CN111961118B - 一种抗菌活性肽 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗菌活性肽，抗菌活性肽的多肽分子的氨基酸序列为：Ac‑RRPVPIIYCNRRKGRCQKM‑NH2，抗菌活性肽的制备方法，包括以下步骤：以Rink‑MBHA树脂为固相载体，将Rink‑MBHA树脂加入到主反应釜中进行处理；采取线性合成的方式进行氨基酸缩合，合成后送入真空干燥机中干燥，得到肽树脂；对肽树脂进行裂解，得到多肽粗品，对多肽粗品进行纯化，得到抗菌活性肽。本发明所述的一种抗菌活性肽，本抗菌活性肽抗菌活性高，浓度为10μg/ml即有显著的抗菌效果，且抗菌谱广，对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等均有显著的抗菌效果；本抗菌活性肽通过物理作用破坏细菌的细胞膜而达到抗菌目的，不会产生耐药性，本抗菌活性肽原料价廉易得，易于制备和生产，带来更好的使用前景。

Description

一种抗菌活性肽
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种抗菌活性肽。
背景技术
常用的抗菌药物包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类化合物。这些小分子化合物抗菌时一般有特殊的受体，如抗生素一般是通过抑制细菌细胞壁、蛋白质或DNA等的合成来达到杀菌的目的，因此，细菌容易通过变异产生耐药性。过去数十年，随着抗生素的普遍应用，细菌的耐药性逐渐增强，人们对此也越来越关注，在某些情况下这甚至可能导致诸如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、万古霉素耐药菌（VRE）等超级细菌的出现；
由于现有小分子抗菌药物存在耐药性的问题，使得致病菌越来越进化，抗菌药物的开发难度越来越大。迫切需要寻找一类新型的抗菌药物。
多肽作为介于小分子和大分子之间的一类分子，大多为天然的内源性配体, 与受体的亲和力强, 选择性好, 是一类比较容易成为先导化合物及药物的分子。
抗菌肽就是一种活性多肽，其抗菌时一般没有特殊的受体，通过物理静电作用造成细胞膜的穿孔裂解而达到广谱抗菌的效果，所以抗菌肽的使用不容易产生抗性菌和交叉抗性，且一般具有广谱性。
因此，这些耐抗生素的细菌基本上都对抗菌肽敏感，由于抗菌肽非特异性的天然生物活性，作为天然的杀菌剂，抗菌肽是新的或替代性的抗菌疗法的有力候选者，为此，我们提出一种抗菌活性肽。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种抗菌活性肽，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种抗菌活性肽由以下重量份的组分制成：抗菌活性肽的多肽分子的氨基酸序列为：Ac-RRPVPIIYCNRRKGRCQKM-NH2。
优选的，一种抗菌活性肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、以Rink-MBHA树脂为固相载体，将Rink-MBHA树脂加入到主反应釜中进行处理；
（2）、采取线性合成的方式进行氨基酸缩合，合成后送入真空干燥机中干燥，得到肽树脂；
（3）、对肽树脂进行裂解，得到多肽粗品，对多肽粗品进行纯化，得到抗菌活性肽。
优选的，步骤（1）中Rink-MBHA树脂处理的流程为：
①、采用二氯甲烷（DCM）充分溶胀；
②、溶胀后先后添加N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和20%哌啶-DMF进行脱Fmoc保护反应；
③、脱Fmoc保护反应后先后用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和二氯甲烷（DCM）洗涤至无哌啶残留。
优选的，所述步骤（2）中氨基酸缩合时以苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）、6-氯-1-羟基苯并三氮唑（6-Cl-HOBt）和二异丙基乙胺（DIEA）为缩合剂体系，采取线性合成的方式，按肽链序列从C端到N端逐个进行氨基酸缩合合成多肽。
优选的，氨基酸缩合时先制备氨基酸活化液，氨基酸活化液制备时将序列中C端的第1个氨基酸Fmoc-Met-OH与缩合剂体系按2-3当量的投料比加入到活化釜，以N,N-二甲基甲酰胺（DMF）为溶剂，在0-5℃下配制氨基酸活化液，并且在0-5℃下搅拌10-15min。
优选的，缩合反应时将活化液添加到反应釜中于常温下进行缩合反应1-2h，采用Kasier试验检测反应进程，直到反应为无色，反应完先后用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和二氯甲烷（DCM）洗涤。
优选的，氨基酸缩合，肽链的N末端精氨酸的α-NH2采用乙酰化封端。
优选的，所述步骤（3）中，裂解采用95%三氟乙酸水溶液作裂解试剂，裂解反应在20-30℃下进行，裂解反应1-2h。
优选的，多肽粗品纯化时采用高压制备液相，以纯化水为A相、制备级乙腈为B相进行纯化得到纯度大于95%的馏分，然后所得纯化液换盐成醋酸盐，旋蒸浓缩去除乙腈，再采用0.45μm的滤膜过滤，滤液冻干后制得抗菌活性肽。
与现有技术相比，本发明提供了一种抗菌活性肽，具有如下有益效果：
1、本抗菌活性肽抗菌活性高，浓度为10μg/ml即有显著的抗菌效果；
2、本抗菌活性肽抗菌谱广，对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等均有显著的抗菌效果；
3、本抗菌活性肽通过物理作用破坏细菌的细胞膜而达到抗菌目的，不会产生耐药性；
4、本抗菌活性肽含有10-30个氨基酸的多肽，原料价廉易得，易于制备和生产。
附图说明
图1为本发明一种抗菌活性肽的制备方法整体流程图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例
一种抗菌活性肽，抗菌活性肽的多肽分子的氨基酸序列为：Ac-RRPVPIIYCNRRKGRCQKM-NH2。
一种抗菌活性肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）、以Rink-MBHA树脂为固相载体，将Rink-MBHA树脂加入到主反应釜中进行处理；
步骤（1）中Rink-MBHA树脂处理的流程为：
①、采用二氯甲烷（DCM）充分溶胀；
②、溶胀后先后添加N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和20%哌啶-DMF进行脱Fmoc保护反应；
③、脱Fmoc保护反应后先后用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和二氯甲烷（DCM）洗涤至无哌啶残留。
（2）、采取线性合成的方式进行氨基酸缩合，合成后送入真空干燥机中干燥，得到肽树脂；
氨基酸缩合时以苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）、6-氯-1-羟基苯并三氮唑（6-Cl-HOBt）和二异丙基乙胺（DIEA）为缩合剂体系，采取线性合成的方式，按肽链序列从C端到N端逐个进行氨基酸缩合合成多肽；
氨基酸缩合时先制备氨基酸活化液，氨基酸活化液制备时将序列中C端的第1个氨基酸Fmoc-Met-OH与缩合剂体系按2-3当量的投料比加入到活化釜，以N,N-二甲基甲酰胺（DMF）为溶剂，在0℃下配制氨基酸活化液，并且在2℃下搅拌12min；
缩合反应时将活化液添加到反应釜中于常温下进行缩合反应1.5h，采用Kasier试验检测反应进程，直到反应为无色，反应完先后用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和二氯甲烷（DCM）洗涤；
氨基酸缩合，肽链的N末端精氨酸的α-NH2采用乙酰化封端。
（3）、对肽树脂进行裂解，得到多肽粗品，对多肽粗品进行纯化，得到抗菌活性肽；
裂解采用95%三氟乙酸水溶液作裂解试剂，裂解反应在25℃下进行，裂解反应1.5h；
多肽粗品纯化时采用高压制备液相，以纯化水为A相、制备级乙腈为B相进行纯化得到纯度大于95%的馏分，然后所得纯化液换盐成醋酸盐，旋蒸浓缩去除乙腈，再采用0.45μm的滤膜过滤，滤液冻干后制得抗菌活性肽。
抗菌能力实验：
一、实验方法
称取多肽适量，用无菌生理盐水溶解后，稀释成多肽含量为10μg/ml的多肽溶液（以多肽的净含量计算，供试液冷藏保存），多肽溶液与检测菌接触考察时间为1min。
分别考察多肽在10μg/ml的浓度、接触作用时间为1min的条件下，对金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠杆菌（8099）、白色念珠菌（ATCC 10231）的抑菌效果。
二、实验结果：
表1本发明所述多肽分子的杀菌率
Figure 94871DEST_PATH_IMAGE001
由表1可知，本发明所提供的活性多肽，对大肠埃希氏菌（CICC 10899）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）和白色念珠菌（ATCC 10231）都具有很强的抗菌活性，已抑菌率都高达98％以上，其中对后两种菌种的抑菌率达99%以上。
显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (9)

