CN101325960A - 乳酸杆菌用于治疗自身免疫性疾病的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及至少一种选自乳酸杆菌的益生菌菌株在制备用于治疗和/或预防自身免疫性疾病的药物组合物中的用途。

Description

乳酸杆菌用于治疗自身免疫性疾病的用途

发明领域

本发明涉及至少一种选自乳酸杆菌的益生菌菌株，用于制备用于治疗和/或预防自身免疫性疾病的药物组合物的用途。

背景技术

益生菌被定义为当给予足够量时对接受者有益的活微生物。乳酸杆菌(Lactobacilli)和双歧杆菌(bifidobacteria)是益生菌制品中最常用的细菌。这些细菌通常是安全的，基于这些生物体的益生制品也是这样。对于所有年龄组和免疫损伤的个体，都没有致病性。不同的益生菌的摄入显示出其具有对不同的生理学或病理学状态的临床益处。在由抗生素治疗或轮状病毒感染引起的腹泻方面显示了最明确的作用。还有研究显示摄入益生菌之后，在炎性肠疾病，特异性皮炎和血胆固醇过多方面有积极的临床作用。益生菌促成这些临床改善的机理还不清楚。人的体外，以及动物的体内和体外研究，显示不同种的乳酸杆菌通过很多不同的途径影响先天和后天的免疫系统。

临床研究主要显示先天细胞免疫系统的刺激作用和针对天然感染和全身或口服免疫的体液免疫反应的加强。关于先天免疫系统的作用，增强的多形核细胞(PMN)的吞噬细胞活性和增强的NK细胞肿瘤杀伤活性已经被报道。根据我们掌握的知识，现在尚没有临床研究显示在摄入益生菌之后，在特定细胞免疫系统中的作用。

本申请中全面研究了每日摄入乳酸杆菌或革兰氏阴性菌P.lundensis后，对先天和后天免疫系统的影响等。有趣的是，已经观察到接受L.plantarum(胚芽乳酸杆菌)的受试者的特定细胞免疫系统的激活作用以及接受L.paracasei(副干酪乳酸杆菌)的受试者的这种指示。此外，观察了接受不同的乳酸杆菌物种的受试者中，对先天免疫系统的免疫增强作用，例如NKT细胞群的扩张和吞噬细胞活性的增强。无论怎样，革兰氏阴性菌P.lundensis的摄入对本研究测量的不同的免疫参数均没有产生影响。

在西半球，人体免疫系统错误的攻击自己使个体可能很不舒服的自身免疫以及自身免疫相关疾病是日益增多的问题。自身免疫疾病可影响结缔组织和许多其他身体部位例如特殊器官，例如皮肤、神经、脑、肺、肾和关节。神经和脑部的自身免疫疾病的一个例子是多发性硬化症，皮肤的例子为银屑病。自身免疫疾病有多种不同形式且也有很多治疗方法。根据疾病类型和患病器官进行治疗。

本领域有缓解和治疗自身免疫疾病相关症状的需要，以及在疾病发生之前提供预防治疗的需要。这些内容是本发明的主题，将通过下面的内容变得明显。

发明概要

本发明的一个目的是选自乳酸杆菌的至少一种益生菌菌株用于制备用于治疗和/或预防自身免疫疾病的药物组合物的用途。

本发明的另一个目的是治疗自身免疫疾病的方法，其中选自乳酸杆菌的至少一种益生菌菌株被给予个体。

附图简述

图1显示了试验中报告任何小的不良肠胃反应的志愿者数目。

图2显示了每ml血中不同的淋巴细胞的基线数(0天)(平均值±(SEM))。

图3显示了淋巴细胞的基线(0天)百分数或者GMFI(平均值±(SEM))，其对不同的细胞活化和记忆标记为阳性。

图4，随机指定受试者为九个不同的研究组。试验从两周的间歇期开始。其后，接着是活性研究阶段。在该阶段中，受试者每天接受一个剂量的研究产品至14天(L.plantarum Heal 19、L.fermentum、L.paracasei、L.gasseri、L.rhamnosus、P.lundensis组)或35天((L.plantarum 299v和安慰剂组)。每剂量包含10¹⁰细菌群落总数(CFU)(乳酸杆菌组)或者10⁹CFU的杆菌(P.lundensis组)。

