KR20190027399A - 넥틴-4를 포함하는 천식 진단용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents
넥틴-4를 포함하는 천식 진단용 바이오마커 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20190027399A KR20190027399A KR1020170113735A KR20170113735A KR20190027399A KR 20190027399 A KR20190027399 A KR 20190027399A KR 1020170113735 A KR1020170113735 A KR 1020170113735A KR 20170113735 A KR20170113735 A KR 20170113735A KR 20190027399 A KR20190027399 A KR 20190027399A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- protein
- asthma
- expression level
- nectin
- gene
- Prior art date
Links
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 title claims abstract description 110
- 102100035486 Nectin-4 Human genes 0.000 title claims abstract description 61
- 101710043865 Nectin-4 Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 118
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 78
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 64
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108010055717 JNK Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 claims description 25
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 24
- 102100036775 Afadin Human genes 0.000 claims description 19
- 108010076838 afadin Proteins 0.000 claims description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 16
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 15
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 14
- 101150001535 SRC gene Proteins 0.000 claims description 13
- 101150058540 RAC1 gene Proteins 0.000 claims description 11
- 102100022122 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 Human genes 0.000 claims description 11
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 claims description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 9
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 8
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 5
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims description 5
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 claims description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 4
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 claims description 4
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 claims description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 claims description 3
- 238000013388 immunohistochemistry analysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000000670 ligand binding assay Methods 0.000 claims description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- 229940124598 therapeutic candidate Drugs 0.000 claims description 3
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 claims 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 6
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 abstract description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 3
- 238000009535 clinical urine test Methods 0.000 abstract description 2
- 238000009534 blood test Methods 0.000 abstract 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 30
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 30
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 208000002200 Respiratory Hypersensitivity Diseases 0.000 description 14
- 230000010085 airway hyperresponsiveness Effects 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 12
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 5
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 4
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- NZWOPGCLSHLLPA-UHFFFAOYSA-N methacholine Chemical compound C[N+](C)(C)CC(C)OC(C)=O NZWOPGCLSHLLPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002329 methacholine Drugs 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 3
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002356 Nectin Human genes 0.000 description 3
- 108060005251 Nectin Proteins 0.000 description 3
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940124630 bronchodilator Drugs 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108010062302 rac1 GTP Binding Protein Proteins 0.000 description 3
- 102000010838 rac1 GTP Binding Protein Human genes 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 206010008479 Chest Pain Diseases 0.000 description 2
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 2
- 206010011703 Cyanosis Diseases 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 208000037656 Respiratory Sounds Diseases 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010047924 Wheezing Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000009961 allergic asthma Diseases 0.000 description 2
- 230000009285 allergic inflammation Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000168 bronchodilator agent Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- QAXBVGVYDCAVLV-UHFFFAOYSA-N tiletamine Chemical compound C=1C=CSC=1C1(NCC)CCCCC1=O QAXBVGVYDCAVLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 206010001382 Adrenal suppression Diseases 0.000 description 1
- 208000033309 Analgesic asthma syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010003557 Asthma exercise induced Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical class CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004657 Exercise-Induced Asthma Diseases 0.000 description 1
- 108010077781 F-actin-binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000609762 Gallus gallus Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100031801 Nexilin Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- GIIZNNXWQWCKIB-UHFFFAOYSA-N Serevent Chemical compound C1=C(O)C(CO)=CC(C(O)CNCCCCCCOCCCCC=2C=CC=CC=2)=C1 GIIZNNXWQWCKIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000000809 air pollutant Substances 0.000 description 1
- 231100001243 air pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 238000003915 air pollution Methods 0.000 description 1
- 208000037883 airway inflammation Diseases 0.000 description 1
- NDAUXUAQIAJITI-UHFFFAOYSA-N albuterol Chemical compound CC(C)(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(CO)=C1 NDAUXUAQIAJITI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127225 asthma medication Drugs 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229940124748 beta 2 agonist Drugs 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037182 bone density Effects 0.000 description 1
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003123 bronchiole Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001269 cardiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 235000006694 eating habits Nutrition 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000034964 establishment of cell polarity Effects 0.000 description 1
- 230000003090 exacerbative effect Effects 0.000 description 1
- 208000024695 exercise-induced bronchoconstriction Diseases 0.000 description 1
- 208000024711 extrinsic asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 229940125369 inhaled corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005732 intercellular adhesion Effects 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 229940100602 interleukin-5 Drugs 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 201000010659 intrinsic asthma Diseases 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- KNWQLFOXPQZGPX-UHFFFAOYSA-N methanesulfonyl fluoride Chemical compound CS(F)(=O)=O KNWQLFOXPQZGPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000031990 negative regulation of inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000010149 post-hoc-test Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960002052 salbutamol Drugs 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 229960004017 salmeterol Drugs 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010181 skin prick test Methods 0.000 description 1
- 206010041232 sneezing Diseases 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 description 1
- 238000013125 spirometry Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004523 tiletamine Drugs 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/12—Pulmonary diseases
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
본 발명은 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트, 상기 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법, 천식치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은, 천식 진단용 조성물을 제공함으로서, 천식환자에게서 발현이 변화하는 단백질 또는 그 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교함으로서, 천식의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다.
