CN106153919A - CD105,esVEGR2和MYC三蛋白联合预测食管鳞癌患者预后试剂盒 - Google Patents

CD105,esVEGR2和MYC三蛋白联合预测食管鳞癌患者预后试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测石蜡包埋组织中目的蛋白表达情况的试剂。本发明解决该技术问题的技术方案是提供了一种评价食管鳞癌患者预后信息的检测试剂盒。该试剂盒包括抗3种目的蛋白的抗体一抗CD105蛋白、esVEGFR2蛋白和MYC蛋白抗体，还包括山羊血清、0.01M柠檬酸盐修复液、3％H2O2、Polymer增强剂、Polymer聚合物、DAB显色试剂、PBS溶液。使用该试剂盒可评价食管鳞癌患者的预后，比国际TNM分期简单、易行，且敏感性及特异性均高于TNM分期，以及更适用于国人的食管鳞癌预后评估。

Description

CD105，esVEGR2和MYC三蛋白联合预测食管鳞癌患者预后试 剂盒
技术领域
本发明涉及联合多个蛋白抗体，并利用免疫组织化学超敏型二步法，去检测食管鳞癌患者标本的表达情况，进而预测患者预后的试剂盒。
背景技术
食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC)，简称食管鳞癌，在我国是一种常见的上消化道恶性肿瘤，在国人的恶性肿瘤死亡率中位居第四位。全世界每年40余万的新发食管鳞癌病例中，一半以上发生在我国，我国也是世界上公认的食管鳞癌第一高发国。上世纪70年代，在全国范围内实施了恶性肿瘤普查，确立河北磁县、河南林县、山西阳泉、四川盐亭、广东潮汕和江苏淮安等地区为中国食管鳞癌六大高发区。
准确预测食管鳞癌患者的预后对于临床进一步的治疗和随访具有重要意义。然而，目前除了国际TNM分期外还没有一种简便有效的方法可以更加准确地预测食管鳞癌患者的预后。然而，TNM分期预测患者的预后比较繁琐，需要准确地评价肿瘤的浸润深度、转移淋巴结的个数、肿瘤有无远处转移等，况且国际TNM分期的制定缺少大量国人食管鳞癌的病例资料，因此在评价我国患者的预后时适用性比较差，而本发明所采用的3个指标联合预测患者预后的试剂盒比单个指标检测具有更高的预测效果，同时也明显高于TNM分期的预测能力，并且本发明所基于的免疫组织化学超敏型二步法是一种成熟可靠、可在基层医院广泛使用的方法。本试剂盒中3种蛋白抗体的背景介绍如下：
CD105标记的血管密度，代表的是肿瘤发生发展的一个重要环节：肿瘤血管生成。血管的生成是肿瘤生长的关键，实体瘤的进行性生长依赖于其诱导产生的血管网的建立，血管的形成确保了肿瘤代谢的进行，对肿瘤增殖必不可少。
esVEGFR2，即可溶性内源性血管内皮生长因子2，最初是作为淋巴管生成的特异性抑制分子被发现的。我们前期研究发现，在食管鳞癌中，无论是采用RT-PCR，还是免疫组化等方法，esVEGFR2的表达都与患者的生存率存在显著负相关关系，并且与患者的淋巴结转移、临床分期之间的相关关系有统计学意义。
MYC基因是较早发现的一种癌基因。MYC在细胞周期变化、细胞的生长代谢、基因的不稳定性、刺激血管生成、细胞恶性转化、分化及凋亡中发挥重要的调节作用。MYC的表达和效能受众多癌基因、抑癌基因及其他调节因素(如生长因子)的影响，彼此之间互相制约、互相协同。MYC的异常表达发生在很多人类肿瘤中，其异常表达是癌变过程中较早出现的分子改变，与肿瘤的启动及癌性程度密切相关。
虽然上述每种蛋白均具有预测食管鳞癌患者预后的能力，但把3种蛋白联合起来预测食管鳞癌患者的预后则具有更强的判断效能，甚至高于国际公认的TNM分期的预测能力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于免疫组织化学方法的3个蛋白抗体联合预测食管鳞癌患者预后的试剂盒。
其中，上述的免疫组织化学方法主要是检测中性福尔马林固定和石蜡包埋的标本。
其中，上述试剂盒主要包括抗3种蛋白的抗体，分别是抗CD105蛋白、抗esVEGFR2蛋白和抗MYC蛋白抗体。
其中，上述试剂盒中的检测试剂，分别是山羊血清，0.01M柠檬酸盐修复液，3％H2O2，Polymer增强剂，Polymer聚合物，DAB显色试剂，PBS溶液。
附图说明
