KR20170105162A - 천식 진단용 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 S100A9 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물에 관한 것이다.
상기 S100A9 단백질은 정상 대조군에 비해, 천식 환자에서 발현이 증가하였는 바, 상기 단백질 또는 그 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교함으로서, 천식의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다.
아울러, 본 발명의 진단용 조성물은 비침습성 진단을 가능하게 하여 객담 등으로 간단하고 유효성 있는, 천식의 초기 진단을 할 수 있다.

Description

천식 진단용 마커 및 이의 용도{A biomarker for diagnosing asthma and the uses thereof}

본 발명은 천식 진단용 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 S100A9 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트에 관한 것이다.

천식(asthma)은 만성 기도 염증 및 기도과민성을 특징으로 하는 폐질환으로, 대기오염물질, 황사, 알러젠(allergen) 등에 의하여 발생한다. 특히, 천식은 호흡곤란을 야기하는 염증성 호흡기 질환으로 우리나라 인구 중 약 300만명이 천식을 앓고 있다. 천식은 색색거리는 천명, 호흡곤란, 재채기, 심한 경우 산소부족으로 인한 청색증 및 흉통을 나타내는 질환으로 최근 들어 대기오염 및 각종 화학물질에 대한 노출과 식생활의 서구화로 인하여 급격히 증가하고 있으며, 특히 소아에서 발병률이 증가하고 있고 식습관의 변화 및 서구화에 따라 증가하고 있는 추세이다(JAMA 1997;278:1855-1873).

이러한 천식은 병인, 병리, 심각도, 생리적 파라미터 및 치료 반응에 의해 정의될 수 있는 다양한 아형으로 이루어지는 이종 질환이다. 최근 몇 년 동안, 백인 천식 집단(Caucasian asthma cohorts)의 클러스터 분석은 정상 폐 기능을 가진 조기 발병의 아토피성 천식, 심한 공기흐름 방해를 가진 성인 천식환자, 그리고 FEV1이 감소된 비아토피성 비만 여성을 포함하여 독특한 임상 서브 표현형을 규명하는 것을 가능하게 했다. 한국어 천식 집단도 이와 유사한 클러스터를 나타냈다(Eur Respir J 2013; 41:1308-14).

임상 및 인구통계학적 파라미터는 임상 경과를 예측하는 데 제한되기 때문에, 기도 염증 패턴 또는 사이토카인 같은 다른 파라미터 역시, 천식의 endotypes을 정의하는 데 사용되어 왔다. 기도 염증은 독특한 생리학적 및 임상적 특징, 호산성, 호중구, 혼합 세포 및 pauci-granulocytic 타입을 가진다. 조기 발병 알레르기 천식은 Th2-type 사이토카인과 강력한 호산성 기도 염증 증상을 가지며, 후기 발병 천식 환자의 5 ~ 10 %는 흡입 코르티코스테로이드 치료에도 불구하고 호중구성 기도 염증과 심한 증상이 있다고 알려져 있다(Am J Respir Crit Care Med 1999; 160:1001-8).

Th2 편중된 림프구로부터 분비되는 IL-4, IL-5, IL-13은 천식환자의 호산구성 기도에 관여하며, Th1 림프구로부터 분비되는 IL-8, TNF-α, 인터페론 (INF)-γ와 Th17으로부터 분비되는 IL-17은 호중구성 염증에 관여하는 것으로 알려져 있다(Clin Exp Allergy 2012; 42:625-37). 그러나, 천식에서 호중구성 기도에 원인이 되는 분자는 아직 규명되지 않았다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 천식을 진단할 수 있는 분자의 탐색을 위하여 연구한 결과, 객담에서 분리된 S100A9가 천식을 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 S100A9 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로, S100A9 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 용어 "S100A9"는 스트레스를 받은 세포에서 분비되는 alarmin으로 인식되는 작은 칼슘 결합 단백질이다. S100A9는 Toll-like receptor 4의 활성화, 호중구 주화성(chemotaxis), 호중구 염증, IL-8 생산 증가를 유도한다.

