KR101892598B1

KR101892598B1 - 수지상 세포를 포함하는 결핵 백신 부스터용 조성물

Info

Publication number: KR101892598B1
Application number: KR1020170008769A
Authority: KR
Inventors: 신성재; 김종석; 김우식
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2017-01-18
Filing date: 2017-01-18
Publication date: 2018-08-28
Also published as: KR20180088536A

Abstract

본 발병은 성숙화된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는, 결핵 백신 부스터용 조성물 및 잠복결핵 재활성화 억제용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 성숙화된 수지상 세포를 결핵 백신 투여 후, 부스터 백신으로 투여하는 경우, 고병원성 결핵 균주에 대한 뛰어난 결핵 예방 효과를 나타낼 수 있으며, 재발률이 높은 고병원성 결핵의 재발을 막고, 잠복 결핵의 재활성화를 장기간 방지할 수 있어 난치 결핵을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

수지상 세포를 포함하는 결핵 백신 부스터용 조성물 {Composition for boosting of tuberculosis vaccine comprising dendritic cell}

본 발병은 성숙화된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는, 결핵 백신 부스터용 조성물 및 잠복결핵 재활성화 억제용 백신 조성물에 관한 것이다.

결핵(Tuberculosis)은 단일 세균성 질환으로는 인류 역사상 사람이 목숨을 가장 많이 앗아간 감염성 질환이다. 전세계 인구의 3분의 1 이상이 결핵균(MTB; Mycobacterium tuberculosis)에 감염되어 있으며, 결핵균은 결핵(TB; Tuberculosis)을 일으키는 병원성 세균을 지칭한다. 세계보건기구(WHO; World Health Organization)에서는 결핵을 인류의 건강을 위협하는 3대 감염질병 중 하나로 인식하고 있으며, 한 해에만 9백만명의 새로운 결핵환자가 발생하고 이 중 약 150만 명의 사람들이 사망하였다고 보고된 바 있다. 최근에는 다제내성 (MDR; Multi-drug-resistant) 결핵균 및 광범위 내성(XDR; Extensively-drug-resistant) 결핵균의 증가로 인하여 결핵의 치료가 어려워지고 있고, 모든 약제에 대한 내성을 가지는 결핵균(TDR; Totally-drug-resistant)도 등장하여 상황은 더욱 심각해지고 있다. 이처럼 약제 내성 결핵은 치료 비용의 증가를 불러올 뿐만 아니라 치료 효율도 낮아져 난치성 결핵으로 발전하는 위협을 주고 있다.

결핵 백신에서 가장 큰 문제점은, 현재 유일하게 사용되는 결핵 예방백신인 약독화된 소 결핵균(Mycobacterium bovis)인 BCG (Bacille Calmette-Guerin)가 신생아에서 속립성 결핵(miliary tuberculosis)에 대한 예방효과는 보이지만, 가장 흔한 결핵의 형태인 성인의 폐결핵에 대한 예방효과가 없다는 것이며 특히 잠복 결핵을 억제하는 데에는 거의 효과가 없다는 것이다 (Colditz et al, 1994; Aronson et al, 2004). 결핵을 예방하기 위해 백신 연구들이 계속 진행되고 있지만 아직까지 뚜렷한 성과를 나타내지 못하고 있고, 새로운 결핵 백신으로 기대를 모았던 MVA85A 역시 효과적으로 결핵을 예방하지 못하는 것으로 밝혀져(Tameris et al, 2013), 새로운 타겟 항원을 이용한 결핵 예방백신 개발의 필요성이 더욱 증대되고 있다.

결핵을 예방하는 전략은 결핵의 감염을 방지하는 것과 결핵의 발병을 방지하는 것으로 나누어 생각할 수 있는데, 결핵균 자체에 노출되는 것을 막는 감염 자체를 방지하는 것은 현실적으로 불가능하므로, 현실적인 목표는 결핵균에 노출 또는 감염되더라도 질병으로 진행하는 결핵의 발병을 막는 것이다. 결핵의 발병을 막기 위해서는 결핵에 대항할 수 있는 숙주의 면역반응을 유도하는 것을 고려할 수 있으며, 세포 매개성 면역반응 (cell mediated immune response)을 유도해 볼 수 있다.

결핵의 백신개발에서 두 번째 큰 문제점은 현재 임상에서 문제를 야기시키고 있는 고병원성 결핵균의 병원성을 고려하지 않고 개발한다는 것이다. 현재 개발 중인 백신의 평가용으로 사용하는 균주는 표준균주인 결핵균 H37Rv 균주 또는 임상 분리 주인 Erdman 균주로 현재 환자에서 분리된 균주보다는 병원성이 약하다. 특히, H37Rv 표준 균주의 경우, 90년 전에 분리된 균주로 BCG 백신을 사용하지 않는 사람에게서 분리된 균주이므로 실제 백신 개발에 필요한 정보를 효과적으로 제공할 수 없는 한계점이 있다. 즉, 과거 개발되었거나 현재 개발 중인 백신은 동물 실험에서는 효과가 있었지만 임상시험에서 매번 실패하는 이유는 현재 국내외에서 실제로 문제가 되고 있는 고병원성 균주에 대한 방어효과를 평가하지 않고 임상 시험을 하고 있기 때문인 것이다. 한 예로, 우리나라의 경우 BCG 백신이 신생아의 의무접종으로 대부분의 국민이 BCG 백신을 접종받았지만 여전히 결핵의 발병율이 OECD 국가 중 가장 높다. 특히 BCG 백신은 현재 문제가 되고 있는 고병원성 결핵균의 면역학적 진화인자로 생각되고 있다. 즉, 병원성이 약한 결핵균은 BCG 백신에 의하여 생긴 면역에 적응하지 못하고 도태된 반면, 현재 문제가 되고 있는 균주는 BCG 백신이 부여하는 면역학적 스트레스를 이겨내고 진화된 고병원성 결핵균이므로, 기존에 사용하고 있는 BCG 백신은 고병원성 균주에 대해서는 효과적인 예방 효과를 나타내기 어려운 한계점이 있다.

특히, 우리나라의 경우, 환자에서 분리되는 임상결핵균의 80% 이상이 고병원성 베이징(Beijing) 균주형임을 감안하면 고병원성 베이징 균주에 효과적인 것은 백신의 개발이 절실히 필요한 상황이다.