아울러, 본 발명의 천식 진단용 조성물은 비침습성 진단을 가능하게 하여 혈액, 뇨 검사 등으로 간단하고 유효성 있는, 천식의 초기 진단방법이다.
본 발명은, 천식 진단용 조성물을 제공함으로서, 천식환자에게서 발현이 변화하는 단백질 또는 그 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교함으로서, 천식의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다.
아울러, 본 발명의 천식 진단용 조성물은 비침습성 진단을 가능하게 하여 혈액, 뇨 검사 등으로 간단하고 유효성 있는, 천식의 초기 진단방법이다.
Description
본 발명은 천식 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트, 상기 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
천식(asthma)은 만성 기도 염증 및 기도과민성을 특징으로 하는 폐질환으로, 대기오염물질, 황사, 알러젠(allergen) 등에 의하여 발생한다. 특히, 천식은 호흡곤란을 야기하는 염증성 호흡기 질환으로 우리나라 인구 중 약 300만명이 천식을 앓고 있다. 천식은 색색거리는 천명, 호흡곤란, 재채기, 심한 경우 산소부족으로 인한 청색증 및 흉통을 나타내는 질환으로 최근 들어 대기오염 및 각종 화학물질에 대한 노출과 식생활의 서구화로 인하여 급격히 증가하고 있으며, 특히 소아에서 발병률이 증가하고 있고 식습관의 변화 및 서구화에 따라 증가하고 있는 추세이다. 그러나 천식 환자들에서는 질병의 원인 및 발병기전이 명확하게 밝혀지지 않은 상태이다. 이러한 발병 기전 중에 Th2(T helper type 2) 타입의 면역반응이 항진되어 이에 따라 인터루킨(interluekin)-4, 5, 13 등의 분비가 증가되게 되며(Liu et al., 2006; Williams et al., 2012), 이러한 반응과 연계하여 호산구를 비롯한 많은 염증세포들이 폐조직 내로 이동 및 침윤하게 된다(Zhou et al., 2011). 또한 염증세포들은 다양한 전염증인자 및 화학주성인자들을 방출하여, 염증반응을 더욱 악화시키며, 기도 내 배상세포의 점액분비를 증가시키고, 기도 과민성을 야기하게 된다(Chibana et al., 2008). 이러한 일련의 반응으로 인하여 천식환자들은 호흡곤란, 청색증 및 흉통 등의 임상증상을 나타내게 된다.
현재, 천식의 치료에 사용되고 있는 약물은 스테로이드제제, 기관지 확장제 및 항생제가 주로 사용되고 있다. 스테로이드제제와 항생제의 경우 면역반응 및 염증반응 억제를 통하여 천식치료에 사용되고 있으며, 기관지 확장제의 경우 호흡곤란 등의 임상증상이 발현 시에 이를 상쇄시키고자 사용되고 있다. 현재 가장 광범위하게 사용되고 있는 흡입형 코르티코스테로이드(corticosteroid) 제제는 뛰어난 치료 효과를 나타내지만 장기적으로 사용할 경우 용량과 사용시간에 비례하여 부신 억제, 골밀도 감소, 성장 장애, 눈과 피부의 합병증, 콜라겐의 합성 증가 등을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 살메테롤(salmeterol)과 포르메테롤(formeterol)과 같은 지속성 베타-2 길항제(beta-2 agonist)는 천식 발작에 대해 예방 효과를 나타내지만 경우에 따라서는 환자를 사망케 할 수도 있다고 경고된 바 있다. 그리고 장기 사용시 부작용이 발견되어 천식치료제로서 사용이 제한적이다.
현재까지 개발된 천식 치료제는 여러 가지 부작용들을 가지고 있는 바, 천식을 조기에 발견하여 치료하는 것이 무엇보다 중요하다. 이에, 천식을 조기에 진단할 수 있는 바이오마커의 발굴이 시급한 실정이다.
본 발명의 하나의 목적은, 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 천식치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서, 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 천식 진단용 조성물은 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물일 수 있다.