1.一种抗菌活性肽，其特征在于，抗菌活性肽的多肽分子的氨基酸序列为：Ac-RRPVPIIYCNRRKGRCQKM-NH2。
2.根据权利要求1所述的一种抗菌活性肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、以Rink-MBHA树脂为固相载体，将Rink-MBHA树脂加入到主反应釜中进行处理；
（2）、采取线性合成的方式进行氨基酸缩合，合成后送入真空干燥机中干燥，得到肽树脂；
（3）、对肽树脂进行裂解，得到多肽粗品，对多肽粗品进行纯化，得到抗菌活性肽。
3.根据权利要求2所述的一种抗菌活性肽的制备方法，其特征在于：步骤（1）中Rink-MBHA树脂处理的流程为：
①、采用二氯甲烷（DCM）充分溶胀；
②、溶胀后先后添加N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和20%哌啶-DMF进行脱Fmoc保护反应；
③、脱Fmoc保护反应后先后用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和二氯甲烷（DCM）洗涤至无哌啶残留。
4.根据权利要求2所述的一种抗菌活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中氨基酸缩合时以苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）、6-氯-1-羟基苯并三氮唑（6-Cl-HOBt）和二异丙基乙胺（DIEA）为缩合剂体系，采取线性合成的方式，按肽链序列从C端到N端逐个进行氨基酸缩合合成多肽。
5.根据权利要求4所述的一种抗菌活性肽的制备方法，其特征在于：氨基酸缩合时先制备氨基酸活化液，氨基酸活化液制备时将序列中C端的第1个氨基酸Fmoc-Met-OH与缩合剂体系按2-3当量的投料比加入到活化釜，以N,N-二甲基甲酰胺（DMF）为溶剂，在0-5℃下配制氨基酸活化液，并且在0-5℃下搅拌10-15min。
6.根据权利要求5所述的一种抗菌活性肽的制备方法，其特征在于：缩合反应时将活化液添加到反应釜中于常温下进行缩合反应1-2h，采用Kasier试验检测反应进程，直到反应为无色，反应完先后用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和二氯甲烷（DCM）洗涤。
7.根据权利要求6所述的一种抗菌活性肽的制备方法，其特征在于：氨基酸缩合，肽链的N末端精氨酸的α-NH2采用乙酰化封端。
8.根据权利要求2所述的一种抗菌活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，裂解采用95%三氟乙酸水溶液作裂解试剂，裂解反应在20-30℃下进行，裂解反应1-2h。
9.根据权利要求8所述的一种抗菌活性肽的制备方法，其特征在于：多肽粗品纯化时采用高压制备液相，以纯化水为A相、制备级乙腈为B相进行纯化得到纯度大于95%的馏分，然后所得纯化液换盐成醋酸盐，旋蒸浓缩去除乙腈，再采用0.45μm的滤膜过滤，滤液冻干后制得抗菌活性肽。
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