본 발명의 일실시예에서는 정상 대조군에 비해 천식 환자(BA군)의 객담내에 S100A9의 발현이 유의적으로 높은 것을 확인하였으며, BA군내에서도 호중구의 비율이 높은 그룹에서 S100A9의 발현이 유의적으로 높음을 확인하였다(실험예 2).

또한, 본 발명의 일실시예에서는 OVA/CFA를 이용하여 천식을 유도한 마우스에서, 대식세포, 호중구, 호산구 및 림프구 수가 증가하는 것을 확인하였으며, 항-S100A9 항체를 투여한 결과, 호산구 수에는 영향이 없었으나, 증가된 호중구 수가 감소하는 것을 확인하였으며, 증가된 폐 저항성이 사라지는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 일실시예에서는 OVA/CFA를 투여하여 천식을 유도한 마우스에서, 주변 기관지 영역과 기관지 상피를 침투한 호중구 엘라스타제 더블 양성 세포와 S100A9 수준은 항-S100A9 항체 처리에 의해 사라지는 것을 확인하였으며, 증가된 P20-활성화된 카스파제 1, IL-1β, IL-17 및 IFN-γ 수준도 항-S100A9 항체 처리에 의해 현저히 감소하는 것을 확인하였다(실험예 4).

이에 따라, 본 발명의 S100A9는 정상인에 비해, 천식환자에서 발현이 증가하는 단백질로, 상기 S100A9의 발현양을 측정함으로써 천식을 진단할 수 있다는 것이 본 발명자들에 의해 최초로 규명하였다.

또한, 상기 항-S100A9 항체를 투여한 결과, 호산구에는 영향이 없었으나, 천식 모델에서 증가된 호중구 수가 감소하는 것을 확인하였는바, 본 발명은 호중구성 기도 염증이 관여하는 호중구성 천식을 진단하는데, 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, “천식”은 기관, 기관지, 세기관지, 그리고 폐포로 이어지는 기도의 염증반응과 이로 인한 기도조직의 손상 및 변화를 특징으로 하는 여러 가지 질환들을 통칭하는 포괄적인 질환명이다(Wardlaw A 등, Clin Exp Allergy 2005;35:1254-62). 보다 구체적으로, 천식은 폐 속에 있는 기관지가 아주 예민해진 상태로, 때때로 기관지가 좁아져서 숨이 차고 가랑가랑하는 숨소리가 들리면서 기침을 심하게 하는 증상을 나타내는 질환으로, 기관지의 알레르기 염증 반응 때문에 발생하는 알레르기 질환이다. 천식의 대표적인 증상은 호흡곤란, 기침, 천명(쌕쌕거리는 거친 숨소리) 등이며, 좁아진 기관지를 짧은 시간 내에 완화시키는 증상 완화제(기관지 확장제) 또는 기관지의 알레르기 염증을 억제하여 천식발작을 예방하는 질병 조절제(항염증제, 류코트리엔 조절제) 등이 대표적인 치료제로 사용된다. 본 발명에서 상기 천식은 기관지성 천식, 알러지성 천식, 아토피형 천식, 비아토피형 천식, 운동유발 천식, 아스피린 천식, 심인성 천식, 호중구성 천식, 호산구성 천식 또는 폐포성 천식일 수 있으며, 구체적으로는 호중구성 기도 염증이 관여하는 호중구성 천식일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 천식 질환 발병 여부를 확인하는 것으로서, 천식 질환 발병 여부를 조기에 확인 할 수 있다.

또한, 상기 S100A9는 대조군과 비교하여, 천식이 있는 환자에서 해당 단백질의 발현 수준이 변화하는 특징을 가지므로, 천식 진단을 위한 마커로 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "마커(marker)"란 정상군 개체와 천식 질환을 가진 개체를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 본 발명의 천식 질환을 가지는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다. 특히 본 발명에서는 본 발명의 천식 질환을 가지는 개체에서 변화되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 사용된 용어 "mRNA 수준 측정"이란 천식을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 천식 진단용 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "프라이머 쌍"은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머쌍을 포함하나, 구체적으로, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 구체적으로는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 구체적으로는 8 내지 60 염기, 보다 구체적으로는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 한다.

