CN109553682B - 抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体及其在检测试纸卡中的应用 - Google Patents

抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体及其在检测试纸卡中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体及其在检测试纸卡中应用。本发明制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的一组抗体组合(NG02及NG19)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能可满足人血液或尿液样本检测的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡。

Description

抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体及其在检测试 纸卡中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的涉及两种抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体及其制备方法以及上述抗体在人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白定量检测中的应用。
背景技术
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associatedlipocalin,NGAL)，又称载脂蛋白-2(Lipocalin-2)，属于lipocalin超家族的成员，是一种相对分子质量为25kDa的分泌型糖蛋白。在一系列临床研究中，已证明NGAL对于急性肾损伤具有诊断和评估预后的价值。目前，NGAL是诊断急性肾损伤的重要标志物。发生急性肾损伤时血、尿NGAL的水平均升高。因此，尿和血中NGAL检测可作为诊断急性肾损伤的早期、敏感且极具特异性的生物学标志物。
NGAL的检测最初采用免疫印迹法(Western Blot)，但由于该方法灵敏度和精密度低、操作复杂、重复性差等缺点现在已很少用于NGAL的定量研究。2005年丹麦BioPorto公司首先推出酶联免疫吸附法(ELISA)商品试剂盒，可用于血清(浆)、尿液的NGAL检测，标本量需100μL，检测周期约4h，检测限达到0.1ng/mL。随后，有适用于全自动免疫分析仪的分析系统面世，如美国雅培公司的Architect i2000SR全自动免疫分析仪测定尿液NGAL(化学发光微粒子免疫分析法)，标本量需150μL，检测周期约28h。化学发光法灵敏度虽高，但测定线性范围较小且检测成本较高，需要特定仪器，难以在临床上普及应用；美国博适公司的Triage分析仪检测EDTA抗凝血浆或全血(双抗体夹心免疫荧光层析法)，15h即可完成NGAL的测定，检测范围50～2000ng/mL。这些检测系统只能单一的检测尿液或者血浆，且标本用量大，检测周期长，检测范围窄，限制了其在临床的常规应用。
本试剂盒采用胶体金法，该法快速、简便，易操作，自动化程度高，且与ELISA法、免疫比浊法等均具有很好的相关性，临床应用非常广泛，与其他方法检测试剂比较，通用性较强。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一组能有效的、特异性结合人NGAL的抗体对。
本发明的第一目的在于提供两种抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体。
第一种抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体(NG02)，
其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；
以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3。
优选的是本发明中NG02抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
第二种抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体(NG19)，
其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：9所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO：11所示的HCDR3；
以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：12所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：13所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO：14所示的LCDR3。
优选的是本发明中NG19抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
本发明第二个目的是提供两种单链抗体，所述单链抗体NG02的氨基酸序列如SEQID NO:17所示；所述单链抗体NG19的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
本发明第三个目的是提供两种编码上述单链抗体的核苷酸序列，编码单链抗体NG02的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示、编码单链抗体NG19的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
本发明第四个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。
本发明第五个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主菌。
本发明第六个目的是提供一种生产上述单链抗体的方法，包括：
1)在合适的条件下培养上述重组宿主菌表达抗体；
2)然后从宿主菌中纯化、收集抗体。
