 변이체 엑손 v1-10을 나타낸다. 화살표는 엑손 특이적 프라이머 중복 전체 변형 영역을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 코 상피(HNE) 세포로부터 분리한 RNA에 IL-4로 3일 동안 처리 후 프라이머의 AB, AD, AE, CB 또는 CE 조합으로 RT-PCR 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에서 CD44 스플라이싱 변이체의 유전자 구조를 나타낸 것이다. 회색 박스에서 엑손 v1은 정지 코돈을 포함하고 있어 인간에서 발현되지 않는다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서 IL-4가 1 내지 7일간 처리된 세포 또는 미처리된 세포 사이에서 CD44v3, CD44v6, 및 CD44v9 mRNA 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서 엑손 v3-, v6-, 또는 v9- 특이적 항체를 이용하여 각기 다른 시점에서 CD44v3, CD44v6, 및 CD44v9 단백질의 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에서 IL-4가 1 내지 7일간 처리된 세포 또는 미처리된 세포 사이에서 중요한 계통 마커 단백질(증식세포 마커: Ki-67; 기저세포와 전구세포 마커: KRT5; 기저세포 마커: TP63; 전구세포 마커: SOX2; 술잔세포로 분화되기로 운명이 결정된 분비세포 마커: CA2, 및 SPDEF)의 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에서 IL-4 처리 후 1일 또는 3일 경과 후 ALI 배양의 포르말린 고정 파라핀-삽입 절편에서 CD44v3와; Ki-67, TP63, KRT5, 또는 SOX2의 이중 면역형광염색 결과를 나타낸 것이다. 흰색 화살표는 기저위층에서 약하게 양성인 TP63-발현 세포를 나타낸다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에서 IL-4가 1 내지 7일간 처리된 세포 또는 미처리된 HNE 세포 유래 mRNA에서 술잔세포 마커인 MUC5AC와 섬모세포의 마커인 FOXJ1 발현 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에서 IL-4 처리 후 1일 또는 3일 경과 후 ALI 배양의 절편에서 CD44v3, MUC5AC, 및 Ac-Tub의 3중 면역형광염색 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에 IL-4 처리 후 1일 또는 3일 경과하였을 때 항-CD44v3 항체와 FACS를 이용한 CD44v3- 및 CD44v3+ 세포의 분리 모식도를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에서 IL-4 처리된 HNE 세포를 항-CD44v3 및 항-KRT5로 이중 면역형광염색 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에 IL-4를 1일 또는 3일간 처리 후 CD44v3의 FACS 분석 점 플롯을 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에 IL-4를 1일 또는 3일간 처리 후 CD44v3- 세포 및 CD44v3+ 세포의 공초점 형광 사진을 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에서 CD44v3- 세포 및 CD44v3+ 세포에서 CD44v3, Ki-67, KRT5, TP63, SOX2, CA2, 및 SPDEF 단백질의 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에 대하여 IL-4의 존재 하에서 7일 동안 항-CD44 항체(10 μg/mL) 또는 항-IgG 대조군(10 μg/mL)으로 블러킹하는 과정의 모식도를 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에, IL-4 존재 하에서 항-CD44 처리 후 qRT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에, IL-4 존재 하에서 항-CD44 처리 후 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에서 ALI 배양 시 IL-4 존재 하에서 항-CD44 처리 후 술잔 세포를 AB-PAS 염색으로 시각화한 사진을 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자와 건강한 대조군 유래 비점액 추출물에 대하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자와 건강한 대조군 유래 비점막 시료의 파라핀 삽입 절편에서 항-CD44v3 항체를 이용하여 CD44v3의 면역조직화학 위치화를 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자 유래 비점막 시료의 파라핀 삽입 절편에서 CD44v3, MUC5AC, 및 Ac-Tub의 면역형광염색 결과와 CD44v3와, KRT5, TP63, 또는 SOX2의 면역형광염색 결과를 나타낸 것이다.
도 28 및 29는 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자 유래 비점막 시료의 파라핀 삽입 절편에 대하여 CD44v3 (흰색), MUC5AC (적색), 및 Ac-Tub (녹색)의 3중 면역형광염색을 수행한 결과와, CD44v3 (흰색) 및 KRT5, TP63, 또는 SOX2 (녹색)의 2중 면역형광염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자 유래 코 브러쉬된 상피 세포에서 대조군 IgG와 CD44v3; 및 KRT5, TP63, 또는 SOX2의 항체로 면역염색된 공초점 형광 사진을 나타낸 것이다.
도 31은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자와 건강한 대조군 유래 비점막 시료의 파라핀 삽입 절편에 대하여 비오티닐화된 히알루로난 결합 단백질을 이용하여 히알루론산의 분포를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자(33명)와 건강한 대조군(11명)에 대하여 연령 수준, 혈액 호산구, 총 혈청 IgE 및, 내벽 액체(ELF)에 존재하는 히알루론산(ELF 히알루론산)의 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 33은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자와 건강한 대조군 유래 코 브러쉬된 상피 세포에서 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 34 내지 37은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자와 건강한 대조군 유래 ELF에 대하여 인간 사이토카인 패널 다중 어쎄이를 이용하여 각 사이토카인의 발현 수준을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 38은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 환자 유래 ELF에서 히알루론산과 사이토카인 발현 수준 사이의 스피어만 상관 관계의 r 및 P 값을 계산한 결과를 나타낸 것이다.
도 39는 본 발명의 일 실시예에서 1차 HNE 세포를 배양하기 위한 ALI 모델의 모식도를 나타낸 것이다.
도 40은 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에 IL-4를 처리한 뒤 mRNA 시료에서 HAS1, HAS2, HAS3, 및 CD44v3에 대한 qRT-PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 41은 본 발명의 일 실시예에서 ALI 배양 시 5 ng/mL IL-4를 1 내지 7일간 처리 후 ALI 배양 추출물에 대하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 42는 본 발명의 일 실시예에서 ALI 배양 시 IL-4를 1일 내지 7일간 처리한 뒤 ALI 배양의 포르말린 고정된 파라핀 삽입 절편에서 히알루론산 및 CD44v3 이중 면역형광염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 43은 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에 IL-4의 존재 하에서 히알루론산의 합성을 억제하는 4-MU를 다양한 농도(0 내지 1.0 mM)로 3일간 처리하여 분화를 유도하는 모식도를 나타낸 것이다.
도 44는 본 발명의 일 실시예에서 IL-4의 존재 하에서 HNE 세포에 4-MU를 처리한 뒤 HNE 세포의 추출물에서 HAS2, HAS3 및 중요한 계통 마커 단백질(Ki-67, KRT5, p63, SOX2, SPDEF, 및 대표적인 알레르기 마커인 POSTN)의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 45는 본 발명의 일 실시예에서 IL-4의 존재 하에서 HNE 세포에 4-MU를 처리한 뒤 HNE 세포로부터 얻어진 mRNA에서 HAS2, HAS3 및 중요한 계통 마커의 발현 수준을 qPCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 46은 본 발명의 일 실시예에서 HNE 세포에 IL-4의 존재 하에서 0.5 mM 4-MU를 1일 내지 7일간 처리하여 분화를 유도하는 모식도를 나타낸 것이다.
도 47은 본 발명의 일 실시예에서 IL-4의 존재 하에서 HNE 세포에 4-MU를 처리한 뒤 HNE 세포의 추출물에서 HAS2, HAS3 및 중요한 계통 마커 단백질(Ki-67, KRT5, p63, SOX2, SPDEF, 및 POSTN)의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 48은 본 발명의 일 실시예에서 IL-4의 존재 하에서 HNE 세포에 4-MU를 처리한 뒤 HNE 세포로부터 얻어진 mRNA에서 HAS2, HAS3 및 중요한 계통 마커의 발현 수준을 qPCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 49는 본 발명의 일 실시예에서 ALI 배양 시 IL-4를 7일간 처리한 뒤 절편에서 CD44v3, MUC5AC, 및 Ac-Tub의 3중 면역형광염색 결과(왼쪽 패널) 및 CD44v3, MUC5AC, 및 HA의 3중 면역형광염색 결과(가운데 패널)와, AB-PAS 염색으로 술잔 세포를 시각화한 결과(오른쪽 패널)를 나타낸 것이다.
도 50은 본 발명의 일 실시예에서 IL-4 존재 하에서 HNE 세포에 4-MU를 처리한 뒤 HAS2, HAS3, CD44v3, MUC5AC, 및 FOXJ1 mRNAs 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 51은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 마우스 모델을 유도하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 52는 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 마우스 모델의 비점막 파라핀 삽입 절편에서 히알루론산 및 Muc5ac의 이중 면역형광염색 결과를 나타낸 것이다.
도 53은 본 발명의 일 실시예에서 알레르기성 비염 마우스 모델에서 Muc5ac-양성 세포, 혈청 총 IgE 및 HDM-특이적 IgE의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실험예 1]
시료의 채취
코 조직 및 코의 브러쉬된 세포(nasal brushed cells)를 비갑개뿐만 아니라 콧 구멍 주위를 적극적으로 브러쉬하여 채취하였고, 알러지성 비염은 다중 알레르기 항원 검사를 통해 양성의 결과(항원 특이적 IgE 수준 클래스 ≥ 2)와 함께, 비충혈(nasal congestion), 간지러움, 콧물 또는 재채기 등의 알레르기 증상을 기반으로 진단하였다.
세포 배양
인간 코 상피 세포(Human nasal epithelial cells; HNE cells)를 천식, 아스피린 민감성 또는 낭포성 섬유증이 발병한 적 없는 만성 비부비동염 환자의 비용종으로부터 채취하거나 점액성 염증이 없는 건강한 개체의 하위 갑개골로부터 코 브러싱(nasal brushing)을 통해 획득하였다. HNE 세포의 배양을 위해서는 공기-액체 접면 배양(air-liquid interface culture; ALI) 시스템을 사용하였다. 간단히, 2 계대의 HNE 세포를 12 mm, 0.45 μm 포어 트랜스웰-클리어 배양 삽입물(Costar Co, Cambridge, MA, USA)에 2Х105 세포/cm2의 밀도로 접종하고, 배양물을 0.5 μg/ml 히드로코르티손(hydrocortisone), 5 μg/ml 인슐린, 10 μg/ml 트랜스퍼린, 0.5 μg/ml 에피네프린, 6.5 μg/ml 트리요오드티로닌(triiodothyronine), 50 μg/ml 젠타마이신(gentamicin), 50 μg/ml 암포테리신(amphotericin)-B, 50 μg/ml 소 뇌하수체 추출물, 1.5 μg/ml 소 혈청 알부민, 10 ng/ml 상피 성장 인자 및 50 nM 레티노산이 보충된 BEBM/DMEM의 50:50 혼합물(BEGM; Lonza, Basel, Switzerland)에 담갔다. 컨플루언트(confluent) 시 첨부 배지(apical medium)을 제거하고 세포를, 추가의 50nM 레티노산이 보충된 BEGM 배지(ALI medium)의 공기-액체 접면에서 37 ℃ 및 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 상기 ALI 배지를 기저측 챔버(basolateral chamber)에 14일 간 매일 추가하였다. ALI 배양 14일간 1일차, 3일차, 5일차, 7일차에 IL-4(5 ng/ml or 0 ~ 10 ng/mL)를 기저측 챔버에 추가하고, IL-4-함유 배지는 매 2일마다 교체하였다. 이하의 실험에서, 세포를 기능-블러킹 CD44 항체(10 μg/ml)로 1시간 동안 전처리한 뒤, 기능-블러킹 CD44 항체로 IL-4 자극을 7일간 주었다. 정상 마우스 IgG를 기능-블러킹 항체의 대조군으로 사용하였다. 모든 실험은 3명의 다른 공여자로부터 제공된 ALI 배양에서 적어도 2회 수행하였다.