한편 수지상 세포는 선천성면역뿐만 아니라 후천적인 인과에 의해 선택적으로 발생되는 획득면역조절에도 중추적인 역할을 담당하는 세포로서, 주로 외부에서 침입한 항원의 정보를 T세포에 항원제시 기능을 수행하는 대표적인 항원제시세포의 일종이다. 림프계 조직을 비롯하여 여러 조직의 각 조직 세포간극에서 나뭇가지모양으로 존재한다. 수지상 세포는 최종 분화세포로 체내 전체 면역세포의 1% 이하로 존재하나 단핵구나 대식세포에 비해 훨씬 강력하게 림파구의 활성을 유도할 수 있는 세포이며, 골수에서 기원해서 미성숙한 형태로 혈류를 거쳐 체내 모든 기관으로 이동한다. 이로 인해 수지상 세포는 각 조직 주변의 항원을 채집하여 림프기관으로 이동해 T림프구에 항원을 전달하여 T세포 활성화에 중요한 역할을 담당한다. 수지상 세포를 이용한 백신은 부작용이 없고 안전한 치료용 백신으로 알려져 있어 수지상 세포 백신을 이용한 난치성 질병치료에 대해 많은 연구가 수행 되어지고 있다. 그러나 수지상 세포를 유효성분으로 하는 신규한 결핵 치료제에 대한 연구는 많지 않고 특히 수지상 세포를 기반으로 하는 부스터 백신의 개발은 전무한 상태이다.

한편, 결핵균 유래의 항원 단백질을 이용하여 결핵 감염을 예방하고자 하는 연구가 진행되고 있다. 이 중 대표적인 항원 단백질로 Ag85A, Ag85B 가 알려져 있으나, 아직까지 결핵의 방어에 어떤 항원이 주요한 역할을 하는지는 명확하게 확인되지 않은 상황이다. 오히려 백시니아 바이러스를 이용하여 임상을 수행하였던 연구에서 Ag85A를 항원 단백질로 하는 경우, BCG 부스터로서의 효과가 없음이 보고된 바 있다.

이처럼 아직까지 BCG 백신이 효과를 나타내지 않는 고병원성 결핵균을 효과적으로 예방할 수 있고, BCG 백신의 면역학적 결핵예방 효과를 최대한 높이면서 잠복결핵의 재활성화를 억제할 수 있는 새로운 백신 조성물에 대한 보고는 없으며, 이에 대한 필요성이 절실하다.

이에 본 발명자들은 BCG 백신의 면역학적 결핵예방 효과를 최대한 높이면서 잠복결핵의 재활성화를 억제할 수 있는 부스터 백신에 대한 연구를 수행하던 중, 결핵균의 CFA (culture filtrated antigen) 로 성숙화된 수지상 세포를 부스터 백신으로 이용하는 경우, 장기간 효과를 나타내어 잠복결핵의 재활성화를 억제하고, 치사량의 고병원성 결핵균 감염에도 방어 효능이 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 성숙화된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는, 결핵 백신 부스터(booster)용 조성물 및 잠복결핵 재활성화 억제용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 성숙화된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는, 결핵 백신 부스터(booster)용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 성숙화된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는, 잠복결핵 재활성화 억제용 백신 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 성숙화된 수지상 세포 및 결핵 백신을 포함하는 잠복 결핵 재활성화 억제용 키트를 제공한다.

본 발명의 성숙화된 수지상 세포를 결핵 백신 투여 후, 부스터 백신으로 투여하는 경우, 고병원성 결핵 균주에 대한 뛰어난 결핵 예방 효과를 나타낼 수 있으며, 재발률이 높은 고병원성 결핵의 재발을 막고, 잠복 결핵의 재활성화를 장기간 방지할 수 있어 난치 결핵을 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 BCG 백신에 의한 면역화, 성숙화된 수지상 세포 투여, K 균주 감염으로 이루어지는 투여 프로토콜을 나타낸 모식도이다.
도 2는 도 1의 프로토콜에 의한 처리 후의 폐 및 비장에서의 염증 병변을 감염군, BCG 단독 면역화군, BCG 면역화 및 성숙화된 수지상세포 처리군에서 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 도 1의 프로토콜에 의한 처리 후의 폐 및 비장에서의 감염 균수의 변화를 감염군, BCG 단독 면역화군, BCG 면역화 및 성숙화된 수지상세포 처리군에서 확인한 결과를 나타낸 도이다. 통계학적 유의성은 BCG 단독 처리군 대 BCG후 CFA-mDC 처리군의 차이를 나타낸다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, Student's t-test).
도 4는 BCG 백신에 의한 면역화, 성숙화된 수지상 세포 투여, HN878 균주 감염으로 이루어지는 투여 프로토콜을 나타낸 모식도이다.
도 5는 도 4의 프로토콜에 의한 처리 후의 폐 및 비장에서의 폐 및 비장에서의 감염 균수의 변화를 감염군, BCG 단독 면역화군, BCG 면역화 및 성숙화된 수지상세포 처리군에서 확인한 결과를 나타낸 도이다. 통계학적 유의성은 BCG 단독 처리군 대 BCG후 CFA-mDC 처리군의 차이를 나타낸다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, Student's t-test).
도 6은 도 4의 프로토콜에 의한 처리 후의 폐 및 비장에서의 염증 병변을 감염군, BCG 단독 면역화군, BCG 면역화 및 성숙화된 수지상세포 처리군에서 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 BCG 단독 면역화군과 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상세포만 투여한 군, 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상 세포를 BCG booster 백신으로 사용하였을 때, 결핵균 K 균주 감염 후, 각 1주 (short term) 와 10주(long term)에 multifunctional CD4 와 CD8 T 세포들을 유세포 분석기를 통하여 분석한 그래프이다. 통계학적 유의성은 BCG 단독 처리군 대 BCG후 CFA-mDC 처리군의 차이를 나타낸다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, Student's t-test).
도 8 는 성숙화된 수지상 세포 투여량 의존적 백신 효과 증가 효과를 폐 조직의 염증 비교를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 성숙화된 수지상 세포 투여량 의존적 백신 효과 증가 효과를 폐와 비장에서의 감염 균수 변화를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다. 통계학적 유의성은 BCG 단독 처리군 대 BCG후 CFA-mDC 처리군의 차이를 나타낸다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, Student's t-test).
도 10은 고용량 결핵균 감염에 대한 방어 효과를 확인하기 위한 처리 프로토콜을 나타낸 모식도이다.
도 11 은 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상 세포를 BCG 면역화 후 처리하고 고용량의 결핵균(치사량)을 감염시킨 후, 마우스의 생존을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12 는 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상 세포를 BCG 면역화 후 처리하고 고용량의 결핵균(치사량)을 감염시킨 후 폐 조직 병변을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 결핵균 감염에 대한 장기간 방어 효과를 확인하기 위한 처리 프로토콜을 나타낸 모식도이다.
도 14는 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상 세포의 장기간 방어 효과를 폐 및 비장에서의 면역학적 특성 (a, b) 과 폐와 비장의 결핵균의 세균 수(c) 및 폐 조직에서의 조직병리학적인 분석(d)를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다. 통계학적 유의성은 BCG 단독 처리군 대 BCG후 CFA-mDC 처리군의 차이를 나타낸다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, Student's t-test).

