KR20220125218A - 신규한 tlr9 작용제 - Google Patents

Abstract

본 출원은 신규한 올리고뉴클레오티드 및 이의 치료적 용도를 제공한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 대상체에서의 면역력의 활성화 또는 조절에 사용될 수 있다.

Description

신규한 TLR9 작용제

본 명세서에 언급된 모든 공개물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별적 공개물, 특허 또는 특허 출원이 본원에 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.

본 발명은 TLR9 를 포함하는 핵산 수용체에 결합할 수 있는 신규한 올리고뉴클레오티드 또는 유도체 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 암 또는 감염성 질환을 포함하는 표적 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

TLR (톨 (toll)-유사 수용체) 은 병원체-관련 분자 패턴 (PAMP) 을 인식하며 세포 멤브레인 또는 엔도솜 멤브레인의 표면에 위치하는 수용체의 패밀리이다. TLR 의 활성화는 유형 I 인터페론 및 염증성 사이토카인의 분비를 초래한다. TLR1 에서 TLR10 의 10 종류의 TLR 이 인간에서 공지되어 있다. 이들 중에서, TLR3, TLR7, TLR8 및 TLR9 는 엔도솜-상주이고 주로 핵산을 검출한다. TLR3 이 바이러스 RNA 와 유사한 폴리(I:C) 로 지칭되는 이중-가닥 RNA 및 합성 RNA 를 주로 인식하지만, TLR7 및 TLR8 은 단일-가닥 RNA 를 주로 인식한다. 한편, TLR9 는 주로 단일-가닥 DNA 를 인식한다. 인간에서, TLR9 는 형질세포양 수지상 세포 (pDC), B 세포, 호산구, 호염기구, 대식세포 및 NK 세포에서 발현된다 (Roda, J.M., et al., J Immunol, 2005. 175(3): p.1619-27; Liu, M., et al., Nat Immunol, 2019. 20(3): p.265-275; Hemmi, H., et al., Nature, 2000. 408(6813): p.740-5).

TLR9 작용제는 pDC 및 B 세포를 활성화시켜 이들의 증식, 염증성 사이토카인 및 항체의 생성, 항원 제시, 및 공동-자극 분자 및 MHC 분자의 발현을 촉진시킨다. TLR9 작용제로부터 자극을 받으면, pDC 및 B 세포는 또한 케모카인 수용체의 발현, 세포자멸사에 대한 저항성, 및 Th1-촉진 케모카인을 포함하는 사이토카인의 생성, 예컨대 대식세포 염증성 단백질 1 (MIP1) 및 10 kDa 의 인터페론-유도성 단백질 (IP10) 의 발현을 증가시킨다. 기억 B 세포는 TLR9 의 활성화에만 의존하여 항체를 분비하는 혈장 세포로 특히 분화된다. TLR9 작용제의 예는 CpG DNA (CpG) 이다. CpG DNA 는 메틸화되지 않은 시토신 및 구아닌을 포함하고 있는데, 이는 박테리아 DNA 에서 병원체-관련 분자 패턴 (PAMP) 을 구성하는 중요한 모티프로서 본래 발견되었다 (Krieg, A.M., Nat Rev Drug Discov, 2006. 5(6): p.471-84).

CpG-올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN) 는 구조 및 기능 측면에서 4 가지 클래스로 분류되는 것으로 보고된다. 클래스 D ODN 으로도 공지된 클래스 A ODN 은 3' 말단의 여러 뉴클레오티드 및 5' 말단의 여러 뉴클레오티드에서 포스포로티오에이트화 백본을 갖는다. 클래스 A ODN 은 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 CpG 를 포함하는 회문 서열을 함유한다. 클래스 A ODN 의 말단은 polyG 서열을 함유하며, 이는 G-테트라드로 불리는 평행 사중체 구조를 형성할 수 있다 (Puig M. et al., Nucleic Acids Res. 2006, 34(22): p.6488-95). 클래스 A ODN 은 pDC 로부터 인터페론-알파 (IFN-α) 의 생성을 강하게 촉진하지만, B 세포를 단지 약하게 활성화시킨다. 클래스 K ODN 으로도 공지된 클래스 B ODN 은 하나 이상의 CpG 서열(들) 을 가지며 대다수의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트화되는 백본을 갖는다. 클래스 B ODN 은 B 세포의 증식을 강하게 유도하고, B 세포로부터 IgM 항체의 분비를 촉진하며, pDC 의 분화 및 성숙을 유도한다. 클래스 C ODN 은 포스포로티오에이트화되는 백본을 갖는다. 클래스 C ODN 은 3' 말단에서 CpG 를 갖는 회문 서열을 가지며, 회문 서열은 분자간 어닐링되어 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 클래스 C ODN 는 pDC 로부터 IFN-α 생성 및 B 세포로부터 IL-6 생성을 촉진한다. 따라서, 클래스 C ODN 은 클래스 A ODN 및 클래스 B ODN 둘 모두와 유사한 기능을 갖는다. 클래스 P ODN 은 2 개의 회문 서열을 갖는다. 클래스 P ODN 은 분자간 어닐링되어 5' 말단에서의 회문에서 연쇄동일서열 (concatemer) 을 형성하거나 분자내 어닐링되어 GC-풍부 3' 말단에서 헤어핀-구조를 형성할 수 있다. 클래스 P ODN 은 유형 I IFN 의 생성을 강하게 유도한다 (Scheiermann, J. et al., Vaccine, 2014. 32(48): p.6377-89).

CpG-ODN 이 TLR9 를 발현하는 세포를 활성화시키는 메커니즘이 하기와 같이 보고된다. 먼저, 내재화된 CpG-ODN 은 엔도솜에서 TLR9 에 결합한다. CpG-ODN 이 TLR9 에 결합하고 나면, TLR9 의 사이토졸 측에 결합하는 어댑터 단백질 MyD88 은 인산화에 의해 활성화된다. 활성화된 MyD88 은 IRF3, 5 및 7 과 같은 전사 인자의 활성화를 통해 유형 I 인터페론 (IFN) 을 포함하는 사이토카인의 전사를 유도한다. 활성화된 MyD88 은 또한 핵 인자-카파 B (NF-kB) 경로를 통해 신호전달을 전달하고; MyD88 의 신호 다운스트림은 IkB (kB 의 억제제 또는 카파-베타의 억제제) 를 유비퀴틴화하고, NF-kB 를 활성화시키는 IkB 의 분해를 유도한다. NF-kB 활성화시, NF-kB 는 NF-kB 프로모터에 결합하며 표적 유전자의 발현을 활성화시킨다. 그 결과, 인터류킨-1베타 (IL-1β), TNF-알파 (TNF-α) 및 인터류킨-6 (IL-6) 과 같은 염증성 사이토카인의 생성이 유도된다.

CpG-ODN 은 상기 언급된 생물학적 TLR9 활성화 활성을 보유하므로, CpG-ODN 의 투여는 하기와 같은 여러 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방에 적합하다.

<항암 (종양) 활성>

CpG-ODN 은 종양 미세환경 (TME) 에 영향을 미칠 수 있고, 반응성이 낮은 종양 (cold tumor) into 반응성이 높은 종양 (hot tumor) 으로 전환시킬 수 있다 ("Warming "Cold" Melanoma with TLR9 Agonists", Cancer Discov, 2018. 8(6): p.670). TME 는 면역 세포, 섬유아세포 및 혈관 세포와 같은 종양을 둘러싸고 있는 종양 세포 및 비-종양 세포에 의해 구축되는 환경이다. TME 의 상태는 종양 진행에 엄청난 영향을 미친다. 반응성이 낮은 종양은 면역억제성 TME 를 구성하는 종양-관련 대식세포 (TAM), 골수-유래 면역억제 세포 (MDSC) 및 조절 T 세포 (Treg) 와 같은 면역억제성 세포, 및 소수의 활성화된 종양 침윤 림프구 (TIL) 를 함유하는 종양이다. 반응성이 낮은 종양은 종종 면역요법을 포함하는 암 치료에 저항성이 있다. 반응성이 높은 종양은 면역학적으로 활성화된 TME 를 구성하는g TIL 및 M1 대식세포를 포함하는 항-종양 면역 세포를 함유하는 종양이다. 반응성이 높은 종양은 일반적으로 암 치료에 반응성이다. 예를 들어, CpG-ODN 의 종양내 투여가 T 세포, pDC 및 NK 세포의 증가, Treg 의 감소 및 MDSC 의 억제를 초래한다는 것이 보고된다 (Shirota, H., et al., Vaccines (Basel), 2015. 3(2): p.390-407). 또한, TLR9 작용제는 전-종양 M2-유사 대식세포를 재양성하여 항종양 M1-유사 대식세포 분극화를 유도하는 것으로 보고된다 (Mantovani, A., et al., J Exp Med, 2015. 212(4): p.435-45).

CpG-ODN 은 또한 CD47 과 같은 '공격 무력화 신호 (don't eat me signal)' 를 발현하는 암 세포를 포획하는 대식세포의 항종양 활성을 강화시키는 것으로 보고된다 (Liu, M., et al., Nat Immunol, 2019. 20(3): p.265-275).

CpG-ODN 은 또한 단핵구 (CD11b+, Ly6G-, Ly6C^high) MDSC 의 면역억제 성질, 예컨대 T 세포 기능의 억제 활성을 억제할 수 있다 (Shirota, Y., et al., J Immunol, 2012. 188(4): p.1592-9).

<Th2 또는 Th17-매개 질환의 예방 또는 치료요법>

CpG-ODN 은 Th2 또는 Th17-매개 질환의 효과적인 예방 또는 치료요법에 적합하다. 통상적인 CpG ODN 은 Th1 세포 및 Treg 를 활성화시킴으로써 면역 반응의 균형을 조절하고, 그 결과, Th2 세포 및 Th17 세포를 억제하는 그의 면역조절 효과를 나타내었다. CpG-ODN 에 의한 Th1 세포로의 분화 유도는 Th1 세포와 Th2 세포가 각각 Th2 세포 또는 Th1 세포로의 분화를 상호 억제하기 때문에 Th2 세포의 감소를 초래하는 것으로 여겨진다.

Th17 세포 및 Treg 의 균형을 조절하는 많은 인자들이 최근에 보고되었다. 이러한 인자의 예는 T-세포 수용체, 공동-자극 분자, 사이토카인, 대사 경로 및 장 미생물총의 다운스트림 신호에 있다 (Lee, G.R., Int J Mol Sci, 2018. 19(3): p.730). TLR4 작용제, LPS 가 Th17 세포의 분화를 유도하고, TLR2 작용제, 펩티도글리칸이 Th17 세포 및 Th1 세포의 분화를 적당히 유도하는 것으로 보고되었다. 한편, CpG-ODN 은 IFN-α 생성을 통해 Th1 세포의 분화를 우선적으로 유도하는 것으로 보고되었다 (Shi, G., et al., J Immunol, 2013. 191(1): p.415-23).

면역의 균형을 유지하기 위한 치료요법의 실행가능성 또한 생체내 설정에서 나타났다. 예를 들어, CpG-ODN 이 모델 마우스 및 궤양성 대장염을 앓고 있는 환자에게 투여된 경우, Th17 세포 수, IL-17 및 IL-6 의 생성이 감소되었으나, Treg 수 및 IL-10 생성이 증가하여, 증상의 개선이 초래되었음이 관찰되었다 (Schmitt, H et al., J Crohns Colitis, 2018, 12(Suppl1) : p.S003). 또한, CpG 의 첨가는 완전 프로인트 보조제에 의해 마우스의 EAE 증상을 감소시켜, Th17-매개 발병기전을 감소시키는데 있어서 CpG 의 효과를 나타내는 것으로 보고되었다 (Tigno-Aranjuez, JT, et al., J Immunol, 2009, 183(9): p.5654-61).

또한, CpG ODN 이 수지상 세포로부터 인돌아민 2,3-디옥시게나아제 (IDO) 의 생성과 Treg 의 활성화 및 증식을 유도하였다는 관찰을 기반으로 하여, Th17-매개 질환에 속하는 천식 및 아토피 질환에 CpG-ODN 이 효과적임이 또한 시사된다 (Kline, J.N., et al., Drug News Perspect, 2008. 21(8): p.434-9).

<조합 치료요법>

또한, CpG-ODN 이 상기 언급된 바와 같이 면역 활성의 조절 활성을 나타내기 때문에, CpG-ODN 이 조합 치료요법에도 적합한 것으로 보고된다. 이전의 보고는 (i) 백신; (ii) 항체 약물; (iii) 통상적인 화학요법; (iv) 분자 표적화 약물; (v) 외과적 치료; (vi) 사이토카인; (vii) 입양 면역 세포 치료요법 (또한 입양 세포 전달 (ACT) 로도 공지됨); 및 (viii) 핵산의 수용체에 대한 작용제를 포함하는 치료요법과의 조합을 보고하였다.

'(i) 백신' 과의 조합

CpG-ODN 은 백신의 면역원성을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, CpG-ODN 은 흑색종-항원 백신과 같은 항암 백신 (Scheiermann, J. et al., D.M., Vaccine, 2014. 32(48): p.6377-89; Shirota, H., et al., Vaccines (Basel), 2015. 3(2): p.390-407) 뿐만 아니라 거대세포바이러스, 말라리아, 탄저병 및 인플루엔자 바이러스와 같은 바이러스에 대한 백신과 함께 투여될 수 있다 (Scheiermann, J. et al., D.M., Vaccine, 2014. 32(48): p.6377-89). CpG-ODN 및 B 형 간염 항원을 포함하는 B 형 간염 백신 Heplisav-B® 가 FDA 에 의해 승인되었다.

'(ii) 항체 약물' (예컨대 면역 체크포인트 억제제 (CPI) 및 세포독성 항체) 와의 조합

CPI 는 체크포인트 분자 또는 이들의 리간드에 결합하여 종양 미세환경 또는 감염된 세포 주변의 환경의 면역억제 상태를 전환시키는 약물이다. 예를 들어, CpG-ODN 과 Keytruda (펨브롤리주맙) 의 조합은 진행성 흑색종의 임상 시험에서 조사되었다 (Ribas, A., et al., Cancer Discov, 2018. 8(10): p.1250-1257). Yervoy (이필리무맙) 과의 조합 사용의 임상 시험은 또한 진행성 고형 종양의 치료 목적으로 실시되었다 (Reilley, M., et al., Journal of Clinical Oncology, 2019. 37(15_suppl): p.TPS2669-TPS2669). 흥미롭게도, CpG-ODN 과 CPI 의 조합은 표준 치료에 저항성이 있는 환자에게 효과적임이 시사된다. 예를 들어, CpG-ODN 과 CPI 의 조합은 환자가 PD-1 항체와 같은 CPI 에 저항성이 있더라도 항-종양 활성을 나타낸다는 것이 보고된다 (Wang, S., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2016. 113(46): p.E7240-E7249). 세포독성 항체는 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC), 보체-의존적 세포성 세포독성 (CDC) 및 항체-의존적 세포성 식세포작용 (ADCP) 을 유도하는 약물이다. CpG-ODN 과 세포독성 항체의 조합 사용에 의한 상승작용적 효과가 보고되었다 (Hiramatsu, K., et al., Cancer Sci, 2015. 106(10): p.1474-8). 예를 들어, CpG-ODN 과 Rituxan (리툭시맙) 의 조합은 비-호지킨 림프종의 임상 실험에서 조사되었다 (Friedberg, J.W., et al., Blood, 2005. 105(2): p.489-95). 또한, CpG 올리고뉴클레오티드, 폴리 (I:C) 및 세포독성 항체의 조합은 환자가 Herceptin (트라스투주맙) 과 같은 세포독성 항체에 저항성이 있는 경우에도 항-종양 활성을 갖는 것으로 나타났다 (Charlebois, R., et al., Cancer Res, 2017. 77(2): p.312-319).

'(iii) 통상적인 화학요법' 과의 조합

통상적인 화학요법 약물은 빠르게 성장하는 종양 세포의 증식을 억제하고 이러한 세포를 사멸시키는 화학 물질로 만들어진다. 예를 들어, 백금계 약물, 탁산계 약물 및 CpG-ODN 의 조합이 임상 연구에서 조사되었다 (Krieg, A.M., J Clin Invest, 2007. 117(5): p.1184-94).

'(iv) 분자 표적화 약물' 과의 조합

통상적인 분자 표적화 약물은 일반적으로 특정 표적 분자에 결합하고 그 기능을 조절하는 소분자로 만들어진다. 표적화된 분자의 예는, 드라이버 돌연변이와 관련되거나 종양 세포의 항상성에 관여하는 발암성을 유발하는 것들이다. 예를 들어, 다발성 골수종에서 CpG 와 보르테조밉 사이의 상승작용은 전임상 설정에서 보고되었고, 이는 임상 단계에서 시험될 실행가능성의 기초를 구성하는 것으로 결론지어졌다 (Ray, A., et al., Leukemia, 2014. 28(8): p.1716-24).

(v) 외과적 치료 (방사선 치료요법, 냉동절제 및 고주파절제 포함) 와의 조합

외과적 절제 후 CpG-ODN 의 투여가 생존율을 개선시킨 것으로 보고되었다 (Weigel, B.J., et al., Clin Cancer Res, 2003. 9(8): p.3105-14). 방사선 치료요법은 증식하는 종양 세포의 DNA 를 손상시키고 이러한 세포를 방사선조사로 사멸시키는 치료이다. 냉동절제는 종양 세포를 동결하고 사멸시키는 치료이다. 고주파절제는 종양 세포를 무선주파수로부터 발생한 열로 응고시키고 이들 세포를 사멸시키는 치료이다. CpG-ODN 은 이러한 치료에 의해 사멸된 죽은 세포로부터 방출된 종양 항원에 대한 면역력을 유발하는데 효과적인 것으로 간주된다 (Jahrsdorfer, B. et al., G.J., Update Cancer Ther, 2008. 3(1): p.27-32).

'(vi) 사이토카인' 과의 조합

사이토카인의 예는 NK 세포 또는 수지상 세포를 활성화하는 IFN-α 및 IL-18 이다. IL-18 및 CpG-ODN 의 조합이 악성 B 세포의 세포자멸사를 유도하였고, 이들 B 세포가 그랜자임을 분비하였으며, 이는 이웃 악성 B 세포를 추가로 사멸시켰다는 것이 보고된다 (Jahrsdorfer, B. et al., Update Cancer Ther, 2008. 3(1): p.27-32).

'(vii) 입양 면역 세포 치료요법' 과의 조합

입양 면역 세포 치료요법은 생체외에서 변형된 면역 세포를 투여하는 치료요법의 일종이며; 이러한 치료요법의 예는 하기와 같다: 특정 암 항원에 대한 TCR 로 형질도입된 유전적으로 변형된 T 세포, 및 항-종양 효과를 갖도록 생체외 자극된, 환자 또는 공여자로부터의 TIL 또는 수지상 세포와 같은 면역 세포를 이용하는 CAR-T 치료요법 (Xu, L., et al., Clin Dev Immunol, 2010. 2010: p.410893).

'(viii) 핵산의 수용체에 대한 작용제' 와의 조합

TLR7/8 작용제와의 조합은 임상 실험에서 상승작용적 효과를 나타내는 것으로 보고되었다 (Shirota, H., et al., Vaccines (Basel), 2015. 3(2): p.390-407). TLR9 작용제, 예컨대 CpG 및 인터페론 유전자의 자극제 (STING) 작용제 사이의 상승작용적 효과는 또한 Th1-편향된 면역 반응, 예컨대 PBMC 에서의 항원-특이적 IgG 및 IFN-γ 생성 뿐만 아니라 세포독성 CD8(+) T-세포 반응을 향상시키는 것으로 보고된다 (Temizoz B., et al, Eur J Immunol, 2015, 45(4): p.1159-69).

<CpG 의 투여를 포함하는 조합 치료요법을 지지하는 메커니즘>

상기 기재된 치료 또는 약물 중 일부는 면역원성 세포 사멸 (ICD) 을 유도하는 것으로 나타났으며, CpG-ODN 과의 조합에 대해 조사되었다. ICD 는, ICD 에 의해 사멸된 세포 사체 또는 죽어가는 세포가 DAMP 의 분비에 의해 강력한 면역 반응을 유도하는 세포 사멸의 일종이며; DAMP 를 구성하는 분자는 예를 들어, 칼레티쿨린, 고이동성 그룹 박스 (HMGB), 열충격 단백질 또는 ATP 인 것으로 보고되었다. 이러한 DAMP 의 증가된 양의 제시가 통상의 세포 사멸과 비교하여 관찰되었다 (Bedognetti, D., et al., J Immunother Cancer, 2019. 7(1): p.131). 일부 화학요법 약물 및 일부 분자 표적화 약물은 ICD 의 유도제로서 공지되어 있으며; 이러한 ICD 유도제는 독소루비신, 미톡산트론, 옥살리플라틴 및 보르테조밉을 포함한다. 방사선 및 광역학요법 (PDT) 은 ICD 의 유도제로도 공지된다 (Galluzzi, L., et al., Nat Rev Immunol, 2017. 17(2): p.97-111).