본 발명에서 용어, “천식”은 기관, 기관지, 세기관지, 그리고 폐포로 이어지는 기도의 염증반응과 이로 인한 기도조직의 손상 및 변화를 특징으로 하는 여러 가지 질환들을 통칭하는 포괄적인 질환명이다(Wardlaw A 등, Clin Exp Allergy 2005;35:1254-62). 구체적으로, 천식은 폐 속에 있는 기관지가 아주 예민해진 상태로, 때때로 기관지가 좁아져서 숨이 차고 가랑가랑하는 숨소리가 들리면서 기침을 심하게 하는 증상을 나타내는 질환으로, 기관지의 알레르기 염증 반응 때문에 발생하는 알레르기 질환이다. 천식의 대표적인 증상은 호흡곤란, 기침, 천명(쌕쌕거리는 거친 숨소리) 등이며, 좁아진 기관지를 짧은 시간 내에 완화시키는 증상 완화제(기관지 확장제) 또는 기관지의 알레르기 염증을 억제하여 천식발작을 예방하는 질병 조절제(항염증제, 류코트리엔 조절제) 등이 대표적인 치료제로 사용된다. 본 발명에서 상기 천식은 기관지성 천식, 알러지성 천식, 아토피형 천식, 비아토피형 천식, 운동유발 천식, 아스피린 천식, 심인성 천식 또는 폐포성 천식일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 천식발병 여부를 확인하는 것으로서, 천식발병 여부를 조기에 확인 할 수 있다.
본 발명에서 상기 넥틴 (nectin)은 F-액틴 결합 단백질인 아파딘(afadin)을 통해 액틴 세포 골격과 연결되고, 최근에 세포간 유착의 형성에 상당한 기여를 하는 것으로 확인되었고, 세포 분극, 분화, 운동, 증식 및 생존을 포함한 세포 활성에 대한 새로운 조절물질로 보고되었다 (Takahashi K, et al., 1999; Takai et al., 2008; Ogita et al., 2010). 특히, 넥틴-4는 인간 폐 선암종 세포에서 Rac1 신호 전달 경로를 통해 세포 성장, 혈관 신생, 나쁜 예후 및 종양의 증식에 기여한다고 보고되었다 (Takano A, et al.,2009; Nishiwada S, et al., 2015). 본 발명에서 넥틴-4 (nectin-4)와 천식과의 관련성에 대하여 최초로 규명하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 대조군에 비해, OVA으로 감작한 마우스에서 기도과민성(AHR, airway hyperresponsiveness)이 증가되었고, 기관지 폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)에서 염증 세포의 수가 증가된 것을 확인하였으며, 넥틴-4와 afadin(아파딘) 그리고 아파딘의 다운스트림 단백질인 src, rac1, JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, OVA로 감작한 마우스의 폐 조직의 단핵 염증 세포와 내피 세포, 및 상피 세포에서 넥틴-4, 아파딘의 면역 조직 화학 염색이 증가되는 것을 관찰하였으며, 천식 환자의 혈장에서 넥틴-4의 수준이 대조군에 비해 증가하는 것을 확인하였는바, 상기 넥틴-4 단백질이 천식을 조기에 진단할 수 있는 마커로 활용할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 대조군에 비해 OVA으로 감작한 마우스에서 넥틴-4 뿐만 아니라, afadin(아파딘)과 아파딘의 다운스트림 단백질인 src, rac1, JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 발현이 증가하는 것을 확인하였는 바, 넥틴-4 뿐만 아니라, 아파딘(afadin), Src, Rac1, 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질을 마커로 활용하여 천식을 조기 진단할 수 있다.
본 발명에서 용어 "마커(marker)"란 정상군 개체와 천식을 가진 개체를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 본 발명의 천식을 가지는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다. 특히 본 발명에서는 본 발명의 천식을 가지는 개체에서 변화되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용된 용어 "mRNA 수준 측정"이란 천식을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 천식 진단용 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
바람직하게 천식 진단을 위하여, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프라이머 쌍"은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용된 용어 "단백질 수준 측정"이란 천식 진단을 위하여 생물학적 시료에서 천식 진단용 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 바람직하게는 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정한다.
상기 단백질 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
천식 진단을 위하여 바람직하게 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 넥틴-4 (nectin-4), 아파딘(afadin), Src, Rac1, 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명은 다른 양태로서, 상기 천식 진단용 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트를 제공한다.
바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트 또는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다.
또한, 바람직하게, 상기 천식 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
바람직하게, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. RT-PCR (역전사 중합효소반응) 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 신속한 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다. 래피드 키트는 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로 셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수패드와 샘플 패드 등 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 양태로서, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
바람직하게, 본 발명의 방법은 생물학적 시료로부터 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질 또는 이의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 단계에서 측정된 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 천식발병에 의해 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 넥틴-4 (nectin-4)은 모두 정상 대조군과 비교하여, 천식이 있는 개체에서 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 변화하는 특징을 가지므로, 상기 수준이 변화하면 천식으로 진단할 수 있다.
또한, 천식 의심 개체의 분리된 시료의 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준보다 높을 경우, 천식으로 판단할 수 있다.