본 발명은 성숙화된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는, 결핵 백신 부스터(booster)용 조성물을 제공한다.

본 발명의 백신 부스터(booster)용 조성물은 BCG 백신 접종과 함께 처리되는 경우, 기존에 BCG 에 의한 결핵 예방 효과가 미미한 고병원성 결핵 균주, 예컨대 베이징 균주에 대한 우수한 결핵 예방 효과를 달성할 수 있으며, 특히 면역 반응 유도를 통해 잠복 결핵의 재활성화를 효과적으로 억제할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 백신 부스터용 조성물이란, 보호 면역을 증진, 연장 또는 유지하여 일차 투여된 백신 치료의 효과를 증진시킬 수 있는 조성물을 의미하며, 일차 백신 접종을 마친 후, 일정 간격으로 필요에 따라 투여될 수 있는 조성물이다.

일차 예방 접종 및 부스터 접종을 포함한 백신 투여 스케줄은, 환자에게 필요한 한, 수일, 수주, 수년의 과정에 걸쳐 계속될 수 있다. 일부 양상으로, 백신 스케줄은 백신 요법의 시작 시에 가장 높은 빈도로 투여되며, 부스터 효과를 위한 부스터 백신의 투여는 점차 빈도를 줄여서 투여할 수 있다.

본원 발명의 성숙화된 수지상 세포 (Matured Dendritic Cell) 는 미성숙 수지상 세포 (Immatured Dendritic Cell)를 성숙시켜 얻어질 수 있다. 성숙한 수지상 세포는 항원을 포획하고 동시 자극하는 세포 표면 분자 및 각종 사이토카인의 상향-조절된 발현을 나타내는 능력을 상실한다. 특히, 성숙한 수지상 세포는 MHC I형 및 II형 항원을 미숙한 수지상 세포보다 더 높은 수준으로 발현시키고, CD (Cluster of Differentiation) 80+, CD83+, CD86+ 및 CD14-을 조절한다. 성숙한 수지상 세포는 더 많은 MHC 발현으로 수지상 세포 표면상에서 항원 밀도의 증가를 유도하는 반면, 동시-자극의 분자 CD80 및 CD86의 상향 조절로, T 세포 상에 CD28과 같은 동시-자극의 분자 상응물을 통해서 T 세포 활성 신호를 강화한다. 본 발명의 성숙화된 수지상 세포는 골수로부터 분리된 수지상 세포인 것이 바람직하다.

수지상 세포의 성숙은 당해 기술분야에 공지된 방법으로 모니터할 수 있다. 예를 들어, 세포 표면 마커를 유세포 분석기(flow cytometry) 및 면역조직화학법 등과 같은 당해 기술분야에 친숙한 검정으로 검출할 수 있으며, 사이토카인 생성 (예, ELISA, FACS 및 다른 면역 검정)을 통해 모니터할 수 있다.

상기 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 성숙시키는 과정은, 수지상 세포의 성숙을 위한 당 분야에 알려진 통상의 방법을 제한없이 이용할 수 있으나, 바람직하게는 결핵균으로부터 분리된 CFA (culture filtrated antigen) 로 미성숙 수지상 세포를 자극하는 방법을 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서 CFA는 '결핵균 항원', '배양 여과 항원'으로도 불리며, 배양 여과 단백질 (culture filtrate proteins; CFPs) 과도 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 결핵균으로부터 분리된 CFA는 이에 제한되는 것은 아니나, Ag85 복합체 항원, 38-kDa 당지질단백질(glycolipoprotein), ESAT-6 (early secreted antigenic target-6) 을 포함할 수 있으며, Ag85 복합체 항원은 Ag85A (32-kDa Ag), Ag85B (30-kDa 또는 α-Ag), 및 Ag85C (32.5-kDa Ag) 및 다양한 면역원성 항원을 포함하는 복합단백질 일 수 있다.

본 발명의 CFA는 1000개 이상의 결핵균 분비 항원을 포함하고 있어, 단일 결핵균 분리 항원을 이용하는 것과 비교하여 다양한 T 세포 레파토리를 만들어 낼 수 있는 장점이 있으며, 다양한 항원에 대한 다양한 T 세포 집단 생성으로 면역 반응을 더욱 효과적으로 유도할 수 있는 장점이 있다.

또한 본 발명의 CFA를 이용하여 수지상 새포를 성숙화시키는 경우, CFA 자체에 PAMP 분자 등이 다수 포함되어 있어 수지상 세포를 직접 활성화 시킬 수 있는 장점이 있으며, 미성숙 수지상 세포가 항원을 이용하여 직접 항원제시하는 과정이 수행되므로, MHC I 및 MHC II 에 직접 펩타이드가 결합되고 결핵균 특이적인 T 세포 결합의 효율이 더욱 증대될 수 이는 장점이 있다. 이는 별도의 PAMP 분자, 예컨대 자이모산과 같은 분자를 처리하는 단계 없이도 바로 미성숙 수지상세포를 활성화 시키고 항원 제시 가정을 통해 강력한 수지상 세포를 만들 수 있다는 점에서 특히 우수성이 있다.

본 발명의 CFA는 결핵균, 바람직하게는 베이징 균주, 더욱 바람직하게는 한국형 결핵균 K 균주 또는 마이코박테리움 튜베르쿨로시스 HN878 을 배양하고, 원심분리한 후, 여과 및 투석하여 얻어질 수 있다.