本发明的第七个目的在于提供上述抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体在检测人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量中的应用。
本发明的第八个目的在于提供一组可进行配对并检测人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的抗体对组合；该抗体对组合的检测灵敏度高，特异性好。
本发明的第九个目的在于提供一种利用所述抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体检测人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡，包括样品吸收垫、金标垫、反应膜和吸水垫；所述金标垫喷涂有胶体金颗粒标记的抗体NG02，所述反应膜上有检测带和质控带，检测带位置包被有抗体NG19。
所述分封闭液是1％-10％BSA、0.01MPB溶液，pH7.4。
所述金标抗体复溶液是1％-10％BSA、5％海藻糖、0.025％tween20、0.01MPB溶液，pH7.4。
所述抗体包被液是0.25％-0.5％BSA、0.01MPB溶液，pH7.4。
所述样本稀释液是0.1％Proclin300、0.01MPBS溶液，pH7.4；所述样本稀释液还含有2％BSA或2％-2.5％tween20。
所述质控带位置包被抗His标签抗体或Protein L。所述反应膜优选硝酸纤维素膜。所述抗His标签抗体优选鼠抗His抗体。
本发明制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的一组抗体组合(NG02及NG19)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能可满足人血液或尿液样本检测的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的胶体金免疫层析定量检测卡。
附图说明
图1：抗体NG02及NG19特异性检测效果图(Western Blot)。其中图1(a)为抗体NG02；图1(b)为抗体NG19。泳道1为标准蛋白质(Marker)；泳道2为人重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白
图2：本发明胶体金免疫层析定量检测卡结构示意图。1为样品垫、2为反应膜、3为吸收垫、4为质控线(C线)、5为检测线(T线)、6为金标垫、7为PVC片材。
图3：实施例6NGAL检测卡(19-02)拟合曲线
图4：实施例6NGAL检测卡(19-02)线性范围
图5：实施例6NGAL检测卡(19-02)方法学比对相关性
具体实施方式
定义
“抗体”又称免疫球蛋白，是一类由B淋巴细胞分泌的大型Y形蛋白质，能够通过Y形的其中两个分叉顶端的互补位点(抗原结结合位)特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，所述靶抗原如蛋白质、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。
“单链抗体”(scFv)指的是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过15～20个氨基酸短肽(linker)连接形成的单一链融合蛋白，用于连接的linker通常富含甘氨酸和丝氨酸，以利于单链抗体的稳定性与柔韧性。连接方式可将VL的N端连接至VH的C末端，或者相反。尽管去除了恒定区并引入linker，单链抗体依然保留了抗体对抗原的特异性，且其具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。
互补决定区(complementarity-determining region,CDR)，也叫做高变区。成型于抗体单体氨基酸的末端，是靶抗原与抗体结合的最关键区域，在免疫网络理论中，每个抗体的互补决定区又被称为独特型或者基因型。
实施例1.抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白杂交瘤细胞株的制备
1.动物免疫以重组人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(大肠杆菌重组表达，本公司制备)按照一般免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠(购自常州卡文斯实验动物有限公司)。具体免疫情况参见《抗体制备与使用实验指南》。采用间接ELISA法跟踪免疫小鼠血清滴度，选取血清效价最高的免疫小鼠，进行小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合实验。
2.细胞融合
(1).脾脏细胞的制备将免疫小鼠，摘眼球取血，经断颈椎处死后置于75％(v/v)的酒精中浸泡10分钟，于无菌操作台中取出其脾脏，置于细胞筛网中，充分研磨细胞，过筛网，用无菌1640培养基(购自Gibco公司)离心洗涤数次后，重悬细胞以制成单细胞悬液，并计数，备用。
(2).饲养细胞的制备取8～10周龄的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球获取阴性血清，经断颈椎处死后置75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌揭开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约10mL 1640HT培养基(购自SIGMA公司)注入小鼠腹腔，轻轻按摩腹部并吹打数次。吸取含有巨噬细胞的培养基注入20％1640HAT培养基中备用；
取2～3周龄的雌性BALB/c小鼠一只，经断颈椎处死后置于75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌取胸腺于细胞筛网中，研磨，过筛网，获得胸腺细胞置于上述含有巨噬细胞的20％1640HAT培养基中，备用。
(3).细胞融合
选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0，收集并计数。取约108个上述脾细胞与2×107个上述SP2/0细胞株加入融合管中混合，1000rpm离心10分钟后弃上清(尽量弃净)，将融合管置手掌上来回轻轻摩擦以使沉淀松散。60秒内先慢后快地加入1mL预热的PEG1450(聚乙二醇1450，购自SIGMA公司)，加入1640HT培养基30mL终止，1000rpm离心10分钟，去上清，轻轻摩擦使沉淀松散，加入步骤2所获得的20％的1640HAT培养基中。