RNA 분리 및 반-정량적 및 정량적 RT-PCR 분석
TRIzol 시약(Invitrogen, Gaithersburg, MD, USA)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 역전사 전에 DNase I (RNase-free, NEB, Ipswich, MA, USA)을 이용하여 가능한 게놈 DNA 오염을 제거하였다. 총 RNA 1 μg을 M-MLV 역전사 효소(THERMO, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 역전사 시켰다. GoTaq® DNA 중합효소(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 반-정량적 PCR을 수행한 뒤 PCR 산물은 아가로스 겔 전기영동 및 에티디움 브로마이드 염색(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 통해 분별하였다. 선별된 DNA 밴드를 아가로스 겔로부터 자른 뒤 QIAquick 겔 추출 키트(QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 추출하였다. 추출된 DNA의 직접적인 DNA 시퀀싱은 Applied Biosystems 3730xl DNA analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 수행하였다. 또한 7300 Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 KAPA SYBR® FAST qPCR 키트(Roche, Indianapolis, IN, USA)를 이용하여 정량적 RT-PCR (qPCR)을 수행하였다. CD44 엑손(exon)-특이적 qPCR에 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다.
웨스턴 블럿
알레르기성 비염 환자와 건강한 개체에서 얻은 비점막 시료는 사용 전까지 액상 질소 하에서 막자사발과 막자(mortar and pestle)를 이용하여 미세한 파우더 형태로 분쇄하고, -80 ℃에서 보관하였다. 이후 분쇄된 조직과 HNE 세포를 1 mM 페닐메틸설포닐 플로오라이드(PMSF), Halt 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)을 포함하는 세포 용혈 버퍼(Invitrogen, Camarillo, CA) 내에서 균질화 하였다. 시료를 8% 또는 10% SDS-PAGE 겔에서 전기영동 시킨 뒤 웨스턴 블럿을 수행하였다. 단백질은 겔에서 PVDF 막으로 이동하였고, 막은 0.5% Tween 20 (TTBS)를 포함하는 TBS(50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl)에서 5% 탈지유에서 1시간 동안 상온에서 전-배양시켰다. 이후 TTBS 내 5% 탈지유 또는 TTBS 내 5% BSA에서 1:1000으로 희석된 항-혈청으로 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 막을 TTBS로 3회 세척한 뒤 2차 항체(1:2000 dilution, anti-mouse/rabbit IgG coupled to alkaline phosphatase)를 이용하여 상온에서 1시간 추가 배양하였다. Thermo Scientific Pierce ECL 웨스턴 블럿 기질(Rockford, IL, USA)을 통해 특정 밴드를 검출한 뒤 막 레이 필름(membranes ray film)의 노출을 통해 시각화하였다. 시료를 β-액틴으로 정규화하였다.
FACS 분석
세포를 비-효소 세포 해리 용액(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)에서 배양하여 단일 세포로 분리한 뒤 분산된 세포를 70 μm 메쉬 필터(Partec, Swedesboro, NJ, USA)로 여과시켰다. 백만 개의 세포를 10 μL APCanti-human CD44v3(R&D FAB5088A)으로 4 ℃에서 30분간 배양한 뒤 BD FACSAria?? III sorter(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 로딩시켰다. 비-생세포는 이하의 분석을 위해 제거하였다. 데이터는 BD CellQuest PRO 소프트웨어(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 얻었고, FlowJo 유세포 분석 소프트웨어(Tree Star, Ashland, OR, USA)를 이용하여 분석하였다.
조직학적 분석 및 면역조직화학
조직 시료의 포르말린 고정된 파라핀 절편(4 μm)을 크실렌(Sigma Chemicals, St Louis, MO, USA)에서 왁스를 제거하고 에탄올을 이용하여 재수화시킨 뒤 H&E 또는 알시안 블루를 이용하여 술잔 세포(goblet cells)를 10 분간 염색하였다. 물로 2 분간 세척한 뒤 과요오드 산(5 g/L)에서 5 분간 산화시키고 증류수에서 세척한 뒤 대조 염색을 위해 Coleman's Schiff 시약으로 10 분간 염색시켰다. 이후 유황 세척 용액에서 세척하고 물에서 세척한 뒤 Mayer 헤마톡실린으로 1 분 동안 염색시키고 물로 다시 세척하였다. 면역 조직 화학 염색을 위하여, 왁스가 제거된 절편(4 μm)을 0.01 mol/L 소디움 시트레이트 버퍼(pH 6.0)에서 전자레인지로 항원 회수(antigen retrieval) 시켰다. 3% 메탄올성 과산화수소로 내인성 퍼옥시다제 활성을 상온에서 10 분간 퀀칭 하였다. VECTASTAIN Elite ABC 키트(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로부터 10% 정상 혈청으로 상온에서 30 분 동안 배양시켜 비특이적 결합을 블러킹하였다. 1차 항체를 4 ℃에서 24시간 동안 적용한 뒤 TBS로 세척하고 슬라이드를 겨자무 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 종 특이적 2차 항체(1:5000 희석, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 상온에서 30 분 동안 배양하였다. DAKO Envision 키트(Dako, Kingsgrove, Australia)를 이용하여 간접적 이뮤노퍼옥시다제 기술을 이용하여 신호를 증폭시켰다. 조직 절편을 Gill's 헤마톡실린(Sigma Chemicals, St Louis, MO, USA)으로 대비 염색시킨 뒤 탈수하고 DPX(ProSciTech, Thuringowa, Australia)로 마운팅(mounting)하였다. Olympus U-TV0.63XC 현미경을 이용하여 DP 컨트롤러 소프트웨어(Hamburg, Germany)로 신호를 시각화 하였다. 실험은 알레르기성 비염 환자와 건강한 정상 개체로부터 얻어진 비점막 시료를 이용하여 수행되었다.
면역형광 염색
사이토스핀(cytospin) 슬라이드 준비를 위하여, 하위 갑개골의 중간 정도 부분을 부드러운 멸균 브러쉬(Medical Packaging Camarillo, CA, USA)로 브러싱하여 표피 상의 비점막 세포를 획득하였다. 브러쉬를 부드럽게 회전시킨 뒤 즉시 15-mL 코니컬 튜브 내 이동 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium: HAM's F12K medium + 1% Penicillin/Streptomycin)에 담가 이동시켰다. 코니컬 튜브를 볼텍싱한 뒤 팁을 제거하고, 튜브를 1,000 rpm으로 4 ℃에서 5 분간 원심분리한 뒤 상청액을 조심스럽게 흡입하고 세포를 PBS에서 재부유시켰다. 코 브러쉬 생검과 HNE 세포를 비-효소 세포 해리 용액에서 배양하여 단일 세포로 분리한 뒤 슬라이드에 사이토스핀(500 cells per slide, 800rpm for 3 min)하고, 차가운 메탄올-아세톤 용액에서 5 분 동안 고정시켰다. 면역 형광 염색을 위하여, 트렌스웰-클리어 배양 삽입물 및 조직 시료의 여과물의 상피 시트의 사이토스핀과 왁스가 제거된 절편(4 μm)을 4% 파라포름알데히드 용액으로 10 분 동안 고정시킨 뒤 1% Triton X-100로 5 분 동안 투과시키고 적절한 항혈청(diluted 1:200 in DakoCytomation antidody diluent, respectively)을 이용하여 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 인간 CD44v3 APC-컨쥬게이드된 항체는 트리플 라벨링을 위해 사용하였다. 이후, TBS에서 세척하고, 슬라이드를 2차 항-마우스 Texas 레드-컨쥬게이트된 IgG 항체 또는 2차 항-토끼 FITC-컨쥬게이트된 IgG 항체(1:250)로 상온에서 1 시간 동안 배양하였다. 세척 후 커버 슬립을 VECTASHIELD 마운팅 배지(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 마운팅한 뒤 공초점 레이저-주사 현미경(LSM780, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Germany)으로 분석하였다.
통계적 분석
통계적 분석은 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어(LaJolla, CA, USA)를 이용하여 수행되었고, 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 각 군 사이의 차이는 비-파라미터의 Mann-Whitney U 검정 또는 ruskal-Wallis 검정 및 Dunn's 다중 비교 검정을 포함하는 일원 분산 분석을 통해 분석하였다. P < 0.05의 값은 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
알레르기성 HNE 세포에서 CD44의 발현의 증가
가장 먼저, 알레르기성 비염 환자와 건강한 대조군 개체로부터 수득한 비점막에서 panCD44 항체를 이용하여 면역조직화학 분석을 통해 총 CD44의 발현 수준과 분포를 평가하였다(도 1, 도 2). 알레르기성 비염 환자와 대조군 개체로부터 얻어진 점막에서의 CD44 면역 반응성은 섬유아세포 및/또는 몇몇의 침윤성 세포를 포함하는 상피하 기질 영역과 표면 상피의 기저층 및 기저위층(supra-basal layer)으로 국한하였지만, 대조군 대비 알레르기성 비염 환자 유래의 점막에서 염색 정도가 매우 강하게 나타났다(중간 패널). 대조군의 상피 조직에 비하여 알레르기성 비염 환자의 표면 상피 조직의 상단 부분에서 AB-PAS-양성 술잔 세포의 수가 현저히 많은 것을 확인할 수 있었다(오른쪽 패널). 그런데 CD44 면역 반응성은 AB-PAS 반응성과 겹치지는 않았다. 따라서 이를 통해 CD44는 비분화된 그리고 계통이 결정된 전구 세포(각각 기저 상피 조직층과 기저위 상피 조직층에서 발현됨)에서 모두 발현되지만 분화된 세포에서는 발현되지 않는 것을 알 수 있었다. panCD44 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과, 알레르기성 비염 환자 및 건강한 대조군 개체의 점액 모두에서 CD44에 상응하는 대략 85 내지 90 kDa의 강한 밴드가 관찰되었고, 대체적 스플라이싱 및 번역 후 변형 등에 의해 생성되는 CD44v에 상응하는 대략 180 내지 250 kDa의 high-MW(multiple higher molecular weight) 밴드가 관찰되었다(도 3). 알레르기성 비염 환자 및 건강한 대조군 개체의 점막에서 CD44의 발현 수준에는 유의적 차이가 관찰되지 않았지만, 대조군 대비 알레르기성 비염 환자의 점액에서 high-MW CD44v 발현이 현저히 증가된 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라 알레르기성 조건 하에서 HNE 세포에서 CD44 아이소폼의 발현 패턴을 확인하기 위하여, ALI에서 2 주간 배양된 웰-분화된 1차 HNE 세포를 사용하여 생체 내 비 상피조직과 유사하게 거짓 중층 상피(pseudostratified columnar epithelium)를 제작하였다(도 4). 생체 내 알레르기성 환경을 모사하기 위하여, 세포에 트렌스웰의 기저측 부분에 Th2 사이토카인 IL-4를 처리하였다. IL-4를 3일 동안 다른 농도(0 to 10 ng/mL)로 처리한 뒤 웨스턴 블럿을 이용하여 CD44 발현 수준의 변화를 확인하였다. 비처리된 세포에서 CD44 발현이 거의 관찰되지 않았으나, IL-4 처리 시 그 발현 수준이 증가하였고, 5 ng/mL의 농도로 처리 시 발현 수준이 가장 효율적으로 증가하였다(도 5). IL-4-자극된 HNE 세포에서는 180 내지 250 kDa의 high-MW(multiple higher molecular weight) 밴드가 관찰되었고(도 4), 생체 내 인간 비점막에서 관찰되는 발현 패턴과 유사하였다(도 3). 그런데 IL-4-자극된 HNE 세포에서는 CD44가 거의 관찰되지 않았으나, 인간 비점막에서는 CD44가 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었는 바, CD44는 기질 세포에서 발현되는 것을 알 수 있었다. 혹은 그렇지 않다면 CD44v 아이소폼의 수준은 CD44와 매우 높은 상관성을 보이거나 생체 외 시스템이 생체 내 시스템을 반영하지 못하는 것임을 알 수 있었다. 다음으로, 5 ng/mL IL-4를 1 일 내지 7 일 동안 처리하며 HNE 세포에서 CD44 발현 수준의 변화를 확인하였다. IL-4 처리 후 1 일이 경과하였을 때 High-MW CD44v 발현이 현저히 증가하였고, 3 일 째에 정점에 다른 뒤 점차 감소하였다(도 6). 이로부터 알레르기성 환경에서의 인간 코 표면 상피 세포에서는 스플라이싱된 엑손을 포함하여 CD44의 다양한 아이소폼의 발현이 상향 조절됨을 알 수 있었다.