성숙화된 수지상 세포는 골수로부터 분리된 수지상 세포에 CFA를 30 내지 100 μg/ml, 바람직하게는 50 μg/ml 로 처리한 후 24시간 내지 48시간 동안 6-웰 플레이트에서 배지에서 배양하는 방법을 통해 얻어질 수 있다.

본 발명의 성숙화된 수지상 세포는 결핵 백신 부스터용이며, 바람직하게는 BCG 백신의 부스터 백신일 수 있다. 특히 본 발명의 성숙화된 수지상 세포는 BCG 백신의 효과가 미미한 고병원성 결핵균을 예방하는데 유용하게 사용될 수 있으며, BCG 백신 접종/투여 후 개체에 투여되어 고병원성 결핵균을 예방하고, 잠복 결핵의 재활성화를 억제할 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 결핵 백신이 BCG 백신인 것을 특징으로 하고, 상기 결핵은 고병원성 결핵 균주 감염에 의해 유발되는 것인 결핵 백신 부스터용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 고 병원성 결핵 균주는 베이징 균주를 포함한다. 베이징 균주는 표준 균주인 마이코박테리움 튜베르쿨로시스 H37Rv (Mycobacterium tuberculosis H37Rv)에 비하여 병원성이 높고 치료 후, 재발율이 높은 것이 특징이며, 이 중 상당수는 많은 약물, 심지어 다른 결핵균을 물리칠 수 있는 약물에 대해서도 내성을 획득한 것으로 알려져 결핵 치료에 있어 가장 문제가 되는 균주이다.

본 발명에 있어서, 베이징 균주는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) HN878 및 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주(Mycobacterium tuberculosis K strain) 일 수 있다.

본 발명의 결핵 백신 부스터용 조성물은 고병원성 결핵균에 효과적이나, 일반 결핵균에 대한 BCG 면역의 부스터용으로도 사용될 수 있고, 상기 결핵은 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis), 마이코박테리움 보비스(M. bovis), 마이코박테리움 보비스(M. bovis) BCG, 마이코박테리움 아프리카눔(M. africanum), 마이코박테리움 카네티(M. canetti), 마이코박테리움 카프라에(M. caprae), 마이코박테리움 마이크로티(M. microti), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) HN878 및 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주(Mycobacterium tuberculosis K strain)의 감염에 의해 유발되는 결핵 일 수 있다.

본 발명의 성숙화된 수지상 세포는 결핵 백신의 접종 전, 접종 후, 접종과 동시에 투여될 수 있으나, 바람직하게는 결핵 백신의 접종 후 투여되어 결핵 백신의 효과를 유지하고, 항원 특이적 다기능(multifunctional) CD4⁺ T 세포 및 CD8⁺ T 세포를 증가시킬 수 있다.

성숙화된 수지상 세포의 투여 시기는, 결핵 백신 BCG후 접종 후 평생 동안 1회 주입하여 효과를 얻을 수 있다. 바람직하게는 1 내지 10년 이내 일 수 있으며, 1회 BCG 백신 접종을 받을 사람에게 투여 될 수 있다. 또한, 일부 양상으로, 부스터 백신으로서의 성숙화된 수지상 세포는 일차 예방접종 스케줄을 마친 후 일정 간격으로, 예를 들어 6개월 이상의 간격으로 필요에 따라 투여될 수 있다.

특히 본 발명의 성숙화된 수지상 세포의 투여는 BCG 백신의 효과를 장기간 유지되도록 할 수 있으므로, 결핵균 감염 10주 이상이 지난 후에도 결핵 항원 특이적 방어 면역이 빠르고 효과적으로 유도되도록 할 수 있다. 따라서 본 발명의 성숙화된 수지상 세포는 이와 같이 결핵 백신의 효과를 유지시키는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이는 항원 특이적 다기능(multifunctional) CD4⁺ T 세포 및 CD8⁺ T 세포를 증가시키고, 이를 장기간 유지시킴으로써 달성될 수 있다.

본 발명에 있어, 상기 결핵은 폐 결핵 및 폐외 결핵을 모두 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 폐외 결핵은 안결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장 결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두 결핵, 중이 결핵, 장결핵, 다제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후결핵, 임파선 결핵, 폐허증, 유방 결핵, 비장 결핵 및 척추 결핵으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 폐 결핵 및 비장 결핵일 수 있다.

상기 잠복결핵이란 비활동성 결핵을 의미할 수 있다. 즉, 1차 결핵 감염 이후 휴지기 상태의 결핵을 말하며, 질병 증상의 발현이 없는 결핵균 감염을 의미한다. 결핵의 재활성화는 2차 결핵과 동일한 의미로 사용될 수 있으며, 1차 결핵 감염 이후 휴지기, 비활동성 또는 잠복성 결핵균 감염의 재활성화를 의미한다. 보다 구체적으로 용어 "결핵의 재활성화"는 투베르쿨린 시험에서 양성인 것으로 판명되나 명확한 질병 증상을 지니지 않는 개체에서의 질병 증상의 뒤늦은 발현(manifestation)을 의미한다. 상기 개체는 결핵균에 감염되어 있고, 결핵이 비활동성 또는 잠복 상태가 될 정도로 충분히 치료되어 질병 증상이 이전에 활발히 발현되었거나 되지 않았을 수 있다. 결핵 재활성화를 예방 또는 치료하기 위한 방법은 그러나 질병 증상이 활발히 발현된 개체에서도 개시될 수 있다.

특히 본 발명의 성숙화된 수지상 세포에 의한 잠복 결핵 재활성화는 면역 약화에 의해 유발되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 결핵 치료 후, 또는 다양한 면역억제 치료에 따른 결핵의 재활성화, 예를 들어 류마티스 관절염 또는 크론씨병 환자에서 TNF-alpha 억제용 항체 투여시 결핵의 활성화 또는 항암치료시 면역억제에 의한 결핵의 재활성화를 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 성숙화된 수지상 세포 및 결핵 백신을 포함하는 잠복 결핵 재활성화 억제용 키트 또는 키트 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 키트에 포함되는 구성 중 상술한 바와 중복되는 것은 위의 기재를 참고할 수 있다. 또한 본 발명의 키트는 본 발명에 따른 키트 사용에 관한 안내서를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 일 구획에 성숙화된 수지상 세포를 포함할 수 있으며, 다른 일 구획에 결핵 백신을 포함하는 형태일 수 있다. 따라서 본 발명의 키트는 성숙화된 수지상 세포와 결핵 백신이 동시에 투여될 수 있도록 또는 순차적으로 투여될 수 있도록 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 비강, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 주사에 의해 투여될 수 있다.