将上述HAT培养基充分混匀后，以200μL/孔分装至96孔细胞培养板中，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。一周后用10％1640HT培养基替换20％1640HAT培养基，3天后取上清进行检测。
3.抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白特异性杂交瘤株筛选
(1).检测板的准备：用CB包被液稀释重组人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(大肠杆菌系统表达，本公司制备)至1μg/mL，包被96孔ELISA酶标板，100μL/孔，2～8℃包被过夜，洗涤一次拍干；含2％牛血清白蛋白的PBST缓冲液封闭(200ul/孔)，37℃封闭2小时；拍干，备用。
(2).阳性克隆的筛选：将待检细胞培养上清100μL/孔加入上述检测板中，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μL/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μL/孔的TMB显色液，于37℃避光显色15分钟，每孔加入50μL的2M H2SO4终止反应，并于OD450处读取数值。阳性孔确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1。选取阳性克隆株进行细胞克隆化筛选。经过三至四轮的克隆化筛选后，单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定细胞株，对细胞株进行定株。杂交瘤细胞株NG02及NG19均具有较高的效价，遂后续进一步对上述杂交瘤细胞株进行抗体可变区序列测序分析实施例2.杂交瘤细胞株抗体可变区序列的测定对上述杂交瘤细胞株NG02及NG19抗体可变区序列进行测定。
a.RNA的提取：参照细胞总RNA抽提试剂盒(购自Roche公司)说明书对上述杂交瘤细胞株NG02及NG19进行总RNA提取并立即进行反转录；
b.RNA反转录成为DNA：参照Thermo Scientific Reverted First strand cDNASynthesis Kit(购自Thermo公司)对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录，制得cDNA，冻存于-20℃备用；
c.可变区序列的PCR扩增及回收：以上一步骤中所得cDNA为模板，以鼠IgG亚型单克隆抗体可变区序列通用引物为引物，对重链及轻链的可变区序列进行PCR扩增，将PCR产物经DNA胶回收试剂盒(购自TIANGEN公司)进行回收；
d.可变区序列的克隆和序列测定：按照克隆载体pMD18-T kit(购自Takara公司)说明书，将重链和轻链可变区基因分别与pMD18-T载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。
测序得到杂交瘤细胞株NG02的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。Vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；其轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3。
测序得到杂交瘤细胞株NG19的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。Vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID NO：9所示的HCDR1、如序列SEQ IDNO：10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO：11所示的HCDR3；其轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO：12所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：13所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO：14所示的LCDR3。
实施例3.单链抗体的重组表达及纯化
根据实施例2中测序结果，将杂交瘤细胞株NG02及NG19的抗体重链及轻链可变区之间加入连接肽(GGGGS)3，引入六个组氨酸，并将其全基因直接融合并用毕赤酵母表达系统进行单链抗体的重组表达。所表达得到的抗体分别命名为抗体NG02及NG19。上述单链抗体的重组表达具体如下：
1.单链抗体基因表达载体构建
单链抗体NG02的基因序列如SEQ ID NO:19所示、氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；单链抗体NG19的基因序列如SEQ ID NO:20所示、氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。将单链抗体NG02，NG19基因片段上游引入XhoI酶切位点以及pPICZαA载体中XhoI序列后DNA序列，下游引入组氨酸标签和XbaI酶切位点，进行全基因合成并构建到pUC57质粒(购自南京金斯瑞生物科技有限公司)中，得到一种长期保存质粒，质粒记为pUC57-NG02-scFv、pMD19-NG19-scFv。进行PCR扩增，其中
上游引物P1为TGT AAA ACG ACG GCC AGT；
下游引物P2为:CAG GAA ACA GCT ATG AC。
常规PCR程序后，琼脂糖凝胶电泳分析，显示产物大小与预期大小一致。分别将PCR获得基因产物回收纯化后，采用XhoI(#R0146S,购自New England Biolabs公司)和XbaI(#R0145V,购自New England Biolabs公司)双酶切，用T4连接酶连接到pPICZαA(V19520，购自Invitrogen)质粒中，转化到DH5α感受态细胞中，在含有Zeocin(R250-01，购自Invitrogen公司)的LB平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到单链抗体NG02、NG19的表达载体，记为pPICZα-NG02-scFv、pPICZα-NG19-scFv。