图5，用流式细胞仪测定的表达活化表型CD8CD25、CD8HLA-DR、CD4CD25和CD4HLA-DR的淋巴细胞的百分数被分析。显示了基于个体比值的各组值(±SEM)，14天/0天以及35天/0天(仅对于L.plantarum 299v和安慰剂组)。

图6，用流式细胞仪测定的表达记忆表型CD8CD45RO和CD4CD45RO的淋巴细胞的百分数被分析。显示了基于个体比值的各组值(±SEM)，14天/0天以及35天/0天(仅对于L.plantarum和安慰剂组)。

图7，用流式细胞仪测定的NKT细胞标记物(CD56CD16CD3)阳性的淋巴细胞的百分数被分析。基于个体比值分组计算(14天/0天)。

图8，通过用FTTC-标记的E.coli或S.aureus培养全血细胞，嗜中性粒细胞的吞噬活性被测定。图中显示了分别确定的在14天和0天获得的平均荧光值的比值并分组计算。

图9显示了预防治疗EAE的发育，体重和临床症状(实验3)。

图10显示了从发病日开始在EAE治疗中慢性炎症的治疗(实验3)。

图11和12显示了通过给予L.paracasei 8700:2或L.plantarum HEAL 9，与对照组比EAE发病被延迟。

图13显示了EAE被益生菌菌株L.paracasei 8700:2、L.plantarum HEAL 9和L.plantarum HEAL 19的混合物抑制。进一步显示该抑制作用通过除去CD4+T细胞而被破坏。

图14显示EAE被L.paracasei 8700:2、L.plantarum HEAL 9和L.plantarumHEAL 19的混合物抑制，相对于对照，甲氨喋呤和L.Delbrueckii。

图15显示了得自实验2的表达活化表型CD4CD25的淋巴细胞的比值。

图16显示了得自实验2的表达活化表型CD4⁺CD25⁺⁺的淋巴细胞的比值。

图17显示了得自实验2的表达活化表型CD8⁺HLA-DR⁺的淋巴细胞的比值。

图18显示了得自实验2的表达活化表型CD8+CD25+的淋巴细胞的比值。

图19显示了得自实验2的表达活化表型CD4CD45RO的淋巴细胞的比值。

发明详述

在本发明的一个实施方式中，至少一种选自乳酸杆菌的益生菌菌株被用于制造治疗自身免疫疾病的药物组合物，该自身免疫疾病选自例如多发性硬化症(MS)、过敏症、银屑病、风湿性关节炎、Chrohns′病、溃疡性结肠炎、I型糖尿病、炎症性肠病或全身性红斑狼疮的器官特异性自身免疫疾病，但不限于此。

益生菌对其有作用(预防或治疗的)的这里没有明确提及的任何其它的自身免疫疾病也在本发明范围之内。

本文中，“治疗和/或预防”一词包括个体的预防性治疗，即为了预防疾病，在疾病发生之前开始用益生菌治疗，以及对个体中已经发生的疾病的治疗性治疗。在后一种情况中，症状的缓解例如是被期望的，或病人的总体状况被加强或者患者的疾病被治愈。因此，个体可以是有发生自身免疫疾病风险或者已经是该疾病患者的人。

本发明所使用的乳酸杆菌可以选自由胚芽乳酸杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、发酵乳酸杆菌、副干酪乳酸杆菌和加氏乳酸杆菌组成的组，但是不限于此。

其他益生菌株，除了在这里明确公开的菌株，还可以根据本发明自然的被使用，只要它们能提供期望的作用就在发明的范围之内，即，对自身免疫疾病有预防作用或缓解自身免疫疾病症状的作用。