图1是CD105蛋白在不同表达人群的Kaplan-Meier生存曲线(P＝0.000)。图2是esVEGFR2蛋白在不同表达人群的Kaplan-Meier生存曲线(P＝0.009)。图3是MYC蛋白在不同表达人群的Kaplan-Meier生存曲线(P＝0.035)。图4是3种蛋白联合后，判断该人群的Kaplan-Meier生存曲线(P＜0.001)。图5是ROC曲线(注：3种蛋白联合后形成的曲线下面积最大，为0.723)。
具体实施方式
我们收集了124例2000-2006年的食管鳞癌患者的手术标本存档蜡块。下面结合附图实施例作进一步详细描述。
免疫组织化学超敏型二步法步骤如下：
标本经连续切片、二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后，用超敏型二步法检测目的蛋白的表达。具体方法如下：
(1)切片经0.01M柠檬酸盐修复液抗原修复、3％H2O2灭活内源性过氧化物酶、山羊血清封闭后，分别与CD105、esVEGFR2和MYC抗体4℃孵育过夜；
(2)切片与Polymer增强剂和Polymer聚合物分别孵育后，DAB显色；
(3)切片经苏木素复染核，梯度酒精脱水，二甲苯透明和中性树胶封片；
(4)切片在完成上述每步后均经PBS溶液洗涤。
所有的免疫染色切片经2位病理医师采用盲法独立评分。CD105标记的微血管评分方法为血管密度，参照传统方法，首先在100倍镜下由表皮到基底选取组织内血管最多的区域，通过图像采集仪在400倍镜下计数血管密度(MVD)，计算其MVD均值。任何棕黄染色细胞或细胞群，即使未显示管状结构也计算为1个MVD值。其cut-off值根据平均血管密度确定。其它两个蛋白评分方法为肿瘤细胞浆中出现棕黄色颗粒被认为是阳性信号。染色强度分为4级：0，阴性；1，弱染色；2，中度染色；3，强染色。阳性细胞百分数分为5级：0，0～5％；1，6～25％；2，26～50％；3，51～75％；4，≥76％。每个标本的总分数是由肿瘤细胞染色强度和肿瘤细胞阳性百分数两部分的乘积得出的，范围是0～12。为了方便统计，我们把所有病例分为低表达和高表达2组，1代表低表达组，2代表高表达组，其cut-off值根据X-tile软件确定。esVEGFR2：0～8分为低表达组，9～12分为高表达组；MYC：0～4分为低表达组，6～12分为高表达组。
3个指标联合起来判断食管鳞癌患者预后的方程式如下：
Y＝α×A+β×B+γ×C，其中α、β、γ为系数，通过Cox回归可以得出数值，故方程式变为Y＝1.204×A+0.641×B+0.517×C。A、B、C为该例标本中3个蛋白的表达状态，1代表低表达，2代表高表达。计算出每例标本的Y值后按照从小到大的顺序排列，其中位于中间位置的病例对应的Y值为cut-off值，即3.566。小于等于该值的病例为低危组，高于该值的病例为高危组，这样分成2组后再进行单因素统计分析。此外，也可以通过绘制ROC曲线去比较每个蛋白形成的曲线下面积(AUC)的大小。
数据的统计学处理：
使用SPSS 13.0统计软件处理数据。各蛋白的表达与患者的生存时间的关系使用Kaplan-Meier生存分析；预测影响患者预后的独立危险因素使用Cox比例风险回归模型；每种蛋白预测食管鳞癌患者预后的效能使用ROC曲线；P＜0.05被认为有统计学显著性。
结果显示：
3个蛋白的表达都与食管鳞癌患者的TNM分期及淋巴结转移状态密切相关。3蛋白单独及联合的单因素及多因素Cox风险回归模型预测患者的独立危险因素如下：
3个蛋白联合具有更强的食管鳞癌预后预测能力，同时也是独立的预后因子。
3个蛋白联合后形成的ROC曲线面积是最大的，同时也具有较高的敏感性和特异性。
3个指标联合后得到的ROC曲线下面积是0.723，均大于每种指标单独评价时所形成的ROC曲线下面积，甚至高于TNM分期所形成的曲线下面积(0.697)，同时3个指标联合后预测食管鳞癌患者的预后，也具有较高的敏感性和特异性(分别为55.2％和89.5％)。因此说CD105、esVEGFR2、MYC联合后评价食管鳞癌患者的预后具有更高的预测价值，并且比TNM分期更好操作及适用性更强。
评价临床上个体食管鳞癌患者的预后信息时，只需把所得到的该患者3个蛋白表达的免疫组化分数对应的表达状态数值(1代表低表达，2代表高表达)套入公式Y＝1.204×A+0.641×B+0.517×C中，就可以得出Y值，然后与我们确定的cut-off值3.566比较，小于该值的患者属于低危组(5年生存率为54.70％)，大于该值的患者属于高危组(5年生存率为9.40％)。