본 발명에 사용된 용어 "단백질 수준 측정"이란 천식 진단을 위하여 생물학적 시료에서 천식 진단용 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다.

상기 단백질 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 S100A9의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명은 다른 하나의 양태로서, 상기 천식 진단용 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트를 제공한다.

또한, 상기 천식 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

구체적으로는, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 구체적으로는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수등 을 포함할 수 있다.

구체적으로, DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또한, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 5분내 분석결과를 알 수 있는 신속한 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다. 래피드 키트는 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로 셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수패드와 샘플 패드 등 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 다른 하나의 양태로, (a) 생물학적 시료로부터 S100A9 단백질 또는 이의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 측정된 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 천식 발병에 의해 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 차이가 나는 조직, 객담, 세포, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 S100A9는 정상 대조군과 비교하여, 천식 질환이 있는 개체에서 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 변화하는 특징을 가지므로, 상기 수준이 증가하면 천식 질환으로 진단할 수 있다.

따라서, 천식 질환 의심 개체의 분리된 시료의 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준보다 높은 경우, 천식 질환으로 판단할 수 있다.

상기 유전자의 발현 수준은 mRNA 발현 수준을 측정하거나 비교할 수 있다.

상기 mRNA 발현 수준 측정 또는 비교는 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 본 발명은 이들에 제한되는 것이 아니다. 상기 측정 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 천식 환자의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량 정도를 비교함으로써 천식 발병 여부를 진단 또는 예측할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다. 상기 항체와 생물학적 시료 내의 해당 단백질이 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 이용한다.

본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다.

본 발명의 목적상, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LCMS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은, 천식 진단용 조성물을 제공함으로서 천식 환자에게서 발현이 변화하는 단백질 또는 그 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교함으로서, 천식의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다.

도 1은 정상 대조군과 천식환자군의 객담내에 S100A9 단백질 수준을 나타낸 것이다.
도 2는 기도 염증과 사이토카인 수준에 대한 S100A9의 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 호중구성 천식 마우스 모델에서의 세포내 프로파일과 항-S100A9 항체 처리시의 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 호중구성 천식 마우스 모델에서의 P20-활성화된 카스파제 1, IL-1β, IL-17 및 IFN-γ의 수준, S100A9의 위치와 항-S100A9 항체 처리시의 억제 효과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험 재료 및 방법>

실시예 1. 개체 및 객담(sputum) 수집

천식은 천식에 대한 글로벌 이니셔티브 (GINA) 가이드 라인에 따라 의사에 의해 진단되었다. 상기 진단은 online data supplement에 규정된 진단 기준 중 하나 이상에 의해 지지되었다. 등록 나이, 성별, BMI, 천식 발병 연령, 천식 기간 및 흡연량 같은 인구통계학적 정보가 수집되었다. 모든 환자는 유도된 객담 시료의 분석, 혈액 세포 수, 총 IgE, 흉부 방사선 촬영 및 알레르기 피부 단자 시험 등 표준화된 평가를 받았다. 기부자들은 순천향대학교 부천 병원의 바이오 뱅크에 자신의 혈액과 객담의 자발적인 기부를 하였으며, 이에 대한 정보에 서면 동의하였으며, 프로토콜은 병원의 윤리위원회 (SCHGM 2014-16)에 의해 승인되었다. 객담은 short-acting bronchodilator(기관지 확장제)가 포함된 등장액을 사용하여 유도되었으며, 온라인 데이터 보충에 설명된대로 샘플을 처리했다. 객담에서 호산구와 호중구 비율을 바탕으로, 개체는 다음과 같은 염증 하위 유형으로 분류 하였다 (19) : (i) 호산구성 천식, 객담 호산구> 3.0 %; 및 (ii) 호중구성 천식, 객담 호중구 ≥60 %. 객담 샘플은 34명의 정상 대조군 (NC)과 흡연을 한 적이 없거나, 금연을 한 101명의 천식환자군(BA)로부터 얻어졌다. 천식 환자는 객담 검사하기 전에 최소 4 주 동안 전신 또는 흡입 코르티코스테로이드를 사용하지 않았다. 개체의 특성은 표 1에 요약되어있다.