또한, 상기 아파딘(afadin), Src, Rac1 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 추가로 측정할 수 있으며, 천식 의심 개체의 분리된 시료의 상기 아파딘(afadin), Src, Rac1 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준보다 높을 경우 천식으로 진단할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준은 mRNA 발현 수준을 측정하거나 비교할 수 있다.
상기 mRNA 발현 수준 측정 또는 비교는 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 본 발명은 이들에 제한되는 것이 아니다. 상기 측정 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 천식환자의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량 정도를 비교함으로써 천식발병 여부를 진단 또는 예측할 수 있다.
바람직하게 본 발명의 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다. 상기 항체와 생물학적 시료 내의 해당 단백질이 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 이용한다.
본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LCMS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에서는, 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질 발현 수준 자체를 측정 및 비교하기 위해서, 면역조직화학(immunohistochemistry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)을 사용하였다.
본 발명은 다른 양태로서 천식치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 천식치료제의 스크리닝 방법은
분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에 천식 치료제 후보물질을 처리하는 단계;
상기 후보물질 처리군에서 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면, 상기 후보물질을 천식치료제로 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 용어, "천식치료제 후보물질"은 통상적인 선정방식에 따라 천식치료의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 또는 화합물 등이 될 수 있다.
본 발명에서 발현 수준 측정은 넥틴-4 (nectin-4) 단백질의 발현수준을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "대조군"이란 천식치료제 후보물질을 처리하지 않은 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물로 상기 후보물질을 처리한 군과 병렬 관계에 속하는 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물을 의미한다.
본 발명의 “천식치료제의 스크리닝 방법”은, 천식에 넥틴-4 (nectin-4)의 의 발현이 관련됨을 확인함으로써, 넥틴-4 (nectin-4)의 발현을 치료제 후보물질을 처리하지 않은 대조군 세포와 비교하는 방식으로 고안되었다. 천식을 예방 또는 치료할 수 있는 후보물질의 부재 하에 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에서의 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질의 수준을 측정하고, 또한, 상기 후보물질의 존재 하에서 넥틴-4 (nectin-4) 단백질의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보물질이 존재할 때의 넥틴-4 (nectin-4) 단백질의 수준이 상기 후보물질의 부존재 하에서의 수준보다 감소시키는 물질을 천식의 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다. 상기 분리된 세포로는 인체에서 분리된 primary 세포일 수 있으며, 기관지 상피세포주와 같은 확립된 세포주를 사용할 수도 있다.
또한, 아파딘(afadin), Src, Rac1, 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질의 발현 수준을 추가로 측정하고, 상기 측정된 아파딘(afadin), Src, Rac1 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면, 상기 후보물질을 천식치료제로 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명은, 천식 진단용 조성물을 제공함으로서, 천식환자에게서 발현이 변화하는 단백질 또는 그 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교함으로서, 천식의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다.
아울러, 본 발명의 진단용 조성물은 비침습성 진단을 가능하게 하여 혈액, 뇨 검사 등으로 간단하고 유효성 있는, 천식의 초기 진단을 제공할 수 있다.
도 1A는 마우스에 OVA(오브알부민)으로 감작 유발하여 기도과민성을 유발한 마우스 실험디자인을 나타낸다. 도 1B는 OVA으로 감작한 마우스에서 유도된 기도과민성(AHR, airway hyperresponsiveness)을 나타낸다. 도 1C는 OVA로 감작된 마우스의 기관지 폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)에서 증가된 염증 세포의 수를 나타낸다. 도 1D는 OVA로 감작 및 유발 (OVA)된 마우스에서의 넥틴-4/아파딘의 단백질 발현을 웨스턴 블럿으로 나타낸 것이고, 이를 β-액틴으로 표준화한 것이다. 평균 ± SEM (n = 8 마우스/그룹). * p<0.05 OVA vs sham.
도 2는 면역조직화학 염색법에 의해 오브알부민으로 감작 유발된 마우스 폐 조직의 넥틴-4와 아파딘 발현을 분석한 것이다.
도 3은 대조군과 천식 환자의 혈장 넥틴-4 수치를 나타낸다. *p<0.05, 대조군 vs. 천식 환자. 본 연구에 사용된 생체표본과 데이터는 한국 바이오뱅크 네트워크 회원인 순천향대학교 부천 병원의 바이오뱅크에서 얻었다.
도 4는 혈장 넥틴-4와 상기 임상변수와의 상관관계를 나타낸다.
도 2는 면역조직화학 염색법에 의해 오브알부민으로 감작 유발된 마우스 폐 조직의 넥틴-4와 아파딘 발현을 분석한 것이다.
도 3은 대조군과 천식 환자의 혈장 넥틴-4 수치를 나타낸다. *p<0.05, 대조군 vs. 천식 환자. 본 연구에 사용된 생체표본과 데이터는 한국 바이오뱅크 네트워크 회원인 순천향대학교 부천 병원의 바이오뱅크에서 얻었다.