IL-4 자극된 HNE 세포에서 엑손 3을 공유하는 CD44v 아이소폼의 상향 조절
HNE 세포에서 CD44 전-mRNA의 대체 스플라이싱 패턴을 확인하기 위하여, HNE 세포에 IL-4를 CD44 단백질 발현이 정점을 이루는 시간인 3일 동안 처리한 뒤 상기 HNE 세포로부터 RNA를 분리하였다. 전체 변형 영역(variable region)에 중복되는 엑손-특이적 프라이머의 다양한 조합을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다(도 7, 표 1). 직접적인 DNA 시퀀싱을 통하여 PCR 산물에 단일 또는 인접(contiguous) 변형 엑손이 존재하는 지 확인하였다. 그 결과, CD44v mRNA 중 9개의 종류로, CD44v1, CD44v1,v6, CD44v1,v3, CD44v3-v6, CD44v1-v3, CD44v3,v8-v10, CD44v1,v3-v6, CD44v1,v8-10, 및 CD44v3-v10가 IL-4 처리에 의해 상향 조절되는 것을 확인할 수 있었다(도 8, 9). 엑손 v1은 인간 CD44에서 미성숙 종결 코돈을 포함하기 때문에, 9개의 CD44 mRNA 중 3개, 즉 CD44v3-v6, CD44v3,v8-v10, 및 CD44v3-v10만이 CD44v 단백질로 번역되었다. 이러한 3개의 mRNA는 모두 엑손 3을 포함하였다. 이에 다음으로 CD44v3와, 천식 환자의 기관지 상피 세포에서 상향 조절되는 CD44v6 및 CD44v9의 mRNA와 단백질 발현에 있어서 IL-4 처리 후 1 내지 7일간 IL-4 의존성 장기간 변화를 확인하였다(도 10, 11). qRT-PCR 결과, IL-4 미처리된 세포에서는 CD44v3, CD44v6, 및 CD44v9 mRNAs 발현 수준에 변화가 없었다. 하지만 IL-4 처리된 세포에서는 상기 CD44v3, CD44v6, 및 CD44v9 mRNAs 발현 수준이 모두 6 배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 10). 처리 후 1일까지 발현 수준이 증가하여 정점에 달했으나, 그 후에는 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 엑손 v3-, v6- 및 v9-특이적 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과, IL-4 미처리된 세포에서는 이러한 아이소폼을 관찰하기가 어려웠지만, IL-4가 처리된 세포에서는 처리 후 3일까지 그 발현 수준이 매우 증가하다가 점차 감소하는 경향을 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 11). 모든 변형체 특이적 항체를 사용한 결과, 180 내지 250 kDa의 다중 high-MW 밴드를 관찰할 수 있었지만, 강도에서는 차이를 보였다. 그 원인으로는 변형된 CD44v 아이소폼에 대한 각 항체의 결합 친화도의 차이에 의한 것으로 볼 수 있다. 그런데 HNE 세포에 IL-4의 처리 시 CD44v mRNA 발현 수준은 처리 후 1 일에 정점을 이르렀으나, 단백질은 3일 후 정점에 이르는 것을 확인할 수 있었는데, 이러한 CD44v 단백질의 지연(delay)은 HNE 세포의 IL-4 자극 후 BC 분화기 동안 단백질 발현의 복잡한 번역 후 조절에 의한 것임을 알 수 있었다. IL-4 자극 후 상향 조절된 모든 성숙된 CD44v mRNA가 엑손 3을 포함하고 있었으므로, 이하의 실험에서는 CD44v3를 위주로 관찰하였다.
CD44v3-발현 세포에서 계통-특이적 마커의 발현에서의 이질성(heterogeneity)
기도 상피 세포에서, 손상에 대한 TP63+ BCs의 초기 반응은 24 시간 내에 일어나는데, 이는 노출된 기저판을 덮기 위하여 퍼지고, 손상 후 48 내지 72 시간 내에 계통이 결정된 전구 세포로 되는 미결정된 전구 세포를 생성하기 위해 증식이 일어난다. 이러한 반응들은 손상 복구의 초기 단계에서 일어나는 역동적 세포 상태 변화의 지표로 작용한다. 배양된 HNE 세포의 IL-4 자극 후 세포 상태에서 일어나는 변화와 CD44v3 발현 사이 상관 관계를 확인하기 위하여, IL-4 처리 후 1 내지 7일 동안 계통-특이적 마커 단백질인 증식 및 기저 세포 마커인 Ki-67 및 TP63; 기저 및 기저-위 세포 마커인 KRT5; 계통 특이적 전구 세포가 주된 기도 상피 세포(곤봉체 세포, 술잔 세포 및 섬모 세포)로 분화하기 위하여 필요한 전사 인자인 SOX2(the progenitor cell marker sex determining region Y-box 2); 미성숙/성숙 술잔 세포의 마커인 세포질 CA2(carbonic anhydrase 2); 항원 및 Th2 사이토카인에 노출되었을 때 기도 상피세포에서 술잔 세포의 과형성을 유도하는 초기 분비성 전구체에 작용하는 SPDEF(SAM pointed domain-containing Ets transcription factor)의 장기간 변화를 확인하였다. 이때 상기 CA2는 기관지 세포에서 IL-4의 처리에 의해 발현 수준이 현저히 증가되고, 처리 후 72 시간이 경과하였을 때에는 MUC5AC-발현 세포로 위치화한다. IL-4 처리 후 1일 째에 Ki-67 및 TP63의 발현 수준은 일시적으로 증가하였으나 다시 기저 수준으로 감소하였다. 하지만, KRT5의 경우 IL-4 처리군과 미처리군에서 그 발현 수준에 큰 차이가 관찰되지 않았다(도 12). 반면에, SOX2의 경우 IL-4의 처리 시 어느 시점에서도 발현 수준이 현저히 증가하였다. CA2 및 SPDEF의 경우 IL-4 처리 후 시간이 경과함에 따라 차츰 증가하는 양상을 보였다. 이로부터 ALI 배양에 있어 IL-4 처리 시 1일 내지 3일 사이에 기저/전구 세포의 증식-분화 전환이 일어나는 것을 알 수 있었다. HNE 세포에 IL-4 자극 후 CD44v3-발현 세포의 상태를 확인하기 위하여 IL-4를 1일 또는 3일 간 처리한 ALI 배양물로부터 포르말린-고정된 파라핀-함유 횡단 절편을 준비하고, 면역 염색을 통해 CD44v3와 함께 Ki-67, TP63, KRT5, 또는 SOX2이 공동-발현되는 지 확인하였다(도 13). 면역 형광 염색 결과 기저/전구 세포, 섬모 세포 및 술잔 세포를 포함하는 거짓 배양체(pseudostratified cultures)의 다중층이 형성된 것을 확인할 수 있었다(도 13, 15). 웨스턴 블럿 결과와 일치하게(도 11), IL-4의 미처리 배양 시 CD44v3 발현이 거의 확인되지 않은 반면, IL-4 처리된 ALI 배양물의 기저층과 기저위층에서 CD44-발현 세포의 수가 현저히 증가하였으며, 처리 1일에 비하여 3일에서 더욱 증가하였다(도 13). IL-4 처리 후 1일 경과하였을 때에 CD44v3 및 Ki-67 항체로 공동 염색된 증식 세포(CD44v3+Ki-67+ 세포)가 배양물의 기저층에서 관찰되었다. 반면에, TP63-표지된 핵은 IL-4 처리 및 미처리군의 기저층의 대부분의 세포에서 관찰되었다. 또한, CD44v3 및 TP63에 대하여 약한 양성인 몇몇의 세포가 IL-4 처리 배양물의 기저층 위에서 발견되었다. 이로부터 이러한 세포들은 기저층으로부터 결정된 분비성 전구 세포를 포함하는 기저위층으로 이동하는 과정 중에 속한 세포인 것으로 추측할 수 있었다. 한편, IL-4 처리군과 미처리군 모두에서 기저층과 기저위층에서 KRT5+ 세포가 관찰되었다. IL-4 처리된 배양물에서 KRT5+ 세포의 대다수가 CD44v3+에 해당하였는 바, CD44v3+ 세포가 IL-4 자극된 BCs 유래임을 알 수 있었다. 또한, IL-4 처리된 배양물의 기저위층에서 CD44v3+SOX2+ 세포가 예외적으로 검출되었는데, 이로부터 CD44v3+ 세포의 계통-특이적 마커의 이질적 발현을 알 수 있었다. Th2 사이토카인은 기도 상피 조직에서 술잔 세포의 과형성을 유도하고 섬모 세포의 감소를 유도하므로, IL-4 처리된 HNE 세포에서 CD44v3 발현과 표현형의 변화 사이 상관 관계를 분석하였다. IL-7 처리 후 1 내지 7일 동안 술잔 세포의 마커인 MUC5AC와 섬모 세포의 마커인 FOXJ1의 발현 수준의 변화를 qRT-PCR 분석으로 확인하였다(도 14). IL-4 처리 후 72 시간 경과하였을 때에 MUC5AC-발현 기관지 상피 세포가 높은 비율로 존재하는 것과 마찬가지로, IL-4에 대하여 MUC5AC 유전자의 지연된 반응을 확인할 수 있었고, 특히 처리 후 7일 째에 미처리군에 비하여 발현 수준이 현저히 증가하였다(처리 5일째에 2.5-배, 그리고 처리 7일째에 15-배). 그런데, FOXJ1 유전자는 처리 후 1일째에 그 발현 수준이 급격히 감소하였다. 포르말린-고정된 파라핀-함유 횡단 절편에 대하여 MUC5AC와 섬모 세포의 마커인 Ac-Tub(acetylated-tubulin)의 면역 염색을 수행한 결과, qRT-PCR 결과와 일치하게, IL-4 처리 후 5일째에 술잔 세포의 수가 증가하였고 섬모 세포의 수는 감소하였다(도 15). 그런데 IL-4 자극된 HNE 세포에서 CD44v3는 MUC5AC 또는 Ac-Tub와 공동 위치화가 일어나지 않았다. 이로부터 CD44v3-발현 세포는 증식능과, IL-4 자극에 의해 술잔 세포를 형성하는 분화능을 가진 IPCs의 이질적 군집에 해당함을 알 수 있었다.