本发明使用的胚芽乳酸杆菌可以选自由胚芽乳酸杆菌299，DSM 6595，胚芽乳酸杆菌299v，DSM 9843，胚芽乳酸杆菌HEAL 9，DSM 15312，胚芽乳酸杆菌HEAL 19，DSM 15313，和胚芽乳酸杆菌HEAL 99，DSM 15316组成的组，但是不限于此。

本发明使用的副干酪乳酸杆菌可以选自由副干酪乳酸杆菌8700:2，DSM13434，和副干酪乳酸杆菌02A，DSM13432组成的组，但是不限于此。

本发明使用的加氏乳酸杆菌可以选自加氏乳酸杆菌VPG44，DSM 16737，但是不限于此。

本发明的另一个实施方式中，至少两种益生菌菌株被用于治疗和/或预防所述的自身免疫疾病。这至少两种菌株选自乳酸杆菌，优选选自胚芽乳酸杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、发酵乳酸杆菌、副干酪乳酸杆菌和加氏乳酸杆菌。

在一个实施方式中，其中至少两种益生菌菌株被用于预期治疗，所述的至少两种菌株被按顺序或同时给予。因此，菌株可以以一种组合物中的混合物的形式被给予或者它们可以按顺序在不同的组合物中分别被给予。

在发明的进一步的实施方式中，所述药物组合物是液体制剂或者固体制剂，其中所述固体制剂选自由片剂，含片，糖果，咀嚼片，口香糖，胶囊，小药囊，粉剂，颗粒剂，包衣微粒，包衣片剂，肠包衣片和胶囊，以及溶条和薄膜组成的组，而所述的液体制剂选自由口服溶液，混悬液，乳液或糖浆组成的组。

在发明的更进一步的实施方式中，所述组合物包括载体材料，所述载体材料独立的选自由燕麦粥、乳酸发酵食品、抗性淀粉、膳食纤维、碳水化合物、蛋白质和糖基化蛋白组成的组，但是不限于此。

本发明的进一步的实施方式中，所述的药物组合物选自但不限于药用食品、功能食品、食品添加剂、营养品或食物制品。因此，这里使用的“药物组合物”一词不是必须是标准意义上的药物组合物，例如药剂，而还可以是药用食品、功能食品、食品添加剂、以及营养品和食品产品的领域内的产品。当为食品产品时，它可以选自饮料、酸乳酪、果汁、冰淇淋、面包、饼干、谷类、健康棒(healthbars)和糊(spreads)，但不限于此。

因此，本发明的组合物的用途在预防有用的意义上可能非常有益，即在自身免疫疾病发展之前。由于使用的药物组合物不一定是标准意义上的药物组合物，而还可以是食品添加剂或功能食品，因此对普通的健康的个体而言，预防性地服用本发明组合物是非常方便的。

在本发明的一个实施方案中，组合物中的每个所述的菌株的量为约1×10⁶至约1×10¹⁴CFU，优选自约1×10⁸至约1×10¹²，且更优选自约1×10⁹至约1×10¹¹。

本发明药物组合物还可以包括其他物质，例如本领域技术人员已知的惰性载体，或者药学上可接受的辅剂、载体、防腐剂等。

实施例

实施例1

受试者和试验标准

选择年龄范围为18-55岁(中值26岁)的五十七名表观健康志愿者，作盲安慰剂对照研究。受试者被随机指定为八个小组，接受下列的革兰氏阳性菌中的一种：L.plantarum 299v(n＝7)，L.plantarum Heal 19(n＝7)，L.fermentum 35D(n＝7)，L.paracasei 8700:2(n＝7)，L.gasseri VPG44(n＝7)，L.rhamnosus 271(n＝7)，或革兰氏阴性菌，P.lundensis(n＝7)或安慰剂(n＝10)。菌的剂量为对于乳酸杆菌10¹⁰菌/天和P.lundensis 10⁹菌/天。对照组用脱脂奶粉(1g)。根据组，研究持续6或9周，包括两周间歇期(wash out period)，2或5周活跃研究期和2周追踪期(图4)。每个受试者被供给包括益生产品的一组产品，在整个研究期间应该没有耗尽。从受试者通过在两个或三个时间点，0天，14天和35天静脉穿刺抽取外周血样品。在试验过程中每日记录每个受试者所述的不良反应，健康状况和确认摄入的研究产品。