특히 본 발명은 성숙화된 수지상 세포를 생체 내 전체(systemic)적으로 적용 하기 위하여 정맥 내 투여(intravenous injection) 또는 근육내 투여(intramuscular injection) 하는 것이 바람직하며, 성숙화된 수지상 세포가 정맥 내 또는 근육내 투여되는 경우, 다른 투여 방법과 비교하여 폐 및 폐외 결핵을 모두 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 우수하다. 일부 투여방법의 경우, 전신성 면역을 유도하지 못해 폐에서만 면역이 증가될 수 있으나, 본 발명의 성숙화된 수지상 세포를 정맥 또는 근육 내 투여하는 경우 폐 뿐만 아니라 비장 등의 폐 외에서 발생되는 결핵균의 감염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명의 성숙화된 수지상 세포는 정맥 또는 근육내 투여용일 수 있고, 성숙화된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물 및 키트는 정맥 또는 근육내 투여용으로 제조될 수 있다.

또한 본 발명은 성숙화된 수지상 세포 및 결핵 백신을 개체에 투여하는 단계; 를 포함하는 결핵의 예방 방법 또는 잠복 결핵 재활성화 억제 방법을 제공한다.

상기 개체는 인간을 포함한 포유류인 것이 바람직하며, 결핵 치료를 필요로 하는 환자로 결핵 치료 중인 환자, 결핵 치료를 받은 적이 있는 환자, 결핵 치료를 받을 필요가 있는 환자를 모두 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 성숙화된 수지상 세포 및 동물 모델 준비

1.1. 수지상 세포의 분리 및 유도

C57BL/6마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용해 대퇴부 골수를 채취하였다. 분리한 세포를 6-웰 플레이트에서 RPMI 1640 (10% FBS (Fetal bovine serum, 송아지 혈청), 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 50 μM 머캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨, 20 ng/ml GM-CSF, 2.5 ng/ml IL-4)을 첨가하여 8 일 동안 배양하였다. GM-CSF 및 IL-4은 수지상 세포로의 분화를 유도하기 위하여 사용하였다.

1.2 한국형 결핵균 K-균주의 CFA (culture filtrated antigen) 생산

한국형 결핵균 K-균주의 CFA(culture filtrated antigen)를 얻기 위해, 균을 modified Watson-Reid medium (mWR, pH 6.0)에 접종하여 37℃에서 2주간 키운 후 mid-log phase 때 30,000 × g 로 30 분간 원심분리하였다. 그 다음 0.2-μm filter (Millipore)로 여과한 후 Centricon Plus-80 filture로 40-50배 농축하였다. 그 다음, 10 mM PBS 와 Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 투석한 후 사용하였다.

1.3 CFA에 의한 수지상세포의 성숙화 유도

상기 1.1에 기재된 방법에 의해 골수로부터 분리된 수지상 세포에 CFA를 50 μg/ml로 처리 한 후 24시간 동안 6-웰 플레이트에서 RPMI 1640 (10% FBS (Fetal bovine serum, 송아지 혈청), 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 50 μM 머캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨, 20 ng/ml GM-CSF, 2.5 ng/ml IL-4)이 포함된 배지에 배양하였다. 그 다음, 수지상 세포의 성숙화 정도를 분석하기 위해 항-CD11c-APC (BD bioscience), 항-CD40-FITC(BD bioscience), 항-CD80-PE (BD bioscience), 항-CD86-PE (BD bioscience), 항-MHC I 및 II-PE (BD bioscience)와 같은 세포 표면인자 항체를 이용하여 염색한 후 유세포 분석FACs Canto (BD Biosciences, USA)로 분석하였다.

1.4 동물감염 모델의 제조

국내에서 유행하는 고병원 결핵균 K 균주와 기존에 BCG 백신의 효능이 미미한 베이징 패밀리에 속하는 결핵균 HN878 균주를 첼린지 균주로 이용하였다. 결핵균 K 균주, HN878 균주, BCG Pasteur 1173P2 균주를 각각 7H9-OADC broth에서 30일간 배양하였다. 배양된 균주를 수집한 후, 6 mm 글래스 비드로 부드럽게 볼텍싱하면서 파쇄하였다. 세포 응집물이 가라앉은 다음, 상청액을 수거하고 각각 나누어 -80℃에 보관하였다. 이를 해동한 후, 살아있는 박테리아를 Middlebrook 7H11 아가(Difco, Detroit, MI, USA)에서 단계적 희석 평판 배양하고 카운팅하였다. 각 마우스에게 결핵균을 접종하기 위해, 상기 박테리아 현탁액을 음파조(sonic bath)에서 가볍게 음파처리하고, pH7.2의 PBS(phosphate buffered saline)로 희석시켜 원하는 수의 박테리아를 마우스에 감염시켰다.

동물감염 모델로 6주령 specific pathogen-free female C57BL/6 마우스(Japan SLC, Inc., Shijuoka, Japan)를 사용하였으며, 마우스당 200~300 CFU를 공기감염 장치(Glas-Col, Terre Haute, IN, USA)를 이용해 감염시켰다. 모든 결핵균 감염 연구는 연세대학교 의생명연구원내의 ABL-3 바이오해저드 애닐멀 룸의 제한 공간에서 실시하였다.

결핵균 감염 마우스 모델에 CFA에 의해 성숙화 된 수지상 세포를 주입하기 위해, CFA를 50μg/ml로 수지상세포에 처리 한 후 24시간 동안 100mm 플레이트에 RPMI 1640 (10% FBS (Fetal bovine serum, 송아지 혈청), 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 50μM 머캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨, 20 ng/ml GM-CSF, 2.5 ng/ml IL-4)이 포함된 배지에 배양하였다. 그 다음, 세포를 파이페팅하여 회수 한 후 300 × g 로 10 분간 원심분리하였다. 그 다음, PBS로 세포를 수회 세척하여 수 300 × g 로 10 분간 원심분리하는 과정을 3회 반복하였다. 마지막 과정에서 세포 수를 1x10⁵(low dose) 또는 1x10⁶ (high dose) cells/200μl로 조정하여 마우스 꼬리 정맥에 주사하였다. 대조군으로 결핵균의 항원을 처리하지 않은 미성숙 수지상 세포를 동일하게 사용하였다.