Treg 를 억제 또는 사멸시키는 치료 또는 약물 중 일부는 상기 기재된 CpG-ODN 과의 조합에 대해 조사된다. 예를 들어, CpG-ODN 은 항-CD25 항체로 Treg 의 고갈 후 면역 반응을 상승작용적으로 향상시킨다 (Jarry, U., et al., J Neuroimmunol, 2014. 267(1-2): p.35-42).

결과적으로, CpG-ODN 은 하기의 약학적 목적을 위해 단독으로 또는 적어도 하나의 활성 성분과 조합으로 투여될 수 있다: (i) 암 (예를 들어, 전이성 고형 암, 흑색종, 피부 T-세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병 등) 및 감염성 질환을 포함하는 신생물을 예방 및 치료하기 위한 면역자극성 효과, (ii) 일부 유형의 자가면역 질환 및 알레르기 질환을 포함하는 Th2 또는 Th17-관련 질환과 같은 면역-매개 질환을 예방 또는 치료하기 위한 면역조절성 효과 및 (iii) 항암 약물 및 면역 세포에 대한 TLR7/9 를 발현하는 종양 세포의 반응성의 조절.

[선행기술문헌]

[특허문헌]

WO2014082254A

JP5011520B

WO2004016805A

[ 비특허문헌 ]

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본 발명은 신규한 TLR 작용제 및 이의 치료적 용도를 제공한다.

본 발명자들은 하기를 새로이 발견하였다:

(1) 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 대상체에서 면역력의 활성화 또는 조절을 위해 사용될 수 있음; 및

(2) 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 종양, 미생물 감염, 1차성 면역결핍 질환 및 Th2/Th17-관련 질환을 포함하는 질환을 앓고 있는 대상체의 치료 또는 이러한 질환의 예방에 특히 유용함.

본 발명은 하기 구현예를 포함한다:

(1) 서열 모티프 5'-tcgcaacgttt-3' (SEQ ID NO:1) 및 5'-cgacg-3' 를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드.

(2) 올리고뉴클레오티드가 뉴클레오티드 서열 모티프 5'-tcgcaacgttt-n-cgacg-n-cg-nn-cg-3' (SEQ ID NO:2) (여기서, n 은 임의의 염기를 나타냄) 을 포함하는, (1) 에 따른 올리고뉴클레오티드.

(3) 총 뉴클레오티드 수가 20 내지 25 개, 바람직하게는 21 내지 24 개, 보다 바람직하게는 22 내지 23 개인, (1) 또는 (2) 에 따른 올리고뉴클레오티드.

(4) 올리고뉴클레오티드가 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 서열 모티프를 포함하는, (1)-(3) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드:

(5) 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결(들) 이 부분적으로 또는 완전히 화학적으로 변형되는, (1)-(4) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드.

(6) 화학적으로 변형된 뉴클레오티드간 연결이 포스포로티오에이트화되는, (5) 에 따른 올리고뉴클레오티드.

(7) 올리고뉴클레오티드가 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 부분적으로 포스포로티오에이트화된 올리고뉴클레오티드 스트레치를 포함하는, (6) 에 따른 올리고뉴클레오티드:

여기서, 대문자는 3' 에서 변형된 뉴클레오티드간 연결을 갖지 않는 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 3' 에서 포스포로티오화를 갖는 뉴클레오티드간 연결을 갖는 뉴클레오시드를 나타낸다.

(8) 올리고뉴클레오티드가 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 부분적으로 포스포로티오에이트화된 올리고뉴클레오티드 스트레치를 포함하는, (6) 에 따른 올리고뉴클레오티드:

여기서, 대문자는 3' 에서 변형된 뉴클레오티드간 연결을 갖지 않는 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 3' 에서 포스포로티오화를 갖는 뉴클레오티드간 연결을 갖는 뉴클레오시드를 나타낸다.

(9) 올리고뉴클레오티드가 DNA 로 구성되는, (1) - (8) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드.

(10) 올리고뉴클레오티드에 있어서 하나 또는 여러 뉴클레오티드(들) 가 추가로 결실, 대체 또는 부가되는, (1) - (9) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드.

(11) 올리고뉴클레오티드가 발현 벡터 내에 포함되는, (1)-(10) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드.

(12) 올리고뉴클레오티드가 원형화되는, (1)-(10) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드.

(13) 올리고뉴클레오티드가 선형인, (1)-(10) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드.

(14) 선형 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 인산을 갖지 않는, (13) 에 따른 올리고뉴클레오티드.

(15) (1)-(10) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드 및 이의 상보적 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드.

(16) 활성 분자와 컨쥬게이션되는, (1)-(15) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드.

(17) 활성 분자가 (폴리)펩티드/항체 및 핵산/올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는, (16) 에 따른 올리고뉴클레오티드.

(18) 컨쥬게이션이 링커를 통해 이루어지는, (16) 또는 (17) 에 따른 올리고뉴클레오티드.

(19) 링커가 글리세롤, (S)-(-)-1,2,4-부탄트리올, 1,3,5-펜탄트리올, 시스,시스-1,3,5-시클로헥산트리올, 시스트랜스-1,3,5-시클로헥산트리올, 1,3,5-트리스-(2-히드록시에틸)이소시아누레이트, 테트라에틸렌글리콜, 및 헥사에틸렌글리콜, 디올 예컨대 1,3-프로판 디올 또는 도데칸-1,12-디올, 시클로헥산디올, 콜레스테롤, 니트로인돌, 트리에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜, d-스페이서, PEG-스페이서 및 알킬 링커로 이루어지는 군에서 선택되는, (18) 에 따른 올리고뉴클레오티드.

(20) 치료적 유효량의 (1)-(19) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.

(21) 치료적 유효량의 (1)-(19) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 표적 질환 또는 장애의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로서, 표적 질환 또는 장애가 신생물, 감염성 질환, Th2/Th17 과 관련된 질환, 1차성 면역결핍 질환 및 외상후 스트레스 장애 (PTSD) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.

(22) 표적 질환 또는 장애가 악성 신생물, 상피 신생물 또는 조혈 기관 종양, 육종, 중피종, 양성 종양, 이형성증 및 화생으로 이루어지는 군에서 선택되는 신생물인, (21) 에 따른 약학 조성물.

(23) 표적 질환 또는 장애가 바이러스, 박테리아 또는 진균을 포함하는 미생물에 의해 유발되는 감염성 질환인, (21) 에 따른 약학 조성물.

(24) 표적 질환 또는 장애가 천식, 아토피성 질환, 알레르기, 다발성 경화증, 궤양성 대장염 및 크론병을 포함하는 염증성 장 질환, 피부 편평태선 및 알츠하이머병으로 이루어지는 군에서 선택되는 Th2/Th17 에 관련된 질환인, (21) 에 따른 약학 조성물.

(25) 표적 질환 또는 장애가 IRAK4 결핍, MyD88 결핍, Unc93B 결핍 또는 TLR 에서의 돌연변이에 의해 유발되는 1차성 면역결핍 질환인, (21) 에 따른 약학 조성물.

(26) 적어도 하나의 활성 성분을 추가로 포함하는, (20) 또는 (21) 에 따른 약학 조성물.

(27) 적어도 하나의 활성 성분과 동시 투여되는, (20) 또는 (21) 에 따른 약학 조성물.

(28) 활성 성분이 항암 약물; 티로신 키나아제 억제제, 혈관형성 억제제 및 프로테아좀 억제제를 포함하는 분자 표적화 약물; 항암 항체 약물; 사이토카인; 백신; 항박테리아제; 항진균제; 항바이러스제; 항기생충 약물; 독소를 중화시키는 항체 약물; 다른 TLR 의 작용제 및 이의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는, (26) 또는 (27) 에 따른 약학 조성물.

(29) 장관 투여, 비경구 투여, 국소 투여 및 흡입으로 이루어지는 군에서 선택되는 투약 경로를 통해 대상체에게 투여되는, (20) 또는 (21) 에 따른 약학 조성물.

(30) 대상체가 인간인, (29) 에 따른 약학 조성물.

(31) 0.3-60 mg/일, 바람직하게는 1-30 mg/일, 보다 바람직하게는 2-8 mg/일로 대상체에게 투여되는, (30) 에 따른 약학 조성물.

(32) 방사선 요법, 냉동절제, 고주파절제 및 광역학요법 (PDT) 을 포함하는 외과적 치료 또는 입양 면역 세포 치료요법 전 또는 후에 투여되는, (20) 또는 (21) 에 따른 약학 조성물.

(A1) 신생물, 감염, Th2/Th17 과 관련된 질환, 1차성 면역결핍 질환 및 외상후 스트레스 장애 (PTSD) 로 이루어지는 군에서 선택되는 표적 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의 (1)-(19) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드의 용도.

(A2) 대상체에서의 면역 반응의 조절을 위한 약제의 제조에서의 (1)-(19) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드의 용도.

(A3) 표적 질환 또는 장애가 악성 신생물, 상피 신생물 또는 조혈 기관 종양, 육종, 중피종, 양성 종양, 이형성증 및 화생으로 이루어지는 군에서 선택되는 신생물인, (A1) 에 따른 용도.

(A4) 표적 질환 또는 장애가 바이러스, 박테리아 또는 진균을 포함하는 미생물에 의해 유발되는 감염성 질환인, (A1) 에 따른 용도.

(A5) 표적 질환 또는 장애가 천식, 아토피성 질환, 알레르기, 다발성 경화증, 궤양성 대장염 및 크론병을 포함하는 염증성 장 질환, 피부 편평태선 및 알츠하이머병으로 이루어지는 군에서 선택되는 Th2/Th17 에 관련된 질환인, (A1) 에 따른 용도.

(A6) 표적 질환 또는 장애가 IRAK4 결핍, MyD88 결핍, Unc93B 결핍 또는 TLR 에서의 돌연변이에 의해 유발되는 1차성 면역결핍 질환인, (A1) 에 따른 용도.

(A7) 약제가 적어도 하나의 활성 성분을 추가로 포함하는, (A1) 또는 (A2) 에 따른 용도.

(A8) 약제가 적어도 하나의 활성 성분과 동시 투여되는, (A1) 또는 (A2) 에 따른 용도.

(A9) 활성 성분이 항암 약물; 티로신 키나아제 억제제, 혈관형성 억제제 및 프로테아좀 억제제를 포함하는 분자 표적화 약물; 항암 항체 약물; 사이토카인; 백신; 항박테리아제; 항진균제; 항바이러스제; 항기생충 약물; 독소를 중화시키는 항체 약물; 다른 TLR 의 작용제 및 이의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는, (A7) 또는 (A8) 에 따른 용도.

(A10) 약제가 장관 투여, 비경구 투여, 국소 투여 및 흡입으로 이루어지는 군에서 선택되는 투약 경로를 통해 대상체에게 투여되는, (A1) 또는 (A2) 에 따른 용도.

(A11) 대상체가 인간인, (A10) 에 따른 용도.

(A12) 약제가 0.3-60 mg/일, 바람직하게는 1-30 mg/일, 보다 바람직하게는 2-8 mg/일로 대상체에게 투여되는, (A11) 에 따른 용도.

(A13) 약제가 방사선 요법, 냉동절제, 고주파절제 및 광역학요법 (PDT) 을 포함하는 외과적 치료 또는 입양 면역 세포 치료요법 전 또는 후에 투여되는, (A1) 또는 (A2) 에 따른 용도.

(B1) (1) - (19) 내지 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 표적 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 표적 질환 또는 장애가 신생물, 감염, Th2/Th17 과 관련된 질환, 1차성 면역결핍 질환 및 외상후 스트레스 장애 (PTSD) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나이고; 바람직하게는 표적 질환 또는 장애가 대상체에서 올리고뉴클레오티드로 NF-kB 를 활성화시켜 치료 또는 예방되는, 방법.

(B2) 표적 질환 또는 장애가 악성 신생물, 상피 신생물 또는 조혈 기관 종양, 육종, 중피종, 양성 종양, 이형성증 및 화생으로 이루어지는 군에서 선택되는 신생물인, (B1) 에 따른 방법.

(B3) 표적 질환 또는 장애가 바이러스, 박테리아 또는 진균을 포함하는 미생물에 의해 유발되는 감염성 질환인, (B1) 에 따른 방법.

(B4) 표적 질환 또는 장애가 천식, 아토피성 질환, 알레르기, 다발성 경화증, 궤양성 대장염 및 크론병을 포함하는 염증성 장 질환, 피부 편평태선 및 알츠하이머병으로 이루어지는 군에서 선택되는 Th2/Th17 에 관련된 질환인, (B1) 에 따른 방법.

(B5) 표적 질환 또는 장애가 IRAK4 결핍, MyD88 결핍, Unc93B 결핍 또는 TLR 에서의 돌연변이에 의해 유발되는 1차성 면역결핍 질환인, (B1) 에 따른 방법.

(B6) 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 활성 성분과 동시 투여되는, (B1) 에 따른 방법.

(B7) 활성 성분이 항암 약물; 티로신 키나아제 억제제, 혈관형성 억제제 및 프로테아좀 억제제를 포함하는 분자 표적화 약물; 항암 항체 약물; 사이토카인; 백신; 항박테리아제; 항진균제; 항바이러스제; 항기생충 약물; 독소를 중화시키는 항체 약물; 다른 TLR 의 작용제 및 이의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는, (B6) 에 따른 방법.

(B8) 올리고뉴클레오티드가 장관 투여, 비경구 투여, 국소 투여 및 흡입으로 이루어지는 군에서 선택되는 투약 경로를 통해 대상체에게 투여되는, (B1) 에 따른 방법.

(B9) 대상체가 인간인, (B8) 에 따른 방법.

(B10) 올리고뉴클레오티드가 0.3-60 mg/일, 바람직하게는 1-30 mg/일, 보다 바람직하게는 2-8 mg/일로 대상체에게 투여되는, (B9) 에 따른 방법.

(B11) 방사선 요법, 냉동절제, 고주파절제 및 광역학요법 (PDT) 을 포함하는 외과적 치료 또는 입양 면역 세포 치료요법의 단계를 추가로 포함하는, (B1) 에 따른 방법.

(C1) 치료적 유효량의 (1) - (19) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드를 대상체에게 투여하여 대상체에서 염증성 사이토카인을 유도하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.

(C2) 치료적 유효량의 (1) - (19) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드를 대상체에게 투여하여 대상체에서 염증성 사이토카인을 유도하는 것을 포함하는, 대상체에서 Th2-편향된 면역 반응을 Th1-편향된 면역 반응으로 재지향하는 방법.

(C3) 염증성 사이토카인이 IL-6, TNF-α, IFN-γ 및 IL-12 로 이루어지는 군에서 선택되는, (C1) 또는 (C2) 에 따른 방법.

(D1) 표적 질환 또는 장애의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 (1) - (19) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드로서, 표적 질환 또는 장애가 신생물, 감염성 질환, Th2/Th17 과 관련된 질환, 1차성 면역결핍 질환 및 외상후 스트레스 장애 (PTSD) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인, 올리고뉴클레오티드.

(D2) 표적 질환 또는 장애가 악성 신생물, 상피 신생물 또는 조혈 기관 종양, 육종, 중피종, 양성 종양, 이형성증 및 화생으로 이루어지는 군에서 선택되는 신생물인, (D1) 에 따른 올리고뉴클레오티드.

(D3) 표적 질환 또는 장애가 바이러스, 박테리아 또는 진균을 포함하는 미생물에 의해 유발되는 감염성 질환인, (D1) 에 따른 올리고뉴클레오티드.

(D4) 표적 질환 또는 장애가 천식, 아토피성 질환, 알레르기, 다발성 경화증, 궤양성 대장염 및 크론병을 포함하는 염증성 장 질환, 피부 편평태선 및 알츠하이머병으로 이루어지는 군에서 선택되는 Th2/Th17 에 관련된 질환인, (D1) 에 따른 올리고뉴클레오티드.

(D5) 표적 질환 또는 장애가 IRAK4 결핍, MyD88 결핍, Unc93B 결핍 또는 TLR 에서의 돌연변이에 의해 유발되는 1차성 면역결핍 질환인, (D1) 에 따른 올리고뉴클레오티드.

(D6) 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 활성 성분과 동시 투여되는, (D1) 에 따른 올리고뉴클레오티드.

(D7) 활성 성분이 티로신 키나아제 억제제, 혈관형성 억제제, 프로테아좀 억제제, 항암 항체 약물 및 사이토카인을 포함하는 분자 표적화 약물 및 이의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는, (D6) 에 따른 올리고뉴클레오티드.

(D8) 올리고뉴클레오티드가 장관 투여, 비경구 투여, 국소 투여 및 흡입으로 이루어지는 군에서 선택되는 투약 경로를 통해 대상체에게 투여되는, (D1) 에 따른 올리고뉴클레오티드.

(D9) 대상체가 인간인, (D8) 에 따른 올리고뉴클레오티드.

(D10) 올리고뉴클레오티드가 0.3-60 mg/일, 바람직하게는 1-30 mg/일, 보다 바람직하게는 2-8 mg/일로 대상체에게 투여되는, (D9) 에 따른 올리고뉴클레오티드.

(D11) 올리고뉴클레오티드가 방사선 요법, 냉동절제, 고주파절제 및 광역학요법 (PDT) 을 포함하는 외과적 치료 또는 입양 면역 세포 치료요법 전 또는 후에 투여되는, (D1) 에 따른 올리고뉴클레오티드.

(E1) 신생물, 감염, Th2/Th17 과 관련된 질환, 1차성 면역결핍 질환 및 외상후 스트레스 장애 (PTSD) 로 이루어지는 군에서 선택되는 표적 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한, (1) - (19) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드의 용도.

(F1) 유효량의 (1) - (19) 중 어느 하나에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 면역 반응의 조절을 위한 생체내 또는 시험관내 제제.

본 발명은 신규한 CpG 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드의 치료적 용도를 제공할 수 있다.