流式细胞术

全血中淋巴细胞表型的分析通过流式细胞术实现。下列的抗人单克隆抗体用作不同细胞群的表面标志：CD3FITC(SK7)、CD4APC(SK3)、CD8PerCP(SK1)、CD19PerCP(SJ25C1)、CD56PE(MY31)、CD16PE(B73.1)和CD5FITC(L17F12)。下列的抗人单克隆抗体用于检测不同的激活和记忆标记：CD25FITC(2A3)、HLA-DR PE(L243)、CD45RO PE(UCHL-1)、CD38PE(HB7)、CD27PE(L128)和CD11b PE(D12)。所有的抗体购买自Becton-Dickinson(Erembodegum，BeIgium)。全血(100μl)用抗体(10μl/抗体)在4℃黑暗中培养30min。然后加入2ml FACS溶解溶液(lysing solution)(Becton-Dickinson)并在20℃暗室中培养15min。用3ml FACSFlow冲洗细胞并在300xg离心5min。冲洗过的细胞重悬浮在200μl FACSFlow中并用CellQuest软件在FacsCalibur(Becton-Dickinson)分析。

吞噬作用测定

粒细胞和单核细胞的吞噬活性用

(Orpegen Pharma，Heidelberg，Germany)定量，根据制造厂家的说明，有某些修改。简要的，将20×10⁶FITC标记的大肠杆菌或FITC标记的S.aureus加入预冷的全血(100μl)中。血细胞和菌在37℃培养10FacsCalibur，用CellQuest软件。

计算

不同的免疫参数的个体变化通过计算在14天和0天或者35天和0天获得的各值之间的比值而确定。这些比值用于所有的组的计算和统计。

统计

所有的统计分析使用Statview实现。使用Mann-Whitney U检验法来比较不同的组。

结果

临床观察

57个志愿者之中54人完成了该研究。两人因为感染和抗生素治疗被排除在外(一人在安慰剂组而另一人在接受P.lundensis的组)。一人因为怀孕在16天被排除在外(安慰剂组)。摄入研究产品之后只报告有轻微的肠胃不良的副作用(图1)。

摄入乳酸杆菌激活T细胞

关于在CD4⁺和CD8⁺T细胞上的激活标记，有大的基线(0天)个体变化。图2中显示了表达不同细胞表面标记的细胞的基线百分比。在该时间点上没有观察到不同组之间的显著差别。因为观察到有巨大的个体间差异，选择比较每个个体在14天和35天与0天相比的比值。所有的计算和比较都基于这些比值(14天/0天和35天/0天)做出。摄入含有L.plantarum(胚芽乳酸杆菌)299v的被研究的产品14天之后，在CD8⁺T细胞上激活标记CD25的表达有大约两倍的增长(p＝0.01)(图5)。在摄入L.plantarum 299v之后，有强的CD8⁺T细胞上HLA-DR的增量调节的指示，虽然不显著(p＝0.12)。另外，在摄入L.plantarum.299v之后还可以观察到CD4⁺T细胞激活的趋势。摄入其它包括在本研究之内的乳酸杆菌菌种以及革兰氏阴性菌P.lundensis，没有激活CD8⁺T细胞也没有激活CD4⁺T细胞。但是，有这样的趋势即摄入L.paracasei(副干酪乳酸杆菌)确实增多CD4⁺T细胞上HLA-DR的表达(P＝0.18)。

摄入乳酸杆菌诱发CD4 ⁺ T细胞的记忆表型

将接受不同研究产品的各组之间CD4⁺和CD8⁺T细胞上CD45RO表达的荧光强度(GMFI)的几何平均值进行比较。如上所述，根据各比值(14天/0天和35天/0天)的组计算结果用于比较。摄入包含L.plantarum 299v的研究产品35天之后，CD4⁺T细胞上CD45RO GMFI增长显著(p＝0.03)。在摄入L.plantarum之后，CD8⁺T细胞上表达的CD45RO还有增长的趋势(图6)。此外，摄入L.paracasei似乎对CD8⁺T细胞上CD45RO的增量调节有积极的影响(p＝0.10)(图6)。