2.单链抗体基因在毕赤酵母宿主工程菌株的构建、筛选及表达YPDS固体培养基配制：参照Invitrogen公司EasySelectPichia Expression Kit说明书；毕赤酵母感受态细胞：参照EasySelectPichia Expression Kit说明书；BMGY培养基配制：参照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit说明书；BMMY培养基配制：参照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit说明书。
分别将pPICZα-NG02-scFv、pPICZα-NG19-scFv质粒，用SacI限制性内切酶酶切线性化。乙醇沉淀后将线性化载体，电转化进入到X-33感受态酵母细胞，涂布到含有Zeocin的YPDS固体培养基，30℃培养3-5天，就有阳性克隆产生。
将上述获得的NG02及NG19重组单链抗体基因工程菌株接种于BMGY培养基中，30℃，220rpm培养至菌体密度到OD600＝2.0～6.0，每隔24小时补加甲醇至终浓度为1.0％(v/v)。一周后，收集发酵培养液。
3.单链抗体纯化
采用组氨酸标签亲和柱纯化单链抗体NG02及NG19，预装柱子选择为HisTrap HP，具体步骤如下：
(1)发酵液的除杂预处理：将上述表达得到单链抗体NG02及NG19融合蛋白发酵液上清，离心收集上清，并加入结合缓冲液，使得上清终浓度为300mM NaCl，20mM NaH2PO4，10mM Imidazole，调pH7.5，0.45μm滤膜过滤。
(2)HisTrap HP亲和柱纯化：运用全自动智能蛋白纯化系统(AKTA avant150，购自GE healcare公司)对预处理获得的单链抗体NG02及NG19发酵液进行亲和纯化，柱子为HisTrap HP(17-5248-02,购自GE healcare公司)。结合缓冲液为300mM NaCl，20mMNaH2PO4，10mM Imidazole，pH7.5，洗脱缓冲液为300mM NaCl，20mM NaH2PO4，500mMImidazole，pH7.5。洗脱时进行线性洗脱，并收集各个洗脱峰。纯化后的蛋白纯度均达到95％以上；合并符合要求的收集管，更换缓冲液为PBS溶液并超滤浓缩(1mg/ml)，过滤除菌于-20℃保存备用。
实施例4.抗体的性能评价
1.抗体NG02及NG19的Western blot鉴定
a.聚丙烯酰胺凝胶电泳：配置12％分离胶、5％浓缩胶，分别上样标准蛋白质及重组人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白蛋白(大肠杆菌系统表达，本公司制备)，待样品进入分离胶后恒压下电泳1小时；
b.转膜：恒流(35mA/膜)条件下转膜1小时，将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。考马斯亮蓝G250对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，观察蛋白的残留情况；
c.封闭：含5％脱脂奶的TBST缓冲液封闭(封闭液)，4℃过夜；封闭后洗涤液(TBST，详见TaKaRa公司TBST buffer)洗涤一次，10分钟；
d.抗原抗体反应：封闭液稀释(按1:1000体积比)辣根过氧化物酶标记NG02(NG02-HRP，1mg/mL，本公司采用经典过碘酸钠法标记，下同)及辣根过氧化物酶标记NG19(NG19-HRP，1mg/mL，本公司采用经典过碘酸钠法标记，下同)，分别加入上述两张硝酸纤维素膜中，室温反应1小时；TBST洗涤5次，每次10分钟；
e.显色及拍照：吸干硝酸纤维素膜上残留液体，硝酸纤维素膜加入2mL稳定型过氧化物酶溶液(1mL)与鲁米诺/增强剂溶液(1mL)的混合液(购买于Thermo公司)，均匀润湿硝酸纤维素膜的表面，室温避光反应一分钟后于凝胶成像系统(购买于GE公司)拍照(图1)，留取结果。
检测结果可见，抗体NG02及NG19均具有较好的特异性，可特异性检测人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白蛋白。
2.单链抗体NG19及NG02在胶体金检测平台的评价
将实施例3中纯化的抗体进行配对组合，分别作为包被抗体或标记抗体进行配对检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)，检测步骤如下：
1)用抗体包被液将NG19或NG02稀释至1.5mg/ml，划线于硝酸纤维素膜上；
2)用金标抗体重悬液将胶体金标记的NG19或NG02稀释后喷与结合垫上；
3)按附图2所示贴膜，切条，装卡(具体制备参见实施例5)
4)用样本稀释液稀释NGAL标准品(众红自制)，至浓度为700ng/ml，175ng/ml，将这两个浓度标准品和零浓度标准品(即样本稀释液)分别添加50ul到胶体金检测卡中(NG19包被-NG02标记或NG02包被-NG19标记)，10min后将检测卡放置在读数仪上进行读数。结果如下表所示：
Figure BDA0001930438160000091
Figure BDA0001930438160000101
由上述结果可知，可见NG19作为包被抗体，NG02作为标记抗体组成的双抗体夹心法检测系统可应用于胶体金检测平台，进行NGAL的检测。
实施例5.抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的胶体金免疫检测卡的制备
1、溶液配制
1)0.01M PB缓冲液制备：称取Na2HPO4·12H2O 3.22g，NaH2PO4·2H2O 0.15g，加纯化水1000ml，转子搅拌至溶解，用pH计测定其pH7.4±0.1，0.45um滤膜过滤。
2)封闭液制备：封闭液配制：称取牛血清白蛋白5g，加0.01M PB溶液(pH7.4±0.1)50ml，转子搅拌至溶解。
3)抗体包被液制备：称取0.05g海藻糖，加入10ml 0.01M PB溶液(pH7.4±0.1)转子搅拌5-10min。
4)金标抗体复溶液制备：称取1g牛血清白蛋白，5g海藻糖，加入100ml 0.01M PB溶液(pH7.4±0.1)，转子搅拌至溶解后，加入25ul Tween-20，继续用转子搅拌5-10min
5)样本稀释液制备：取14ul Tween-20加入685.3ml 0.01M PB溶液(pH7.4±0.1)，转子搅拌至溶解，加入0.7ml Proclin300，继续用转子搅拌5-10min,0.45um滤膜过滤。