실시예 . 2 BCG 백신 및 수지상 세포 순차적 투여에 의한 효과 확인

2.1 BCG 백신균주의 면역화 및 수지상 세포의 부스터 백신 면역화

생후 7주된 특이적 병원체가 없는 암컷 C57BL/6 마우스에 결핵균 감염 (첼린지) 6주 전, BCG 백신을 피하로 주사하여 면역화 시킨 후, 성숙화된 수지상 세포를 투여하고, 결핵균 K 균주를 감염시켰으며, 이 후 부스터 백신으로서의 효과를 평가하였다.

보다 구체적으로 BCG Pasteur 1173P2 (2 × 10⁵ CFU/mouse) 균주를 피하로 투여하여 마우스를 면역화시킨 후, K 균주 감염 3일 전 실시예 1.2 에서 수득된 결핵균 항원 (CFA) 으로 성숙화된 수지상 세포 또는 아무것도 처리하지 않은 미성숙 수지상 세포를 감염 1-3 일전에 꼬리 정맥으로 투여하여 CFA 처리에 의해 성숙화된 수지상 세포의 BCG의 부스터 백신으로서의 효능을 평가하였다. 수지상 세포는 1x10⁶ / 200 uL로 하여 꼬리정맥으로 주사하였으며, K 균주의 감염을 위하여 마우스 폐에 200개의 결핵균 K 균주가 도달하도록 공기 감염시켰다. 또한 챌린지 균주로 K 균주 대신 베이징 패밀리에 속하는 결핵균 HN878 균주를 이용하여 동일한 실험을 수행하였으며, K 균주를 이용한 처리 프로토콜을 도 1에, HN878 균주를 이용한 처리 프로토콜을 도 4에 나타내었다.

2.2 조직병리학적 분석

결핵균 항원으로 성숙화 시킨 수지상 세포의 BCG 부스터 백신으로의 효능을 평가하기 위하여 폐 조직과 비장조직 내 살아있는 박테리아 수를 계수하였다. 이를 위하여Middlebrook 7H11 아가상에서 전체 기관 균질현탁액을 순차적으로 희석하여 플레이팅한 후, 이를 37℃에서 3-4주간 배양하고 콜로니를 카운팅하였다. 전체 폐 조직 당 평균 log10CFU±표준편차로 나타내었으며, 각 군에서 균수를 비교 평가하였다. 또한 결핵균으로 감염시키고 각 군의 마우스에서 폐 조직을 적출하여 이를 10% 중성 완충된 포르말린에 보존시킨 후, 파라핀에 고정시켰다. 고정된 조직을 4-5-mm의 두께로 절편을 만들고 H&E (hematoxylin and eosin)로 염색하였다. 결핵균 항원으로 성숙화 시킨 수지상 세포의 BCG 부스터 백신으로의 효능을 평가하기 위하여 각 군에서 감염 1주와 10주째 폐 병변의 염증 정도를 비교, 평가하였다. K 균주를 챌린지 균주로 한 조직병리학적 비교 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.

도 2 에 나타낸 바와 같이, 백신의 면역화 없이 감염만 시킨 군(infection)이나 BCG 백신만 면역화시킨 군 (BCG) 에서는 많은 면역세포의 유입과 심각한 염증을 나타낸 반면, BCG 백신 후, 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상 세포를 부스터 백신으로 투여한 군 (BCG+mDC) 에서는 면역세포의 유입이 현저히 감소하여 염증 병변이 거의 나타나지 않았다.

또한 도 3에 나타낸 바와 같이, 폐 조직과 비장 조직에서 살아 있는 결핵 균수를 측정한 결과, 본 발명의 수지상 세포를 이용하여 BCG 부스터 백신으로 면역화 시킨 군 (BCG+mDC)은 대조군인 감염만 시킨 군 또는 BCG 백신으로만 면역화 시킨 군에 비하여, 폐와 비장의 박테리아 수가 유의적으로 감소됨을 확인하였다 (페조직: ***p<0.001, 비장조직: **p<0.005).

HN878 균주를 챌린지 균주로 한 실험 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.

도 5 및 도 6에 나타낸 바와 K 균주와 동일하게 BCG 백신의 효과가 미미하다고 알려진 또 다른 결핵균인 HN878 균주에서도 K 균주에서의 결과와 동일하게 단독 감염 및 BCG 백신 단독 면역화 군과 비교하여, BCG 백신 후, 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상 세포를 부스터 백신으로 투여한 군 (BCG+mDC) 에서는 염증 병변이 현저하게 감소되었으며, 폐와 비장 모두에서 박테리아 수가 유의적으로 감소됨을 확인하였다 (페조직: ***p<0.001, 비장조직: **p<0.005).

상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상 세포를 BCG 투여 후 개체에 투여하는 경우 BCG 의 효과를 증진시킬 수 있는 부스터 백신 또는 BCG백신의 효과를 돕는 보조제로 효과를 나타낼 수 있으며, 특히 고병원성 결핵균 K-균주 및 HN878 균주에 의해서 유발되는 결핵에 탁월한 예방 효과를 나타냄을 확인하였다.