摄入研究产品之后对不同的细胞群的影响

摄入L.pararcasei之后，鉴定为NKT细胞的淋巴细胞的百分比有所增长(P＝0.06)(图7)。关于其他细胞群，与0天相比较，没有检测到相对增长/减少，例如CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、B细胞、B-1细胞(CD19+CD5+)、NK细胞、粒细胞和单核细胞。

吞噬作用活性

在FSC-SSC图中鉴定粒细胞和单核细胞。测定这些细胞吞噬FITC标记的革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌的能力。如图8中所示，从给予L.plantarum 299v(p＝0.064)、L.plantarum Heal 19(p＝0.064)、L.fermentum  (p＝0.064)或L.paracasei(p＝0.05)的志愿者获得的粒细胞比用安慰剂处理的志愿者的粒细胞对革兰氏阴性菌大肠杆菌的吞噬作用更有效。然而，各组对革兰氏阳性菌S.aureus的吞噬作用没有区别。没有检测到单核细胞吞噬活性的区别(数据没有显示)。

讨论

免疫系统的主要任务是对微生物产生快速且强烈的应答从而预防和治愈感染。杀死微生物所使用的强大的机制也会引起对我们自身组织的损伤。因此，不对我们自身组织产生应答，也不对环境中出现的无害物质产生应答是必需的。因此，免疫系统对我们自己身体的组成部分，和食品以及摄入的蛋白质都发展并维持耐受性。如果失败，将出现许多疾病。发展特异性免疫耐受性的手段是免疫系统必要的任务。

所有免疫反应中的一个重要角色是T辅助细胞扮演的。当T辅助细胞被它的特异性抗原激活时，将变得有活性，分裂，成熟且生成指导免疫系统中其他类型细胞的作用的一系列细胞因子，例如细胞毒性T细胞和B细胞。T辅助细胞的激活是为了生成大多数类型免疫反应所必须的，包括抗体的生成。相反的，如果T辅助细胞的激活被阻止，那么大多数类型的免疫反应将被阻断。

确保T辅助细胞激活和耐受性维持的机制有几种。一种机制是胸腺中有识别自身组织和对自身组织一起反应的能力的T细胞的清除。然而，这种清除不完全，所以此外，我们还需要发展对外源性抗原的特异性免疫耐受性。否则，我们将对所有类型的吸入和摄入的物质有强烈应答，导致大量炎症和免疫资源浪费。

一种对维持耐受性很重要的细胞类型是调节性T细胞。该细胞类型可以通过某些标记识别，例如CD4和CD25的表面表达，具有细胞内CTLA-4，和核蛋白Foxp3的转录。调节性T细胞有能力当遇见无害物质的时候防止其他T细胞被激活，由此，阻止所有类型的不需要的免疫反应。

本文中，与某标记连用的符号“+”，例如CD4+和CD25+意思是指该标记在T细胞上表达。例如CD4+CD25+T细胞是在其表面表达CD4标记和CD25标记的T细胞。但是没有述及表达的标记的量，只是说它存在。本文中与标记连用的符号“++”，例如CD4++或CD25++意思是指有大量标记被表达。调节性T细胞是那些表面有大量CD25的细胞，即CD4+CD25++细胞。另一方面，CD4+CD25+T细胞是唯一被激活的T细胞。有时，不使用特殊符号“+”和“++”，例如仅仅为CD4CD25细胞，这表示这些细胞是被激活的，例如CD4+CD25+细胞。因此，CD4CD25与CD4+CD25+是一样的。当讨论调节性T细胞的时候，常写作CD4+CD25++细胞。