실시예 2. ELISA를 이용한 정량분석

객담내에 S100A9 농도는 제조사의 프로토콜에 따라 정량 샌드위치 효소 면역 분석법 (ELISA) 키트 (Mybiosource, 샌디에고, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. S100A9의 검출 한계는 0.1ng/mL이었다. 검출 한계 미만은 0 ng/mL로 간주되었다. 수치는 BCA 키트를 사용하여 샘플내에 총 단백질 농도로 정규화하였다(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). 객담에서 S100A9의 웨스턴 블롯은 Ann Allergy Asthma Immunol 2013; 111:268-275에 기재된 방법에 따라 수행하였다.

실시예 3. 마우스의 기도에 재조합 S100A9 단백질의 전달

재조합 S100A9 단백질은 pCMV6-XL4/S100A9 (Origene, Rockville, MD, USA) 인간의 cDNA 클론을 사용하여 합성하였으며, 대장균에서 발현 및 TALON 친화성 컬럼 (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)으로 정제하였으며, S100A9의 시험 관내 효능은 NF-κB-luc와 pRL-TK constructs(Panamics, Santa Clara, CA, USA)로 형질전환된 293-hTLR4A-MD2-CD14 cells을 사용하여 분석하였다. 재조합 S100A9는 비강 경로를 통해 6 주령의 C57BL/6 마우스에 투여 한 후, Am J Respir Crit Care Med 2011; 184: 528-36에 기재된 방법에 따라 BAL 및 조직 형태를 2, 4, 8, 24, 48 및 72 시간에 분석하였다. 정제된 토끼의 IgG 아이소타입 컨트롤 ((550875, BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA)를 중화 실험 대조군으로 사용하였다. 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회는 이 연구(SCHBC 동물-2014-012)를 승인했다.

실시예 4. 마우스 천식의 호중구 모델

특정 병원균이 없는 상태에서 마우스를 Orientbio Inc. (성남, 경기도, 한국)에서 얻었다. 호중구 지배적 모델은 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2011; 300:L679-90에 기재된 대로, OVA/complete Freund’s adjuvant(CFA)를 이용하여 제조하였다. PBS에 유화된 CFA(75 μL; Sigma-Aldrich)와 등급 V chicken egg OVA (20 μg; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 6주된 female C57BL/6 마우스에 0, 7, 및 14일째에 복강 내 주사를 통해 민감하게 만들었다(sensitized). 그리고 나서, 21일 및 22일에 모든 마우스는 등급 III OVA 0.1 %를 포함하는 50 μL PBS을 intra-nasal challenges를 받았다. Sham 마우스는 PBS로 민감화 및 challenge했다. S100A9의 발현 및 호중구 침투의 일시적 변화는 7일, 14일에 분석하였다. 덱사메타손(DEX)의 효과는 OVA challenge 전에, 21일과 22일에 위관을 통해 3mg/kg DEX (Sigma-Aldrich) 의 투여(administration)에 의해 평가하였다. OVA/CFA 모델에서 S100A9 활동을 억제하기 위해, 7, 14, 17, 및 21일에 sensitization 또는 challenge 3시간 전에 비강 경로를 통해 마우스에 항-S100A9 항체 20 μL(70 mg/mL, Novus Biological, Littleton, CA, USA)를 투여하였다. 순천향대 학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회는 연구 (SCHBC 동물-2014-012)를 승인했다.