[도 1] 인간 형질세포양 수지상 세포 (pDC) 세포주에서 TLR 작용제에 의한 NF-kB 활성화 및 전염증성 사이토카인의 생성
CAL-1/NF-kB-GFP 세포주는 세포-기반 어세이에서 NF-kB 전사 인자의 활성을 모니터링하기 위해 설계되었다. NF-kB 컨센서스 전사 반응 요소에 의해 구동된 GFP 리포터 유전자를 인코딩하는 벡터를 인간 pDC 세포주, CAL-1 에 형질감염시켰다.
A. CAL-1/NF-kB-GFP 세포를 6 시간 동안 1 μM (마이크로몰) 에서 본 발명의 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN) 또는 양성 대조군으로 자극하였다. TLR9 작용제에 의해 유도된 GFP 발현을 도트 플롯에 의해 나타내었다.
B. ODN 에 의해 TLR9 로 활성화된 CAL-1/NF-kB-GFP 세포의 비율을 나타내는 그래프. CAL-1/NF-kB-GFP 세포를 6 시간 동안 0.3 μM 에서 본 발명의 ODN 또는 양성 대조군으로 자극하였다. CpG2395 를 갖는 샘플에서 GFP 양성 세포의 비율을 100% 로 설정하였다. 각각의 ODN 의 활성을 GFP 양성 세포와 CpG2395 중 하나의 비율을 비교하여 계산하였다.
C. CAL-1/NF-kB-GFP 세포를 6 시간 동안 1.0 μM 에서 본 발명의 ODN 으로 자극하였다. A003#delA 의 활성은 A003 과 비교하여 약간 더 약했으나, 진본 TLR9 작용제 중 하나, CpG2395 보다 훨씬 더 강했다 (도 1A 참조). A003#endG 및 A003 의 TLR9 활성화 활성은 유사한 수준이었으며, 이는 3' 에서의 뉴클레오시드가 활성에 중요하지 않다는 것을 나타낸다.
D. CAL-1/NF-kB-GFP 세포를 6 시간 동안 1 μM 에서 ODN 으로 자극하고, 배양 상청액을 회수하였다. 사이토카인 생성을 ELISA 에 의해 평가하였다.
E, F. CAL-1/NF-kB-GFP 세포를 6 시간 동안 1.0 μM 에서 ODN 으로 자극하였다. GFP 발현을 조사하고 (도 1E), 배양 상청액에서의 사이토카인 생성을 ELISA 에 의해 평가하였다 (도 1F). A003 및 A013 의 활성은 서로 비교하여 거의 동일한 수준이었으며, 이는 올리고뉴클레오티드에서의 염기 변화가 활성에 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다.
G. CAL-1/NF-kB-GFP 세포를 6 시간 동안 1.0 μM 에서 ODN 으로 자극하고, GFP 발현을 조사하였다. A001/A011, A002/A012, A003/A013 또는 A004/A014 의 각각의 세트는 서로 동일한 활성을 나타내었으며, 이는 ODN 의 각각의 세트에서의 염기 변화가 활성에 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다.
[도 2] 인간 TLR7 및 TLR8 활성화
A. HEK blue^TM TLR7 세포를 24 시간 동안 TLR 작용제로 자극하였다. 나타낸 바와 같이, TLR7 작용제 가르디퀴모드 (GQ) 및 CL264 는 TLR7 을 활성화시키고 양성 신호를 제공하였다. 반대로, 0.3 μM 에서, 진본 TLR9 작용제, CpG2395, 및 본 발명의 ODN, A001 - A004 는 TLR7 신호전달 경로를 활성화시킬 수 없었다.
B. HEK blue^TM TLR8 세포를 24 시간 동안 ODN 으로 자극하였다. 도면에서 나타낸 바와 같이, TLR8 작용제, TL8-506 및 CL075 는 TLR8 을 활성화시키고 양성 신호를 제공하였다. 반대로, CpG2395, 및 A001 - A004 (0.3 μM) 는 TLR8 신호전달 경로를 활성화시킬 수 없었다.
[도 3] NF-kB 활성화 및 전염증성 사이토카인의 생성
A. CAL-1/NF-kB-GFP 세포를 6 시간 동안 0.3 μM 에서 본 발명의 ODN 으로 자극하였다. CaaCg 는 인간 TLR9 활성화에 중요하다.
B. CAL-1/NF-kB-GFP 세포를 6 시간 동안 0.3 μM 또는 0.1 μM 에서 본 발명의 ODN 으로 자극하였다. GFP 양성 세포의 비율 (% 로 나타냄) 을 나타낸다.
C. CAL-1/NF-kB-GFP 세포를 6 시간 동안 0.3 μM 또는 0.1 μM 에서 본 발명의 ODN 으로 자극하였다. A303, A603 및 A703 은 다른 시험한 ODN 보다 더 높은 활성을 나타내었으며, 이는 CaaCg 의 존재가 Cg 의 수보다 더 중요하다는 것을 시사한다.
D. CAL-1/NF-kB-GFP 세포를 6 시간 동안 0.3 μM 에서 ODN 으로 자극하고, 배양 상청액을 회수하였다. 사이토카인 생성을 ELISA 에 의해 평가하였다. A403 및 A503 은 사이토카인 생성의 더 낮은 수준의 유도성 활성을 명백히 나타내었으며, 이는 CaaCg 가 최적의 TLR9 자극에 중요하다는 것을 시사한다.
E. CAL-1/NF-kB-GFP 세포를 6 시간 동안 0.3 μM 에서 본 발명의 ODN 으로 자극하였다. CpG2395 의 GFP 양성 세포 비율을 도면에서 100% 인 것으로 설정하였다. 각각의 ODN 의 활성을 CpG2395 중 하나와 비교하여 GFP 양성 세포 비율로부터 계산하였다. DV093 및 DV094 는 A003 보다 더 낮은 TLR9 활성을 나타내었으며, 이는 무작위 위치에서의 caacg 모티프가 아니라 A003 에서 국재화된 특이적 caacg 모티프가 TLR9 활성에 중요하다는 것을 시사한다.
F. CAL-1/NF-kB-GFP 세포를 6 시간 동안 0.3 μM 에서 ODN 으로 자극하였다. CpG2395 의 GFP 양성 세포 비율을 100% 인 것으로 설정하였다. 각각의 ODN 의 활성을 CpG2395 중 하나와 비교하여 GFP 양성 세포 비율로부터 계산하였다. 뉴클레오티드간 연결의 변화에 의한 DV093 및 DV094 에서의 caacg 스트레치로부터 CaaCg 스트레치로의 구조적 변화가 TLR9 활성을 강화시키지 않는다는 것에 유의한다.
[도 4] 본 발명의 ODN 의 3' 부위에서의 불필요한 뉴클레오티드
A, B. CAL-1/NF-kB-GFP 세포를 6 시간 동안 0.3 μM 에서 ODN 으로 자극하였다. GFP 양성 세포의 비율 (%) 을 (B) 에서 나타내었다. 진본 TLR9 작용제 CpG2006 는 A601, A602, A603, A604, A605, A606 및 A607 (B) 과 비교하여 훨씬 더 약한 활성을 나타내었다.
[도 5] 인간 TLR7 및 TLR8 활성화
A. HEK blue^TM TLR7 세포를 24 시간 동안 ODN 또는 양성 대조군으로 자극하였다. TLR7 작용제 CL264 는 TLR7 을 활성화시키고 양성 신호를 제공하였다. 반대로, CpG2395, A601, A602 및 A603 (0.3 μM) 은 TLR7 신호전달 경로를 활성화시킬 수 없었다.
B. HEK blue^TM TLR8 세포를 24 시간 동안 ODN 또는 양성 대조군으로 자극하였다. TLR8 작용제 CL075 는 TLR8 을 활성화시키고 양성 신호를 제공하였다. 반대로, CpG2395, A601, A602 및 A603 (0.3 μM) 은 TLR8 신호전달 경로를 활성화시킬 수 없었다.
[도 6] ODN 중간에서의 염기 변화 및 뉴클레오티드간 연결에서의 변화에 의한 TLR9 활성화 활성에 대한 무시할만한 효과
A. CAL-1/NF-kB-GFP 세포를 3 시간 동안 A601, A601G, A602 또는 A602G (0.3 μM) 로 자극하였다.
B. CAL-1/NF-kB-GFP 세포를 3 시간 동안 A601G, A611A, A602G 또는 A612A (0.3 μM) 로 자극하였다.
C. CAL-1/NF-kB-GFP 세포를 3 시간 동안 0.3 μM 에서 ODN 으로 자극하였다. GFP 양성 세포의 비율 (%) 을 나타내었다.
[도 7] 인간 TLR7 및 TLR8 활성화
A. HEK blue^TM TLR7 세포를 24 시간 동안 TLR 작용제로 자극하였다. TLR7 작용제 CL264 는 TLR7 을 활성화시키고 양성 신호를 제공하였다. 반대로, CpG2395, A601G, A611A, A602G 및 A612A (0.3 μM) 는 TLR7 신호전달 경로를 활성화시킬 수 없었다.
B. HEK blue^TM TLR8 세포를 24 시간 동안 TLR 작용제로 자극하였다. TLR8 작용제 CL075 는 TLR8 을 활성화시키고 양성 신호를 제공하였다. 반대로, CpG2395, A601G, A611A, A602G 및 A612A (0.3 μM) 는 TLR8 신호전달 경로를 활성화시킬 수 없었다.
[도 8] 인간 B 세포 또는 인간 PBMC 에서 사이토카인 생성을 유도하는 활성
A. HAL-01 세포를 24 시간 동안 1 μM 에서 본 발명의 ODN 으로 자극하였다. 세포를 항-CD40 항체 (Ab) 및 항-CD86 Ab 로 염색하였다. CD40 및 CD86 발현의 유도를 유세포 분석기로 평가하였다.
B. 인간 PBMC 를 24 시간 동안 본 발명의 ODN (0.1 μM) 으로 자극하고, 세포 증식을 WST-1 어세이로 평가하였다.
C. 인간 PBMC 를 24 시간 동안 본 발명의 ODN (0.3 μM) 으로 자극하고, 배양 상청액을 회수하였다. 사이토카인 생성을 ELISA 로 평가하였다.
[도 9] 마우스 세포에 대한 작용제 활성
A. 마우스 비장세포를 24 시간 동안 본 발명의 ODN 으로 자극하고, 상청액을 회수하였다. 사이토카인 생성을 ELISA 로 평가하였다.
B, C. 마우스 비장세포를 48 시간 동안 본 발명의 ODN 으로 자극하였다. 세포 증식을 WST-1 어세이로 평가하였다. A601, A602 및 A603 은 진본 TLR9 작용제, CpG2395 및 CpG2006 보다 더 강력한 활성을 나타내었다.
[도 10] 생체내 항종양 활성
A. CT26 세포를 우측 옆구리에 접종하고, 마우스를 2 주 동안 미처리 상태로 유지하였다. 종양 부피를 측정하고, 마우스를 종양 부피를 기준으로 3 개 군으로 나누었다. 본 발명의 ODN 또는 PBS 를 종양부근 부위에 투여하는 것을 그룹화 일 (제 0 일) 에 실시하고, 제 2 일에 반복하였다. 본 발명의 ODN 을 연구 동안 총 2 회 투여하였다. 각각의 군 마우스의 종양 부피를 2 일마다 측정하였다.
B. 매일 각각의 마우스의 종양 부피.
C. 연구 동안 각각의 군에서의 마우스 체중의 평균값. 모든 군에서 심각한 체중 손실은 관찰되지 않았다.
[도 11] 항종양 면역력의 기억 유도
A. CT26 세포를 우측 옆구리에 접종하고, 마우스를 2 주 동안 미처리 상태로 유지하였다. 종양 부피를 측정하고, 마우스를 종양 부피를 기준으로 3 개 군으로 나누었다. 본 발명의 ODN 또는 PBS 를 투여하는 것을 그룹화 일 (제 0 일) 에 시작하고, 제 2 일에 반복하였다. 본 발명의 ODN 을 연구 동안 총 2 회 투여하였다. 각각의 군 마우스의 종양 부피를 2 일마다 측정하였다.
B. CT26 세포를 제 14 일에 각각의 군 마우스의 좌측 옆구리에 재접종한 다음, 마우스를 미처리 상태로 유지하였다. CT26 재접종 후 14 일까지 좌측 옆구리에서 종양 부피를 측정하였다. 본 발명의 ODN 으로 처리된 마우스는 2 주 동안 어떤 추가 치료도 없이 재챌린지된 종양을 거부하였으며, 이는 본 발명의 ODN 이 항암 면역력의 기억을 유도하였다는 것을 나타낸다는 것에 유의한다.
[도 12] 폐 전이 모델에서의 생체내 효능
CT26 세포의 폐 전이를 유도하기 위해, 세포 현탁액을 꼬리 정맥으로부터 BALB/c 마우스에 정맥내 주사하였다 (5x10⁵ 세포/마우스) (제 0 일). 제 1 일에, 본 발명의 ODN 의 투여를 시작하였다 (등 표면에 피하 주사, 40 μg/50 μl/마우스). 동일 용량의 ODN 을 제 5 일에 재투여하였다. 제 18 일에, 마우스를 희생시켰다. 폐 중량을 측정하고, 마우스로부터의 각각의 폐에서의 전이성 종양 결절을 계수하였다.
[도 13] 종양 전이에 대한 전신 효과
A. CT26 세포의 폐 전이를 유도하기 위해, 세포 현탁액을 꼬리 정맥으로부터 BALB/c 마우스에 정맥내 주사하였다 (5x10⁵ 세포/마우스) (제 0 일). 종양 접종 다음 날 (제 1 일), A602 의 투여를 시작하였다. 2 가지 투여 경로를 시험하였다. 하나는 등의 피부에 대한 피하 (S.C.) 주사이고, 다른 것은 귀 뿌리 내로의 피내 (I.D.) 주사이다 (25 μg/마우스). 동일 용량의 투여를 제 3 일 및 제 5 일에 실시하였다. 제 16 일에, 마우스를 희생시키고 마우스로부터의 각각의 폐에서의 전이성 종양 결절을 계수하였다 (우측 그래프). 사진: 제 16 일에 시험한 마우스의 단리된 폐.
B. CT26 세포의 간 전이를 유도하기 위해, 세포 현탁액을 비장에 주사하였다 (1x10⁵ 세포/마우스, 제 0 일). 제 2 일에, 마우스를 체중을 기준으로 3 개 군으로 나누고, A602 의 투여를 시작하였다. 2 가지 투여 경로, 등 피부로의 S.C. 주사 및 귀 뿌리 내로의 I.D. 주사 (12.5 μg/마우스) 를 이 연구에서 시험하였다. 동일 용량의 투여를 또한 제 5 일, 제 8 일 및 제 12 일에 실시하였다. 제 20 일에, 마우스를 희생시키고 마우스로부터의 각각의 간에서의 전이성 종양 결절을 계수하였다.
[도 14] 활성화된 PBMC 에 의한 B-ALL 세포의 제거
A. 인간 PBMC 를 3 일 동안 본 발명의 ODN (0.1 μM) 과 함께 인간 B-ALL 세포, RCH-ACV 와 공동 배양하고, 전체 세포를 CD19 및 CD138 항체로 염색한 후 유세포 분석에 의해 분석하였다.
B. 100% 로 설정한 비-자극 샘플과 비교하여 샘플 중 RCH-ACV 집단의 비율을 도시한다.
[도 15] 활성화된 PBMC 에 의한 결장 암종 세포의 제거
A. 인간 PBMC (5x10⁵) 를 3 일 동안 본 발명의 ODN (0.1 μM) 과 함께 인간 결장 암종 세포, COLO205 와 공동 배양하고, 전체 세포를 CD45 및 CD24 항체로의 염색에 의해 분석하였다.
B. 100% 로 설정한 비-자극 샘플과 비교하여 샘플 중 COLO205 집단의 비율을 도시한다.
[도 16] 면역 세포에 대한 효과
A. 인간 PBMC 및 마우스 비장세포를 24 시간 동안 본 발명의 ODN (0.15 μM) 으로 자극하고, 세포 증식을 WST-1 어세이로 평가하였다.
B. 인간 PBMC 를 3 일 동안 본 발명의 ODN (0.1 μM) 과 함께 암 세포 (RCH-ACV 또는 COLO205) 와 공동 배양하였다. 인간 PBMC 에 의한 암 세포의 제거를 평가하였다. 100% 로 설정한 비-자극 샘플과 비교하여 샘플 중 암 세포의 비율을 도시한다.

바람직한 구현예

달리 표기되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 모든 용어는, 본 개시물이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 단수형 표현은 문맥이 달리 나타내지 않는 한, 복수형 지시 대상을 포함한다. 유사하게, 단어 "또는" 은 문맥이 달리 나타내지 않는 한, "및" 을 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 용어 "소수의" 는 2 내지 3 의 숫자를 의미한다. 본 명세서에서 용어 "여러" 는 2 내지 6 의 숫자를 의미한다. 분쟁의 경우에, 용어의 설명을 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 예는 단지 예시적일 뿐 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 치료하다, 치료하는 또는 치료는 문법에 관계없이 동일한 의미를 갖는다. 유사하게, 예방하다, 예방하는 또는 예방은 문법에 관계없이 동일한 의미를 갖는다.

"뉴클레오티드": 뉴클레오티드는 DNA, RNA 및 DNA 와 RNA 의 키메라 분자와 같은 핵산 분자를 구성한다. 뉴클레오티드는 염기, 인산 및 당으로 이루어질 수 있다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 포스페이트 에스테르일 수 있다.

"뉴클레오시드": 뉴클레오시드는 염기 및 당의 분자로 이루어질 수 있으며, 뉴클레오티드의 성분이다. 뉴클레오시드는 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 데옥시시티딘, 아데노신, 구아노신, 우리딘 및 시티딘을 포함할 수 있다.

"올리고뉴클레오티드": 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드간 연결로 연결되는 뉴클레오티드의 중합체/올리고머이다. 올리고뉴클레오티드의 형태는 선형 또는 원형일 수 있다.

"염기": 염기는 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드의 성분 중 하나이다. 천연 염기는 2 개의 기, 구아닌 및 아데닌과 같은 퓨린 염기, 및 티민, 시토신 및 우라실과 같은 피리미딘 염기를 포함한다.

"당": 당은 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드의 성분 중 하나이다. 기본적으로 DNA 에 포함된 당은 데옥시리보오스이고, RNA 에 포함된 당은 리보오스이다.

"뉴클레오티드간 연결": 뉴클레오티드간 연결은 핵산 분자의 2 개의 인접 뉴클레오티드 사이의 연결을 의미한다.

뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 염기 및 당의 일부는 이들의 유사체로 지칭되는 또 다른 분자로 치환 또는 변형될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드는 PNA 와 같은 비천연 인공 뉴클레오티드를 더 포함할 수 있고; 염기는 하이포크산틴 (즉, 뉴클레오시드로서 이노신) 과 같은 비천연 염기를 더 포함할 수 있고; 당은 잠금 핵산에 2'-4' 브릿지와 같은 비천연 인공물을 포함할 수 있다.

본 출원에서, "(서열) 모티프" 는 "염기" 만을 기준으로 규정되고, "(서열) 스트레치" 는 "염기", "당" 및 "뉴클레오티드간 연결" 을 기준으로 규정된다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 데옥시리보오스 백본을 갖는 데옥시리보핵산, 리보오스 백본을 갖는 리보핵산 또는 이들의 혼합물로 구성될 수 있고; 당 백본은 또한 합성 분자, 예컨대 잠금 핵산 (LNA), 가교 핵산 (BNA), 모르폴리노 또는 펩티드 핵산 (PNA) 으로 대체될 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 변형된 뉴클레오시드 및/또는 변형된 뉴클레오티드간 연결을 포함하여 하나 이상의 특성, 예컨대 뉴클레아제 저항성, 또는 약동학을 향상시킬 수 있다.

화학적으로 변형된 뉴클레오시드는 하기와 같은 변형된 염기 또는 관련 구조를 갖는 것들을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다:

8-할로겐 (브로모, 클로로, 플루오로, 요오도)-, 8-아미노-, 8-티올-, 8-티오알킬-, 8-히드록실-, 8-아자-, 8-옥소- 및 다른 8-치환된 퓨린;

5-할로겐 (브로모, 클로로, 플루오로, 요오도)-, 5-디플루오로메틸-, 5-트리플루오로메틸-, 5-히드록시, 5-카르복시-, 5-히드록시메틸-, 5-브로모비닐-, 5-포르밀-, 5-아자-, 5-알키닐-5-프로피닐-, 5-(C1-C6)-알킬-, 5-(C2-C6)-알케닐-, 5-(C2-C6)-알키닐-, 및 다른 5-치환된 피리미딘;

5,6-디히드록시-5,6-디히드로티민, N6-메틸-아데닌; N4-에틸시토신, N4-알킬시토신 및 다른 N4-치환된 시토신;

2-머캅토-시토신, 이소-시토신, 슈도-이소시토신, 4-티오-우라실, 디히드로우라실, 슈도우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 2,4-디아미노퓨린, 6-티오구아닌, N2-메틸-구아닌, N2-디메틸구아닌 및 다른 N2-치환된 구아닌.

변형된 핵염기는 또한 다른 헤테로사이클, 예를 들어 7-데아자-아데닌, 8-아자-7-데아자-아데닌, 7-데아자-구아닌, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 대체되는 염기일 수 있다.

변형된 핵염기는 또한 추가적인 융합 고리를 포함할 수 있으며 이러한 핵염기의 예는 N6-에테노아데노신, N4-에테노시티딘, N2-에테노구아노신 및 다른 관련 유도체이다.