该盲安慰剂对照研究是独特的，原因在于它是比较了在摄入不同的革兰氏阳性乳酸杆菌或革兰氏阴性菌P.lundensis之后一些免疫参数的影响的第一项研究。有趣的是，摄入P.lundensis没有影响任何测量的参数。相反，摄入乳酸杆菌影响特异性和先天免疫系统不同的组分。该研究中有个新的发现，摄入L.plantarum对激活和诱导T细胞群中的记忆细胞有显著的积极作用。IL-2受体α链(CD25)有显著的增量调节，且有细胞毒性T细胞上HLA-DR增量调节的强烈趋势。这些激活标记增量调节的趋势还可以在摄入L.plantarum之后，在辅助T细胞上观察到。激活标记的表达表明T细胞开始对抗原特异或非特异性刺激作出响应而增殖，且这些细胞与静止性T细胞相比更容易发挥它们的效应功能。L.plantarum诱导的T细胞的激活的机制可能是通过被toll-like受体激活的抗原递呈细胞与微生物化合物相结合。抗原递呈细胞的激活使得它们更加有效地将抗原传递至T细胞。另外，辅助和细胞毒性T细胞都表现出有toll-like受体的不同的表达，这很可能使得这些细胞易于被微生物成分和产品非特异性激活。

与辅助T细胞分隔相类似，CD45RO的表达似乎是标记了一个记忆群，在细胞毒性T细胞中也是。发现在辅助T细胞上的这种记忆细胞标记的表达有显著的增长，且在摄入L.plantarum35天之后，细胞毒性T细胞上有增量调节的趋势。另外，摄入L.paracasei(副干酪乳酸杆菌)也显示了细胞毒性T细胞上CD45RO的增量调节的趋势。与幼稚T细胞(

T cells)相比较，CD45RO+T细胞可以分泌广谱的细胞因子。此外，当CD3-TCR复合物在次最适度的条件下受刺激的时候，CD45RO+T细胞可以增殖并生成IL-2，而幼稚的T细胞需要强的CD3-TCR刺激以实现这些功能。记忆T细胞的生成对于感染和接种疫苗之后诱导有效免疫应答而言是重要的。

先天的细胞免疫系统也受益生菌的摄入的影响。已经被证实了，在摄入L.paracasei(副干酪乳酸杆菌)之后，自然杀伤T(NKT)细胞群扩大。NKT细胞构成一个共表达NK细胞标记CD56和T细胞标记CD3-T细胞受体复合物的淋巴细胞亚群。对人和小鼠的研究均证实了NKT细胞在自身免疫性疾病的调节中扮演了重要的角色，例如多发性硬化、I型糖尿病、以及系统性红斑狼疮。NKT细胞还产生对抗肿瘤和病毒感染的细胞的效应功能。因此，NKT细胞的功能多效(pleotropic)。评价了益生菌免疫效应的其他临床研究显示了摄入L.rhamnosus HN001和Bifidobacterium lactis HN019加强了K562细胞的NK(包括NKT)细胞肿瘤杀伤活性。该研究中也证实了多形核细胞的吞噬活性在摄入不同的乳酸杆菌之后有所增长。在本研究中观测到的对不同的免疫参数的影响结果是人们可能推测出细胞毒性T细胞和NKT细胞扩增的同时激活指向对抗病毒感染和/或肿瘤的加强的免疫防御。体外研究发现，乳酸杆菌诱导单核细胞分泌IL-12和IL-18，支持了摄入这些细菌刺激细胞介导活性的理论。

依照本发明，得到摄入L.plantarum(胚芽乳酸杆菌)和L.paracasei(副干酪乳酸杆菌)对特异性和先天细胞免疫系统有大的影响的结论。

实施例2

该实施例的目的是为了研究更长的时间给予相同种的乳酸杆菌，与按顺序一个个的给予几种乳酸杆菌(不同种的)相比较，对免疫系统的影响。

志愿者被给予冻干菌的粉剂14或35天。作为革兰氏阳性菌，益生菌胚芽乳酸杆菌299v被单独使用或与L.rhamnosus，L.fermentum，L.paracasei和L.gasseri联合使用。给予Psedomonas lundensis，作为革兰氏阴性菌。