도 4는 혈장 넥틴-4와 상기 임상변수와의 상관관계를 나타낸다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
<
실시예
1> 천식 환자의 모집
생체 물질의 표본과 임상 자료는 한국 바이오뱅크 네트워크 회원인 순천향대학교 부천 병원의 바이오뱅크에서 얻었다. 모든 피험자는 다음 기준 중 하나 이상인 경우, 천식 (GINA) 지침에 따라 천식의 임상 진단을 받았다.
1) 14일간을 넘어서 20% 초과하는 매일의 최대 피크 호흡 흐름의 가변성
2) 알부테롤(albuterol) 200-400μg을 흡입한 후에 15% 초과의 FEV1 증가
3) 10mg/ml 미만의 흡입된 메타콜린(PC20 methacholine) 자극 농도에 반응한 FEV1에서의 20% 감소
모든 피험자는 완전한 혈액 세포 검사와 분화 카운트 (complete blood cell and differential counts), IgE 측정, 흉부 전후 방사선촬영, 알레르기 피부 단자 검사 및 폐활량 측정을 포함하는 표준화된 평가를 받았다. 모든 데이터는 진단 당시와 천식 약물을 투여하기 전에 수득하였다. 천식 환자는 연령과 BMI (Body mass index)에서 정상 대조군과 일치하였다. 정상 대조군 피험자는 호흡 증상과 기타 알레르기 질환에 대한 스크리닝 조사에서 부정적으로 응답하고, 예측 FEV1 값이 80% 이상이고, PC20 메타콜린이 10 mg/ml 이상이고, 흉부 방사선 사진에서 정상 소견을 갖는 일반인이나 피험자의 배우자로부터 모집하였다.
<
실시예
2> 동물 준비
암컷 생후 6주된 BALB/c 마우스에 0일과 14일에 10 mg 수산화 알루미늄에 유화된 50 μg V급 치킨 에그 오브알부민 OVA (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)를 함유한 Dulbecco 인산완충식염수 100 ㎕를 복강내 주사하였다. 21일 내지 23일에, 모든 마우스에 150 ㎍ III급 OVA (Sigma-Aldrich)를 함유하는 50 ㎕ D-PBS를 비강내(intranasal) 투여(challenge)하였다. 대조군 마우스에는 식염수를 투여하였다. 24일에, 2.5 mg/kg 틸레타민(tiletamine)과 자일라진(xylazine) (Zoletil and lumpum; Bayer Korea Co., Seoul, Korea)으로 마우스를 마취하고, 0, 5, 20, 또는 100 mg/ml의 메타콜린 (Sigma-Aldrich)을 투여한 후, 기도과민증 (AHR)을 평가하였다. 다음 날에, 기관지폐포 세척액 (BALF)을 수거하여, 폐 조직을 단백질과 RNA로 가공하였으며, 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고 (H&E), 공초점 사진 촬영하였다. BALF을 원심분리하고 상층액을 보관하고, 세포 펠렛은 세포수 측정을 위해 현탁하였고, 세포 감별 계산 (cell differential)을 위해 사이톱신 슬라이드 (cytospin slides) 를 제조하였다 (500 cells/mouse, Diff-Quick 염색). 폐의 일부를 4% 인산 완충 파라포름알데히드에 고정하고, 파라핀에 포매하고, 절편으로 분획하여 (4 μm), H&E 염색하였다.
<
실시예
3>
웨스턴
블럿
마우스 폐 조직을 증류수에 50 mM Tris-HCL (pH 7.4), 50 mM NaCl, 0.1% 도데실 황산 나트륨 (SDS), 1% Triton X-100, 0.5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 및 100 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF)를 포함하는 단백질 용해 용액에서 균질화하고, 원심 분리한 후 (20,000g x 30분, 4oC), 수용성 물질 (soluble material)을 수거하였다. 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하여 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막으로 옮겼다. 5% 소 혈청 알부민 (BSA)을 포함하는 0.1% Tween-20을 함유하는 트리스 완충 식염수 (TBS)로 막을 블로킹하였고 (21℃, 2시간), 항-넥틴-4, 아파딘, rac1, src, JNK로 배양(4℃, 밤새)한 후에, HRP (horseradish peroxidase)-접합 이차 항체를 사용하여 배양하였다. WEST-ZOL과 웨스턴 블럿 검출 시스템 (iNtRon, SungNam, Korea)을 사용하여 검출하였다. 정량적 농도법으로 상대적인 단백질 수준을 판단하였고 데이터는, 베타-액틴 (Sigma-Aldrich)으로 표준화하였다.