IL-4 자극된 HNE 세포에서 CD44v3의 이질적 IPC 군집의 마커로서의 역할
CD44v3-발현 세포의 다른 세포 상태로 예를 들면 증식적 미결정된 상태 및 계통-결정 상태를 규명하기 위하여, IL-4 처리 후 1일 또는 3일 경과 시점에서 FACS로 CD44v3-발현 HNE 세포를 분리하였다(도 16). 단 이 시점은 MUC5AC-발현 세포가 등장하기 전에 해당한다(도 14, 15). 해리된 IL-4 자극 HNE 세포의 면역 형광 분석 결과, KRT5+ 세포에 의해 이질적 CD44v3 단백질의 발현을 확인할 수 있었다(도 17). FACS 분석 결과, IL-4 처리 후 1일 경과 시 8.3%의 세포가, 그리고 3일 경과 시에는 28.3%가 CD44v3+ 세포인 것을 확인할 수 있었다(도 18, 중간 및 오른쪽 패널). IL-4-자극된 HNE 세포에 대하여 2차 항체의 비특이적 결합의 대조군에서는 97.7%가 음성 게이팅이었다(도 18, 왼쪽 패널). FACS-분리된 세포 군집을 CD44v3 및 KRT5에 대한 항체로 면역 형광 염색을 통해 입증하였다(도 19). 그 결과 놀랍게도 CD44v3+ 군집은 세포 표면 CD44v3 면역 형광에 있어서 구분되는 발현 수준을 보이는 두 개의 아집단으로 구별할 수 있었다. 이때 처리 1일차에서 CD44v3이 상대적으로 약하고 비대칭적으로 발현되는 군집을 "CD44v3low"로 나타내었고, 처리 3일차에 전체 세포에 있어서 강하게 CD44v3 면역 형광을 보이는 군집을 "CD44v3high"로 나타내었다(도 19, 오른쪽 패널). IL-4 처리 후 1일째에 HNE 세포에서 증식 세포의 마커이자 기저 세포의 마커인 Ki-67 및 TP63의 일시적인 발현 증가는 미성숙/성숙 술잔 세포 마커인 CA2 및 SPDEF의 발현의 점차적인 증가와 함께 나타났다(도 12). 이에 따라 CD44v3low 세포는 유사 분열이 활성화된 상태이고, CD44v3high 세포는 술잔 세포로 분화하는 잠재력이 강한 것으로 가정할 수 있었다. 이러한 가정을 입증하기 위하여, CD44v3low 및 CD44v3high 세포에서 계통-특이적 마커의 발현을 확인하였다(도 20). 면역 형광 결과와 일치하게, CD44v3low 세포에 비하여 CD44v3high 세포에서 CD44v3 발현이 높게 확인되었다. 또한, CD44v3high 세포에 비하여 CD44v3low 세포에서 Ki67 및 TP63 단백질의 수준이 높게 발현되었으나, SOX2, CA2, 및 SPDEF의 경우 반대의 양상을 보였다. 한편, KRT5 발현 수준은 각 아집단 간의 차이가 없었다. 이를 통해 CD44v3+ 세포는 증식능이 뛰어난 CD44v3low 세포와, IL-4 자극에 의해 술잔 세포의 계통을 생성하는 분화능이 뛰어난 CD44v3high를 포함하는 이질적 IPC군에 해당함을 알 수 있었다.
CD44-히알루론산의 상호 작용을 위한 IL-4-유도 술잔 세포의 과형성의 필요성
CD44는 세포 외 기질의 주된 구성 성분인 히알루론산의 공통 리셉터에 해당하며, CD44-HA 신호는 많은 질환의 병리생리학에 관여하는 것으로 알려져 있다. HA 결합 도메인을 차단하는 항-CD44 항체가 코 상피 조직에서 IL-4-유도 술잔 세포의 과형성에 영향을 미치는 지 확인하기 위하여, HNE 세포의 ALI 배양 시 기저측 부분에 IL-4와 함께 항-CD44 항체 또는 대조군으로 IgG를 첨가하였다(도 21). 앞선 결과와 일치하게 술잔 세포의 과형성 시 기도 상피 세포에서 전사 인자인 FOXA2의 발현의 감소와 FOXA3 및 SPDEF의 발현 증가와 관련이 있는 것을 볼 수 있었다. IL-4는 FOXA2 mRNA의 발현을 감소시키지만, FOXA3, SPDEF, 및 MUC5AC의 mRNA의 발현은 증가시켰다(도 22). 반면에, HNE 세포에 항-CD44 항체와 IL-4를 처리하는 경우, FOXA2 발현이 증가하고 FOXA3, SPDEF, 및 MUC5AC의 발현은 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 웨스턴 블럿을 확인한 결과 IL-4 처리에 대한 반응으로 HNE 세포에서 SOX2, CA2, 및 SPDEF의 발현 수준은 항-CD44 항체 처리 시 현저히 감소하는 것을 볼 수 있었는데, KRT5 발현 수준에는 변화가 없었다(도 23). 앞선 실험 결과와 일치하게, IL-4로 자극된 HNE 세포에서는 미자극 세포에 비하여 AB-PAS-양성 술잔 세포의 수가 현저히 증가하였고, 점액(mucins)의 과다 발현이 관찰되었다(도 24). 또한, HNE 세포에 IL-4와 함께 항-CD44 항체를 첨가하는 경우 AB-PAS 활성이 현저히 감소하였다. 즉, 항체로 인해 점액의 생성이 감소되었다(도 24). 이러한 결과로부터 CD44의 발현뿐만 아니라, CD44와 그 리간드인 HA 사이의 물리적 상호 작용은 HNE 세포에 의한 IL-4-유도 뮤신의 생성에 중요한 것을 알 수 있었다. 따라서, IL-4-자극된 HNE 세포에서 3개의 CD44v mRNA를 함유하는 엑손 v3의 상향 조절되는 데이터(도 9)와, 그리고 FACS-분리된 CD44v3 고발현 세포에서 미성숙/성숙 술잔 세포의 마커 단백질인 CA2 및 SPDEF의 높은 발현 수준의 결과(도 20)를 종합적으로 검토해 보건대, CD44v3는 IL-4-자극된 HNE 세포에서 술잔 세포의 과형성과 점액 성분의 과다 분비와 관련이 높은 것을 알 수 있었다.
알레르기성 비염 개체의 코 표면 상피 조직에서의 CD44v3 발현의 상향 조절
Th2-유도 알러지성 비염에서 CD44v3 발현의 인-비보 관련성을 설명하기 위하여, 알레르기성 비염 환자 및 건강한 개체로부터 비점막에서의 CD44v3 단백질의 발현 수준을 평가하였다. 웨스턴 블럿을 통해, 건강한 개체의 비점막에 비하여 알레르기성 비염 환자 유래의 비점막에서 CD44v3 발현 수준이 현저히 향상된 것을 확인할 수 있었다(도 25). 이와 일관되게, 면역조직화학 분석 결과 건강한 개체에 비하여 알레르기성 비염 환자의 코 표면 상피 세포에서 강하게 면역염색된 CD44v3+ 세포가 높은 빈도로 존재하는 것으로 확인되었고, 기저 및 기저위층에 선택적으로 풍부하게 존재하는 것을 확인할 수 있었다(도 26). 더욱이, 현미경 이미지의 근접한 관찰 결과 CD44v3가 주로 세포 표면에 존재하는 것을 확인할 수 있었다(도 26, 아래 행). 예상한 바와 같이, 종국적으로 분화된 상피 층에서는 CD44v3가 발현되지 않았다. CD44v3와 유사하게, 두 단백질 모두 알레르기성 비염 환자와 건강한 개체의 코 표면 상피 조직의 기저층 및 기저위층에서 거의 독점적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었고, 건강한 개체에 비하여 특히 알레르기성 비염 개체의 점막에서 보다 강한 면역 염색 결과를 보였다. CD44v3와 달리, CD44v6 및 CD44v9 아이소폼은 점막하샘 혈청 선포 세포(submucosal gland serous acinar cells)와 점막하샘관 세포(submucosal gland duct cells) 각각에서 발현되었다. 이를 통해 점막하샘 및 관에서 전구 세포는 코 표면 상피 조직에서의 전구 세포와 종류가 상이할 것임을 알 수 있었다. 알레르기성 비염 환자의 비점막 시료와 브러쉬된 코 상피 세포로부터 CD44v3와 계통-특이적 마커인 KRT5, TP63, SOX2, MUC5AC, 및 Ac-Tub의 공동 발현을 추가로 조사하였다. 알레르기성 비염 환자의 비점막에 대하여 면역 형광 분석 결과(도 27, 도 28, 29), 표면 상피 조직의 기저층과 기저위층에서 몇몇의 CD44v3-발현 세포는 TP63+인 반면, KRT5-발현 세포의 대다수는 CD44v3+ 세포이었다. 비록 CD44v3+Ki-67+ 세포는 거의 관찰하기 어려웠지만, 전구 상태에서 예측 가능하듯이, 이중 표지된 CD44v3+SOX2+ 세포는 기저위층에서 주로 검출되었다. ALI 배양물에서와 같이, CD44v3+ 세포는 MUC5AC 또는 Ac-Tub에 대한 항체로 공동 표지되지 않았다. 알레르기성 비염 환자로부터 얻은 기도 상피 브러슁의 면역 형광 분석 결과, CD44v3는 KRT5, TP63 또는 SOX2과 공동 발현되는 것을 볼 수 있었다(도 30). 종합하여 보건대, 코 표면 상피 조직의 기저층 및 기저위층에서 CD44v3+ IPC 세포 수의 증가와 함께 CD44v3 상향 조절은 알레르기성 비염의 발병과 상관성이 높은 것을 알 수 있었다.
[실험예 2]
인간 연구
다중 알레르기 항원 검사(multiple-allergen simultaneous test)로부터 양성의 결과(항원-특이적 IgE 수준 클래스 ≥ 1)이거나 비충혈, 간지러움, 콧물 또는 재채기 등의 알레르기 증상에 근거하여 알레르기성 비염으로 진단받은 환자로부터 코 조직, 코의 브러쉬된 세포(nasal brushed cells) 및 비점막 내벽 액체(Epithelial lining fluids; ELF)를 회수하였다. 본 실험에서는 항-먼지 IgE에 대해 양성 결과를 갖는 지속적인 알레르기성 비염 환자를 선별하였고, 실험 전 4 주 동안 경구 또는 국소 투여를 받은 적이 있는 환자는 제외하였다. 또한 비부비동 염증 질환을 가지고 있는 환자나 계절 항원에 대하여 양성인 환자는 제외하였다. 총 33명의 환자(32 ± 2 세, M/F 24/9)에 대하여 기능적 내시경 부비동 수술(functional endoscopic sinus surgery) 중 시료를 획득하였고, 11명의 건강한 대조군(36 ± 4 세, M/F 4/7)으로부터도 시료를 획득하였다. 이렇게 얻어진 비갑개 조직은 PBS 내 4% 파라포름알데히드에서 밤새 상온에서 고정시키고 파라핀에 끼워 넣었다. 조직 절편은 면역 염색을 위해 4 μm 두께로 준비하였다. 웨스턴 블럿을 위해 비점막 시료를 사용 전까지 액상 질소 하에서 막자사발과 막자(mortar and pestle)를 이용하여 미세한 파우더 형태로 분쇄하고, -80 ℃에서 보관하였다.