2.3 면역 반응 증진 확인

상기 2.2 를 통해, BCG 백신과 CFA로 성숙화된 수지상 세포를 병용 처리하는 경우 K 균주 및 HN878 균주에 의한 결핵균 감염 예방 효과의 증진을 확인하였으므로, 병용 처리에 따른 면역 반응 증진 효과를 추가적으로 확인하였다. 도 1에 나타낸 바와 같은 프로토콜로 마우스를 감염시킨 후, 1주 (short term), 10주 (long term) 주 폐조직에 memory phenotype에 대한 multifunctional CD4⁺ 와 CD8⁺ T cell의 형성유무를 유세포기로 측정하여, 다양한 사이토카인을 분비하는 multifunctional CD4⁺ 와 CD8⁺ T cell과 결핵균 항원에 대한 IFN-gamma 수준을 분석하였다. Multifunctional Th1 세포(IFN-γ, TNF-α, IL-2, 모두 분비)는 결핵균을 방어하는데 중요한 숙주의 구성 요소 중 하나로 알려져 있다. 감염 후 1주와 10주째 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상 세포를 처치한 군에서 폐 조직과 비장 조직에서 세포를 분리하여 결핵균의PPD 항원으로 생체외(ex vivo)에서 재자극하여 multifunctional CD4⁺ 와 CD8⁺ T cell의 형성유무를 유세포기로 측정한 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 실시예 1.2 의 결핵균 항원 (CFA)에 의해 성숙화된 수지상 세포를BCG 면역화 후 추가적으로 투여한 군에서는 폐 조직에 결핵균 방어에 중요한 항원 특이적 multifunctional CD4⁺ 와 CD8⁺ T 세포가 증가함을 확인하였고 감염 10주째에도 multifunctional CD4⁺ 와 CD8⁺ T cell이 잘 유지됨을 확인하였다.

실시예 3. 수지상 세포 투여량에 따른 방어 효과 확인

수지상 세포의 투여량에 따라 방어 효과가 증가되는지 여부를 확인하기 위하여, 7주된 특이적 병원체가 없는 암컷 C57BL/6 마우스에 감염 6주 전, BCG 백신을 피하로 주사하여 면역화 시킨 후, 감염 1일 전 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상 세포를1x10⁵ 또는 1x10⁶ / 200 uL로 투여량을 달리하여 꼬리정맥으로 주사한 후, 마우스 폐에 200개의 결핵균 K 균주가 도달하도록 공기 감염시켰으며, 이와 같이 투여량에 따른 방어 효과를 폐 조직의 염증 정도 및 폐 조직 및 비장 조직에서의 살아있는 결핵 수 측정을 통해 확인하였다. 결과를 도 8 및 도 9에 각각 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 감염 8주에 폐 병변을 각 군에서 비교 분석한 결과, 많은 개수 (1x10⁶)의 성숙화된 수지상 세포를 주입한 군에서는 폐 조직에 염증이 거의 생성되지 않음을 확인하였다. 또한 도 9에 나타낸 바와 같이, 폐 조직과 비장 조직에서 살아 있는 결핵 균수를 측정한 결과, 본 발명의 CFA 처리를 통해 성숙화된 수지상 세포를 이용한 군에서 주입한 수지상 세포의 개수 의존적으로 폐와 비장의 박테리아 수가 유의적으로 감소됨을 확인하였다(페조직: ***p<0.001, 비장조직: **p<0.005). 따라서, 본 발명의 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상 세포는 BCG 백신을 이용한 결핵균 예방 또는 치료에 대하여 효과적인 보조제 또는 부스터 백신으로 사용될 수 있으며, 특히 고병원성 결핵균 K-균주에 의해서 유발되는 결핵에 탁월한 예방효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

실시예 4. 치사량 결핵균 감염에 대한 방어 효과 확인

상기 실시예 2를 통해 BCG 백신과 CFA로 성숙화된 수지상 세포의 병용 투여가 K 균주 및 HN878 균주에 의한 결핵균 예방 또는 치료에 우수한 상승작용이 나타냄을 확인하였으므로, 이와 같은 병용 투여가 고용량의 결핵균 감염에 대해서도 우수한 방어 효능을 갖는지 여부를 확인하였다. 보다 구체적으로 도 1 과 동일한 프로토콜을 따르되, 고병원성 결핵균인 K 균주를 치사량인 3만개로 마우스에 감염시키고, 실시예 1의 CFA 로 성숙화된 수지상 세포를 K 균주 감염 1주전에 처리하였다. 이와 같은 실험 프로토콜을 도 10에 나타내었다. 도 10과 동일한 실험 디자인으로 고병원성 결핵균을 3만개 감여시킨 후, 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상 세포의 BCG 부스터 백신의 효능을 마우스의 생존 여부로 관찰하고 그 결과를 도 11에 나타내었다. 또한, 각 폐사 또는 살아있는 마우스의 폐 조직 병리사진을 바탕으로 그 효능을 평가하였으며 결과를 도 12에 나타내었다.

도 11 에 나타낸 바와 같이, 치사량의 결핵균을 감염시킨 후, 감염 14주 (98일)까지의 마우스 생존 곡선을 확인한 결과, 아무런 면역화가 없이 결핵균만 감염시킨 군은 감염 20일째 모든 마우스가 폐사하였고 BCG 단독으로 면역화 시킨 군 또는 BCG 면역화 후 아무런 처리 없이 대조군으로 미성숙 수지상 세포를 주입한 군에서는 감염 40일째 마우스가 모두 폐사하였다. 그러나 본 발명의 BCG 백신 후, 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상 세포를 부스터 백신으로 투여한 군에서는 감염 98일까지 모든 마우스가 생존함을 확인하였다. 이는 많은 수의 결핵균이 감염되어 결핵 질병이 매우 빠르게 진행되었을 때, BCG 백신 자체로는 효과가 없지만 결핵균 항원으로 BCG 부스터 백신으로 성숙화된 수지상 세포를 함께 투여하는 경우, 치사량의 결핵균 감염과 질병의 진행속도가 빠른 중증 결핵까지도 예방할 수 있어 그 효과가 매우 탁월하다는 것을 의미한다.

또한 도 12에 나타낸 바와 같이, 감염 98일째, 본 발명의 BCG 백신 후, 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상 세포를 연속하여 투여한 군 (BCG+mDC) 에서는 폐 병변의 염증이 폐사한 다른 군의 마우스 (감염 20일째 또는 감염 40일째)보다 오히려 깨끗함을 확인할 수 있었다. 또한 본 실험 결과 앞서 실시예 2 에서 확인한 챌린지 균을 200개 감염시킨 마우스의 폐조직보다 오히려 폐 병변이 적게 일어나는 것으로 나타났으며, 이와 같은 결과는 치사량의 결핵균 감염과 질병의 진행 속도가 빠른 중증 결핵에서도 폐 염증 반응이 잘 일어나지 않아 BCG 면역화 후 CFA로 성숙화된 수지상 세포를 면역 보조제로 함께 처리하여 BCG 부스터 백신으로 이용하는 경우, 그 결핵균 감염 예방 또는 치료 효과가 매우 탁월하다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. CFA 성숙화 수지상 세포의 장기간 효과 확인