2、人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的胶体金免疫检测卡的制备
1)胶体金的标记
抗体NG02的胶体金标记(以1ml胶体金溶液标记为例)：用K2CO3调节胶体金pH值(每1ml胶体金中加入6ul 0.2M K2CO3)，搅拌5-10分钟，向胶体金溶液中缓慢加入抗体NG02(每1ml胶体金中加入15ug抗体NG02)，低速搅拌30分钟；加入封闭液100ul，搅拌20分钟；将胶体金溶液转入离心管中，1500rpm，2-8℃离心15min.；上清移至另一离心管中，12000rpm，2-8℃离心30min；去上清用200ul金标抗体复溶液复溶沉淀即得胶体金标记的NG02抗体。
2)金标垫及反应膜制备
将NG02金标抗体喷涂在金标垫6上，干燥备用；
将抗体NG19用抗体稀释液稀释至1.5mg/ml后，包被于反应膜2(硝酸纤维素膜)的T线5位置；将抗His标签抗体用抗体稀释液稀释至0.4mg/ml后，包被于反应膜2(硝酸纤维素膜)的C线4位置，反应膜干燥备用。
3)组装大卡、切条、组装
将样品垫1、金标垫6、包被有抗体的硝酸纤维素膜2、吸水垫3从左至右依次黏贴在PVC底板上(如图2所示)，所述包被有抗体的硝酸纤维素膜的T线5在左、C线4在右。
将大板切割成小条；将切好的条子放置在底卡的卡槽内，面板加样孔位置对应样本垫；将面板与底板对合，用力按压，使面板与底板吻合；压卡时应使卡竖向排列在压壳机传送带上依次压盖。
4)试剂盒组装
将组装好的检测卡，干燥剂装入铝箔袋中，热封机封口，贴标签；
将样本稀释液按0.7ml/管进行分装，并按照试剂盒规格装入自封袋，贴标签；
按照成品规格，将一定份数的内包，1个含样本稀释液的自封袋，1份说明书，1个合格标签装入包装盒内，并在包装盒外贴好标签。
3、人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白胶体金检测卡使用方法
1)打开外包装，从密封铝箔袋中取出检测卡，置于平坦台面上。
2)吸取50μl尿液样本，加入0.7ml样本稀释液中充分混合。
3)吸取50ul经处理后的样本加入检测卡的加样孔中，室温下静置10min。
4)将检测卡放入免疫层析定量分析仪中，按“快速检测”键开始检测，仪器将自动对检测卡进行扫描。
5)从免疫层析定量分析仪的显示屏幕上读取/打印检测结果。
实施例6人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白胶体金检测卡检测效果评估
1)精密性：将NG19(包被)-NG02(标记)检测卡按检测卡使用方法检测175、700ng/ml的NGAL参考品各10次重复测定，剔除离群值后计算检测卡精密度。实验结果显示检测结果变异系数分别为8.79％、8.54％。
2)检测范围：将NG19(包被)-NG02(标记)检测卡检测不同浓度的NGAL重组蛋白60/175/350/700/1400ng/ml，拟合曲线及检测范围为60-1400ng/ml(如附图3所示)。
3)线性范围：将高值样本与样本稀释液按照一定比例配制成5个系列浓度样本，用NG19(包被)-NG02(标记)检测卡检测，每个样本检测3次，将结果与理论浓度进行回归统计，判断在该浓度范围内是否成线性。线性范围为60-1400ng/ml(如附图4)。
4)准确度：将NG19(包被)-NG02(标记)检测卡按检测卡使用方法检测175、700ng/ml的NGAL参考品各3次重复，计算平均值和理论值的相对偏差，实验结果显示两个浓度检测结果相对偏差分别为1.09％、0.886％。
5)方法学比对：选择同类产品中目前市场上获得良好信誉的重庆中元生物技术有限公司中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)作对照产品比对验证。选择30份临床病人标本，按1到30的顺序编号，用对照产品和待评价的NGAL19(包被)-NGAL02(标记)的胶体金检测卡同时进行实验，按照1，2，3......28，29，30，30，29，28......3，2，1的样本顺序进行测定。对照和待评价产品的检测结果相关系数R2＝0.9985，说明两种方法检测结果有较好的相关性。
实施例7、不同配方的筛选
除上述最优制备例1外，申请人还尝试多种制备方案，例如下面几组检测卡。
Figure BDA0001930438160000121
序列表
<110> 江苏众红生物工程创药研究院有限公司
<120> 抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体及其在检测试纸卡中的应用
<130> 抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体及其在检测试纸卡中的应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 1
Ser Glu Val Phe Pro Ile Ala Tyr
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Ile Leu Pro Ser Ile Gly Arg Thr
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 3
Ala Arg Ser Arg Phe Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 5
Asp Thr Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
Gln Gln Trp Arg Thr Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 7
Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Arg Ser Pro Gly Ser Ser
1 5 10 15
Val Lys Leu Ser Cys Lys Asp Phe Asp Ser Glu Val Phe Pro Ile Ala
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly His Gly Phe Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Leu Pro Ser Ile Gly Arg Thr Asn Tyr Gly Glu Lys Phe