뉴클레오티드간 연결은 올리고/폴리 뉴클레오티드에서 뉴클레오티드 사이의 공유 백본 연결이다. 전형적으로, 천연 뉴클레오티드간 연결은 포스포디에스테르 구조이지만, 다양한 변형이 분자의 화학적 또는 물리적 특성에 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드에서 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드간 연결에서의 화학적 변형은 천연 포스포디에스테르 구조의 하기 결합 구조로의 전환을 포함한다: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 메틸포스포로티오에이트, 에틸포스페이트, 포스포노아세테이트, 알파-히드록시벤질포스페이트, 이소프로필-페녹시아세테이트, 보라노포스페이트, 포스포노카르복실레이트, 알파-히드록시벤질 포스포네이트, 포스페이트-(C1-C21)-O-알킬에스테르, 포스페이트-[(C6-C12)아릴-(C1-C21)-O-알킬]에스테르, 포스포트리에스테르, 포스포트리에스테르아미드, 에테르, 아세탈, 티오에테르, 티오아세탈, 포스포르아미데이트, 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸에스테르, 아세트아미데이트, 카르바메이트, 우레아, 티오우레아, 술폰아미드, 또는 술포닐 우레아, 카르보네이트, 카르복시메틸, 아미드, 에틸렌 옥시드 링커, 술포네이트, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌아미노카르보닐, 메틸렌메틸이미노 (MMI), 메틸렌히드라조, 메틸렌디메틸히드라조 (MDH), 및 메틸렌옥시메틸이미노.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 데옥시리보핵산, 단일 가닥 리보핵산 또는 이의 키메라 분자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 단일 및 이중 가닥의 하이브리드일 수 있다. 이들은 또한 단일 분자의 5' 및 3' 말단을 연결함으로써 원형 구조를 형성할 수 있다; 본 발명의 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 공유 결합에 의해 또는 5' 또는 3' 말단에서 독특한 링커를 통해 연결되어 나란히 연결된 긴 구조 또는 다가 구조를 형성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 분자간 또는 분자내 어닐링되어 긴 구조, 다량체 구조, 또는 연쇄동일서열을 형성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 다량체를 형성하기 위해 다른 분자에 결합될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 다른 올리고뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터를 포함하는 발현 벡터에 포함될 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 CpG 모티프, 즉 비메틸화 디뉴클레오티드, 시토신 및 구아닌을 포함할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 공통 서열 모티프, tcgcaacgttt (SEQ ID NO:1) 및 cgacg, 바람직하게는, tcgcaacgttt-n-cgacg-n-cg-nn-cg (SEQ ID NO:2), 또는 보다 바람직하게는, tcgcaacgttt-r-cgacg-k-cg-bd-cg (SEQ ID NO:3) 를 포함할 수 있고; 여기서 각각의 a, t, c 또는 g 는 각각 아데닌, 티민/우라실, 시토신 또는 구아닌에 상응하는 염기를 나타내고; n 은 임의의 염기를 나타내고; r 은 아데닌 또는 구아닌을 나타내고; k 는 구아닌 또는 티민/우라실을 각각 나타내고; b 는 시토신, 구아닌 또는 티민/우라실을 나타내고; d 는 아데닌, 구아닌 또는 티민/우라실을 나타낸다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 모티프의 3' 에서 r (아데닌 또는 구아닌) 을 가져, tcgcaacgttt-r-cgacg-k-cg-b n-cg-r (SEQ ID NO:4) 을 형성할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트화 뉴클레오티드간 연결을 포함할 수 있다. 각각의 포스포로티오에이트화 뉴클레오티드간 연결은 입체발생 α-인 원자를 포함하여, R 또는 S 부분입체이성질체를 생성할 수 있다.

포스포로티오에이트화 뉴클레오티드간 연결은 또한 포스포로디티오에이트 구조를 포함할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 부분적으로 포스포로티오에이트화 또는 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드의 5' 부위에 특징적인 부분적으로 포스포로티오에이트화된 스트레치, CaaCg 를 포함하는데, 여기서 대문자는 비천연 화학적 변형이 없는 포스포디에스테르 연결과 같은 안정화되지 않은 3' 뉴클레오티드간 연결을 갖는 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 포스포로티오에이트 연결과 같은 안정화된 구조인 3' 뉴클레오티드간 연결을 갖는 뉴클레오시드를 나타낸다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드의 부분적으로 포스포로티오에이트화된 버전은 바람직하게는 부분적으로 포스포로티오에이트화된 스트레치 예컨대 tCgCaaCgttt-n-cgacg-n-Cg-nn-C-g (SEQ ID NO:5) 를 포함할 수 있으며, 여기서 소문자는 포스포로티오에이트 연결과 같은 안정화된 구조인 3' 뉴클레오티드간 연결을 갖는 뉴클레오시드를 나타낸다.

상기 언급된 모티프 또는 스트레치는 동일한 올리고뉴클레오티드에 일렬로 위치되어야 한다; 모티프는 뉴클레오티드(들) 의 삽입/삽입들에 의해 중간에 분리될 수 있으나, 각각의 위치에 삽입된 뉴클레오티드(들) 는 바람직하게는 1 또는 2 이다. 상기 언급된 모티프는 돌연변이될 수 있으나, 각각의 모티프에서 돌연변이된 뉴클레오티드(들) 는 바람직하게는 1 또는 2 이다. 모티프는 최대 2 개 염기까지 말단에서 부분적으로 결실될 수 있다.

한 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표 1 에서 나타낸 하기 서열 모티프를 갖는 올리고뉴클레오티드에서 선택될 수 있으며, 여기서 뉴클레오티드간 연결은 천연 (예를 들어, 포스포디에스테르) 또는 합성 (예를 들어, 포스포로티오화) 또는 그의 혼합에서 선택될 수 있다.

[표 1]

또 다른 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드간 연결에서 완전히 포스포로티오에이트화될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 예를 하기와 같이 표 2 에서 나타낸다:

[표 2]

상기 서열에서 대문자는 3' 뉴클레오티드간 연결로서 포스포디에스테르 결합을 갖는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 3' 뉴클레오티드간 연결에서 포스포로티오화를 갖는 뉴클레오시드를 나타낸다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드간 연결에서 부분적으로 포스포로티오에이트화될 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 서열 모티프 caacg, 바람직하게는 부분적으로 포스포로티오에이트화된 스트레치, caaCg, Caacg 또는 CaaCg, 보다 바람직하게는 부분적으로 포스포로티오에이트화된 스트레치, CaaCg 를 포함할 수 있다.

이러한 올리고뉴클레오티드의 예를 하기와 같이 표 3 에서 나타낸다:

[표 3]

상기 서열에서 대문자는 3' 뉴클레오티드간 연결로서 포스포디에스테르 결합을 갖는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자는 3' 뉴클레오티드간 연결에서 포스포로티오화를 갖는 뉴클레오시드를 나타낸다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 TLR9 에 결합할 수 있으며 수용체의 다운스트림의 신호 전달을 향상시키는 활성을 가질 수 있다.

TLR9 활성화 활성은 하기 현상에 의해 대용물로서 평가될 수 있으나, 이들에 제한되지 않는다 (WO2014082254A, JP5011520B):

(i) CAL-1/NF-kB-GFP 와 같은 세포에서 프로모터에 의해 구동된 GFP 발현의 수준으로서 기술된 NF-kB 결합 올리고뉴클레오티드의 프로모터 활성의 강도;

(ii) 표적 세포로부터의 사이토카인 생성 수준; 및

(iii) 항원-제시 세포와 같은 표적 세포에서 CD40, CD80 또는 CD86 을 포함하는 공동-자극 분자와 같은 마커 단백질의 발현 수준.

상기 언급된 대리 표시제의 강화에 의해 표적 세포의 활성화가 평가될 수 있다. 이러한 마커의 강화는 리간드의 첨가를 포함하는 자극을 활성화시키지 않는 상태 또는 정상 상태와 비교하여 수준의 증가에 의해 조사될 것이다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드의 이러한 활성은 말초 혈액 단핵세포 (PBMC) 또는 확립되고 불멸화된 세포주와 같은 배양된 세포에서 분석될 수 있다. 이러한 세포주는 HAL-1, 및 RCH-ACV 를 (B 세포 대신에), CAL-1 (Maeda, T., et al., Int J Hematol, 2005. 81(2): p.148-54), Gen2.2/Gen3 (Di Domizio, J., et al., Blood, 2009. 114(9): p.1794-802) 또는 PMDC05 를 (형질세포양 수지상 세포 대신에) (Narita, M., et al., Acta Haematol, 2008. 120(2): p.91-9) 포함한다.

<표적 질환>

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 면역 반응과 관련된 표적 질환 또는 장애의 예방 또는 치료요법, 또는 대상체에서 면역 반응의 조절에 적용될 수 있다. 표적 질환 또는 장애의 예는 신생물, 감염성 질환, Th2 또는 Th17 의 활성화시 발생하는 질환을 포함하는 Th2 또는 Th17-관련 질환, 1차성 면역결핍 질환, 또는 외상후 스트레스 장애 (PTSD) 이다.

상기 신생물은 (악성) 종양, 예컨대 암종 (악성 신생물, 상피 신생물, 상피내 신생물 및 혈액 종양), 육종 및 중피종, 양성 종양, 이형성증, 및 화생을 포함한다. 상기 악성 종양은 암 예컨대 폐암 (소세포 폐암 및 비소세포 폐암), 결장암, 직장암, 위암, 식도암, 췌장암, 간암, 담도암, 담관암, 신장암, 신우요관암, 부신암, 방광암, 고환암, 전립선암, 음경암, 갑상선암, 자궁암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 흑색종, 편평세포암, 신경모세포종, 구강암, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 만성 골수성 백혈병, 악성 림프종, 및 다발성 골수종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

상기 육종은 골육종, 골낭종, 동맥류 뼈낭종, 유골종, 연골육종, 불량하게 분화된 원형/방추세포 종양 (유잉 육종 포함), 혈관내피종, 혈관육종, 섬유육종/근섬유육종, 척삭종, 법랑질종, 지방육종, 평활근육종, 악성 말초 신경초 종양, 횡문근육종, 활막육종, 악성 고립성 섬유성 종양, 변칙적 지방종성 종양, 융기성 피부섬유육종, 악성 고립성 섬유성 종양, 염증성 근섬유아세포성 종양, 저등급 근섬유아세포성 육종, 섬유육종 (성인 및 경화성 상피양 품종 포함), 점액섬유육종, 저등급 섬유점액성 육종, 연조직의 거대 세포 종양, 악성 사구 종양, 횡문근육종, 혈관내피종, 연조직의 혈관육종, 골외성 골육종, 위장관기질종양 (골간), 악성 말초 신경초 종양, 악성 트리톤 종양, 악성 과립 세포 종양, 악성 골화성 섬유점액성 종양, 간질 육종, 근상피 암종, 악성 인산염뇨성 간엽성 종양, 유상피 육종, 폐포성 연부조직육종, 연조직의 투명 세포 육종, 골격외 점액양 연골육종, 골격외 유잉 육종, 결합조직성 소원형세포종양, 신외성 횡문성 종양, 혈관주위 상피모양 세포 종양, 혈관내막 육종, 다형성 육종 및 원형 세포 육종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

상기 중피종은 심막 중피종, 복막 중피종 및 흉막 중피종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

상기 이형성증은 골수이형성 증후군 및 경부 이형성증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 악성 세포에 대한 면역력의 활성화를 기반으로 표적 질환에 대한 효능을 나타낸다. 단독으로 사용하는 경우, 면역원성이 높은 신생물에 대해 사용할 때 효능이 더 높을 것으로 예상된다. 면역원성이 높은 신생물은 종양형성 단계 과정 동안 발생하는 유전자의 돌연변이에 의해 생성되는, 신생항원을 발현하는 암 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않으며; 이러한 암은 미스매치 복구 결핍 (deficiency in mismatch repair) (dMMR) 또는 고빈도-현미부수체 불안정성 (microsatellite-instability-high) (MSI-H) 을 갖는 것들을 포함한다 (Sargent, D.J., et al., J Clin Oncol, 2010. 28(20): p.3219-26; Passardi, A., et al., Int J Mol Sci, 2017. 18(6): E1324).

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 TLR9 의 활성화를 통해 pDC 를 활성화시킬 수 있다. 활성화된 pDC 는 인터페론을 통해 다양한 다른 면역 세포를 더 활성화시킨다. 따라서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 바이러스, 박테리아 및 진균을 포함하는 미생물에 의해 유발되는 다양한 감염성 질환의 예방 또는 치료요법에 적용될 수 있다.

감염성 질환을 유발하는 바이러스는 물사마귀 바이러스, 단순포진바이러스 (HSV), 수두 바이러스, 대상포진 바이러스, 인간 파필로마 바이러스, 거대세포바이러스 (CMV), 폴리오바이러스, 콕삭키바이러스, 리노바이러스, 루벨라 바이러스, 홍역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 호흡기 세포융합 (RS) 바이러스, 간염 바이러스 및 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 바이러스 중에서, 일부 바이러스, 예컨대 CMV, HIV, 인플루엔자 바이러스, HSV, B형 간염 바이러스 (HBV), 또는 C형 간염 바이러스 (HCV) 는 TLR9 에 대한 결합을 통해 숙주 면역력을 직접 활성화시키는 것으로 보고된다 (Swiecki, M., et al., Immunol Rev, 2010. 234(1): p.142-62).

감염성 질환을 유발하는 박테리아는 그람-음성과 그람 -양성으로 분류되지만, 본 발명은 이들 군 중 어느 하나의 박테리아에 적용될 수 있다. TLR9 가 그람-음성 박테리아에 대한 선천성 면역력의 활성화를 위해 필요하다는 것이 적어도 보고된다 (Bhan, U., et al., J Immunol, 2007. 179(6): p.3937-46). 그람 음성 박테리아는 나이세리아 고노레아 (Neisseria gonorrhea), 나이세리아 메닝지타이드 (Neisseria meningitides), 헤모필루스 파라인플루엔자에 (Hemophilus parainfluenzae), 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 및 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis), 모락셀라 카타르할리스 (Moraxella catarrhalis), 헤모필루스 두크레이 (Haemophilus ducreyi), 보르데텔라 퍼투시스 (Bordetella pertussis), 보르데텔라 파라퍼투시스 (Bordetella parapertussis), 보르데텔라 브론치셉티카 (Bordetella bronchiseptica), 시트로박터 (Citrobacter), 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 Typhi (Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi), 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 파라티피 A (Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A), 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 파라티피 B (Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi B), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella Typhimurium), 살모넬라 엔테리카 혈청형 엔테리티디스 (Salmonella enterica serovar Enteritidis), 시겔라 디센테리아에 (Shigella dysenteriae), 시겔라 프렉스네리 (Shigella frexneri), 시겔라 손네이 (Shigella sonnei), 클렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae), 클렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 엔테로박터 (Enterobacter), 세라티아 (Serratia), 하프니아 (Hafnia), 프로테우스 (Proteus), 모르가넬라 (Morganella), 프로비덴시아 (Providencia), 예르시니아 (Yersinia), 캄필로박터 (Campylobacter), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera), 비브리오 파라해모리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 잔토모나스 (Xanthomonas), 아시네토박터 (Acinetobacter), 플라보박테리움 (Flavobacterium), 브루셀라 (Brucella), 레지오넬라 (Legionella), 베일로넬라 (Veillonella), 박테로이데스 (Bacteroides) 및 푸소박테리움 (Fusobacterium) 을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

진균에 의해 유발되는 감염성 질환은 크립토코커스증, 칸디다증, 아스페르길루스증, 뉴모시스티스 카리니 (Pneumocystis carinii) 에 의한 폐렴, 트리코피톤 (Trichophyton) 에 의한 백선증 및 티네아 버시컬러 (Tinea versicolor) 에 의한 피부 감염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 실제로, 진균으로부터 유래한 DNA 또는 RNA 가 포유류 TLR9 에 의해 인식되는 것이 보고된다 (Kasperkovitz, P.V., et al., Infect Immun, 2011. 79(12): p.4858-67; Patin, E.C., et al., Semin Cell Dev Biol, 2019. 89: p.24-33).

Th2/Th17 과 관련된 질환은 Th1 의 억제 및 Th2 및/또는 Th17 의 활성화에 의해 유발되는 질환이며; 질환은 천식, 아토피성 질환 (피부염, 습진), 알레르기, 다발성 경화증, 궤양성 대장염 및 크론병을 포함하는 염증성 장 질환, 피부 편평태선 및 알츠하이머병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

1차성 면역결핍 질환은 면역계의 일부가 선천적으로 손실되거나 제대로 기능하지 않는 장애이며, 이 질환의 환자는 특히 감염에 취약한 것으로 알려져 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 IRAK4 결핍, MyD88 결핍, Unc93B 결핍 또는 TLR 에서의 돌연변이를 갖는 환자와 같은 기능적 TLR-관련 시스템이 결여되는 환자에서 특히 효능을 나타낼 것으로 잘 예상되지만, 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 감염성 질환에 대해 광범위하게 면역력을 활성화시킬 것으로 예상되기 때문에 효능은 이러한 질환에 제한되지 않는다.

외상후 스트레스 장애 (PTSD) 는 TLR9 작용제에 의해 개선되는 것으로 보고된 질환 중 하나이며, 이 질환은 또한 표적 질환 중 하나인 것으로 고려된다 (Zimmerman, G., et al., Transl Psychiatry, 2012. 2: p.e78).

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 상기 언급된 표적 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자에게 투여되는 약학 조성물의 활성 성분 중 하나로서 사용될 수 있으나, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 상기 언급된 표적 질환의 예방 목적으로 대상체에게 적용될 수도 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 가능하게는 독특한 링커를 통해 다른 활성 분자와 연결될 수 있다. 예를 들어, 동시 투여를 위한 약학적 화합물의 결합은 동시 투여를 용이하게 할 수 있고; 페길화 또는 지질의 결합은 조직 분포 또는 약동학을 개선시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 페길화는 신장 클리어런스를 낮춤으로써 대상체에서 생체내 지속시간을 연장시킨다고 보고된다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 생체내 반감기 또는 세포 흡수와 같은 약동학의 개선을 목적으로, 비타민 E (α-토코페롤) 또는 비타민 D 와 같은 일부 유기 화합물과 컨쥬게이션될 수 있다 (Winkler, J., Ther Deliv, 2013. 4(7): p.791-809).

본 발명의 올리고뉴클레오티드를 다른 유기 또는 무기 모이어티와 연결하기 위해, 유기 화학적 화합물, 링커가 사용될 수 있고; 링커는 글리세롤, (S)-(-)-1,2,4-부탄트리올, 1,3,5-펜탄트리올, 시스,시스-1,3,5-시클로헥산트리올, 시스트랜스-1,3,5-시클로헥산트리올, 1,3,5-트리스-(2-히드록시에틸)이소시아누레이트, 테트라에틸렌글리콜, 및 헥사에틸렌글리콜, 디올 예컨대 1,3-프로판 디올 또는 도데칸-1,12-디올, 시클로헥산디올, 콜레스테롤, 니트로인돌, 트리에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜, d-스페이서, PEG-스페이서 및 알킬 링커를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 링커 모이어티는 또한 아미노산, 뉴클레오티드 및/또는 이들의 유도체로 구성될 수 있다.