Claims (7)

1.一种预测食管鳞癌患者预后的试剂盒，其特征在于试剂盒中包括3种蛋白抗体与检测试剂，其中3种蛋白抗体是抗CD105蛋白抗体、抗esVEGR2蛋白抗体、和抗MYC蛋白抗体；其中检测试剂分别是山羊血清，0.01M柠檬酸盐修复液，3％H2O2，Polymer增强剂，Polymer聚合物，DAB显色试剂与PBS溶液。
2.权利要求1所述的试剂盒在制备联合预测食管鳞癌患者预后试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于使用试剂盒所检测的标本为中性福尔马林固定和石蜡包埋的组织蜡块。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所使用的检测方法为免疫组织化学超敏型二步法，具体步骤如下：对中性福尔马林固定和石蜡包埋的组织蜡块进行切片，切片经脱蜡至水、抗原修复、灭活内源性过氧化物酶和山羊血清封闭后，分别与抗CD105蛋白抗体、抗esVEGR2蛋白抗体和抗MYC蛋白抗体在保湿盒内4℃孵育过夜；随后分别与Polymer增强剂和Polymer聚合物孵育后，DAB显色和苏木素复染细胞核；最后经酒精脱水和二甲苯透明后用中性树胶封片，并对每张染色切片进行评分。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：CD105这种蛋白标记于肿瘤血管，cut-off值为平均血管密度，其他两种蛋白表达高低的cut-off值由X-tile软件确定，其中esVEGFR2的cut-off值是8分，MYC的cut-off值是4分。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：每例标本在应用3种蛋白抗体分别检测后，其3种蛋白联合表达的计算公式为Y＝α×A+β×B+γ×C，其中α、β、γ为系数，可以通过Cox回归得出，故该公式转换为Y＝1.204×A+0.641×B+0.517×C；A、B、C分别为该例标本中CD105蛋白、esVEGFR2蛋白、MYC蛋白的表达状态，1代表低表达，2代表高表达；在计算出每例标本的Y值后按照从小到大的顺序排列，其中位于中间位置的标本所对应的Y值为cut-off值，即3.566，那么低于该值的病例为低危组，高于该值的病例为高危组。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：评价个体食管鳞癌患者预后的信息时，只需把该患者3个蛋白的免疫组化得分所对应的表达状态代入公式中，就可以得出Y值，然后与我们确定的cut-off值3.566比较，小于该值的患者属于低危组，其5年生存率为54.70％，而大于该值的患者属于高危组，其5年生存率为9.40％。
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