50 55 60
Glu Asp Lys Ala Thr Leu Asp Ala Asp Thr Val Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Asp Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Phe Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 8
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Phe
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Thr Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 9
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Ser
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 10
Ile His Ser Ser Gly Asn Thr
1 5
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 11
Ala Arg Trp Ala Ile Tyr Tyr Gly Asn Phe Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 12
Gln Asp Val Ala Thr Ala
1 5
<210> 13
<211> 3
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 13
Trp Ala Ser
1
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 14
His Gln Tyr Ser Phe Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 15
<211> 122
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 15
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Ala Ser Ile His Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Val Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Ala Ile Tyr Tyr Gly Asn Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ala Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys His Gln Tyr Ser Phe Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 239
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 17
Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Arg Ser Pro Gly Ser Ser
1 5 10 15
Val Lys Leu Ser Cys Lys Asp Phe Asp Ser Glu Val Phe Pro Ile Ala
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly His Gly Phe Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Leu Pro Ser Ile Gly Arg Thr Asn Tyr Gly Glu Lys Phe
50 55 60
Glu Asp Lys Ala Thr Leu Asp Ala Asp Thr Val Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Asp Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Arg Phe Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met
130 135 140
Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser
145 150 155 160
Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro
165 170 175
Lys Arg Trp Ile Phe Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala
180 185 190
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
195 200 205
Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg
210 215 220
Thr Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235
<210> 18
<211> 244
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 18
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Ala Ser Ile His Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Val Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Ala Ile Tyr Tyr Gly Asn Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser
130 135 140