결핵균 항원 (CFA) 으로 성숙화된 수지상 세포가 장기간의 BCG 부스터 역할을 수행할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 결핵균 K 균주로 첼린지 하기 32주 전에 BCG를 면역화 하고, 약 12주 후 실시예 1.2과 같은 결핵균 항원으로 성숙화 시킨 수지상 세포로 BCG 백신 효능을 부스팅하여 감염 10주째 그 효능을 평가하였다. 보다 구체적으로 결핵균 항원으로 성숙화시킨 수지상 세포를 처치 후, 장시간 방치하고 (26주), 결핵균 K 균주를 감염시켰다. 감염 후 10주째 각 군에서 폐 조직과 비장 조직에서 세포를 분리하여 결핵균의 PPD 항원으로 생체외(ex vivo)에서 재자극하여 multifunctional CD4⁺ 와 CD8⁺ T cell의 형성유무와 memory T cell 반응, IFN-gamma 수준 및 폐와 비장의 감염 세포 수, 염증 정도를 확인하였으며, 처리 프로토콜 및 처리에 따른 장기간 효과를 확인한 결과를 도 13 및 도 14 에 나타내었다.

도 14의 a 에 나타낸 바와 같이, 감염 전 결핵의 방어에 중요한 IFN-gamma를 폐 조직과 비장 조직에서 분리한 세포에서 측정한 결과, 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상 세포를 부스터 백신으로 투여한 군에서는 폐와 비장 모두에서 결핵균 특이적 PPD 항원의 농도 의존적인 IFN-gamma를 매우 높은 수준으로 생성함을 확인 하였다. 도 14의 b는 감염 후 10주째에 폐조직에서 memory phenotype의 결핵균의 대표적 항원인 Esat-6와 PPD에 대하여 항원특이적 multifunctional CD4⁺의 형성 유무를 나타낸 결과이며, BCG 면역화 후 장기간 시간이 지나더라도 본 발병의 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상 세포를 부스터 백신으로 투여한다면 결핵균의 방어에 중요한 IFN-γ, TNF-α, IL-2를 모두 분비하는 multifunctional CD4⁺ T 세포가 부스팅 되고 감염 후에도 지속적으로 유지된다는 것을 확인하였다. 이는 BCG 백신 접종 후, 오래 시간이 지나더라도 본 발병의 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상 세포 부스터 백신을 주입한다면 결핵 항원 특이적인 방어 면역이 언제든지 유도될 수 있음을 시사하는 것이다. 도 14의 c는 폐 조직과 비장 조직에서 살아 있는 결핵 균수를 측정한 결과이다. 본 발명의 수지상 세포를 이용하여 BCG 부스터 백신으로 면역화 시킨 군(BCG+mDC)은 폐와 비장의 박테리아 수가 유의적으로 감소됨을 확인하였다(페조직: ***p<0.001, 비장조직: **p<0.005). 따라서, 본 발명의 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상 세포를 이용한 실험군에서는 BCG 백신 후 또는 수지상 세포를 주입 후, 오랜 시간이 지나더라도 고병원성 결핵 균주에 의해서 유발되는 결핵에 탁월한 예방효과를 나타냄을 확인하였다. 도 14d는 폐 조직의 염증 정도를 나타낸 도이며, BCG백신의 면역화 없이 감염만 시킨 군이나 BCG 백신만 면역화시킨 군에서는 많은 면역세포의 유입과 심각한 염증을 나타낸 반면, BCG 백신 후, 결핵균 항원으로 성숙화된 수지상 세포를 부스터 백신으로 투여한 군에서는 면역세포의 유입이 매우 감소하여 염증 병변이 매우 미미하게 나타남을 확인하였다.

상기와 같은 결과를 종합하면, BCG 백신에 의한 결핵 방어 효과가 시간이 흐를수록 점차 감소되는 것을 결핵균 항원(CFA) 자극을 통해 성숙화된 수지상 세포의 병용 투여를 통해 막을 수 있으며, 궁극적으로 장기간의 결핵 예방 또는 치료 효과, 잠복 결핵의 재활성화 억제 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.

Claims

결핵균의 CFA(culture filtrated antigen) 처리에 의해 성숙화된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 결핵 백신 부스터(booster)용 조성물로서,
상기 성숙화된 수지상 세포는 결핵 백신의 효과를 유지시키는 것을 특징으로 하는, 결핵 백신 부스터용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 결핵 백신은 BCG 백신인 것을 특징으로 하는, 결핵 백신 부스터용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 결핵은 베이징 균주 감염에 의해 유발되는 것인, 결핵 백신 부스터용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 결핵은 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis), 마이코박테리움 보비스(M. bovis), 마이코박테리움 보비스(M. bovis) BCG, 마이코박테리움 아프리카눔(M. africanum), 마이코박테리움 카네티(M. canetti), 마이코박테리움 카프라에(M. caprae), 마이코박테리움 마이크로티(M. microti), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) HN878 및 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주(Mycobacterium tuberculosis K strain)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 감염에 의해 유발되는 것인, 결핵 백신 부스터용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 성숙화된 수지상 세포는 결핵 백신 접종 후 투여용인 것을 특징으로 하는, 결핵 백신 부스터용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 성숙화된 수지상 세포는 항원 특이적 다기능(multifunctional) CD4⁺ T 세포 및 CD8⁺ T 세포를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 결핵 백신 부스터용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 결핵은 안결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두 결핵, 중이 결핵, 장결핵, 다제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후결핵, 임파선 결핵, 폐허증, 유방 결핵, 비장 결핵 및 척추 결핵으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 결핵 백신 부스터용 조성물.
결핵균의 CFA(culture filtrated antigen) 처리에 의해 성숙화된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는, 잠복결핵 재활성화 억제용 백신 조성물.
제10항에 있어서, 상기 백신은 정맥 또는 근육 내 투여용인 것을 특징으로 하는, 잠복결핵 재활성화 억제용 백신 조성물.
제10항에 있어서, 상기 잠복결핵 재활성화는 면역 약화에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는, 잠복결핵 재활성화 억제용 백신 조성물.
결핵균의 CFA(culture filtrated antigen) 처리에 의해 성숙화된 수지상 세포 및 결핵 백신을 포함하는 잠복 결핵 재활성화 억제용 키트.