下列组被研究：

1)胚芽乳酸杆菌299v 35天

2)L.plantarum 299v 7天，L.rhamnosus 2717天，L.fermentum 35D 7天，L.paracasei 8700:2 7天，L.gasseri VPG447天。总共35天。(按顺序)

3)L.plantarum 299v、L.rhamnosus 271、L.fermentum 35D、L.paracasei8700:2、L.gasseri VPG44混合物，总共14天

4)L.rhamnosus 271，14天

5)L.fermentum 35D，14天

6)L.paracasei 8700:2，14天

7)L.gasseri VPG44，14天

8)Pseudomonas lundensis，14天

对照组1)安慰剂35天

对照组2)安慰剂14天

在0天，14天和35天取血样。按照上面的试验1说明的，通过流式细胞术确定每个小组的表达大量CD25的辅助T细胞(CD4+)的量。

结果

在14天，在按顺序摄入五种不同的乳酸杆菌菌株的个体中，有CD4+CD25++T细胞扩增的边际显著性(borderline significance)。

讨论

在其他研究中显示了表达高密度的CD25分子(CD4+CD25++)的T辅助细胞(CD4+)，对提供对抗自身免疫性疾病、变态反应和炎性肠疾病的保护是重要的。发现这些细胞在按顺序摄入不同的乳酸杆菌之后扩增，表明摄入这些菌可能对有发展上述疾病的风险的个体有益。

实施例3

动物

八周龄C57BL/6小鼠购买自Taconic Europe(丹麦)。动物在Lund大学细胞和生物学系常规动物实验室内保存和饲养，且所有的实验按照瑞典的伦理委员会的要求实行。小鼠可随意进食正常饮食和水，并在试验开始之前允许有一个至少一周的对新环境的适应期。用于EAE实验中的小鼠被称重，检验EAE临床症状，并在整个实验过程中每天根据临床评价描述的标准打分。评价为6的小鼠每天皮下补充一次0.5ml生理盐水溶液以避免脱水。当任何小鼠表现出临床疾病的征兆的时候，将食物放置在笼子的底部。评价为7的小鼠出于道德的原因被处死。免疫接种后24天结束实验。

抗原

使用一种来自髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的致脑炎肽诱导小鼠EAE(实验性自身免疫性脑脊髓炎)。合成肽，氨基酸35-55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)，购买自Schafer-N，哥本哈根，丹麦。使用的肽为99％纯的。

免疫接种

如前所述，在雌性C57BL/6小鼠中诱导EAE。简要地说，每个动物在用异氟烷麻醉的条件下通过在侧腹皮下注射100μl，200μg MOG_35-55在PBS中的1：1的乳剂以及包含结核分支杆菌H37Ra的CFA(Difco，Detroit，MI)进行免疫接种。此后紧接着以及免疫接种48小时之后，给小鼠腹膜内注射0.1ml的4μg/ml百日咳毒素(Sigma)。

临床评价

EAE的临床症状根据以下以0至8的尺度进行打分：0，没有临床疾病症状；1，尾部虚弱；2，尾部瘫痪；3，后肢瘫痪且步态障碍；4，一侧后肢瘫痪；5，所有后肢瘫痪伴随身体后部瘫痪，小鼠使用其前肢四处走动且活跃；6，所有后肢瘫痪伴随身体后部瘫痪且移动性已严重损伤；7，四肢瘫痪，不能移动，濒死；8，死亡。

细菌菌株和治疗

L.plantarum(胚芽乳酸杆菌)HEAL 9和L.paracasei(副干酪乳酸杆菌)8700:2由Probi AB(Ideon，Lund，瑞典)提供。菌通过离心收获、一次冲洗、并用自来水重悬浮至终浓度为2×10⁹菌落形成单位(CFU)/100ml于瓶中。第三瓶用L.plantarum(胚芽乳酸杆菌)HEAL 9和L.paracasei(副干酪乳酸杆菌)8700:2的混合物制备，终浓度为2×10⁹CFU/100ml。每天冲洗瓶子并制备包括菌的赋形药。实验按照每个治疗组十只小鼠进行。每个动物喝4-5ml赋形药/天，包括近似10⁸CFU。而对照组动物接受自来水。