또한, 이하의 방법으로 비점막 내벽 액체(Epithelial lining fluid; ELF)를 얻었다. 레이저 커터를 이용해 leukosorb 매트릭스(Pall Life Sciences, Portsmouth, UK)를 4 mm x 40 mm 크기의 스트립으로 절단하였다. 두개의 스트립은 각각 콧구멍의 비갑개의 앞 부분에 조심스럽게 삽입하고, 5분 동안 비점액의 흡수를 수행하였다. 이후 스트립을 스핀 컬럼의 상부 챔버에 미리 로딩된 150 μL의 전-냉각(pre-chilled) 어쎄이 버퍼(PBS 내 1% 소 혈청 알부민 (BSA), 0.05% Triton X-100)에 넣고 13,000 rpm으로 4 
에서 5분간 원심 분리하였다. 용출액을 회수하고 분석 전까지 -80 ℃에서 보관하였다.
인-비보 동물 실험
알레르기성 비염 마우스 모델을 하기의 방법으로 준비하였다. 6주령 C57BL/6 마우스(Koatech, Kyonggi-do, Korea)에 수산화알루미늄 2mg 내 집진드기 추출물(Greer Laboratories, Lenoir, NC) 100 μg을 녹여 3주간 복강 주사를 통해 감작시켰다. 마지막 감작 후 1주 경과하였을 때, 마취 없이 집진드기 추출물(HDE) 50 μg을 4일 동안 매일 복강 감작 시켰다. 집진드기 추출물 감작 전 4-메틸엄벨리페론(4-Methylumbelliferone; 4-MU)를 30분 동안 복강 주사하였다. 마우스를 안락사 시킨 뒤 기도 염증을 평가하기 위하여 마우스의 호흡기 점막, 비강 세척액 및 혈액을 회수하였다. 현미경을 통해 비점막을 수거한 뒤 정량적 RT-PCR 분석을 위해 TRIzol 시약에 담그고, 웨스턴 블럿 분석을 위하여 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF), Halt 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)을 포함하는 세포 용혈 버퍼에서 용혈 시켰다.
마우스를 안락사 시킨 뒤 마우스 머리를 4% PFA에서 4 ℃에서 고정시키고, 교반 장비에서 400 rpm에서 24 시간 동안 놓았다. 시료를 50 ml 양의 석회 제거 용액(10% EDTA, pH 7.4)에 넣고, EDTA를 2일마다 교체해 주었다. 적당히 석회 성분이 제거되면 조직을 파라핀에 넣고 조직 염색을 위해 4 μm 두께로 절편화하였다.
마우스의 상기도 방향의 열려진 기관을 통해 후비공 뒤로 마이크로피펫을 삽입한 뒤 200 μL PBS를 뿌리고 양 후비공으로부터 액체를 회수하여 4 ℃에서 10,000 rpm으로 10 분간 원심 분리하였다. 상청액을 -80 ℃에서 보관하였다.
마우스의 혈액 시료를 수득하여 4 ℃에서 10,000 rpm으로 10 분간 원심 분리하였다. 혈청 층을 별도로 분리한 뒤 80 ℃에서 보관하였다. 총 IgE (Thermo Scientific, Fremont, CA, USA) 및 HDM-특이적 IgE 수준(Chondrex., Redmond, WA, USA)을 확인하기 위하여 ELISA를 수행하였다. 검출을 위해 For TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 크로모겐 용액을 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase; HRP)의 기질로 사용하였다(450 nm에서 흡광도를 검출).
세포 배양
천식, 아스피린 민감성 또는 낭포성 섬유증이 없는 만성 비부비동염 환자로부터 코 상피 세포(HNE)를 획득하고, 점액 염증이 없는 건강한 대조군의 하위 비갑개골로부터 코 브러쉬된 세포를 수거하였다. HNE 세포에 대하여는 액체 접면 배양(ALI) 시스템을 사용하였다.
계대-2 HNE 세포를 12 mm, 0.45 μm 포어 트렌스웰-클리어 배양 삽입(Costar Co, Cambridge, MA, USA) 상에 2 Х 105 세포/cm2의 밀도로 접종하였다. 배양물을 0.5 μg/ml 하이드로코르티손(hydrocortisone), 5 μg/ml 인슐린(insulin), 10 μg/ml 트랜스페린(transferrin), 0.5 μg/ml 에피네프린(epinephrine), 6.5 μg/ml 트리요오드티로닌(triiodothyronine), 50 μg/ml 젠타마이신(gentamicin), 50 μg/ml 암포테리신(amphotericin)-B, 50 μg/ml 소 뇌하수체 추출물, 1.5 μg/ml 소 혈청 알부민, 10 ng/ml 상피 성장 인자 및 50 Nm 레티노산으로 보충된 BEBM/DMEM의 50:50 혼합물(BEGM; Lonza, Basel, Switzerland)에 담갔다. 컨플루언시에 다다르면, 정점 배지를 제거하고, 추가의 50nM 레티노산을 포함하는 BEGM 배지의 액체 접면에서 37 ℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. ALI 배지를 기저 챔버에 더한 후 14일 동안 매일 교체하였다. ALI 배양 후 14일 째부터 1일, 3일, 5일 또는 7일째에 기저 챔버에 IL-4 (5 ng/ml)를 추가하고, IL-4-함유 배지를 매 2일 마다 교체해 주었다.
히알루론산 정량화를 위하여, 최종 처리 후 24시간 경과하였을 때에 세포 배지를 회수하였다. 잔존하는 HNE 세포 층을 PBS 내 10 μg/ml 트립신(Sigma-Aldrich, Bornem, Belgium)으로 상온에서 10 분간 배양하여 세포 주변 히알루론산을 제거하였다. 트립신 처리 후 100 μg/ml 프로네이즈(pronase)를 각 세포 펠렛에 37 ℃에서 24 시간 동안 처리하여 잔존하는 세포 관련 히알루론산(세포 층)을 용해시켰다. 각 시료는 분석 전까지 -80 ℃에서 보관하였다.
RNA 분리 및 정량적 RT-PCR 분석
TRIzol 시약을 위하여 조직 및 HNE 세포로부터 총 RNA를 분리하였다. 역전사 전에 DNase I을 통해 가능한 게놈 DNA 오염을 제거하였다. M-MLV 역 전사 효소(Thermo scientific, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 총 RNA 1 μg을 역전사 하였다. 7300 Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 KAPA SYBR® FAST qPCR 키트(Roche, Indianapolis, IN, USA)를 이용하여 정량적 RT-PCR(qPCR)을 수행하였다. 이때 사용된 프라이머 서열은 하기 표 2와 같다.
웨스턴 블럿
얼음 상에서 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF), Halt 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)을 포함하는 세포 용혈 버퍼에서 시료를 용혈시켰다. 시료를 8% 또는 10% SDS-PAGE 겔에서 전기영동 시켰다. 단백질을 겔에서 PVDF 막으로 이동시키고, 막을 TTBS 내 5% 탈지유 또는 5% BSA에서 1:1000 희석된 항-혈청으로 4 ℃에서 밤새 배양하기 전에 0.5% Tween 20 (TTBS)을 포함하는 트리스-버퍼 식염수 내 5% 탈지유에서 상온에서 1시간 동안 전 배양하였다. 막을 2차 항체(1:2000 희석, 항-마우스/토끼 IgG 커플된 알칼린 포스파타제)로 1시간 동안 상온에서 배양한 뒤 TTBS로 3회 세척하였다. ECL 웨스턴 블럿 기절에 의해 특정 밴드를 검출하고, X-레이 필름에 노출시켜 시각화하였다. 베타-액틴으로 정규화하였다.
조직학적 분석
상피 시트 또는 인간 조직의 PFA-고정된 파라핀-삽입 절편(4 μm)을 현미경 슬라이드 상에 놓고 크실렌(Sigma Chemicals, St Louis, MO, USA)으로 왁스를 제거한 뒤 에탄올을 이용하여 재수화시킨 뒤 H&E 또는 알시안 블루를 이용하여 술잔 세포(goblet cells)를 10 분간 염색하였다. 물로 2 분간 세척한 뒤 과요오드 산(5 g/L)에서 5 분간 산화시키고 증류수에서 세척한 뒤 대조 염색을 위해 Coleman's Schiff 시약으로 10 분간 염색시켰다. 이후 유황 세척 용액에서 세척하고 물에서 세척한 뒤 Mayer 헤마톡실린으로 1 분 동안 염색시키고 물로 다시 세척하였다.
왁스를 제거한 마우스 머리 절편을 H&E 염색하고, 호산구를 위해 시리우스 적 염색을 수행하였다. 또한 술잔 세포를 위해 PAS 염색을 수행하였다. Х400 배 광학 현미경을 이용해 비중격막 점액 내 호산구 및 술잔 세포를 확인할 수 있었다.
면역형광 염색
면역 조직 화학 염색을 위하여, 왁스가 제거된 절편(4 μm)을 0.01 mol/L 소디움 시트레이트 버퍼(pH 6.0)를 이용하여 95 ℃에서 12 분간 열로 항원 회수(antigen retrieval) 시켰다. 슬라이드를 PBS에서 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 30분간 블러킹하고, 적절한 항혈청으로 4 ℃에서 밤새 배양하였다. TBS에서 세척하고, 슬라이드를 2차 항-마우스 Texas 레드-컨쥬게이트된 IgG 항체 또는 2차 항-토끼 FITC-컨쥬게이트된 IgG 항체(1:250)로 상온에서 1 시간 동안 배양하였다. 세척 후 커버 슬립을 VECTASHIELD 마운팅 배지(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 마운팅한 뒤 공초점 레이저-주사 현미경(LSM780, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Germany)으로 분석하였다.
상기 열로 항원 회수(antigen retrieval) 시키는 과정에서 절편에 대하여 HA 면역 염색을 수행하였다. 스트렙타비딘 및 비오틴 블러킹 용액(Vector Laboratories, Burlingame, CA)을 이용하여 상온에서 15 분간, 그리고 1% BSA (PBS-1% BSA)을 이용하여 상온에서 30 분간 비특이적 결합에 의한 블러킹을 수행하였다. 스트렙타비딘/비오틴 블러킹 키트는 모든 세포 내 비오틴, 비오틴 수용체 및 스트렙타비딘 결합 부위를 블러킹 하였다. 이후 절편을 5 μg/ml 비오티닐화된 HA 결합 단백질(biotin-HABP: recombinant human versican G1 domain)로 밤새 배양하고, PBS로 세척한 뒤 Alexa Fluor 488 스트렙타비딘(1: 1000)으로 상온에서 1시간 동안 배양하였다.
히알루론산 농도의 결정
히알루로난 ELISA(Echelon Biosciences K-1200, Salt Lake City, UT, USA)를 이용하여 히알루론산 농도를 확인하였다. HA 표준 및 시료 100 μL/웰, 및 HA 검출 시약 50 μL/웰을 배양 용기에 넣고 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 플레이트로부터 시료 100 μL를 검출 플레이트로 이동시킨 뒤 4 ℃에서 30 분간 배양하였다. 플레이트를 버퍼로 3회 세척하고 효소를 100 μL/well의 양으로 첨가하여 37 ℃에서 30 분간 배양하였다. 이후 플레이트를 세척한 뒤 기질 용액을 100 μL/well의 양으로 첨가하고 암실에서 30 분간 배양한 뒤 정지 용액 50 μL/well을 첨가하였다. 각 웰의 흡광도를 405 nm 마이크로플레이트 리더로 결정하였다.