링커는 또한 비-공유 결합을 만드는 데 사용될 수 있다. 링커는 비오틴-아비딘, 핵산 내로 삽입되는 SPB (숙신이미딜-[4-(프소랄렌-8-일옥시)]-부티레이트), 서열이 상보적이고 서로 결합하는 핵산, 및 이중 코일 구조와 같은 단백질-단백질 상호작용을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

한 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 서로, 유사한 기능 메커니즘을 갖는 다른 올리고뉴클레오티드와, (폴리)펩티드/항체 또는 핵산/올리고뉴클레오티드와 같은 다른 유기 화합물과, 또는 약물의 물리적 특성의 개선 또는 변형에 종종 사용되는 세포독성제와 같은 무기 화합물과 조합으로 사용될 수 있다. 이러한 조합은 공유 결합 존재 하 또는 부재 하에 발생할 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 기존의 핵산 공급원 (예를 들어, 게놈 또는 cDNA) 으로부터 수득될 수 있지만, 바람직하게는 합성이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 시판되는 다양한 자동화된 핵산 합성기에 의해 합성될 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드를 합성 올리고뉴클레오티드로 지칭한다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 활성 성분과 동시에 또는 순차적으로 동시 투여될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 다른 치료 방법과 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 종양 형성과 함께 발생하는 다양한 증상을 완화시키기 위해 통상적인 항암 약물 또는 약제와 함께 동시 투여될 수 있다. 통상적인 항암 약물의 예는 항생제, 예컨대 안트라사이클린 또는 미톡산트론; 백금; 알킬화제; 항대사물질; 호르몬 요법용 약물; 피토-알칼로이드, 예컨대 빈카 알칼로이드; 탁산, 예컨대 파클리탁셀 또는 도세탁셀; 및 토포이소머라아제 억제제, 예컨대 이리노테칸 또는 에토포시드를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 암 세포의 생물학적 특징을 표적화하는 다른 분자 표적화 약물과 함께 필요로 하는 대상체에게 동시 투여될 수 있고; 분자 표적화 약물은 티로신 키나아제 억제제, 혈관형성 억제제 또는 프로테아좀 억제제를 포함한다. 분자 표적화 약물의 예는 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다:

에버롤리무스 (Afinitor), 타목시펜 (Nolvadex), 토레미펜 (Fareston), 풀베스트란트 (Faslodex), 아나스트로졸 (Arimidex), 엑세메스탄 (Aromasin), 라파티닙 (Tykerb), 레트로졸 (Femara), 팔보시클립 (Ibrance), 리보시클립 (Kisqali), 네라티닙 말레에이트 (Nerlynx), 아베마시클립 (Verzenio), 올라파립 (Lynparza), 레고라페닙 (Stivarga), 이마티닙 메실레이트(Gleevec), 란레오티드 아세테이트 (Somatuline Depot), 수니티닙 (Sutent), 소라페닙 (Nexavar), 파조파닙 (Votrient), 템시롤리무스 (Torisel), 악시티닙 (Inlyta), 카보잔티닙 (Cabometyx), 렌바티닙 메실레이트 (Lenvima), 트레티노인 (Vesanoid), 다사티닙 (Sprycel), 닐로티닙 (Tasigna), 보수티닙 (Bosulif), 이브루티닙 (Imbruvica), 이델랄리십 (Zydelig), 베네토클락스 (Venclexta), 포나티닙 히드로클로라이드 (Iclusig), 미도스타우린 (Rydapt), 에나시데닙 메실레이트 (Idhifa), 이노투주맙 오조가마이신 (Besponsa), 티사겐레클류셀 (Kymriah), 이보시데닙 (Tibsovo), 듀벨리십 (Copiktra), 소라페닙 (Nexavar), 크리조티닙 (Xalkori), 에를로티닙 (Tarceva), 게피티닙 (Iressa), 아파티닙 디말레에이트 (Gilotrif), 세리티닙 (LDK378/Zykadia), 오시머티닙 (Tagrisso), 알렉티닙 (Alecensa), 브리가티닙 (Alunbrig), 트라메티닙 (Mekinist), 다브라페닙 (Tafinlar), 다코미티닙 (Vizimpro), 데닐류킨 디프티톡스 (Ontak), 보리노스타트 (Zolinza), 로미뎁신 (Istodax), 벡사로텐 (Targretin), 보르테조밉 (Velcade), 프랄라트렉세이트 (Folotyn), 실툭시맙 (Sylvant), 이델랄리십 (Zydelig), 벨리노스타트 (Beleodaq), 코판리십 히드로클로라이드 (Aliqopa), 아칼라브루티닙 (Calquence), 카르필조밉 (Kyprolis), 파노비노스타트 (Farydak), 익사조밉 시트레이트 (Ninlaro), 룩소리티닙 포스페이트 (Jakafi), 카바지탁셀 (Jevtana), 엔잘루타미드 (Xtandi), 아비라테론 아세테이트 (Zytiga), 라디움 223 디클로라이드 (Xofigo), 아팔루타미드 (Erleada), 비스모데깁 (Erivedge), 소니데깁 (Odomzo), 베무라페닙 (Zelboraf), 코비메티닙 (Cotellic), 알리트레티노인 (Panretin), 엔코라페닙 (Braftovi), 비니메티닙 (Mektovi), 세미플리맙-rwlc (Libtayo), 알리트레티노인 (Panretin), 및 반데타닙 (Caprelsa).

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 항암 항체 약물과 함께 대상체에 동시 투여될 수 있다. 본 발명의 ODN 과 동시 투여는 암 세포를 공격하기 위해 면역계를 특히 이용하는 활성 항체 약물을 상승작용적으로 향상시킬 것으로 예상된다. 이러한 항체 약물의 예는 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는다:

(i) 단일 종류의 항체를 포함하는 항체 약물: 트라스투주맙 (Herceptin), 알레무투주맙 (Campath), 베바시주맙 (Avastin), 페르투주맙 (Perjeta), 세툭시맙 (Erbitux), 파니투무맙 (Vectibix), 네시투무맙 (Portrazza), 디누툭시맙 (Unituxin), 라무시루맙 (Ciramza), 올라투주맙 (Lartruvo), 이필리무맙 (Yervoy), 니볼루맙 (Opdivo), 펨브롤리주맙 (Keytruda), 아테졸리주맙 (Tecentriq), 데노수맙 (Xgeva), 두르발루맙 (Imfinzi), 아벨루맙 (Bavencio), 이브리투모맙 티욱세탄 (Zevalin), 브렌툭시맙 베도틴 (Adcetris), 오비누투주맙 (Gazyva), 모가물리주맙-kpkc (Poteligeo), 다라투무맙 (Darzalex), 엘로투주맙 (Empliciti), 루카파립 캄실레이트 (Rubraca), 니라파립 토실레이트 모노히드레이트 (Zejula), 항-OX40;

(ii) 이중특이적 항체를 포함하는 항체 약물: 블리나투모맙 (Blincyto);

(iii) 항체-약물 컨쥬게이트, ADC 를 포함하는 항체 약물: 이브리투모맙 티욱세탄 (Zevalin), 브렌툭시맙 베도틴 (Adcetris), Ado-트라스투주맙 엠탄신 (Kadcyla), 겜투주맙 오조가미신 (Mylotarg); 및

(iv) ziv-아플리베르셉트 (Zaltrap)

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 GM-CSF, IFN-α, IFN-β 또는 IFN-γ 와 같은 사이토카인과 동시 투여될 수 있으며, 이는 암 치료요법의 표준 치료에 이미 사용된다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 방사선 요법, 고주파 절제, 냉동절제 (Aarts, B.M., et al., Insights Imaging, 2019. 10(1): p.53), 또는 광감작제 투여 후 광역학요법 (PDT) 을 포함하는 외과적 절차와 함께 이용될 수 있다.

특히 PDT 가 항암 면역력을 상향조절한 것으로 보고된 것을 고려하면, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 투여와의 조합은 상승작용적 효능을 나타낼 것으로 예상된다 (Kleinovink, J. W. et al., Cancer Immunol Res, 2019, 5(10): p.832-838).

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 보조제 또는 네오-보조제 환경에서 활성 성분으로서 투여될 수 있다 (O'Donnell, J.S., et al., Clin Cancer Res, 2019, 25(19): p.5743-5751).

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 입양 면역 세포 치료요법, (입양 세포 전달 (ACT) 로도 공지됨) 예컨대 키메라 항원 수용체 T (CAR-T)-세포 치료요법 (악시캅타진 실로류셀 (Yescarta®) 또는 티사젠렉류셀 (Kymriah®)), 종양-침윤 림프구 (TIL) 치료요법, 수지상 세포 치료요법 또는 NK 세포 치료요법과 조합으로 사용될 수 있다. 본 발명의 ODN 은 또한 종양 덩어리를 용해하기 위해 인공적으로 변형된 바이러스를 이용하는 종양세포붕괴성 바이러스를 사용하는 치료요법과 조합될 수 있다 (Davola, M.E., et al., Oncoimmunology, 2019. 8(6): p.e1581528; Sivanandam, V., et al., Mol Ther Oncolytics, 2019. 13: p.93-106; Raja, J., et al., J Immunother Cancer, 2018. 6(1): p.140; Martinez-Quintanilla, J., et al., J Clin Invest, 2019. 130: p.1407-1418; Harrington, K., et al., Nat Rev Drug Discov, 2019. 18(9): p.689-706).

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 치료 백신과 조합으로 사용될 수 있으며, 이는 치료요법에 필요한 면역력을 향상시킬 것으로 예상된다. 치료용 백신은 기존 질환의 치료 목적으로 사용되는 백신의 부류이다. 이러한 치료용 백신은 약화 또는 무독화 미생물에 의해 제조된 백신 뿐만 아니라, 생체외 처리된 세포에 의해 제조된 생체외 세포 백신, 및 표적 면역 세포를 활성화시켜 항암 면역력과 같은 면역력을 활성화시키는 생체내 백신을 포함한다. 생체외 세포 백신은 자가 또는 동종 수지상 세포로부터 제조되는 시푸류셀-T (Provenge), 또는 자가 또는 동종 암 세포를 변형시켜 제조되는 GVAX 를 포함한다. 이러한 수지상 세포에 대한 항원의 로딩은 펩티드, 재조합 단백질 또는 종양 용해물을 포함하는 항원을 생체외 배양물에서 수지상 세포와 접촉시켜 달성될 수 있으나, 또한 항원 (예를 들어, 암 세포) 을 발현하는 세포를 수지상 세포와 융합시켜서도 달성될 수 있다 (Hollingsworth, R.E., et al., NPJ Vaccines, 2019. 4: p.7).

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 생체내 백신의 군과 조합으로 사용될 수 있다. 생체내 백신은 암 항원 또는 바이러스 항원과 같은 항원과 조합된 표적 항원-제시 세포 (APC) 로의 전달을 위한 도구를 포함할 수 있고; APC 로의 전달을 위한 도구에 대한 표적 단백질은 하기와 같은 세포 표면 단백질을 포함한다:

수지상 세포: DEC205, CD11c, DC-SIGN, 만노오스 수용체, TLR, CD91

B 세포: CD180, BCR, CD21, CD19

형질세포양 수지상 세포 (pDC): CD32, CLEC12a, BDCA2, DCIR, TLR9

생체내 백신에 사용되는 항원은 이후 기재할 암 항원, 또는 바이러스 항원을 포함하는 펩티드 또는 재조합 단백질을 포함할 수 있고; 폴리뉴클레오티드 코딩 항원은 이러한 표적 APC 에서 항원의 직접 발현에 사용될 수 있다.

예방 암 백신은 B형 간염 바이러스 백신, 인유두종 바이러스 (HPV) 백신, 예컨대 가다실 (Gardasil) 또는 서바릭스 (Cervarix) 를 포함한다. 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 시판 백신 또는 프리마켓 단계에서의 백신의 예방 활성을 향상시킬 것으로 예상된다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 감염성 질환의 예방 또는 치료요법에 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 보조제로서 백신 조성물과 혼합될 수 있다. 또는, 올리고뉴클레오티드는 항박테리아제, 항진균제, 항바이러스제, 항기생충 약물, 백신, 독소를 중화시키는 항체 약물을 포함하는 감염성 질환의 치료를 위한 약학 조성물과 조합으로 대상체에게 투여될 수 있다.

감염성 질환의 예방 또는 치료요법에 사용되는 백신은 하기 카테고리 중 하나를 포함한다:

- 약화된 형태의 살아있는 미생물을 함유하는 생, 약독화 백신.

- 사멸된 미생물을 함유하나 항원성은 유지하는 불활성화된 백신.

- 면역계를 가장 효율적으로 자극하는 항원만을 함유하는 서브유닛 백신.

- 미생물로부터의 독소의 무독화를 목표로 하는 톡소이드 백신.

- 더 강한 면역원성을 갖는 다른 서브유닛을 컨쥬게이션하여 약한 면역력을 갖는 미생물에 대한 면역력이 확립되게 하는, 서브유닛 백신의 특수한 종류인 컨쥬게이트 백신.

- 체세포가 항원을 생성하게 만들어 추가의 생체내 면역화를 달성하게 하는 핵산 백신.

- 표적 미생물에 대한 면역력을 자극하기 위한 재조합 항원의 유전 정보를 가지는 재조합 벡터 백신.

본 발명의 올리고뉴클레오티드와 조합으로 사용될 수 있는 백신의 예는: BCG 백신, 콜레라 백신, 디프테리아 백신, 헤모필루스 인플루엔자 백신, A형 간염 백신, B형 간염 백신, 인유두종 바이러스 백신, 유행성 H1N1 인플루엔자 백신, 계절성 인플루엔자 백신, 일본 뇌염 백신, 홍역 백신, 볼거리 백신, 수막구균 백신, 폐렴구균 백신, 백일해 백신, 소아마비 백신, 광견병 백신, 로타바이러스 백신, 풍진 백신, 파상풍 톡소이드 백신, 장티푸스 백신, 및 황열 백신이다.

최근, 면역력을 조절하는 단백질 군인 면역 체크포인트 분자에 영향을 주어 표적 질환 치료에 필요한 면역력을 자극하는 면역 체크포인트 억제제 (CPI) 로 불리는 부류의 의약이 열렬히 개발되고 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 면역 체크포인트 과정과 관련된 항원-제시 세포의 활성화를 통해 CPI 의 효능을 상승작용적으로 향상시키기 위해 CPI 와 함께 사용될 수 있다.

면역 체크포인트 억제제의 표적 분자의 예는: PD-1, PD-L1, PD-L2, CD28, CD80, CD86, ICOS, B7RP1 (ICOSL), B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), CD28H, B7-H5

VISTA, BTLA, HVEM, CD40L, CD40, OX40, OX40L, CD137, CD137L, CD27, CD70, TIM3, GAL9, GITR, GITRL, LAG-3, MHC-II, CD47, ADORA2A (아데노신 A2A 수용체) 및 아데노신이다 (Pardoll, D.M., Nat Rev Cancer, 2012. 12(4): p.252-64).

Treg, 종양 관련 대식세포 (TAM) 또는 MDSC 와 같은 면역억제성 면역 세포의 활성을 억제하는 치료요법 또는 약물은 또한 본 발명의 올리고뉴클레오티드와의 병용 치료요법에 사용될 수 있다. 이러한 치료요법 또는 약물에 의해 영향받는 경로 또는 표적 분자의 예는 하기의 것이다:

- Treg - 세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4), TGF베타 (TGFβ), IL-10, IL-35, ICOS, 및 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3), 인돌아민 2, 3-디옥시게나아제 (IDO), 트립토판 2, 3-디옥시게나아제 (TDO), CD39, CD73, PI3K, Atg7 및 Atg5

- TAM - CCL2-CCR2 축 및 CSF1/CSF1 수용체 (CSF1R) 신호전달

- MDSC - PDE-5, COX-2, HDAC, STAT3, CCL2/CCR2, VEGF-A/MET/TIE2/VEGFR2 경로, IL-8/CXCR1/2, 갈렉틴-1 (Gal-1),

이러한 면역억제성 면역 세포를 제거하는 치료요법 또는 약물은 또한 본 발명의 올리고뉴클레오티드와의 조합에 사용될 수 있다. 이러한 세포의 고갈에 사용될 수 있는 세포 표면 마커 단백질의 예는 하기와 같다:

Treg - CD25, CTLA-4, PD-1, ICOS, GITR, OX40, CD15s, CCR4, 및 CCR8

TAM - CD206, 레구마인, 스캐빈저 수용체 A 및 CD52

(Ohue, Y., et al., Cancer Sci, 2019. 110(7): p.2080-2089; Yang, L., et al., J Hematol Oncol, 2017, 10(1): p. 58; Gabrilovich, D. I., Cancer Immunol Res, 2017, 5(1): p.3-8; Ding A.S. et al., Front Immunol, 2019, 10: p.1715)

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 질환에 대한 특이적 항원 반응의 향상을 목적으로 항원 단백질, 펩티드, 글리코컨쥬게이트 또는 다른 유기 물질과 함께 사용될 수 있다. 항원 물질의 예는 하기와 같다:

AFP, AKAP-4, ALK, 안드로겐 수용체, B7H3, BAGE, bcr-abl, BMLF1, BmpA, BmpB, BORIS, BRLF1, BZLF1, 카르보닉 안히드라아제 IX, 카탈라아제 B, CDC27, CDCA1, CDH3, CDK4, CEA, crf1, 사이클린 B1, CYP1B1, DEPDC1, EBNA1, EBNA-1, EGFRvIII, 외피 당단백질 D, EpCAM, EphA2, EphA3, ERG, ETV6-AML, FAP, Fos-관련 항원 1, FOXM1, 푸코실 GM1, GD2, GD3, Gel1, GloboH, GM3, gp100, GPC3, HA, HBV 단백질, HCV 단백질, HER2, 헥손, HJURP, HMWMAA, HPV-16 E6, HPV-16 E7, HPV-18 E7, 표면 Ig 의 이디오타입, IE-1, KIF20A, KOC1, KSV 단백질, 대형 T 항원, 소형 T 항원, LCK, 레구마인, LMP1, LMP2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MAGE, MAGE-3, MAGE-A1, MAGE-A4, MAM-A, 멜란-A/MART-1, MELK, MELOE-1/2, 메소텔린, ML-IAP, MP1, MP2, MP65, MPHOSPH1, MUC1, 뮤신-1, MYCN, NA, NA17, NeuGcGM3, 비-구조적 단백질 NS4, 비-구조적 단백질 NS5, NY-BR-1, NY-ESO-1, ospA, ospB, ospC, OY-TES1, p53, Page4, PAP, PAX3, PAX5, PDGFR-베타, 펜톤, PLAC1, pmel17, pmp20, 폴리시알산, pp65, PRAME, 프로스테이트-특이적 멤브레인 항원10, 프로스테인, 프로테이나아제3 (PR1), PSA, PSCA, PSMA, Ras, RGS5, RhoC, RM2, RNF43, ROR1, 육종 전위 절단점, SART3, Select, 세린 프로테아제 NS3, SHMP, sLe, SOD, 정자 단백질 17, SSX2, STEAP1, STn, 서바이빈 (Survivin), TARP, Tax 단백질, 텔로머라아제, 텔로머라아제, TERT, Tie 2, TM4SF5, Tn, TOMM34, 트리오스포스페이트 이소머라아제, TRP1, TRP2, TTK, 티로시나아제, 티로시나아제-관련 단백질 1, 티로시나아제-관련 단백질 2, URLC10, VEGFR2, 바이러스 캡시드 단백질, 바이러스 코어 단백질, 바이러스 핵단백질, WT1, XAGE 1, 알파-액티닌-4 및 베타-카테닌.

신생항원은 또한 항원 물질로서 사용하기에 양호한 후보이며; 신생항원은 종양 형성 동안 발생하는 돌연변이유발과 같은 생체내 과정에 의해 새로이 형성되거나 감염성 외래 물질로부터 생성된 항원이며, 이는 고유한 면역계에 의해 인식된다.

항암 화학요법 약물, 특히 면역원성 세포사 (ICD) 를 유도하는 약물은, 상승작용적으로 향상된 효능을 나타내기 위해, 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 동시 투여될 수 있다. ICD 를 유도하는 약물의 예는: 미톡산트론을 포함하는 안트라사이클린, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 네다플라틴, 트리플라틴 테트라니트레이트, 피코플라틴, 사트라플라틴을 포함하는 백금계 항암 약물이다 (Hato, S.V., et al., Clin Cancer Res, 2014. 20(11): p.2831-7).

항암 면역력의 활성화 특성에 대해 알려져 있는 다른 약물, 예컨대 인돌아민 2,3-디옥시게나제 (IDO) 억제제 (Prendergast, G.C., et al., Cancer Res, 2017. 77(24): p.6795-6811) 또는 보르테조밉을 포함하는 프로테아좀 억제제 (Spisek, R., et al., Blood, 2007. 109(11): p.4839-45; Chang, C.L., et al., J Immunol, 2012. 189(6): p.3209-20) 는, 상승작용적 효능을 나타내기 위해 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 동시 투여될 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 다른 TLR9 작용제 또는 다른 TLR, 예컨대 TLR3, 4, 8 또는 7 에 대한 작용제와 동시 투여될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 세포내 뉴클레오티드 센서 신호전달 경로, 예컨대 cGAS-STING 경로, 또는 RIG-I/MDA5 경로의 인핸서와 조합으로 사용될 수 있는데 (Bode, C., et al., Eur J Immunol, 2016. 46(7): p.1615-21; Iurescia, S., et al., Front Immunol, 2018. 9: p.711), 이들 경로가 IFN-α 또는 NF-kB 와 같은 TLR9 와 공통된 표적 분자를 갖기 때문이며, 동시에 활성화될 때 상승작용적 효과를 나타낼 것으로 예상된다. 각각의 수용체를 활성화시키는 분자의 예는 하기와 같다:

TLR3 작용제: 린타톨리모드, 폴리 C 3SBIO, 폴리(I:C), 힐토놀

TLR4 작용제: ALD046, CRX527, CRX675, G100, 지질 A, GSK1795091, OM174, PGN007

TLR7 작용제: 베사톨리모드, VML600, 852A, NKTR262, TMX101, GS9620, RG7795, DSP0509, PF4878691, RG7854, RG7863, TMX202, TQA3334

TLR8 작용제: GS-9688, VTX 2337

TLR9 작용제: 헤플리사브, SD-101, IMO2125, IMO2055, MGN1703, MGN1706, CPG 7909, 리테니모드, AST008, DUK-CPG-001, 악틸론, CMP001, DV281, 코비톨리모드

TLR9 및 NOD2 작용제: MIS416

STING 신호전달 경로 활성화제: ADU-S100

STING 작용제: MK-1454, SB 11285, IMSA101

RIG-I 작용제: RGT 100

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 전달 담체 중에서/전달 담체와 함께 또는 담체와 연결된 형태로 투여될 수 있다. 담체는 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤), 코클레에이트, 에멀솜, ISCOM; 지질 (예를 들어, 양이온성 지질, 음이온성 지질), 리포솜; 에틸렌 글리콜 (PEG); 폴리글리콜리드-코-락티드 (PGLA); 미소구체; 중합체 (예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC), 키토산, 만니톨, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 (HPMC)); 생 박테리아 벡터 (예를 들어, 살모넬라 (Salmonella), 대장균 (Escherichia coli), 바실루스 칼메트-구린 (bacillus Calmette-Gurin), 시겔라 (Shigella), 락토바실루스 (Lactobacillus)); 생 바이러스 벡터 (예를 들어, 백시니아, 아데노바이러스, 단순 포진), 비로솜, 바이러스-유사 입자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드와 함께 투여되는 표적 대상체는 바람직하게는 인간이지만, 한 구현예에서 대상체는 개, 고양이, 말, 돼지, 염소, 양, 소, 원숭이, 닭, 마우스 또는 랫트와 같은 비인간 동물일 수 있다.