His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ala Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His
180 185 190
Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys His Gln Tyr Ser Phe Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys
<210> 19
<211> 717
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 19
gttcacctac aacagtctgg ttctgaactg aggagtcctg ggtcttcagt aaagctttca 60
tgcaaggatt ttgattcaga agtcttccct attgcttata tgagttgggt taggcagaag 120
cctggacatg gatttgaatg gattggagac atactcccaa gtattggtag aacaaactat 180
ggagagaagt ttgaggacaa agccacactg gatgcagaca cagtgtccaa cacagcctac 240
ttggacctca acagtctgac atctgaggac tctgctatct actactgtgc aaggagcagg 300
ttcgaggact actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctccggtggt 360
ggtggatccg gaggtggtgg ttctggtggt ggtggttctc aaattgttct cacccagtct 420
ccagcaatca tgtctgcatc tccaggggag aaggtcacca tgacctgcag tgccagctca 480
agtgtaagtt acattcactg gtaccagcag aagtcaggca cctcccccaa aagatggatt 540
tttgacacat ccaaactggc ttctggagtc cctgctcgct tcagtggcag tgggtctggg 600
acctcttact ctctcacaat cagcagcatg gaggctgaag atgctgccac ttattactgc 660
cagcagtgga gaactaaccc gctcacgttc ggtgctggga ccaagctgga aataaaa 717
<210> 20
<211> 732
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 20
gatgtgcagc ttcaggagtc aggacctgac ctggtgaaac cttctcagtc actttcactc 60
acctgcactg tcactggcta ctccatcacc agtggttata gttggcactg gatccgacag 120
tttccaggaa acaaactgga gtggatggcc tccattcact ccagtggtaa tacttactac 180
aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240
ctgcagttga attctgtgac tgttgaggac acagccacat attactgtgc aaggtgggct 300
atctactatg gtaacttctg gtacttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 360
tcctcaggtg gtggtggatc cggaggtggt ggttctggtg gtggtggttc tgacattgtg 420
atgacccagt ctcacaaatt catgtccaca tcagttggag acagggtcag catcacctgc 480
aaggccagtc aggatgtggc tactgctgtt gcctggtatc aacagaagcc aggtcaatct 540
cctaaacttc tgatttactg ggcatccacc cggcacactg gagtccctga tcgcttcaca 600
ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accattagca gtgtgcagtc tgaagacttg 660
gcagattatt tctgtcacca atatagcttc tatccgtaca cgttcggagg ggggaccaag 720
ctggaaatca aa 732

Claims (8)

1.一种抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体，
其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；
以及其轻链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3。
2.权利要求1所述的抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
3.权利要求2所述的抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体，为单链抗体，氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示。
4.编码权利要求3所述单链抗体的核酸， 其核酸序列如SEQ ID NO:19所示。
5.含有权利要求4所述核酸序列的表达载体。
6.含有权利要求5所述表达载体的重组宿主菌。
7.生产权利要求1至3任一项所述抗体的方法，包括：
1）在合适的条件下培养权利要求6所述重组宿主菌表达抗体；
2）然后从宿主菌中纯化、收集抗体。
8.权利要求1至3任一项抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体在制备检测人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量的检测卡中的应用。
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