사이토카인 정량화를 위한 다중 분석
인간 ELF 시료에 대하여 45개의 다른 분석물(CCL2, CCL3, CCL4, CCL11, CCL19, CCL20, CD40 Ligand, CXCL1, CXCL2, CXCL10, CX3CL1/Fractalkine, EGF, FGF basic, Flt-3 Ligand, G-CSF, GM-CSF, Granzyme B, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1 α, IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, IL-17E, IL-33, PD-L1/B7-H1, RANTES, PDGF-AA, PDGF-AB/BB, TGF-α, TNF-α, TRAIL, 및 VEGF)을 포함하는 인간 XL 사이토카인 자석 루미넥스 퍼포먼스 어쎄이 45-plex 고정 패널 (R&D Systems LKTM014, Minneapolis, MN, USA)을 적용하였다. 각 분석물의 표준 곡선과 일치시켜 단백질 농도를 분석하였다.
통계적 분석
통계적 분석은 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어(LaJolla, CA, USA)를 이용하여 수행되었고, 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 각 군 사이의 차이는 비-파라미터의 Mann-Whitney U 검정 또는 ruskal-Wallis 검정 및 Dunn's 다중 비교 검정을 포함하는 일원 분산 분석을 통해 분석하였다. P < 0.05의 값은 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
인간 코 상피 세포에서 히알루론산(HA)의 발현 및 분포
정상인과 알레르기성 비염 환자의 비점막으로 제작한 파라핀 블록을 이용하여 면역형광염색을 실시한 결과, 정상인보다 알레르기성 비염 환자의 비점막에서 히알루론산이 강하게 염색되었다(도 31). 특히 정상 비점막의 경우 기저세포(basal cell) 주위와 점막하 결합 조직(submucosal connective tissue)에서 히알루론산이 약하게 염색된 반면, 알레르기성 비염 환자의 비점막의 경우 상피 세포층을 구성하고 있는 모든 세포의 세포막과 점막하 결합 조직에서 히알루론산이 강하게 염색된 것을 볼 수 있었다.
또한, 11명의 건강한 대조군과 33명의 알레르기성 비염 환자를 대상으로 혈중 호산구 수와 총 혈청 IgE 및 코점막 내벽 액체 (epithelial lining fluid, ELF)에 존재하는 히알루론산 농도를 측정한 결과, 건강한 대조군 대비 알레르기성 비염 환자군에서 혈중 호산구 수, 총 혈청 IgE 및 코점막 내벽 액체 (ELF)에 존재하는 히알루론산 농도가 모두 통계학적으로 유의하게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 32).
4명의 건강한 대조군과 5명의 알레르기성 비염 환자에서 분리한 비점막 상피 세포를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과, 건강한 대조군에 비하여 알레르기성 비염 환자군의 비점막 상피 세포에서 히알루론산 합성 효소인 HAS2와 HAS3의 발현이 크게 증가하여 있는 것을 확인할 수 있었다(도 33).
이를 통해 비점막 내벽 액체 내 히알루론산 농도를 이용하여 알레르기성 비염 환자의 상태 및 치료 반응성을 예측할 수 있음을 알 수 있었다.
알레르기성 비염 환자의 비점막 내벽 액체에서의 사이토카인 발현 수준
11명의 건강한 대조군과 33명의 알레르기성 비염 환자로부터 수득한 비점막 내벽 액체(ELF)에서 염증성 사이토카인 특징을 조사하기 위하여 인간 사이토카인 패널 다중 어쎄이를 이용하여 2형 사이토카인, 1형/4형/CD8+ T 세포의 활성화에 관여하는 사이토카인, 염증성 및 조직 손상 마커와 호중구 침윤 및 활성화에 관여하는 사이토카인, 기도 리모델링(기저 세포 및 술잔 세포 과형성, 편평상피화생, 섬유증) 유발에 관여하는 성장인자의 양을 측정하였다(도 34 내지 37).
그 결과, 건강한 대조군 대비 알레르기성 비염 환자에서 알레르기성 호흡기 염증 질환의 염증 반응 특징에 해당하는 2형 사이토카인(IL-13 및 IL-33는 제외)과 기도 리모델링을 유도하는 성장 인자(PDGF-AA는 제외)의 양이 유의하게 증가하였다.
또한, 알레르기성 비염 환자에서 항-염증성 사이토카인인 IL-10의 발현 수준이 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었는 바, 염증 반응과 항-염증 반응이 동시에 일어남을 알 수 있었다.
또한, 건강한 대조군 대비 알레르기성 비염 환자에서 호중구의 침윤 및 활성화에 관여하는 IL-8과 만성 알레르기성 염증 반응에 관여하는 IFN-γ-유도 단백질 10 (IP-10; CXCL10)이 통계적으로 유의하게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
알레르기성 비염 환자에서 증가되어 있는 사이토카인과 히알루론산의 상관 관계 분석
알레르기성 비염 환자에서 유의하게 증가되어 있는 사이토카인과 ELF 히알루론산 간의 상관 분석을 수행한 결과, IL-5, 에오탁신, RANTES, MCP-1, MIP-1α, CD40L, fractalkine, GM-CSF, IL-8, IL-10, EGF, bFGF, TGF-α, VEGF는 히알루론산과 통계적으로 유의적인 양 (positive)의 상관관계를 보였으며, 특히 RANTES, GM-CSF, IL-8, TGF-α, VECF는 히알루론산과 높은 상관 계수를 보였다(도 38).
IL-4 처리된 인간 비 상피세포에서 HAS2 및 HAS3의 상향 조절
인체 비점막 상피 세포층과 유사한 구조를 인-비트로에서 구현하기 위하여, 공기-액체 접면(ALI) 배양 시스템을 이용하여 인간 비점막 상피 세포를 2주간 분화 (primary human nasal epithelial cells, HNE cells) 시킨 다음, 알레르기성 염증 반응을 모사하기 위하여 Th2 사이토카인인 IL-4를 1일 내지 7일간 처리하였다(도 39).
IL-4를 처리한 HNE 세포에서 HA 합성 효소 (hyaluronan synthase, HAS)인 HAS2와 HAS3, 그리고 HA 수용체인 CD44v3 mRNA의 발현은 대조군에 비하여 현저히 증가하였다(도 40).
웨스턴 블럿의 분석 결과에서도 IL-4를 처리한 HNE 세포에서 HAS2, HAS3 및 CD44v3의 발현 수준이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 41).
면역형광염색 결과, 대조군 세포는 세포 주위 바탕질 (pericellular matrix, PCM)에서 HA가 약하게 염색되는 반면에, IL-4 처리된 HNE 세포에서는 히알루론산이 PCM에서 강하게 염색된 것을 확인할 수 있었고, 히알루론산과 히알루론산 수용체인 CD44v3는 기저층과 기저위층에서 같이 염색된 것을 볼 수 있었다(도 42).
HNE 세포에서 4-메틸엄벨리페론(4-methylumbelliferone; 4-MU)에 의한 농도 의존적 IL-4 유도 HAS 및 계통 특이적 마커 발현의 억제
IL-4 처리에 의해 기저전구세포 (basal progenitor cell)에서 술잔 세포 계통으로 분화되는 세포 상태 전이 과정에서 히알루론산의 역할을 알아보기 위하여, IL-4와 함께 히알루론산 합성 억제제인 4-MU를 농도별 (0 ~ 1.0 mM)로 3 일간 HNE 세포에서 처리하였고, 4-MU의 최대 억제 효과를 확인하였다(도 43 내지 45).
그 결과, 4-MU를 처리한 경우 농도 의존적으로 IL-4에 의해 발현이 증가한 HAS3와 계통 특이적 마커(Ki-67, KRT5, p63, SOX2, SPDEF, 및 POSTN)가 단백질 수준 및 RNA 수준 모두에서 발현이 억제되었고, 이러한 효과는 0.5 mM 4-MU에서 부터 가장 잘 나타나는 것을 볼 수 있었다.
단, 4-MU의 처리 시 HAS2의 발현이 억제되지는 않았는 바, HAS2는 기저 세포 (basal cell)와 초기 전구 세포 (early progenitor cell)에서 발현되며, 4-MU는 이러한 세포 상태 이후에 일어나는 이벤트에 대해 억제 효과를 나타내는 것임을 알 수 있었다.
HNE 세포에서 4-메틸엄벨리페론(4-methylumbelliferone; 4-MU)에 의한 시간 의존적 IL-4 유도 HAS 및 계통 특이적 마커 발현의 억제
IL-4-유도 세포 상태 전이 과정에서 히알루론산의 역할을 알아보기 위하여, IL-4와 함께 히알루론산 합성 억제제인 0.5 mM의 4-MU를 1일 내지 7일간 HNE 세포에서 처리하였고, 4-MU의 최대 억제 효과를 확인하였다(도 46 내지 48).
그 결과, 4-MU를 처리한 경우 시간 의존적으로 4-MU는 IL-4에 의해 유도되는 IL-4에 의해 발현이 증가한 HAS3와 계통 특이적 마커(Ki-67, KRT5, p63, SOX2, SPDEF, 및 POSTN)가 단백질 수준 및 RNA 수준 모두에서 발현이 억제되었고, 특히 IL-4에 의해 증가된 HAS2의 발현은 3일 이후부터 4-MU에 의해 감소되었는데, 이러한 발현 수준의 변화는 특정한 세포에서 일어나는 것이라기 보다는 IL-4-유도 세포 상태 전이 과정에서 일어나는 세포 표현형의 변화에 의한 것임을 알 수 있었다(도 43 내지 45).
HNE 세포에서 4-MU 처리에 의한 IL-4-유도 점액 생성의 억제
4-MU가 IL-4에 의해 유도된 술잔 세포의 과형성을 억제할 수 있는 지 알아보기 위하여, HNE 세포에 4-MU을 IL-4와 함께 7일간 처리하였다. IL-4에 의해 증가되는 HA, CD44v3 및 MUC5AC의 발현과 술잔 세포의 수는 4-MU에 의해 크게 감소하였다. 하지만 IL-4에 의해 감소되는 섬모세포 (ciliated cell)의 수는 4-MU에 의해 변화되지 않는 것으로 보아 4-MU는 섬모세포 분화에는 영향이 없는 것을 알 수 있었다(도 49).
HNE 세포에 IL-4 및 4-MU을 7일간 처리한 뒤 qPCR을 시행하여 HAS2, HAS3, CD44v3, MUC5AC, FOXJ1의 mRNAs의 발현 수준의 변화를 확인해 본 결과, IL-4에 의해 증가된 HAS2, HAS3, CD44v3 및 MUC5AC mRNAs의 발현은 4-MU에 의해 크게 감소하였지만, IL-4에 의해 감소된 FOXJ1 mRNAs의 발현은 4-MU에 의해 아무런 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다(도 50).
집먼지 진드기(HDM) 유도 마우스 모델에서 4-MU 투여에 따른 Muc5ac 발현 억제 및 술잔 세포의 수의 감소
마우스 모델에 집먼지 진드기(HDM)를 3 회의 전신 감작과 4 회의 비강 감작을 시행하여 급성 알레르기 비염 (AR) 마우스 모델을 구축하였다. 이때 4-MU는 집먼지 진드기(HDM)를 비강 감작시키기 1시간 전에 비강에 투여하였다(도 51).