실시예 5. 기도 저항 측정, 기관지 폐포 세척 및 면역 염색을 포함하는 조직학 분석

최종 OVA challenge 후, 24시간째에 마우수는 ketamine?xylazine로 마취하였으며, tracheostomize되었으며, 플렉시-환기 시스템을 사용하여 환기했다 (SCIREQ, Flexivent, Montreal, Canada). 기도 저항은 PBS를 사용하여 메타 콜린(0, 20, 및 100 mg/mL; Sigma-Aldrich)의 용량 증가를 측정했다. 그 직후, BAL을 수행했고, 폐 조직은 조직학적으로 처리하였으며, 단백질, RNA는 분석되었다. 조직은 조각(slice) (4 μm의 두께)으로 절단하였으며, S100A9 및 호중구 엘라스타제 (NE)에 대한 면역형광 염색(IF)을 실시하였다. 조직 조각은 탈파라핀하였으며, 재 가수 분해하고, 실온에서 1 시간 동안 normal serum으로 블로킹하였다. 상기 조직 조각은 랫 항-마우스 S100A9 단일클론 항체(1:200 dilution; Hycult Biotech, Uden, NB, Netherlands)와 토끼 다클론 항-마우스 호중구 엘라스타제 (NE) 항체 (1:200 dilution, Abcam, Cambridge, MA, UK)로 4 ℃에서 반응하였다. 이후, TBS 버퍼로 세 번 세척한 후, FITC-conjugated 항-rat IgG와 phycoerythrin (PE)-conjugated 항-rabbit IgG (1:1000 dilution, Abcam)로 실온에서 1 시간 동안 반응하였다. 이후, TBS로 세척한 후, 슬라이드는 DAPI로 반응하였다. TBS로 세척한 후 마운트하였으며, 공초점 레이저 주사 현미경 (CLSM) (LSM 510 META, Zeiss, Jena, Germany)으로 관찰하였다.

실시예 6. Ÿ‡스턴 블랏

웨스턴 블롯 분석을 마우스 폐 용해물(lysate)을 사용하여 수행하였다. 멤브레인은 항-S100A9 다클론 항체(1:1000 dilution; Novus Biological), 항-caspase-1 다클론 항체 (1:1000 dilution; Adipogen, San Diego, CA, USA), 항-IL-1β 단일클론 항체 (1:1000 dilution; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), 항-IFN-γ 단일클론 항체 (1:1000 dilution; Santa Cruz Biotechnology Dallas, Texas, USA), 항-IL-17 단일클론 항체 (1:1000 dilution; R&D systems, Minneapolis, MN USA), 및 항-β-actin 단일클론 항체 (1:5000 dilution; Sigma-Aldrich)를 사용하여 배양하였다. 그리고 나서, HRP-접합된(HRP-conjugated) 2차 항체로 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 표적 단백질은 X 선 필름에 감광된 chemiluminescence 용액(GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) 을 사용하여 검출하였다.

<실험 결과>

실험예 1. 피험자의 임상적 특성

연구 대상의 임상 및 인구통계학적 특성은 표 1에 나타나 있다(101명의 천식 환자군, BA와 34명의 정상 대조군, NC). FVC %를 예측했고, FEV %를 예측했고, FEV1/FVC의 %는 NC군보다 BA군에서 유의하게 낮았다(p<0.01). 아토피 빈도는 BA군에서 현저히 높았다(p<0.05). BA군은 객담내에 호산구, 림프구, 원주 세포(columnar cells) (p <0.01), 및 호중구 (p<0.05)의 비율이 높았으며, 대식세포 (p <0.05)의 비율이 낮았다.