"치료적 유효량": 표적 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위해, 치료적 유효량의 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 대상체에게 투여된다. 하나 이상의 올리고뉴클레오티드의 "치료적 유효량" 은 대상체에서 장애를 치료하거나 예방하는 원하는 결과를 달성하기 위해 사용되는 충분한 양의 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 순수한 형태 또는 약학적으로 허용가능한 담체로 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 ODN 은 약학 조성물로서 투여될 수 있다. 본 발명에서 "양" 은 용량을 의미한다. 용량은 당업자에게 잘 알려진 표준 기법에 의해 결정될 수 있고, 대상체의 크기 또는/및 전반적인 건강 또는 질환 증상의 중증도를 포함하지만 이에 제한되지 않는 인자에 다양하게 좌우될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 도입은 단일 처리로서 또는 일련의 처리에 걸쳐 실행될 수 있다. 투여를 위한 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 대상 용량은 투여 당 약 1 μg (마이크로그램) 내지 10 g 의 범위이다. 바람직하게는, 용량은 0.1 mg 내지 5 g 의 범위이다. 보다 바람직하게는, 용량은 0.3 mg 내지 3 g 의 범위이다. 가장 바람직하게는, 용량은 1 mg 내지 1 g 의 범위이다.

인간 대상체에 대한 치료적 유효량은 인간 등가 용량 (HED) 또는 인간 등가 농도 (HEC) 를 사용하여 비인간 동물에 적합한 양을 기반으로 추정될 수 있다. 인간 대상체에 대한 치료적 유효량은 0.3-60 mg/일, 바람직하게는 1-30 mg/일, 보다 바람직하게는 2-8 mg/일일수 있으나 이에 제한되지 않는다.

"투여 경로": 임상적 사용을 위해, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 단독으로 투여될 수 있거나, 원하는 치료 결과를 달성하기에 효과적인 임의의 적합한 투여 경로를 통해 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 투여하는 "경로" 는 장내, 비경구 및 국소 투여 또는 흡입을 의미한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 장내 투여 경로는 경구, 위, 장, 및 직장을 포함한다. 비경구 경로는 피하, 정맥내, 경피, 피내, 설하, 비강내, 경점막, 폐, 질, 에어로졸, 안구내, 기관내, 직장내, 척수내, 근육내, 관절내, 복강내, 심장내, 골내, 척수강내, 유리체내, 흡입 또는 국소 투여를 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 국소 투여 경로는 표피, 구강 및 귀, 눈 및 코에 대한 올리고뉴클레오티드의 외부 적용을 나타낸다. 종양내 투여는 투여 경로 중 하나이며, 이는 일반적으로 종양 또는 종양 주위 부위에 시험 화합물(들) 을 주사하여 실시된다.

"약학 조성물": 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체의 존재 또는 부재 하에 치료적 유효량의 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 의미한다. 약학 조성물은 본 발명의 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 조성물은 수성 또는 식염수 용액, 입자, 에어로졸, 펠렛, 과립, 분말, 정제, 코팅 정제, 경구 용해/붕해 정제, (마이크로) 캡슐, 좌제, 시럽, 에멀젼, 현탁액, 크림, 드롭 및 다양한 약물 전달 시스템에 사용하기에 적합한 다른 약학 조성물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 조성물은 비경구, 경구, 직장, 질내, 복강내, 국소 (분말, 연고, 겔, 드롭 또는 경피 패치로서의 투약 형태), 협부로, 또는 경구 또는 비강 스프레이로서 투여될 수 있다. 모든 경우에, 조성물은 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되고 안정해야 하며 미생물 오염에 대항하여 보존되어야 한다. 비경구 주사를 위한 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 멸균 수용액 또는 비수용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼 뿐만 아니라 사용 직전에 멸균 주사액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 멸균 분말을 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 수성 담체, 예를 들어, 약 3.0 내지 약 8.0 의 pH, 바람직하게는 약 3.5 내지 약 7.4, 3.5 내지 6.0, 또는 3.5 내지 약 5.0 의 pH 에서 등장성 완충액에 현탁될 수 있다. 완충액은 소듐 시트레이트-시트르산 및 소듐 포스페이트-인산 및 소듐 아세테이트-아세트산 완충제를 포함한다. 경구 투여의 경우, 조성물은 식용 담체와 함께 제형화되어 분말 정제, 알약, 경구 용해/붕해 정제, 드라제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등을 형성할 것이다. 고체 조성물의 경우, 통상적인 비독성 고체 담체는 약학 등급의 만니톨, 락토오스, 전분 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 구강 투여의 경우, 조성물은 통상적인 방식으로의 정제 또는 로젠지일 것이다. 흡입의 경우, 조성물은 가압 팩, 분무기, 또는 건조 분말로부터의 에어로졸 스프레이일 것이며, 당업자에 의해 선택될 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 효과를 연장시키기 위해, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 서방형 시스템에 의해 적합하게 투여된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 수용해도가 불량한 결정질 또는 비정질 물질의 액체 현탁액에서 사용되어, 올리고뉴클레오티드의 방출을 지연시킬 수 있다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드의 비경구 투여된 약물 형태의 지연 방출은 올리고뉴클레오티드를 소수성 물질 (예컨대 허용가능한 오일 비히클) 에 용해 또는 현탁시킴으로써 달성된다. 주사가능한 데포 형태는 리포좀 또는 마이크로에멀젼 또는 다른 생분해성 반투과성 중합체 매트릭스 예컨대 폴리락티드-폴리글리콜리드, 폴리오르토에스테르 및 폴리무수물에 올리고뉴클레오티드를 포획시킴으로써 제조된다.

실시예

본 발명을 이제 하기 실시예에서 보다 상세히 설명할 것이다. 한편, 본 발명은 이들 실시예에 제한되지 않는다. 이들 실시예에서, 시판되는 키트 및 시약을 사용하는 실험은 달리 언급되지 않는 한, 첨부된 프로토콜에 따라 수행하였다. 당업자는 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 암 및 감염성 질환을 포함하는 표적 질환의 치료에 용이하게 적용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 본 발명을 이제 하기 비제한적인 실시예에 의해 입증할 것이다.

재료 및 방법:

<올리고-데옥시뉴클레오티드 (ODN)>

단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN) 를 3' 말단에 포스페이트를 갖지 않는 형태로 통상적인 포스포라미다이트 방법에 의해 Hokkaido System Science Co., Ltd. 에서 합성하고, 순도 및 동일성을 제조사에 의해 확인하였다. 하기 실시예에서, 3' 말단에 포스포로티오에이트 (PS) 뉴클레오티드간 연결을 갖는 뉴클레오시드를 소문자로 기재하고, 3' 말단에 포스포디에스테르 (PO) 뉴클레오티드내 연결을 갖는 뉴클레오시드를 대문자로 기재한다. 모든 합성된 ODN 을 먼저 발열원-불포함 증류수로 용해하고, 연구를 위해 발열원-불포함 시약을 사용하여 추가 희석을 실행하였다.

<10% FBS-RPMI-완전 배지>

RPMI1640 배지에 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 10 mM HEPES, 1 mM 소듐 피루베이트 및 50 mM 2-머캅토에탄올을 보충한다. 배지를 0.45 μm 시린지 필터로 추가 여과하였다.

<CAL-1 세포>

CAL-1 세포 (인간 형질세포양 수지상 세포주; Maeda et al., Int J Hematol., 2005, 81, 148-54; JP5011520B) 를 10% FBS-RPMI-완전 배지와 함께 가습 대기 및 5% CO₂ 조건 하에 37℃ 에서 배양한다. CAL-1 세포는 1:5 로 계대배양한 후 2 일 동안 융합되지만, 세포는 계대 후 하기 나타낸 연구를 위해 융합된다. 현탁 배양 디쉬를 사용하여 CAL-1 세포를 배양한다.

<NF-kB 활성화를 통한 GFP 유도에 의한 TLR9 활성화의 검출>

TLR9 신호전달 경로에 의해 유도되는 NF-kB 프로모터의 전사 활성의 수준을 TLR9 신호전달 활성의 수준의 지표로서 모니터링하였다. CAL-1/NF-kB-GFP 세포주는 세포-기반 어세이에서 NF-kB 전사 인자의 활성을 모니터링하기 위해 확립되었다 (WO2014082254A). CAL-1/NF-kB-GFP 세포주의 확립을 위해, NF-kB 컨센서스 전사 반응 요소에 의해 구동된 GFP 리포터 유전자를 인코딩하는 벡터를 전기천공에 의해 CAL-1 세포 내로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 제오신으로 추가로 선택하였다. 선택된 형질감염체의 단일 세포 클로닝에 의해 안정한 형질감염체를 생성하였다. TLR9 작용제, CpG2395 (5'-tcgtcgttttcggcgcgcgccG-3', SEQ ID NO:45) 에 의해 유도된 GFP 발현을 확인하였다. 간략하게, CAL-1/NF-kB-GFP 세포 (1x10⁵/웰) 를 96-웰 평평 바닥 플레이트에 플레이팅하고, CpG2395 의 존재 또는 부재 하에 배양하였다. 세포를 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 6 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 세포 내 GFP 발현 수준을 유세포 분석기 (FACS Calibur, BD Bioscience Co., Ltd) 에 의해 평가하였다. GFP 양성 세포의 백분율을 TLR9 신호전달 활성 수준의 지표로서 분석하였다. 이러한 확립된 NF-kB-GFP/CAL-1 세포를 각각의 어세이에서 사용하였다.

<TLR7 활성화의 검출>

TLR7 의 활성을, HEK-Blue^TM TLR7 세포 (Invivogen) 에서의 분비형 배아 알칼리 포스파타아제 (SEAP) 의 효소 활성으로서 측정하였다. 세포를 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 24 시간 동안 37℃ 에서 표시한 올리고뉴클레오티드 또는 TLR7 작용제, 예컨대 1 μg (마이크로그램)/ml 의 가르디퀴모드 (GQ) 또는 1 μg/ml 의 CL264 와 함께 인큐베이션하고; 유도된 SEAP 를 기질의 절단으로 인한 655 nm 에서의 흡광도 수준에 의해 측정하였다 (HEK-Blue^TM Detection, Invivogen).

<TLR8 활성화의 검출>

TLR8 의 활성을, HEK-Blue^TM TLR8 세포 (Invivogen) 에서의 분비형 배아 알칼리 포스파타아제 (SEAP) 의 효소 활성으로서 측정하였다. 세포를 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 24 시간 동안 37℃ 에서 표시한 올리고뉴클레오티드 또는 TLR7 작용제, 예컨대 200 ng/ml 의 TL8-506 또는 5 μg/ml 의 CL075 와 함께 인큐베이션하고; 유도된 SEAP 를 기질의 절단으로 인한 655 nm 에서의 흡광도 수준에 의해 측정하였다 (HEK-Blue^TM Detection, Invivogen).

<사이토카인 생성의 검출>

사이토카인의 수준을 하기 키트를 사용하여 ELISA 에 의해 측정하였다: 인간 IFN-α (eBioscience), 인간 IL-6, 인간 TNF-α (Thermo Fisher Scientific), 인간 IL-12p40 (BioLegend), 마우스 IFN-α (PBL), 마우스 IL-6, 마우스 TNF-α 및 마우스 IL-12p40 (Thermo Fisher Scientific). 제조사의 프로토콜에 따라 측정을 실시하였다.

<인간 PBMC 의 단리>

건강한 지원자로부터 말초 혈액을 회수하였다. 동일한 부피의 RPMI 배지를 혈액에 첨가하고 잘 혼합하였다. 인간 PBMC 를 Histopaque^TM 을 통한 원심분리에 의해 정제하였다. 간략하게, Histopaque-1077 (SIGMA) 을 원심분리 튜브에 넣고, 동일한 부피의 혈액/RPMI 혼합물을 Histopaque^TM 에 넣었다. 튜브를 20 분 동안 1800 rpm (700 x g) 에서 원심분리하였다. 중간에 있는 백색 층을 피펫을 사용하여 또 다른 튜브로 회수하고 10% FBS-RPMI 완전 배지를 첨가하였다. 혼합물 용액을 10 분 동안 1800 rpm (700 x g) 에서 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 세포 펠렛을 2 ml 의 증류수로 처리하여 적혈구를 용해시킨 다음, 20 ml 의 10% FBS RPMI 완전 배지를 튜브에 즉시 첨가하였다. 배지로 2 회 세척한 후, 세포를 배지에 현탁하고 세포 수를 계수하였다. 새롭게 단리된 PBMC 를 각각의 어세이에서 사용하였다.

<마우스 비장세포의 제조>

마우스로부터 비장을 회수하였다. 비장을 RPMI 배지로 채워진 디쉬에 넣었다. 시린지 플런저 (2.5 ml 시린지) 의 고무 팁을 사용하여 나일론 메쉬로 비장을 분쇄하였다. 배지에 포함된 비장 세포를 70 μm 거르개를 통해 여과시킴으로써 50 ml 팔콘 (Falcon) 튜브로 옮겼다. 1500 x g 에서 5 분 동안 원심분리한 후, 세포를 1 x DPBS 로 세척하였다. 세포를 ACK 용해 완충제로 처리하여, 적혈구를 용해시켰다. 1 ml 의 ACK 용해 완충제를 세포 펠렛에 첨가하고 P1000 피펫으로 20 회 피펫팅한 다음, 튜브를 2 분 동안 얼음 상에 정치시켰다. 10% FBS 를 갖는 20 ml 의 RPMI 완전 배지를 튜브에 즉시 첨가하였다. 배지로 2 회 세척한 후, 세포를 동일한 배지에 재현탁하고 세포 수를 계수하였다. 그런 다음, 비장세포를 추가 연구에 사용하였다.

실시예 1

본 발명의 전체-포스포로티오에이트화된 ODN 은 보조제 활성을 갖는다.

이 연구에서 사용된 전체-포스포로티오에이트화된 ODN 을 하기 표 4 에 열거한다.

소문자는 뉴클레오시드가 3' 에서 뉴클레오티드간 연결에서 포스포로티오에이트-변형된다는 것을 나타내고, 대문자는 뉴클레오시드가 3' 에서 변형되지 않는다는 것을 (포스포디에스테르 연결 없음) 나타낸다.

[표 4]

<ODN 의 면역자극 활성 분석>

표 4 에서 나타낸 ODN 을 6 시간 동안 표시된 농도 (0.1 μM 또는 0.3 μM) 에서 CAL-1/NF-kB-GFP 세포와 함께 인큐베이션하였다. 유세포 분석기 (FACS Calibur, BD Bioscience Co., Ltd.) 로 분석한 GFP 양성 세포의 백분율을 기반으로 ODN 에 의한 NF-kB 활성화를 평가하였다. 데이터를 FlowJo^TM ver 10 (FlowJo LLC) 으로 분석하였다.

도 1A 에서 나타낸 바와 같이, GFP 발현은 진본 TLR9 작용제에 의해 CAL-1/NF-kB-GFP 세포에서 유도되었고; NF-kB 의 활성화를 나타내는 CpG2395 자극은 CpG2395 를 사용한 TLR9 활성화에 의해 유도되었다. 본 발명의 ODN, 전체 포스포로티오에이트화된 (PS) A001, A002, A003 및 A004 는 CpG2395 와 비교하여 더 강한 TLR9 활성화 활성을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 도 1B 에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 ODN 은 다른 공지된 CpG ODN, 예컨대 CpG685, M362 및 D60-1 의 경우보다 더 강한 TLR9 활성을 나타내었다. ODN 에 의해 유도된 TLR9 활성 수준이 핵산 길이에 의존하지 않는다는 것을 고려하면, 작용제 활성의 차이는 특정 서열에 있는 것으로 간주되었다.

많은 이전 보고가 인간 TLR9 의 최적 활성화를 위한 CpG ODN 에서의 gtcgtt 서열의 중요성을 주장한 바와 같이 (Hartmann, G. et al., J Immunol, 2000. 164(2): p.944-53, Bauer, S., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2001. 98(16): p.9237-42), CpG2395 및 CpG685 (5'-tcgtcgacgtcgttcgttctC-3'; SEQ ID NO:46) 는 하나의 gtcgtt 서열을 갖는다. 이전 보고에서, CpG ODN 내의 5' 말단에서의 tcgt 서열이 인간 TLR9 의 활성화에 매우 중요하다고 주장되었다 (Pohar, J., et al., J Immunol, 2017. 198(5): p.2093-2104; Ohto, U., et al., Immunity, 2018. 48(4): p.649-658). 이 규칙에 따르면, 통상적인 CpG ODN, CpG2395, CpG685 및 M362 (5'-tcgtcgtcgttcgaacgacgttgaT-3'; SEQ ID NO:47) 는 TLR9 활성화 모티프로서 5' 말단에서 tcgt 서열을 갖는다.

본 발명의 ODN 중에서, A003 만이 하나의 gtcgtt 서열을 갖고 다른 것들은 gtcgtt 서열을 갖지 않으며, 본 발명의 모든 ODN 은 5' 말단에서 tcgt 서열을 갖지 않는다. 그러나, 본 발명의 모든 ODN 은 통상적인 CpG ODN, 예컨대 CpG2395, CpG685 및 M362 의 경우보다 더 강한 인간 TLR9 활성화를 나타내었다.

상기 기재된 바와 같이, 진본 CpG ODN 에서의 5'-tcgt 및 'gtcgtt' 모티프는 인간에서 TLR9 활성화 모티프로서 공지되어 있고 (Wang, X., et al., Vaccine, 2008. 26(15): p.1893-901), 본 발명의 ODN 에서의 이들 모티프는 전체 활성에 무시할만한 기여를 갖는 것으로 나타났는데, 이는 인간 TLR9 에 대한 다른 최적의 스트레치/모티프가 본 발명의 ODN 에 존재한다는 것을 시사한다.

도 1C 및 1D 에서 나타낸 바와 같이, A003 및 A003#endG 의 활성을 동일하였다. A003#delA 의 활성이 3' 말단에서 염기의 전환에 의해 약간 감소되었으나, 활성은 통상적인 CpG-ODN, CpG2395 (도 1A 에서 나타냄) 보다 훨씬 더 강하였다. 이는 3' 말단에서의 뉴클레오티드가 활성에 불필요하다는 것을 나타낸다.

또한, 도 1E, 1F 및 1G 에서 나타낸 바와 같이, 각각의 ODN 집합, A001 및 A011; A002 및 A012; A003 및 A013; 그리고 A004 및 A014 는 동일한 집합에서 또 다른 것에 대해 유사한 수준의 활성을 나타내었는데, 이는 ODN 에서의 표시된 뉴클레오티드의 대체가 ODN 의 활성에서 어떠한 유의한 변화도 제공하지 않는다는 것을 나타낸다.

종합하면, ODN 내에서 5' 말단으로부터 위치 12, 18, 21 및 25 에서의 염기의 돌연변이는 ODN 의 자극 활성의 감소를 유발하지 않을 수 있다. 본 발명의 ODN 은 TLR9 활성화 활성을 갖는 코어 구조로서 5'-tcgcaacgttt-n-cgacg-n-cg-nn-cg-3' (SEQ ID NO:2) 을 갖는 것으로 나타났다.