<
실시예
4> 면역조직화학분석
마우스 폐 절편의 파라핀을 제거하고, 에탄올 시리즈 (ethanol series)로 재수화(rehydrated)하였다. 절편을 1.4% 과산화수소 (H2O2)를 포함하는 메탄올로 30분간 처리하여 내재하는 과산화 효소를 저해한 후, 1.5% 말 혈청으로 비특이적 결합을 처리하고 항-넥틴-4, 아파딘 (1:100, Abcam Inc.)으로 배양하였다. 다음 날에, 절편을 아비딘과 비오틴 처리된 HRP 거대분자 복합체 (Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 배양하였다. 액상 DAB+ 기질 키트 (Golden Bridge International Inc., Mukilteo, WA, USA)로 염색하여 색 반응을 유발하였다. 면역조직화학 염색 후에, 슬라이드를 1분간 Harris 헤마톡시린으로 비교 염색하였다. ImageJ 프로그램 (National Institutes of Health, Bethesda, Md)으로 사진을 분석하였고, 염색 밀도는 6 내지 8의 필드(fields)에서 얻은 넥틴-4의 임의 밀도 값의 평균치로 정량화하였다.
<
실시예
5> ELISA
인간 혈장 중 넥틴-4의 단백질 수치를 ELISA (R&D System)로 측정하였다. 다른 플레이트와 결과를 비교하기 위해, 양성 및 음성 대조군에 대하여 시험 샘플의 광학 밀도 (OD)를 조정하였다. 두 웰의 평균 OD를 계산하였다. 각 시험 혈청의 지수값 (index value)은 하기 수학식으로 정의된다:
지수 (index) = (시험 혈청의 OD - 음성 대조군의 OD) / (양성 대조군의 OD - 음성 대조군의 OD) × 100. 낮은 검출 한계는 제조사의 권고에 따라 넥틴-4의 경우 6.56 pg/ml로 설정하였다.
통계 분석
데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 나타내고, Mann-Whitney U 테스트를 이용하여 분석한 후, 필요한 경우에 post hoc test (SPSS version 22; SPSS, Chicago, IL)를 수행하였다. 결과 측정치간 상관 관계는 Pearson 또는 Spearman 상관계수(Pearson or Spearman correlation coeffcients)를 계산하여 판단하였다. p<0.05는 통계적 유의성을 의미하는 것으로 간주되었다.
<
실험예
1> OVA으로 유발된 알레르기성 염증에서
넥틴
-4의 활성 증가
도 1A는 마우스에 OVA(오브알부민)으로 감작 유발하여 기도과민성을 유발한 마우스 실험디자인을 나타낸다. 도 1B는 OVA으로 감작한 마우스에서 유도된 기도과민성(AHR, airway hyperresponsiveness)을 나타낸다. 도 1C는 OVA로 감작된 마우스의 기관지 폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)에서 증가된 염증 세포의 수를 나타낸다. 도 1D는 OVA로 감작 및 유발 (OVA)된 마우스에서의 넥틴-4/아파딘의 단백질 발현을 웨스턴 블럿으로 나타낸 것이고, 이를 β-액틴으로 표준화한 것이다.
도 1B에 나타난 바와 같이, OVA로 감작한 (OVA/OVA) 마우스는 식염수를 처리한 sham 마우스보다 기도과민성(AHR, airway hyperresponsiveness)이 증가하였다(도 1B). 또한, OVA/OVA 마우스는 sham 마우스와 비교하여 기관지 폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)의 염증 세포가 증가하였다 (도 1 C). OVA/OVA 마우스에서 넥틴-4와 afadin(아파딘) 그리고 아파딘의 다운스트림 단백질인 src, rac1, JNK가 sham 마우스보다 훨씬 많이 발현됨을 보여주었다 (도 1D). 따라서, 도 1을 통해, OVA으로 유발된 알레르기성 천식 모델 그룹은 sham 그룹에 비해 넥틴-4 활성이 현저하게 증가한 것으로 결론을 내릴 수 있다.
<
실험예
2> 면역조직화학 분석
다음으로, 오브알부민(OVA)으로 감작된 마우스 폐 조직에서 넥틴-4와 아파딘을 분석하였다. 도 2는 면역조직화학 염색법에 의해 오브알부민으로 감작 유발된 마우스 폐 조직의 넥틴-4와 아파딘 발현을 분석한 것이다.
도 2에 나타난 바와 같이, OVA/OVA 마우스의 폐조직은 염증 세포 침투를 가지는 수많은 집중 지역과 삼출되는 주변 기관지(peribronchial) 및 강내(intraluminal) 영역을 가졌다 (도 2). H&E 염색된 사진에서 염증 지수 (inflammatory index)의 반정량적인 값은 OVA/OVA 마우스에서 증가하였다 (도면에 나타내지 않음). 또한, OVA/OVA 마우스 폐 조직의 단핵 염증 세포와 내피 세포, 및 상피 세포에서 증가된 넥틴-4, 아파딘 면역 조직 화학 염색이 관찰되었다 (도 2).