알레르기성 비염의 병태, 생리적 지표인 Muc5ac-양성 술잔 세포의 수는 알레르기성 비염 마우스 모델에서 크게 증가하였으나, 4-MU를 투여하자 그 수가 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 52 및 53).
또한 히알루론산은 알레르기성 비염 마우스 모델에서 강하게 염색되었으나, 4-MU 투여에 의해 감소되는 것을 볼 수 있었다.
이를 통해 집먼지 진드기로 감작시킨 마우스에 집먼지 진드기를 비강 감작시키기 전에 4-MU를 비강에 투여함으로써 알레르기성 염증 반응인 술잔 세포의 과형성과 점액 과다 생성을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University
<120> Composition for diagnosing allergic respiratory disease
<130> PDPB204393
<160> 18
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 711
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Asp Lys Phe Trp Trp His Ala Ala Trp Gly Leu Cys Leu Val Pro
1 5 10 15
Leu Ser Leu Ala Gln Ile Asp Leu Asn Ile Thr Cys Arg Phe Ala Gly
20 25 30
Val Phe His Val Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu
35 40 45
Ala Ala Asp Leu Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala
50 55 60
Gln Met Glu Lys Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly
65 70 75 80
Phe Ile Glu Gly His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile
85 90 95
Cys Ala Ala Asn Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Ser Asn Thr Ser
100 105 110
Gln Tyr Asp Thr Tyr Cys Phe Asn Ala Ser Ala Pro Pro Glu Glu Asp
115 120 125
Cys Thr Ser Val Thr Asp Leu Pro Asn Ala Phe Asp Gly Pro Ile Thr
130 135 140
Ile Thr Ile Val Asn Arg Asp Gly Thr Arg Tyr Val Gln Lys Gly Glu
145 150 155 160
Tyr Arg Thr Asn Pro Glu Asp Ile Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Asp Asp
165 170 175
Asp Val Ser Ser Gly Ser Ser Ser Glu Arg Ser Ser Thr Ser Gly Ala
180 185 190
Leu Met Ser Thr Ser Ala Thr Ala Thr Glu Thr Ala Thr Lys Arg Gln
195 200 205
Glu Thr Trp Asp Trp Phe Ser Trp Leu Phe Leu Pro Ser Glu Ser Lys
210 215 220
Asn His Leu His Thr Thr Thr Gln Met Ala Gly Thr Ser Ser Asn Thr
225 230 235 240
Ile Ser Ala Gly Trp Glu Pro Asn Glu Glu Asn Glu Asp Glu Arg Asp
245 250 255
Arg His Leu Ser Phe Ser Gly Ser Gly Ile Asp Asp Asp Glu Asp Phe
260 265 270
Ile Ser Ser Thr Ile Ser Thr Thr Pro Arg Ala Phe Asp His Thr Lys
275 280 285
Gln Asn Gln Asp Trp Thr Gln Trp Asn Pro Ser His Ser Asn Pro Glu
290 295 300
Val Leu Leu Gln Thr Thr Thr Arg Met Thr Asp Val Asp Arg Asn Gly
305 310 315 320
Thr Thr Ala Tyr Glu Gly Asn Trp Asn Pro Glu Ala His Pro Pro Leu
325 330 335
Ile His His Glu His His Glu Glu Glu Glu Thr Pro His Ser Thr Ser
340 345 350
Thr Ile Gln Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln
355 360 365
Lys Glu Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr
370 375 380
Pro Lys Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala Ala Ala Ser Ala
385 390 395 400
His Thr Ser His Pro Met Gln Gly Arg Thr Thr Pro Ser Pro Glu Asp
405 410 415
Ser Ser Trp Thr Asp Phe Phe Asn Pro Ile Ser His Pro Met Gly Arg
420 425 430
Gly His Gln Ala Gly Arg Arg Met Asp Met Asp Ser Ser His Ser Ile
435 440 445
Thr Leu Gln Pro Thr Ala Asn Pro Asn Thr Gly Leu Val Glu Asp Leu
450 455 460
Asp Arg Thr Gly Pro Leu Ser Met Thr Thr Gln Gln Ser Asn Ser Gln
465 470 475 480
Ser Phe Ser Thr Ser His Glu Gly Leu Glu Glu Asp Lys Asp His Pro
485 490 495
Thr Thr Ser Thr Leu Thr Ser Ser Asn Arg Asn Asp Val Thr Gly Gly
500 505 510
Arg Arg Asp Pro Asn His Ser Glu Gly Ser Thr Thr Leu Leu Glu Gly
515 520 525
Tyr Thr Ser His Tyr Pro His Thr Lys Glu Ser Arg Thr Phe Ile Pro
530 535 540
Val Thr Ser Ala Lys Thr Gly Ser Phe Gly Val Thr Ala Val Thr Val
545 550 555 560
Gly Asp Ser Asn Ser Asn Val Asn Arg Ser Leu Ser Gly Asp Gln Asp
565 570 575
Thr Phe His Pro Ser Gly Gly Ser His Thr Thr His Gly Ser Glu Ser
580 585 590
Asp Gly His Ser His Gly Ser Gln Glu Gly Gly Ala Asn Thr Thr Ser
595 600 605
Gly Pro Ile Arg Thr Pro Gln Ile Pro Glu Trp Leu Ile Ile Leu Ala
610 615 620
Ser Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys Ile Ala Val Asn
625 630 635 640
Ser Arg Arg Arg Cys Gly Gln Lys Lys Lys Leu Val Ile Asn Ser Gly
645 650 655
Asn Gly Ala Val Glu Asp Arg Lys Pro Ser Gly Leu Asn Gly Glu Ala
660 665 670
Ser Lys Ser Gln Glu Met Val His Leu Val Asn Lys Glu Ser Ser Glu
675 680 685
Thr Pro Asp Gln Phe Met Thr Ala Asp Glu Thr Arg Asn Leu Gln Asn
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Val Asp Met Lys Ile Gly Val
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Leu Ser Leu Ala Gln Ile Asp Leu Asn Ile Thr Cys Arg Phe Ala Gly
20 25 30
Val Phe His Val Glu Lys Asn Gly Arg Tyr Ser Ile Ser Arg Thr Glu
35 40 45
Ala Ala Asp Leu Cys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Leu Pro Thr Met Ala
50 55 60
Gln Met Glu Lys Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Arg Tyr Gly
65 70 75 80
Phe Ile Glu Gly His Val Val Ile Pro Arg Ile His Pro Asn Ser Ile
85 90 95
Cys Ala Ala Asn Asn Thr Gly Val Tyr Ile Leu Thr Ser Asn Thr Ser
100 105 110
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Ile Ile Leu Ala Ser Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys
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Ile Ala Val Asn Ser Arg Arg Arg Cys Gly Gln Lys Lys Lys Leu Val
340 345 350
Ile Asn Ser Gly Asn Gly Ala Val Glu Asp Arg Lys Pro Ser Gly Leu
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<213> Homo sapiens
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130
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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1 5 10 15
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20 25 30
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Pro
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
<400> 13
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115 120 125
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130 135 140
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Ala Asn Val Ala Val Asp Pro Val Glu Arg Phe Ile Phe Trp Ser Ser
165 170 175
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210 215 220
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355 360 365
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Pro Gly Tyr Asp Leu Gln Leu Asp Glu Lys Ser Cys Ala Ala Ser Gly
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485 490 495
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580 585 590
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Leu Ile Trp Pro Ser Gly Ile Thr Ile Asp Phe Leu Thr Asp Lys Leu
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Tyr Trp Cys Asp Ala Lys Gln Ser Val Ile Glu Met Ala Asn Leu Asp
660 665 670
Gly Ser Lys Arg Arg Arg Leu Thr Gln Asn Asp Val Gly His Pro Phe
675 680 685
Ala Val Ala Val Phe Glu Asp Tyr Val Trp Phe Ser Asp Trp Ala Met
690 695 700
Pro Ser Val Ile Arg Val Asn Lys Arg Thr Gly Lys Asp Arg Val Arg
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Leu Gln Gly Ser Met Leu Lys Pro Ser Ser Leu Val Val Val His Pro
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Leu Ala Lys Pro Gly Ala Asp Pro Cys Leu Tyr Gln Asn Gly Gly Cys
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Glu His Ile Cys Lys Lys Arg Leu Gly Thr Ala Trp Cys Ser Cys Arg
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Glu Gly Phe Met Lys Ala Ser Asp Gly Lys Thr Cys Leu Ala Leu Asp
770 775 780
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850 855 860
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885 890 895
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945 950 955 960
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980 985 990
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Ala Gly His Gly Gln Gln Gln Lys Val Ile Val Val Ala Val Cys Val
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Tyr Arg Thr Gln Lys Leu Leu Ser Lys Asn Pro Lys Asn Pro Tyr Glu
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Glu Ser Ser Arg Asp Val Arg Ser Arg Arg Pro Ala Asp Thr Glu Asp
1075 1080 1085
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Ala Ala Asp Gly Ser Met Gln Pro Thr Ser Trp Arg Gln Glu Pro Gln
1125 1130 1135
Leu Cys Gly Met Gly Thr Glu Gln Gly Cys Trp Ile Pro Val Ser Ser
1140 1145 1150
Asp Lys Gly Ser Cys Pro Gln Val Met Glu Arg Ser Phe His Met Pro
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Ser Tyr Gly Thr Gln Thr Leu Glu Gly Gly Val Glu Lys Pro His Ser
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Leu Leu Ser Ala Asn Pro Leu Trp Gln Gln Arg Ala Leu Asp Pro Pro
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His Gln Met Glu Leu Thr Gln
1205
<210> 14
<211> 288
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Val Gly Val Gly Gly Gly Asp Val Glu Asp Val Thr Pro Arg Pro
1 5 10 15
Gly Gly Cys Gln Ile Ser Gly Arg Gly Ala Arg Gly Cys Asn Gly Ile
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Pro Gly Ala Ala Ala Trp Glu Ala Ala Leu Pro Arg Arg Arg Pro Arg
35 40 45
Arg His Pro Ser Val Asn Pro Arg Ser Arg Ala Ala Gly Ser Pro Arg
50 55 60
Thr Arg Gly Arg Arg Thr Glu Glu Arg Pro Ser Gly Ser Arg Leu Gly
65 70 75 80
Asp Arg Gly Arg Gly Arg Ala Leu Pro Gly Gly Arg Leu Gly Gly Arg
85 90 95
Gly Arg Gly Arg Ala Pro Glu Arg Val Gly Gly Arg Gly Arg Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Ala Ala Pro Arg Ala Ala Pro Ala Ala Arg Gly Ser Arg Pro
115 120 125
Gly Pro Ala Gly Thr Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala
130 135 140
Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys
145 150 155 160
Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile
165 170 175
His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His
180 185 190
Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys
195 200 205
Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu
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Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu
225 230 235 240
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245 250 255
Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr
260 265 270
Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser
275 280 285
<210> 15
<211> 160