실시예 2

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 TLR9 를 매우 활성화시킨다.

<ODN 에 의한 인간 TLR7 및 TLR8 활성화>

HEK blue^TM TLR7 세포를 24 시간 동안 TLR 작용제로 자극하였다.

도 2A 에서 나타낸 바와 같이, TLR7 작용제 가르디퀴모드 (GQ) 및 CL264 는 TLR7 을 활성화시켰으며 양성 신호를 제공하였다. 반대로, 진본 TLR9 작용제 CpG2395 및 본 발명의 ODN 은 TLR7 신호전달 경로를 활성화시킬 수 없었다.

또한, HEK blue^TM TLR8 세포를 24 시간 동안 TLR 작용제로 자극하였다. 도 2B 에서 나타낸 바와 같이, TLR8 작용제, TL8-506 및 CL075 는 TLR8 을 활성화시켰으며 양성 신호를 제공하였다. 반대로, 진본 TLR9 작용제 CpG2395 및 본 발명의 ODN 은 TLR8 신호전달 경로를 활성화시킬 수 없었다.

실시예 3

본 발명의 올리고뉴클레오티드의 부분적 포스포로티오화를 갖는 특징적 뉴클레오티드 스트레치

TLR9 작용제 활성을 증가시키는 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 최소 스트레치의 존재를 조사하였다.

<ODN>

부분적 포스포로티오화를 갖는 뉴클레오티드간 연결을 갖는 단일 가닥 ODN 을 표 5 에서 열거한 바와 같이 제조하였다.

[표 5]

소문자는 뉴클레오시드가 3' 에서 뉴클레오티드간 연결에서 포스포로티오에이트-변형된다는 것을 나타내고, 대문자는 뉴클레오시드가 3' 에서 변형되지 않거나 (포스포디에스테르 연결 없음) 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연결을 갖는다는 것을 나타낸다.

<ODN 의 TLR9 작용제 활성의 분석>

CAL-1/NF-kB-GFP 세포에서의 GFP 발현에 의해 ODN 의 작용제 활성을 분석하였다.

도 3A 에서 나타낸 바와 같이, 전체 PS A003 은 6 시간 자극 동안 시험 농도에서 낮은 활성을 나타낸다. 진본 전체 PS CpG ODN 의 CG 모티프에서 포스포디에스테르 (PO) 결합을 갖는 뉴클레오티드간 연결의 변화가 TLR9 의 활성화를 위한 활성을 증가시킨 것으로 보고된 바 있으므로 (Pohar, J., et al., Sci Rep, 2017. 7(1): p.14598., WO2004016805A), PO 결합을 갖는 CG 모티프를 가지며 A003 과 동일한 서열을 보유하는 A103 및 A203 은 증가된 활성을 나타내었다. 그러나, ODN (A303) 의 CAACG 스트레치에서의 CA 에서의 추가적인 PO 결합은 도 3A 및 3B 에서 나타낸 바와 같이 활성을 더 상향 조절한다. 도 3B 의 좌측 패널 (0.1 μM) 에서 볼 수 있는 바와 같이, A303 은 A103 및 A203 의 경우보다 상당히 더 강한 활성을 나타내었다. 이는 활성에 대한 CAACG 스트레치 (CaaCg) 내의 PO 결합의 중요성을 시사한다.

도 3C 에서 나타낸 바와 같이, A403 및 A503 은 A303 의 경우보다 감소된 활성을 나타낸 한편, A403 및 A503 둘 모두는 A303 의 경우보다 PO 결합을 갖는 CG 모티프의 수가 증가하였다. 이는 진본 CpG ODN 에서 PO 결합을 갖는 CG 모티프의 수가 이전에는 활성을 위해 중요하다고 여겨졌지만 (WO2004016805A), 본 발명의 ODN 에서 PO 결합을 갖는 CG 모티프의 수는 활성을 위해 중요하지 않다는 것을 나타낸다. 중요하게는, A403 및 A503 둘 모두는 CaaCg 스트레치 (CAACG 모티프 내 2 개의 PO 결합) 를 갖지 않는다. A603 및 A503 이 CG 모티프에서 동일한 수의 PO 결합을 갖지만, A603 은 A503 의 경우보다 더 양호한 활성을 나타내었다. A603 은 A303 과 같이 CaaCg 스트레치를 유지하며 A303 과 유사한 활성을 나타내었는데, 이는 최적 활성을 위한 PO 결합을 갖는 증가한 수의 CG 모티프와 비교하여 CaaCg 스트레치의 중요성을 시사한다. A703 은 모든 CG 모티프에서 PO 결합을 갖지만 A303 및 A603 (0.1 μM 에서의 자극) 의 경우보다 더 작은 활성을 나타내었는데, 이는 PO 결합을 갖는 CG 모티프의 수 증가가 본 발명의 ODN 의 최대화된 활성을 위해 불필요하다는 것을 나타낸다. PO 결합을 갖는 CG 모티프의 총 수는 활성의 최적화에 있어서 무시할 수 있으며, 이는 Py (피리미딘)-PO-Pu (퓨린) 의 이전에 공지된 효과로부터 예상되지 않는다 (WO2004016805A).

도 3D 에서 나타낸 바와 같이, CaaCg 스트레치의 중요성을 ODN 에 의해 유도된 염증성 사이토카인 생성의 검출에 의해 추가로 확인하였다. A303 및 A603 은 서로 유사한 수준의 사이토카인을 유도하였으며 생성 수준은 A403 및 A503 의 경우보다 더 높았다.

CaaCg 스트레치의 중요성을 이전에 보고된 CpGs, DV093 및 DV094 에서 조사하였다 (도 3E). DV093 및 DV094 둘 모두가 그의 서열에서 caacg 모티프를 갖지만, 그의 활성은 A003 보다 훨씬 더 작았다.

흥미롭게도, DV093C 및 DV094C 에서 CaaCg 스트레치 (부분적 포스포로티오화를 갖는 CAACG 모티프) 는 본래의 DV093 또는 DV094 와 비교하여 그의 활성을 증가시킬 수 없었다. DV093 및 DV094 에서 caacg 스트레치를 CaaCg 로 변화시키는 뉴클레오티드간 연결에서의 변화는 도 3F 에서 나타낸 바와 같이 활성을 개선시키지 않았다.

이들 데이터는 무작위로 위치된 CaaCg ODN 이 아닌 본 발명의 ODN 에서의 것과 같은 특이적 CaaCg 스트레치의 존재가 TLR9 활성을 증가시키는 고유한 특성을 갖는다는 것을 시사한다. 종합하여, 5'-tCgCaaCg 스트레치 (예컨대 A303 및 A603 에서의 것) 는 본 발명의 ODN 의 코어 구조 내에 존재할 수 있다.

실시예 4

본 발명의 ODN 의 코어 구조

<ODN>

부분적 포스포로티오화를 갖는 뉴클레오티드간 연결을 갖는 단일 가닥 ODN 을 표 6 에서 열거한 바와 같이 제조하였다.

[표 6]

ODN 의 활성을 CAL-1/NF-kB-GFP 세포에서의 GFP 발현에 의해 분석하였다. 도 4A 및 4B 에서 나타낸 바와 같이, 3' 부위에서 위치 18, 21 및 22 에서 다양한 염기를 갖는 모든 시험한 ODN 은 서로 유사한 수준의 활성을 나타내었으며 이들의 활성은 CpG2006 과 같은 진본 CpG ODN 의 경우보다 훨씬 더 높았다. 이는 ODN 의 3' 부위에서 위치 18, 21 및 22 에서의 염기가 활성에 불필요하다는 것을 나타낸다.

상기 기재된 바와 같이, 진본 CpG ODN 에서의 'gtcgtt' 모티프는 인간의 경우 TLR9 활성화 모티프로서 공지되어 있고 (Wang, X., et al., Vaccine, 2008. 26(15): p.1893-901), CpG2006 은 서열에서 3 개 모티프를 갖는다. 한편, A603 은 시험한 ODN 중에서 단일 모티프만을 가지며 A603 을 포함하는 모든 시험한 ODN 은 유사한 수준의 활성을 나타내었는데, 이는 인간 TLR9 활성을 위한 다른 최적의 모티프 또는 스트레치가 본 발명의 ODN 에 존재한다는 것을 나타낸다. 또한, 데이터는 그의 3' 부위에서 Cg-nn-Cg 스트레치를 유지하는 한, 본 발명의 ODN 에서의 'gtcgtt' 모티프가 전체 활성에 무시할 수 있는 기여를 갖는 것으로 나타났다는 것을 나타낸다. 본 발명에서 ODN 의 3' 말단은 코어 구조로서 g-n-Cg-nn-Cg 를 필요로 한다.

도 5A 및 5B 에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 ODN 뿐만 아니라 진본 TLR9 작용제 CpG2395 는 TLR7 및 TLR8 신호전달 경로 둘 모두를 활성화시킬 수 없었는데, 이는 본 발명의 ODN 이 TLR9 작용제였음을 시사한다.

실시예 5

본 발명의 부분적으로 탈포스포로티오에이트화된 ODN 은 TLR7 및 TLR8 활성을 갖지 않는다.

<ODN>

부분적 포스포로티오화를 갖는 뉴클레오티드간 연결을 갖는 단일 가닥 ODN 을 표 7 에서 열거한 바와 같이 제조하였다.

[표 7]

ODN 의 활성을 CAL-1/NF-kB-GFP 세포에서의 GFP 발현에 의해 분석하였다. 도 6A, 6B 및 6C 에서 나타낸 바와 같이, 위치 12 에서 3' 측에서 뉴클레오티드간 연결 및/또는 염기의 변이를 갖는 모든 시험한 ODN 은 NF-kB 활성화에 대해 유사한 활성 수준을 나타내었다. 이는 위치 12 에서 뉴클레오티드가 돌연변이를 허용하며 뉴클레오티드의 3' 에서의 뉴클레오티드간 연결이 PO 또는 PS 연결일 수 있다는 것을 나타낸다.

도 7A 및 7B 에서 나타낸 바와 같이, ODN 뿐만 아니라 진본 TLR9 작용제 CpG2395 는 TLR7 및 TLR8 신호전달 경로 둘 모두를 활성화시킬 수 없었는데, 이는 ODN 이 TLR9 활성화제였음을 시사한다.

실시예 1 내지 5 로부터 종합하면, 본 발명의 ODN 은 5'-tcgcaacgttt-n-cgacg-n-cg-nn-cg-3' (SEQ ID NO:2) 을 코어 서열로서 갖는 것으로 나타났다. 최대 인간 TLR9 자극 활성을 위해, ODN 은 바람직하게는 5'-tCgCaaCgttt-n-cgacg-n-Cg-nn-Cg-3'(SEQ ID NO:5) 을 코어 구조로서 갖는다.

또한, 본 발명의 ODN 가 이전에 보고된 규칙을 따르지 않으므로, 본 발명의 ODN 은 보고된 진본 CpG ODN 과 구별되고 신규한 유형의 TLR9 작용제이다.

실시예 6

인간 세포에서 TLR9 자극 수준의 평가

<HAL-01 세포의 자극>

인간 B-ALL 세포주, HAL-01 세포를 DSMZ (Cat. ACC610) 로부터 구입하였다. HAL-01 세포를 10% FBS-RPMI 완전 배지로 유지하고, 24 시간 동안 1.0 μM 에서 ODN 으로 자극하였다. 세포를 APC 컨쥬게이션된 항-CD40 Ab (eBiosciences) 및 PE 컨쥬게이션된 항-CD86 Ab (BD Pharmingen) 로 염색하였다. CD40 및 CD86 발현의 유도를 유세포 분석기로 평가하였다.

<인간 PBMC 의 자극>

제조된 인간 PBMC (5x10⁵ 세포/200 μl) 를 24 시간 동안 0.1 μM 또는 0.3 μM 에서 ODN 으로 자극하였다. 세포 증식을 제조사의 프로토콜에 따라 WST-1 어세이 (Roche) 로 평가하였다. 배양 상청액을 회수하고, 사이토카인 생성을 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA 로 평가하였다.

인간 B 세포는 TLR9 를 발현하고 따라서 TLR9 작용제는 인간 B 세포를 활성화시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 인간 B-ALL 세포주는 TLR9 작용제로 자극되었으며 공동-자극 분자, 예컨대 CD40 및 CD86 의 표면 발현은 자극으로 상향-조절되었다는 것이 입증되었다. 도 8A 에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 ODN 은 B-ALL 세포주, HAL-01 세포를 활성화시켰으며 이는 CD40 및 CD86 의 상향조절된 표면 발현에 의해 나타났다.

본 발명의 ODN 은 인간 PBMC 의 증식 및 염증성 사이토카인 생성을 유도할 수 있다는 것이 입증되었다. 도 8B 및 8C 에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 ODN 은 인간 PBMC 를 활성화시킬 수 있었으며 이는 세포 증식 및 염증성 사이토카인 생성, 예컨대 IFN-α, IL-6 및 IL-12 를 유도하였다.

실시예 7

마우스 세포에서 TLR9 자극 수준의 평가

<마우스 비장 세포 (비장세포) 의 자극>

준비된 비장세포를 0.03 μM 에서 24 시간 동안 ODN 으로 자극하였다. 배양 상청액을 회수하고, 사이토카인 생성을 제조사의 프로토콜에 따라 배양 상청액의 ELISA 로 평가하였다.

준비된 비장세포를 24 시간 동안 다양한 농도에서 ODN 으로 자극하였다. 세포 증식을 제조사의 프로토콜에 따라 WST-1 어세이 (Roche) 로 평가하였다.

TLR9 작용제가 염증성 사이토카인 생성 및 마우스 비장세포의 증식을 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다. 도 9A 에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 ODN 은 TNF-α 및 IL-12 와 같은 마우스 염증성 사이토카인 생성을 유도할 수 있었다. 또한, 도 9B 및 9C 에서 나타낸 바와 같이, ODN 은 마우스 비장세포의 증식을 유도하였다. ODN 의 활성은 진본 TLR9 작용제 CpG2395 및 CpG2006 의 경우보다 명백히 더 높았다.

시험한 ODN A601, A602 및 A603 은 구조 5'-tCgCaaCgttt-n-cgacg-n-Cg-nn-Cg -3'(SEQ ID NO:5) 을 코어 구조로서 가지며 이들 ODN 은 마우스 비장세포 뿐만 아니라 인간 PBMC 를 활성화시킬 수 있었다. 이는 'tCgCaaCg' 및 'Cg-nn-Cg' 구조와 같은 정확한 위치에서 정의된 PO 상호-연결 결합이 인간 및 인간 모두에서 최적 TLR9 활성화에 중요할 것임을 나타낸다.

실시예 8

ODN 의 생체내 항종양 효능

<CT26 세포>

BALB/c-유래 마우스 결장 암종 세포주, CT26 을 American Type Culture Collection (ATCC, CRL-2638) 으로부터 구입하였다. CT26 세포를 37℃ 에서 가습 대기 및 5% CO2 조건 하에 10% FBS-RPMI 완전 배지와 함께 배양하였다.

<마우스에 CT26 세포의 접종>

CT26 세포를 PBS 중 0.25% 트립신-EDTA 용액으로 회수하였다. 배지에 현탁한 후, 세포를 40 μm 거르개를 통과시키고 세포 수로 계수하였다. 현탁액 중 세포의 농도를 2x10⁶ 세포/ml 로 조정하였다. BALB/c 마우스에 접종하기 위해, 100 μl 의 세포 현탁액을 마우스 당 사용하였다 (2x10⁵ 세포/마우스). 마우스의 등을 면도한 후, 100 μl 의 CT26 세포 현탁액을 28 게이지 바늘로 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 부피가 약 150 mm³ 에 도달할 때까지 마우스를 2 주 동안 미처리 상태로 유지하였다. 종양 부피를 2 또는 3 일마다 측정하고, 마우스를 종양 부피를 기준으로 3 개 군으로 나누었다.

종양 부피를 하기 식으로 계산하였다:

종양 부피 (mm³) = 1/2 (길이 x 너비²)

<ODN 의 투여>

종양 부근으로의 ODN 의 투여 (40 μg/50 μl/마우스) 를 그룹화 일 (제 0 일) 에 시작하고, 제 2 일에 반복하였다. 본 발명의 ODN 의 투여를 연구 동안 총 2 회 실시하였다. 각각의 군 마우스의 종양 부피 및 체중을 2 또는 3 일마다 측정하였다.

도 10 에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 ODN 의 투여는 마우스에서 종양 퇴행을 명백히 유도하였다. 제 11 일에, 거의 모든 마우스에서의 종양이 ODN 의 투여에 의해 거부되었다 (도 10A 및 10B). 연구 동안 마우스의 각각의 군에서 체중 손실이 관찰되지 않았다 (도 10C). 이는 ODN (A601 및 A602) 이 항종양 활성을 가지며 독성이 거의 없음을 나타낸다. A601, A602 및 A603 이 도 9B 에 나타낸 바와 같이 마우스 비장세포에서 동일한 활성을 나타내었다는 사실을 고려하면, A603 은 A601 및 A602 의 경우와 동일한 강한 항종양 활성을 나타낼 것이다. 본 발명의 ODN 은 항종양 활성을 갖는 것으로 입증되었다.

실시예 9

ODN 의 생체내 항종양 효능 (2)

<CT26 세포의 접종 및 ODN 으로의 처리>

CT26 세포를 상기 기재된 바와 같이 BALB/c 마우스의 우측 옆구리에 접종하였다. 종양 부피가 약 100 mm³ 에 도달할 때까지 마우스를 2 주 동안 미처리 상태로 유지하였다. 종양 부피를 2 또는 3 일마다 측정하고, 마우스를 종양 부피를 기준으로 3 개 군으로 나누었다. 종양 부근으로의 ODN (A601 및 A602) 의 투여 (40 μg/50 μl/마우스) 를 그룹화 일 (제 0 일) 에 시작하고, 제 2 일에 반복하였다. 본 발명의 ODN 의 투여를 연구 동안 총 2 회 실시하였다. 음성 대조군으로서, ODN 을 함유하는 용액 대신에 PBS 를 투여하였다. 각각의 군 마우스의 종양 부피 및 체중을 종양 거부가 확인될 때까지 (제 14 일) 2 또는 3 일마다 측정하였다.

종양 부피를 하기 식으로 계산하였다:

종양 부피 (mm³) = 1/2 (길이 x 너비²)

<처리된 마우스에서 CT26 세포의 재접종>

종양을 접종하고 종양 거부가 확인된 마우스의 좌측 옆구리에 CT26 세포 (2x10⁵) 를 제 14 일에 재접종하고, 미처리 상태로 더 유지하였다. 각각의 마우스에서 좌측 옆구리의 종양 부피는 CT26 재접종 후 제 14 일까지 2 또는 3 일마다 측정하였다.

도 11A 에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 ODN 의 투여는 마우스에서 종양 거부를 명백히 유도하였다. 또한, ODN 으로 처리된 마우스도 종양이 거부되었다 (도 11B). 좌측 옆구리에서의 종양이 본 발명의 ODN 으로 처리하지 않은 마우스에서 성장하였지만, ODN 으로 처리한 모든 마우스는 2 주 동안 어떠한 추가 처리 없이 재챌린지된 종양이 거부되었다 (도 11B). 이는 본 발명의 ODN 이 항종양 면역력의 기억을 유도하고 확립할 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 10

폐 전이에 대한 ODN 의 생체내 효능

<CT26 폐 전이 모델>

CT26 세포의 세포 현탁액을 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 현탁액을 2.5x10⁶ 세포/ml 의 최종 농도로 조정하였다. CT26 세포의 폐 전이 유도를 위해, 200 μl 의 세포 현탁액을 28 게이지 바늘을 사용하여 꼬리 정맥으로부터 BALB/c 마우스에 정맥내 (I.V.) 주사하였다 (5x10⁵ 세포/마우스) (제 0 일). 제 2 일에, ODN 의 투여를 시작하였다 (등 피부에 피하 주사, 40 μg/50 μl/마우스). 동일 용량의 투여를 제 5 일에 반복하였다. 음성 대조군으로서, ODN 을 함유하는 용액 대신에 PBS 를 투여하였다.