실험예 2. 천식 환자의 객담내에 S100A9 단백질 수준

BA군은 호중구의 비율에 따라 높은 호중구 그룹(≥60 %)과 낮은 호중구 그룹(<60 %) 두 그룹으로 분할하였다. S100A9은 34개의 NC 샘플 중에서 12개의 샘플에서 검출되었다(35.3 %). 낮은 호중구를 가지는 37 개의 BA 샘플 중에서 27개의 샘플에서 S100A9이 검출되었으며(73 %), 높은 호중구 수를 가지는 64개의 BA 샘플 중에서 52개의 샘플에서 S100A9이 검출되었다(81.3 %). 총 단백질 농도에 대해 정규화된 평균 S100A9 수준은 NC(0 [0?10.23] pg/μg, p=0.0002) 군보다 BA군(10.37 [3.40?14.71] pg/μg)에서 유의하게 높았다(도 1A). 평균 S100A9 수준은 높은 호중구(11.60 [5.72?17.50] pg/μg) 그룹에서 낮은 호중구(7.71 [0?12.12] pg/μg, p=0.016)그룹에 비해 높았다(도 1A). BA 군에서 객담에서 S100A9 수준은 호중구의 비율과 상관 관계가 있었다 (n=101, r=0.289, p=0.003) (도 1B).

실험예 3. 기도의 호중구 염증에 재조합 S100A9 단백질의 효과

C57BL/6 마우스의 코에 S100A9 (0.2μg)를 투여한 후, BAL fluid(bronchoalveolar lavage fluid, 기관지 폐포 세척액)에서 호중구와 대식세포 수는 8시간째와 24시간째에 최고로 증가하였으며(p<0.01), 72 시간째에 기초 수준으로 감소했다(도 2A). 또한 염증 세포의 침윤이 강한 주변 기관지 영역에서 관찰되었다(도 2B). 웨스턴 블롯에서 S100A9 단백질은 2 시간에 나타나서, 24 시간에서 발현이 가장 높았다. P20-활성화된 카스파제 1, IL-1β, IL-17 및 IFN-γ 수준도 자극 후 2시간째 현저한 증가, 8시간째 최고수준, 48시간째 pre-challenge level으로 돌아와 유사한 패턴을 보였다(도 2C). IF 염색에서, 기관지 주위와 기관지 상피 세포에서 S100A9 수준 및 호중구 엘라스타제 (NE) 더블 양성 세포의 수는 S100A9의 주입후 24 시간째 최고수준이었다(도 2D).

실험예 4. 마우스 천식 모델에서 S100A9 단백질 수준의 일시적 변화 및 항- S100A9 항체의 억제 효과

염증 세포 수 및 S100A9 단백질 수준은 0 일, 7 일, 14일 및 23일째에 OVA/CFA 마우스의 폐에서 측정하였다(도 3A). 대식세포, 호중구, 호산구 및 림프구 수는 0 일째 및 sham-treated mice에 비해 23일째에 현저히 증가하였다(P <0.01, 도 3B). 20 μL 의 항-S100A9를 비강 내 투여한 경우, 증가된 호산구 수에 영향을 주지 않았으나(p>0.05), 증가된 호중구의 수를 감소시켰다(p<0.01) (도 3B). 23일째에 증가된 호중구와 호산구의 수는 덱사메타손 처리에 의해 감소되었다(p<0.01) (도 3B). 폐 저항성은 OVA/CFA mice에서 충분히 증가하였다(p<0.05). 항-S100A9 항체 처리는 증가된 폐 저항성을 현저한 수준으로 없앴다.

IF 염색 결과, OVA/CFA 마우스에서 23일째에 주변 기관지 영역과 기관지 상피를 침투한 호중구 엘라스타제 더블 양성 세포와 S100A9 수준은 항-S100A9 항체 처리에 의해 없어졌다(도 4A). 웨스턴 블랏에서 S100A9 단백질 수준은 7 일째에 증가하였으며, 23일째 발현이 가장 높았다(도 4B). 또한, P20-활성화된 카스파제 1, IL-1β, IL-17의 mature forms 및 IFN-γ 수준도 23일까지 꾸준히 증가하였다. 상기 증가는 항-S100A9 항체 처리에 의해 현저히 감소하였다(도 4B).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (4)

1. S100A9 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인, 천식 진단용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 천식은 호중구성 기도 염증이 관여하는 호중구성 천식인 것인, 천식 진단용 조성물.
   
4. 제1항에 따른 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트.
   
   

Images