<
실험예
3> 천식 환자의 임상적 특징 분석
표 1은 환자의 기본적인 특성을 보여준다. 기관지 천식 환자 62명의 평균 나이는 47세 (30-83세)였다. 천식 환자의 초기 FEV1 % 예측값 (pred.), FVC % 예측값, FEV1/FVC는 대조군보다 유의하게 낮았다. 천식 환자의 IgE는 대조군보다 유의하게 높았으며, PC20은 대조군보다 낮았다. 체질량 지수(Body mass index)는 천식 환자와 대조군 사이에 차이가 없었다.
<
실험예
4> 천식
환자에서의
넥틴
-4의 변형
다음으로, 천식 환자와 대조군을 대상으로 혈장에서 넥틴-4 발현 정도를 측정하였다. 도 3은 대조군과 천식 환자의 혈장 넥틴-4 수치를 나타낸다. 기관지 천식 환자의 평균 혈장 넥틴-4 수치는 109.15 ± 42.91 pg/ml이었고, 대조군은 71.05 ± 53.03 pg/ml였다. 혈장 넥틴-4 수치는 대조군에 비해 천식 환자에서 유의하게 높았다 (P<0.05, 도 3). 다음으로, 혈장 넥틴-4와 임상 변수, FVC % pred., FEV1 % pred., FEV1/FVC, PC20 간의 상관관계를 분석하였다. 도 4은 혈장 넥틴-4와 상기 임상변수와의 상관관계를 나타낸다. 도 4에 나타난 바와 같이, 혈장 넥틴-4 수치는 FVC % pred. (r=-0.261, P=0.015), FEV1 % pred. (r=-0.294, P=0.006)와 FEV1/FVC (r=-0.324, P=0.002), PC20 (r=-0.222, P=0.025)와 상관 관계가 있었다 (도 4).
이처럼, 천식환자에서 대조군에 비해 넥틴의 발현이 현저한 수준으로 증가하는 것을 확인하였는 바, 넥틴-4의 발현이 증가하는 경우, 천식으로 진단할 수 있다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
Claims (15)
- 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 아파딘(afadin), Src, Rac1 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인, 천식 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것인, 천식 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인, 천식 진단용 조성물.
- 제1항에 따른 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트.
- 제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트 또는 래피드(rapid) 키트인 것인, 천식 진단용 키트.
- 생물학적 시료로부터 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질 또는 이의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 단계에서 측정된 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법. - 제7항에 있어서, 아파딘(afadin), Src, Rac1 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 추가로 측정하는 것인, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 천식 의심 개체의 분리된 시료의 상기 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준보다 높을 경우, 천식으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 발현 수준인, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준 측정은 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것인, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것인, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법.
- 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에 천식 치료제 후보물질을 처리하는 단계;
상기 후보물질 처리군에서 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 넥틴-4 (nectin-4)의 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면, 상기 후보물질을 천식치료제로 선택하는 단계를 포함하는, 천식치료제의 스크리닝 방법. - 제14항에 있어서, 아파딘(afadin), Src, Rac1 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질의 발현 수준을 추가로 측정하고, 상기 측정된 아파딘(afadin), Src, Rac1, 또는 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면, 상기 후보물질을 천식치료제로 선택하는 단계를 더 포함하는 것인, 천식치료제의 스크리닝 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170113735A KR101997142B1 (ko) | 2017-09-06 | 2017-09-06 | 넥틴-4를 포함하는 천식 진단용 바이오마커 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170113735A KR101997142B1 (ko) | 2017-09-06 | 2017-09-06 | 넥틴-4를 포함하는 천식 진단용 바이오마커 및 이의 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20190027399A true KR20190027399A (ko) | 2019-03-15 |
| KR101997142B1 KR101997142B1 (ko) | 2019-07-08 |
Family
ID=65762448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020170113735A KR101997142B1 (ko) | 2017-09-06 | 2017-09-06 | 넥틴-4를 포함하는 천식 진단용 바이오마커 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101997142B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102288656B1 (ko) * | 2020-12-02 | 2021-08-12 | 순천향대학교 산학협력단 | 천식 또는 천식 악화 진단용 pcr 키트 및 이를 이용한 천식 또는 천식 악화 진단을 위한 정보의 제공방법 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004528008A (ja) * | 2000-10-05 | 2004-09-16 | イミュネックス・コーポレーション | ネクチンポリペプチド、ポリヌクレオチド、該ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを作成し、そして使用する方法 |
| US20080268476A1 (en) * | 2004-05-12 | 2008-10-30 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Nectin 4 (N4) as a Marker for Cancer Prognosis |
| KR20120104690A (ko) | 2011-03-14 | 2012-09-24 | 고려대학교 산학협력단 | 에즈린을 이용한 방사선 생물학적 선량 평가용 바이오마커 및 이를 포함하는 키트 |