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Met Val Pro Ser Ala Gly Gln Leu Ala Leu Phe Ala Leu Gly Ile Val
1 5 10 15
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20 25 30
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His Cys Glu Trp Cys Arg Ala Leu Ile Cys Arg His Glu Lys Pro Ser
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Ala Leu Leu Lys Gly Arg Thr Ala Cys Cys His Ser Glu Thr Val Val
145 150 155 160
<210> 16
<211> 232
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly
20 25 30
Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln
35 40 45
Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu
50 55 60
Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu
65 70 75 80
Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro
85 90 95
Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His
100 105 110
Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys
115 120 125
Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val
130 135 140
Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp
165 170 175
Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys
180 185 190
His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn
195 200 205
Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr
210 215 220
Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
225 230
<210> 17
<211> 552
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Met His Cys Glu Arg Phe Leu Cys Ile Leu Arg Ile Ile Gly Thr Thr
1 5 10 15
Leu Phe Gly Val Ser Leu Leu Leu Gly Ile Thr Ala Ala Tyr Ile Val
20 25 30
Gly Tyr Gln Phe Ile Gln Thr Asp Asn Tyr Tyr Phe Ser Phe Gly Leu
35 40 45
Tyr Gly Ala Phe Leu Ala Ser His Leu Ile Ile Gln Ser Leu Phe Ala
50 55 60
Phe Leu Glu His Arg Lys Met Lys Lys Ser Leu Glu Thr Pro Ile Lys
65 70 75 80
Leu Asn Lys Thr Val Ala Leu Cys Ile Ala Ala Tyr Gln Glu Asp Pro
85 90 95
Asp Tyr Leu Arg Lys Cys Leu Gln Ser Val Lys Arg Leu Thr Tyr Pro
100 105 110
Gly Ile Lys Val Val Met Val Ile Asp Gly Asn Ser Glu Asp Asp Leu
115 120 125
Tyr Met Met Asp Ile Phe Ser Glu Val Met Gly Arg Asp Lys Ser Ala
130 135 140
Thr Tyr Ile Trp Lys Asn Asn Phe His Glu Lys Gly Pro Gly Glu Thr
145 150 155 160
Asp Glu Ser His Lys Glu Ser Ser Gln His Val Thr Gln Leu Val Leu
165 170 175
Ser Asn Lys Ser Ile Cys Ile Met Gln Lys Trp Gly Gly Lys Arg Glu
180 185 190
Val Met Tyr Thr Ala Phe Arg Ala Leu Gly Arg Ser Val Asp Tyr Val
195 200 205
Gln Val Cys Asp Ser Asp Thr Met Leu Asp Pro Ala Ser Ser Val Glu
210 215 220
Met Val Lys Val Leu Glu Glu Asp Pro Met Val Gly Gly Val Gly Gly
225 230 235 240
Asp Val Gln Ile Leu Asn Lys Tyr Asp Ser Trp Ile Ser Phe Leu Ser
245 250 255
Ser Val Arg Tyr Trp Met Ala Phe Asn Ile Glu Arg Ala Cys Gln Ser
260 265 270
Tyr Phe Gly Cys Val Gln Cys Ile Ser Gly Pro Leu Gly Met Tyr Arg
275 280 285
Asn Ser Leu Leu His Glu Phe Val Glu Asp Trp Tyr Asn Gln Glu Phe
290 295 300
Met Gly Asn Gln Cys Ser Phe Gly Asp Asp Arg His Leu Thr Asn Arg
305 310 315 320
Val Leu Ser Leu Gly Tyr Ala Thr Lys Tyr Thr Ala Arg Ser Lys Cys
325 330 335
Leu Thr Glu Thr Pro Ile Glu Tyr Leu Arg Trp Leu Asn Gln Gln Thr
340 345 350
Arg Trp Ser Lys Ser Tyr Phe Arg Glu Trp Leu Tyr Asn Ala Met Trp
355 360 365
Phe His Lys His His Leu Trp Met Thr Tyr Glu Ala Ile Ile Thr Gly
370 375 380
Phe Phe Pro Phe Phe Leu Ile Ala Thr Val Ile Gln Leu Phe Tyr Arg
385 390 395 400
Gly Lys Ile Trp Asn Ile Leu Leu Phe Leu Leu Thr Val Gln Leu Val
405 410 415
Gly Leu Ile Lys Ser Ser Phe Ala Ser Cys Leu Arg Gly Asn Ile Val
420 425 430
Met Val Phe Met Ser Leu Tyr Ser Val Leu Tyr Met Ser Ser Leu Leu
435 440 445
Pro Ala Lys Met Phe Ala Ile Ala Thr Ile Asn Lys Ala Gly Trp Gly
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
Ile Val Gly Thr Leu Leu Tyr Ala Cys Tyr Trp Val Met Leu Leu Thr
515 520 525
Leu Tyr Val Val Leu Ile Asn Lys Cys Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gln
530 535 540
Gln Tyr Asp Met Val Leu Asp Val
545 550
<210> 18
<211> 553
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Met Pro Val Gln Leu Thr Thr Ala Leu Arg Val Val Gly Thr Ser Leu
1 5 10 15
Phe Ala Leu Ala Val Leu Gly Gly Ile Leu Ala Ala Tyr Val Thr Gly
20 25 30
Tyr Gln Phe Ile His Thr Glu Lys His Tyr Leu Ser Phe Gly Leu Tyr
35 40 45
Gly Ala Ile Leu Gly Leu His Leu Leu Ile Gln Ser Leu Phe Ala Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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530 535 540
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545 550
Claims (27)
- CD44 변이체 3(CD44 variant 3; CD44v3) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 히알루론산(hyaluronic acid) 중 적어도 하나의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 알레르기성 호흡기 질환의 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 IL-5, 에오탁신(eotaxin), RANTES, MCP-1, MIP-1α, CD40L, 프렉탈카인(fractalkine), GM-CSF, IL-8, IL-10, EGF, bFGF, TGF-α 및 VEGF로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 HAS2 및 HAS3 중 적어도 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 히알루론산의 발현 수준을 측정하는 제제는 히알루론산 결합 단백질(hyaluronic acid binding protein; HABP)인, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 알레르기성 호흡기 질환은 알레르기성 천식, 기관지염, 알레르기성 비염, 부비동염, 하기도 감염증 및 상기도 감염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 조성물. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 알레르기성 호흡기 질환의 진단용 키트.
- 제8항에 있어서,
상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인, 키트. - 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CD44 변이체 3(CD44 variant 3; CD44v3) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 히알루론산(hyaluronic acid) 중 적어도 하나의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 알레르기성 호흡기 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 기관지 생검, 폐 생검, 비강 생검, 부비동 생검, 객담(sputum), 기관지 폐포세척액(bronchoalveolar lavage fluid; BALF), 비강 세척액(nasal lavage fluid), 비강 도말(nasal swap), 비강 흡인액 (nasal aspirate), 비인두 도말(nasopharyngeal swab), 비인두 흡인액(nasopharyngeal aspirate), 비인두 세척액(nasopharyngeal lavage fluid), 전혈(whole blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 눈물(tears), 점액(mucus), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 정보 제공 방법. - 제10항에 있어서,
상기 정보 제공 방법은 IL-5, 에오탁신(eotaxin), RANTES, MCP-1, MIP-1α, CD40L, 프렉탈카인(fractalkine), GM-CSF, IL-8, IL-10, EGF, bFGF, TGF-α 및 VEGF로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, 정보 제공 방법. - 제10항에 있어서,
상기 정보 제공 방법은 HAS2 및 HAS3 중 적어도 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, 정보 제공 방법. - 제10항에 있어서,
상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 정보 제공 방법. - 제10항에 있어서,
상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의하는, 정보 제공 방법. - 제10항에 있어서,
상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 정보 제공 방법. - 제10항에 있어서,
상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의하는, 정보 제공 방법. - 제10항에 있어서,
상기 히알루론산의 발현 수준을 측정하는 제제는 히알루론산 결합 단백질(hyaluronic acid binding protein; HABP)인, 정보 제공 방법. - 제10항에 있어서,
상기 히알루론산의 발현 수준을 측정하는 방법은 ELISA-유사 어쎄이(sandwich ELISA-like assay) 또는 막 블럿팅(membrane blotting)인, 정보 제공 방법. - 제10항에 있어서,
상기 생물학적 시료에 대하여 측정된 CD44 변이체 3(CD44v3) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 히알루론산(hyaluronic acid) 중 적어도 하나의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가된 경우, 알레르기성 호흡기 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 정보 제공 방법. - 제12항에 있어서,
상기 생물학적 시료에 대하여 측정된 IL-5, 에오탁신(eotaxin), RANTES, MCP-1, MIP-1α, CD40L, 프렉탈카인(fractalkine), GM-CSF, IL-8, IL-10, EGF, bFGF, TGF-α 및 VEGF로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가된 경우, 알레르기성 호흡기 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 정보 제공 방법. - 제13항에 있어서,
상기 생물학적 시료에 대하여 측정된 HAS2 및 HAS3 중 적어도 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가된 경우, 알레르기성 호흡기 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 정보 제공 방법. - 제10항에 있어서,
상기 알레르기성 호흡기 질환은 알레르기성 천식, 기관지염, 알레르기성 비염, 부비동염, 하기도 감염증 및 상기도 감염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 정보 제공 방법. - 알레르기성 호흡기 질환 환자로부터 분리한 생물학적 시료 또는 알레르기성 호흡기 질환 유도 동물 모델에서 CD44 변이체 3(CD44v3) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 히알루론산(hyaluronic acid) 중 적어도 하나의 발현 수준을 측정하는 단계;
상기 생물학적 시료 또는 동물 모델에 피검 물질을 처리하는 단계; 및
상기 피검 물질의 처리 후 상기 생물학적 시료 또는 상기 동물 모델에서 CD44 변이체 3(CD44v3) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 히알루론산(hyaluronic acid) 중 적어도 하나의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 알레르기성 호흡기 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법. - 제24항에 있어서,
상기 측정하는 단계 시 IL-5, 에오탁신(eotaxin), RANTES, MCP-1, MIP-1α, CD40L, 프렉탈카인(fractalkine), GM-CSF, IL-8, IL-10, EGF, bFGF, TGF-α 및 VEGF로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 추가로 측정하는, 스크리닝 방법. - 제24항에 있어서,
상기 측정하는 단계 시 HAS2 및 HAS3 중 적어도 하나의 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 추가로 측정하는, 스크리닝 방법. - 제24항에 있어서,
상기 피검 물질의 처리 후 상기 생물학적 시료 또는 상기 동물 모델에서 CD44 변이체 3(CD44v3) 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 히알루론산(hyaluronic acid) 중 적어도 하나의 발현 수준이 처리 전에 비하여 감소된 경우 상기 피검 물질을 알레르기성 호흡기 질환의 치료제로 판별하는 단계를 포함하는, 스크리닝 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210049998A KR20220143459A (ko) | 2021-04-16 | 2021-04-16 | 알레르기성 호흡기 질환의 진단용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210049998A KR20220143459A (ko) | 2021-04-16 | 2021-04-16 | 알레르기성 호흡기 질환의 진단용 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220143459A true KR20220143459A (ko) | 2022-10-25 |
Family
ID=83803592
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210049998A KR20220143459A (ko) | 2021-04-16 | 2021-04-16 | 알레르기성 호흡기 질환의 진단용 조성물 |
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20220143459A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117994595A (zh) * | 2024-04-07 | 2024-05-07 | 首都医科大学附属北京儿童医院 | 一种鼻窦炎的分析方法和相关设备 |
-
2021
- 2021-04-16 KR KR1020210049998A patent/KR20220143459A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117994595A (zh) * | 2024-04-07 | 2024-05-07 | 首都医科大学附属北京儿童医院 | 一种鼻窦炎的分析方法和相关设备 |
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