CT26 세포의 이식 후, 마우스의 체중 측정 및 거동 관찰을 주 3 회 실행하였다. 제 18 일에, 마우스를 희생시키고, 폐 중량을 측정하였다. 마우스로부터의 각각의 폐에서의 전이성 종양 결절을 또한 계수하였다.

도 12 에서 나타낸 바와 같이, PBS 처리군에서의 마우스의 폐 중량이 급격히 증가하였으며, 많은 종양 결절이 관찰되었다. 반대로, 본 발명의 ODN 으로 처리된 군의 마우스에서는 이러한 폐 중량 증가가 관찰되지 않았다. 또한, 치료군의 마우스에서는 적은 수의 종양 결절만이 관찰되었다. 이는 본 발명의 ODN 이 폐에서 전이성 암 세포의 성장을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 11

투여 경로의 변화에 따라 조사된 ODN 의 생체내 효능

<CT26 폐 전이 모델>

CT26 세포를 이용한 폐 전이의 유도를 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. CT26 세포 주입 다음 날, ODN, A602 의 투여를 시작하였다. 이 연구에서, 두 개의 투여 경로를 시험하였다. 하나는 등의 피부에 대한 피하 (S.C.) 주사이고 (25 μg/50 μl/마우스), 다른 것은 귀 뿌리 내로의 피내 (I.D.) 주사이다 (25 μg/20 μl/마우스). 동일한 용량으로의 투여를 제 3 일 및 제 5 일에 반복하였다. CT26 세포의 이식 후, 마우스의 체중 측정 및 거동 관찰을 주 3 회 실행하였다. 제 16 일에, 마우스를 희생시키고 마우스로부터의 각각의 폐에서의 전이성 종양 결절을 계수하였다.

<CT26 간 전이 모델>

CT26 세포의 세포 현탁액을 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 세포 현탁액을 1.0x10⁶ 세포/ml 의 최종 농도로 조정하였다. CT26 세포의 간 전이 유도를 위해, 100 μl 의 세포 현탁액을 하기 기재된 바와 같이 비장에 주입하였다 (1x10⁵ 세포/마우스) (제 0 일). 간략하게는, 마우스를 마취시키고 피부를 면도하였다. 복부 절개 (0.5 cm) 를 비장에 인접하게 만들었다 (좌측 옆구리 절개는 복부 중간선의 대략 2 cm 좌측이었다). 제조된 CT26 세포 현탁액을 30 G 바늘을 사용하여 비장에 주입하고, 주입 후 5 분 동안 비장 내에서 유지하였다. 출혈을 방지하기 위해, 비장으로 이어지는 혈관을 수술용 봉합사로 단단히 묶은 다음, 날카로운 가위로 비장을 절제하였다. 복막 및 피부를 봉합하고 마우스를 빛 아래에서 가온시켰다. 마취로부터 마우스의 회복을 모니터링하고 확인하였다. 제 2 일에, 마우스를 체중을 기준으로 3 개 군으로 나누고, ODN, A602 의 투여를 시작하였다. 이 연구에서, 두 개의 투여 경로를 시험하였다. 하나는 등의 피부에 대한 S.C. 주사이고 (12.5 μg/50 μl/마우스), 다른 것은 귀 뿌리 내로의 I.D. 주사이다 (12.5 μg/20 μl/마우스). 동일 용량의 투여를 제 5 일, 제 8 일 및 제 12 일에 반복하였다. CT26 세포의 이식 후, 마우스의 체중 측정 및 거동 관찰을 주 3 회 실행하였다. 제 20 일에, 마우스를 희생시키고 마우스로부터의 각각의 간에서의 전이성 종양 결절을 계수하였다.

도 13A 에서 나타낸 바와 같이, 많은 종양 결절이 PBS 처리군에서 관찰되었다. 반대로, S.C. 또는 I.D. 경로로 처리된 군 둘 모두에서 적은 수의 종양 결절만이 관찰되었다. 흥미롭게도, 귀 뿌리 내로의 I.D. 투여는 S.C. 투여의 경우보다 양호한 효능을 나타내었다. 이러한 결과는 본 발명의 ODN 이 폐에서 전이성 암 세포의 성장을 차단할 수 있으며 전신 효능을 달성할 수 있다는 것을 나타낸다.

도 13B 에서 나타낸 바와 같이, 심한 간 전이가 또한 PBS 처리군에서 관찰되었다. 반대로, S.C. 또는 I.D. 경로에 의해 처리된 군 둘 모두에서 종양 결절이 관찰되지 않았는데, 이는 본 발명의 ODN 이 간에서 전이성 암 세포의 성장을 방지할 수 있으며 전신 효능을 달성할 수 있다는 것을 나타낸다.

종합하면, 본 발명의 ODN 은 전이성 종양 성장을 전신 차단 및 거부할 수 있다.

실시예 12

인간 PBMC 의 항종양 면역력의 활성화

<인간 B-ALL 세포 및 인간 PBMC 의 공동 배양>

준비된 인간 PBMC (5x10⁵ 세포) 를 3 일 동안 200 μl 의 10% FBS-RPMI-완전 배지 중 ODN (0.1 μM) 과 함께 인간 B-ALL 세포주, RCH-ACV (5x10⁴ 세포) 와 공동 배양하고, 공동 배양된 세포를 회수하였다. 인간 PBMC 에 의한 RCH-ACV 의 제거를 APC 컨쥬게이션된 항-CD19 Ab 및 FITC 컨쥬게이션된 항-CD138 Ab 로 염색함으로써 구별되는 RCH-ACV 세포의 감소에 의해 평가하였다. 인간 PBMC 단독 및 RCH-ACV 단독을 염색 대조군으로서 사용하였다. CD19 및 CD138 이중 양성 세포 (RCH-ACV) 의 존재를 유세포분석기로 분석하였다. 자극되지 않은 PBMC 중의 RCH-ACV 의 존재를 도 14B 에서 100% 로서 설정하였다.

<인간 결장 암종 세포 및 인간 PBMC 의 공동 배양>

준비된 인간 PBMC (5x10⁵ 세포) 를 3 일 동안 200 μl 의 10% FBS-RPMI-완전 배지 중 ODN (0.1 μM) 과 함께 인간 결장 암종 세포, COLO205 (ATCC, CCL-222) (5x10⁴ 세포) 와 공동 배양하고, 공동 배양된 세포를 회수하였다. 인간 PBMC 에 의한 COLO205 의 제거를 APC 컨쥬게이션된 항-CD24 Ab 및 FITC 컨쥬게이션된 항-CD45 Ab 로 염색함으로써 구별되는 COLO205 세포의 감소에 의해 평가하였다. 인간 PBMC 단독 및 COLO205 단독을 염색 대조군으로서 사용하였다. CD24 양성/CD45 음성 세포 (COLO205) 의 존재를 유세포분석기로 분석하였다. 자극되지 않은 PBMC 중의 COLO205 의 존재를 도 15B 에서 100% 로서 설정하였다.

도 14A 에서 나타낸 바와 같이, RCH-ACV 세포는 CD19 및 CD138 이중 양성인 한편, CD19 및 CD138 이중 양성 세포는 준비된 인간 PBMC 단독에서 관찰되지 않았다. 인간 PBMC 및 RCH-ACV 를 무자극 조건에서 공동 배양한 경우, RCH-ACV 세포의 8.6% 가 검출되었다. A601, A602 및 A603 의 존재 하에서, 배양된 세포에서 단지 0.2% 내지 0.3% 의 RCH-ACV 가 검출되었는데, 이는 인간 PBMC 가 본 발명의 ODN 에 반응하여 거의 모든 RCH-ACV 세포를 제거하였다는 것을 나타낸다. 도 14B 에서 나타낸 바와 같이 혈액암 세포의 제거 효능을 추가로 확인하였다.

도 15A 에서 나타낸 바와 같이, COLO205 세포는 CD24 양성 및 CD45 음성인 한편, 이러한 세포는 준비된 인간 PBMC 단독에서 관찰되지 않았다. 인간 PBMC 및 COLO205 를 무자극 조건에서 공동 배양한 경우 (ODN 이 없는 배양), COLO205 세포의 19.2% 가 검출되었다. A601, A602 및 A603 의 존재 하에서, 배양된 세포에서 단지 0.5% 내지 0.9% 의 COLO205 가 검출되었는데, 이는 인간 PBMC 가 본 발명의 ODN 에 반응하여 거의 모든 COLO205 세포를 제거하였다는 것을 나타낸다. 도 15B 에서 나타낸 바와 같이 제거 효능을 추가로 확인하였다.

종합하면, 본 발명의 ODN 을 갖는 활성화된 인간 PBMC 는 혈액학적 악성 종양 및 고형 종양 둘 모두를 제거할 수 있다는 것이 시사된다.

실시예 13

A601, A602 및 A603 외의 ODN 의 효능

인간 PBMC 및 마우스 비장세포를 24 시간 동안 본 발명의 ODN (0.15 μM) 으로 자극하고, 세포 증식을 WST-1 어세이로 평가하였다.

인간 PBMC 를 실시예 12 에서 수행한 바와 같이 3 일 동안 본 발명의 ODN (0.1 μM) 과 함께 암 세포 (RCH-ACV 또는 COLO205) 와 공동 배양하였다. 인간 PBMC 에 의한 암 세포의 제거를 조사하였다. 자극되지 않은 PBMC 중의 암 세포의 존재를 도 16B 에서 100% 로서 설정하였다.

이전에 도 6 에서 나타낸 비와 같이, 모든 ODN, A601, A602, A601G, A611A, A602G 및 A612A 는 CAL-1/NF-kB-GFP 세포에서 조사하였을 때 TLR9 활성화의 활성에 있어서 유사한 수준을 나타내었다. ODN 이 1 차 인간 PBMC 및 마우스 세포에서 동일한 형질을 나타내는지를 평가하기 위해, ODN A601G, A611A, A602G 및 A612A 를 이전에 A601 및 A602 로 시험한 여러 어세이 시스템에서 평가하였다. 도 16A 에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 모든 시험된 ODN 은 인간 PBMC 및 마우스 비장세포 둘 모두에서 유사한 규모로 세포 증식을 유도하였다. 또한, 도 16B 에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 모든 시험된 ODN 은 인간 PBMC 의 존재 하에 암 세포의 유의한 제거를 유도하였다. 이러한 결과는 ODN, A601G, A611A, A602G 및 A612A 를 갖는 활성화된 인간 PBMC 가 A601 및 A602 의 경우에서와 같이 혈액학적 악성 종양 및 고형 종양 둘 모두를 제거할 수 있다는 것을 나타낸다.

종합하면, CAL-1/NF-kB-GFP 세포에서 A601 또는 A602 의 경우와 유사한 수준의 활성을 나타낸 본 발명의 모든 ODN 은 마우스에서 항종양 면역 반응 뿐만 아니라 인간 PBMC 에서 인간 암 세포의 제거를 유도한다는 것이 시사된다.

산업적 이용가능성

본 발명은 신규한 올리고뉴클레오티드 및 그의 유도체 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드에서 선택된 올리고뉴클레오티드(들) 를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 올리고뉴클레오티드에서 선택된 올리고뉴클레오티드(들) 의 투여에 의한 표적 질환의 치료 방법을 제공한다.

<110> SBI Biotech Co., Ltd. <120> Novel TLR9 Agonists <130> FP4645PCT <150> JP 2020-002715 <151> 2020-01-10 <160> 63 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> common sequence motif <400> 1 tcgcaacgtt t 11 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> common sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n stands for any base <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n stands for any base <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n stands for any base <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> n stands for any base <400> 2 tcgcaacgtt tncgacgncg nncg 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> common sequence motif <400> 3 tcgcaacgtt trcgacgkcg bdcg 24 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> common sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (22) <223> n stands for any base <400> 4 tcgcaacgtt trcgacgkcg bncgr 25 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial 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<220> <221> modified_base <222> (13)..(18) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <220> <221> modified_base <222> (20)..(22) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <220> <221> modified_base <222> (24) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <400> 43 tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgg 25 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A613AendG <220> <221> modified_base <222> (1) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <220> <221> modified_base <222> (3) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <220> <221> modified_base <222> (5)..(6) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <220> <221> modified_base <222> (8)..(11) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <220> <221> modified_base <222> (13)..(18) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <220> <221> modified_base <222> (20)..(22) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <220> <221> modified_base <222> (24) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <400> 44 tcgcaacgtt tacgacgtcg ttcgg 25 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG2395 <220> <221> modified_base <222> (1)..(21) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <400> 45 tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG685 <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <400> 46 tcgtcgacgt cgttcgttct c 21 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M362 <220> <221> modified_base <222> (1)..(24) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <400> 47 tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D60-1 <220> <221> modified_base <222> (1)..(29) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <400> 48 tcgaacgttc gaacgttcga acgttcgaat 30 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DV093 <220> <221> modified_base <222> (1) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <220> <221> modified_base <222> (3)..(17) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <400> 49 tcgtgcatcg atgcaacg 18 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DV093C <220> <221> modified_base <222> (1) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <220> <221> modified_base <222> (3)..(13) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <220> <221> modified_base <222> (15)..(16) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <400> 50 tcgtgcatcg atgcaacg 18 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DV094 <220> <221> modified_base <222> (1)..(17) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <400> 51 aacaacaacg ttgttgtt 18 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DV094C <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <220> <221> modified_base <222> (4)..(5) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <220> <221> modified_base <222> (7)..(8) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <220> <221> modified_base <222> (10)..(17) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <400> 52 aacaacaacg ttgttgtt 18 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG2006 <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> phosphorothioate-modified at 3' internucleotide bond <400> 53 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A sequence of the invention <400> 54 tcgcaacgtt tgcgacgtcg gtcga 25 <210> 55 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A sequence of the invention <400> 55 tcgcaacgtt tgcgacggcg ctcga 25 <210> 56 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A sequence of the invention <400> 56 tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcga 25 <210> 57 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A sequence of the invention <400> 57 tcgcaacgtt tgcgacggcg ttcga 25 <210> 58 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A sequence of the invention <400> 58 tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcg 24 <210> 59 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A sequence of the invention <400> 59 tcgcaacgtt tgcgacgtcg ttcgg 25 <210> 60 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A sequence of the invention <400> 60 tcgcaacgtt tacgacgtcg gtcga 25 <210> 61 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A sequence of the invention <400> 61 tcgcaacgtt tacgacggcg ctcga 25 <210> 62 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A sequence of the invention <400> 62 tcgcaacgtt tacgacgtcg ttcga 25 <210> 63 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A sequence of the invention <400> 63 tcgcaacgtt tacgacggcg ttcga 25

Claims (34)

1. 서열 모티프 5'-tcgcaacgttt-3' (SEQ ID NO:1) 및 5'-cgacg-3' 를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드.
2. 제 1 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열 모티프 5'- tcgcaacgttt-n-cgacg-n-cg-nn-cg-3' (SEQ ID NO:2) 를 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드로서, n 이 임의의 염기를 나타내는 것인 올리고뉴클레오티드.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 총 염기 수가 20 내지 25 인 올리고뉴클레오티드.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 서열 모티프를 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드:
   

   
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 연결(들) 이 부분적으로 또는 완전히 화학적으로 변형되는 것인 올리고뉴클레오티드.
6. 제 5 항에 있어서, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드간 연결이 포스포로티오에이트화되는 것인 올리고뉴클레오티드.
7. 제 6 항에 있어서, 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 부분적으로 포스포로티오에이트화된 올리고뉴클레오티드 스트레치를 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드로서:
   

   

   
   

   

   
   대문자가 3' 에서 변형된 뉴클레오티드간 연결을 갖지 않는 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자가 3' 에서 포스포로티오화를 갖는 뉴클레오티드간 연결을 갖는 뉴클레오시드를 나타내는 것인 올리고뉴클레오티드.
8. 제 6 항에 있어서, 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 부분적으로 포스포로티오에이트화된 올리고뉴클레오티드 스트레치를 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드로서,
   

   

   
   대문자가 3' 에서 변형된 뉴클레오티드간 연결을 갖지 않는 뉴클레오시드를 나타내고, 소문자가 3' 에서 포스포로티오화를 갖는 뉴클레오티드간 연결을 갖는 뉴클레오시드를 나타내는 것인 올리고뉴클레오티드.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 로 구성되는 것인 올리고뉴클레오티드.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 여러 뉴클레오티드(들) 가 추가로 결실, 대체 또는 부가되는 것인 올리고뉴클레오티드.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 벡터 내에 포함되는 것인 올리고뉴클레오티드.
12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 원형화되는 것인 올리고뉴클레오티드.
13. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 선형인 올리고뉴클레오티드.
14. 제 13 항에 있어서, 선형 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 인산을 갖지 않는 것인 올리고뉴클레오티드.
15. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 및 이의 상보적 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드.
16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 활성 분자와 컨쥬게이션되는 올리고뉴클레오티드.
17. 제 16 항에 있어서, 활성 분자가 (폴리)펩티드/항체 및 핵산/올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 올리고뉴클레오티드.
18. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 컨쥬게이션이 링커를 통해 이루어지는 것인 올리고뉴클레오티드.
19. 제 18 항에 있어서, 링커가 글리세롤, (S)-(-)-1,2,4-부탄트리올, 1,3,5-펜탄트리올, 시스,시스-1,3,5-시클로헥산트리올, 시스트랜스-1,3,5-시클로헥산트리올, 1,3,5-트리스-(2-히드록시에틸)이소시아누레이트, 테트라에틸렌글리콜, 및 헥사에틸렌글리콜, 디올 예컨대 1,3-프로판 디올 또는 도데칸-1,12-디올, 시클로헥산디올, 콜레스테롤, 니트로인돌, 트리에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜, d-스페이서, PEG-스페이서 및 알킬 링커로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 올리고뉴클레오티드.
20. 치료적 유효량의 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
21. 치료적 유효량의 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 표적 질환 또는 장애의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로서, 표적 질환 또는 장애가 신생물, 감염성 질환, Th2/Th17 과 관련된 질환, 1차성 면역결핍 질환 및 외상후 스트레스 장애 (PTSD) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 약학 조성물.
22. 치료적 유효량의 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 대상체에서의 면역 반응의 조절제.
23. 제 21 항에 있어서, 표적 질환 또는 장애가 악성 신생물, 상피 신생물 또는 조혈 기관 종양, 육종, 중피종, 양성 종양, 이형성증 및 화생으로 이루어지는 군에서 선택되는 신생물인 약학 조성물.
24. 제 21 항에 있어서, 표적 질환 또는 장애가 바이러스, 박테리아 및 진균을 포함하는 미생물에 의해 유발되는 감염성 질환인 약학 조성물.
25. 제 21 항에 있어서, 표적 질환 또는 장애가 천식, 알레르기, 다발성 경화증, 궤양성 대장염 및 크론병을 포함하는 염증성 장 질환, 피부 편평태선 및 알츠하이머병으로 이루어지는 군에서 선택되는 Th2/Th17 에 관련된 질환인 약학 조성물.
26. 제 21 항에 있어서, 표적 질환 또는 장애가 IRAK4 결핍, MyD88 결핍, Unc93B 결핍 또는 TLR 에서의 돌연변이에 의해 유발되는 1차성 면역결핍 질환인 약학 조성물.
27. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 적어도 하나의 활성 성분을 추가로 포함하는 약학 조성물.
28. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 적어도 하나의 활성 성분과 동시 투여되는 약학 조성물.
29. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서, 활성 성분이 항암 약물; 티로신 키나아제 억제제, 혈관형성 억제제 및 프로테아좀 억제제를 포함하는 분자 표적화 약물; 항암 항체 약물; 사이토카인; 백신; 항박테리아제; 항진균제; 항바이러스제; 항기생충 약물; 독소를 중화시키는 항체 약물; 다른 TLR 의 작용제 및 이의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
30. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 장관 투여, 비경구 투여, 국소 투여 및 흡입으로 이루어지는 군에서 선택되는 투약 경로를 통해 대상체에게 투여되는 것인 약학 조성물.
31. 제 30 항에 있어서, 대상체가 인간인 약학 조성물.
32. 제 31 항에 있어서, 2 내지 8 mg/일로 대상체에게 투여되는 것인 약학 조성물.
33. 신생물, 감염, Th2/Th17 과 관련된 질환, 1차성 면역결핍 질환 및 외상후 스트레스 장애 (PTSD) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의, 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드의 용도.
34. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 방사선 요법, 냉동절제, 고주파절제 및 광역학요법 (PDT) 을 포함하는 외과적 치료 또는 입양 면역 세포 치료요법 전 또는 후에 투여되는 것인 약학 조성물.

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