| KR20170053035A (ko) * | 2015-11-05 | 2017-05-15 | 순천향대학교 산학협력단 | 천식 진단용 마커 조성물, 이를 포함하는 천식 진단용 키트 및 천식 진단을 위한 정보제공방법 |
-
2017
- 2017-09-06 KR KR1020170113735A patent/KR101997142B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004528008A (ja) * | 2000-10-05 | 2004-09-16 | イミュネックス・コーポレーション | ネクチンポリペプチド、ポリヌクレオチド、該ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを作成し、そして使用する方法 |
| US20080268476A1 (en) * | 2004-05-12 | 2008-10-30 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Nectin 4 (N4) as a Marker for Cancer Prognosis |
| KR20120104690A (ko) | 2011-03-14 | 2012-09-24 | 고려대학교 산학협력단 | 에즈린을 이용한 방사선 생물학적 선량 평가용 바이오마커 및 이를 포함하는 키트 |
| KR20170053035A (ko) * | 2015-11-05 | 2017-05-15 | 순천향대학교 산학협력단 | 천식 진단용 마커 조성물, 이를 포함하는 천식 진단용 키트 및 천식 진단을 위한 정보제공방법 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102288656B1 (ko) * | 2020-12-02 | 2021-08-12 | 순천향대학교 산학협력단 | 천식 또는 천식 악화 진단용 pcr 키트 및 이를 이용한 천식 또는 천식 악화 진단을 위한 정보의 제공방법 |
| WO2022119243A1 (ko) * | 2020-12-02 | 2022-06-09 | 순천향대학교 산학협력단 | 천식 또는 천식 악화 진단용 pcr 키트 및 이를 이용한 천식 또는 천식 악화 진단을 위한 정보의 제공방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101997142B1 (ko) | 2019-07-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9732151B2 (en) | Biomarkers for TSLP treatment | |
| Watanabe et al. | Elevation of serum squamous cell carcinoma antigen 2 in patients with psoriasis: associations with disease severity and response to the treatment | |
| KR101900428B1 (ko) | 공기오염물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법 | |
| WO2015168602A2 (en) | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of kawasaki disease | |
| KR101978407B1 (ko) | 클라우딘 7을 포함하는 천식 또는 폐섬유화증 진단용 바이오마커 및 이의 용도 | |
| De Corso et al. | Calprotectin in nasal secretion: a new biomarker of non-type 2 inflammation in CRSwNP | |
| EP3402899B1 (en) | Il-10 as a predictive biomarker of responsiveness to house dust mite allergen immunotherapy | |
| KR101997142B1 (ko) | 넥틴-4를 포함하는 천식 진단용 바이오마커 및 이의 용도 | |
| KR20220112204A (ko) | 뇌의 레닌-안지오텐신 시스템 인자를 이용한 알츠하이머병의 진단 방법 | |
| KR102192454B1 (ko) | Prox1을 포함하는 천식 진단용 바이오마커 및 이의 용도 | |
| KR20190028221A (ko) | 아넥신-a5를 포함하는 천식 또는 폐섬유화증 진단용 바이오마커 및 이의 용도 | |
| EP2712934A2 (de) | Markersequenzen für Prostataentzündungserkrankungen, Prostatakarzinom und deren Verwendung | |
| KR101997139B1 (ko) | Sox18를 포함하는 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 진단용 바이오마커 및 이의 용도 | |
| KR102192450B1 (ko) | Jam-a을 포함하는 천식 진단용 바이오마커 및 이의 용도 | |
| KR102232200B1 (ko) | 알츠하이머치매 진단 바이오마커 | |
| KR101889594B1 (ko) | 혈관내피세포 기능 부전 진단용 조성물 및 이의 용도 | |
| KR102494928B1 (ko) | Mrgprx2를 이용한 즉시형 과민 반응 환자를 판별하는 방법 | |
| KR20200085390A (ko) | Ripk3을 포함하는 당뇨병성 신증 진단용 바이오마커 및 이의 용도 | |
| KR102531728B1 (ko) | Pgd2를 포함하는 난소 저자극 증후군 조기 진단용 바이오마커 및 이의 용도 | |
| KR102072772B1 (ko) | 말초신경병증 아형별 진단용 바이오마커 | |
| EP4506468A1 (en) | Method for diagnosing cognitive impairment through adipose tissue / blood and compounds useful for its treatment | |
| KR20170105162A (ko) | 천식 진단용 마커 및 이의 용도 | |
| KR102147928B1 (ko) | 공기오염물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 공기오염물질 노출 확인 방법 | |
| US7879568B2 (en) | Method for the diagnosis and prognosis of demyelinating diseases | |
| KR20230127098A (ko) | 대기오염물질 흡입 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20170906 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20181210 Patent event code: PE09021S01D |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20190605 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20190701 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20190702 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20220621 Start annual number: 4 End annual number: 4 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20230621 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20240624 Start annual number: 6 End annual number: 6 |