结果

益生菌治疗抑制MOG诱导EAE的发展

为了研究益生物(probiotics)的抗炎作用，三组动物十二天内用益生物L.plantarum HEAL 9，L.paracasei 8700:2以及L.plantarum HEAL 9和L.paracasei8700:2的混合物预处理，用CFA和MOG_35-55乳液在0天免疫对抗EAE。然后在整个实验中治疗动物(直至第24天)。作为对照的第四组动物只接受自来水。如图10中所示，用L.plantarum HEAL 9或L.paracasei 8700:2治疗成功的防止慢性EAE发展达10天，而与此相比较，对照组小鼠在第11天开始显示有严重的EAE。用菌混合物治疗的小鼠与对照组相比也显示其开始发病有五天左右的延迟。这些小鼠与单种细菌处理的小鼠相比显示有更加严重的EAE。在第24天，患病动物的发病率显著减小，用单种菌治疗的动物为14％，相比对照小鼠为91％。接受混合菌的动物的发病率为60％。对实验中动物体重的改变进形分析，惊讶的发现用两种菌的混合物治疗抑制体重的减少，而这在发病以前经常发生(图9)。用单种菌治疗的动物与对照组小鼠一样体重减少，尽管没有显示麻痹的体征。

EAE的预防治疗

动物在免疫接种之前用益生物治疗12天并且贯穿整个实验。

100ml包括不同菌的饮用水每天新鲜配置。

近似1.108菌/小鼠/天。对照小鼠只接受水。

N_Plantarum＝7，N_Paracasei＝7，N_混合物＝10，N_对照＝11

结果在图9中显示。

EAE中慢性炎症的治疗

在EAE发病之后一天采用益生物口服治疗。动物用喂食针分别处理。

近似1.108菌/小鼠/天。对照小鼠接受无菌NaCl 9mg/ml。

N_Plantarum＝6，N_Paracasei＝6，N_混合物＝8，N_对照＝8

结果在图10中显示。

实验4

通过口腔给予副干酪乳酸杆菌和胚芽乳酸杆菌抑制中枢神经系统的慢性炎症

本研究的目的是为了检测益生物是否能影响T细胞介导的中枢神经系统的慢性炎症。我们猜测益生物口服治疗可以通过致病的T细胞效应器的免疫调节而发挥抗炎作用。

材料和方法

动物模型

实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，多发性硬化症的动物疾病模型，将通过用完全弗氏佐剂中的髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽35-55免疫接种来诱导。百日咳毒素跟免疫接种一起注入以进一步加强免疫反应。两周后，动物开始显示出临床症状。EAE的症状按八类计分：0-，没有临床疾病症状；1-，尾部瘫痪；2-，尾部瘫痪；3-，瘫痪且步态障碍；4-，单肢瘫痪；5-，双肢瘫痪；6-，双肢瘫痪并且第三肢轻瘫，但小鼠仍能先前移动；7-，四肢瘫痪，不能移动，濒死状态；8-，死亡。

益生菌株

副干酪乳酸杆菌8700:2，副干酪乳酸杆菌defacti，胚芽乳酸杆菌Heal 9，胚芽乳酸杆菌Heal 19，胚芽乳酸杆菌299v和德氏乳酸杆菌(LactobacillusDelbrueckii)由Probi AB提供。

治疗方案

预防治疗；每天配制新鲜的包含1.10⁹-1.10¹⁰不同细菌的100ml饮用水。每个小鼠喝约5ml≈1.10⁸-1.10⁹菌/小鼠/天。在全部实验中，动物在免疫接种之前治疗7-14天。对照小鼠只接受水。在我们近来的实验中，动物在免疫接种之后，在全部实验中每两天用喂食针治疗10天。

治疗性治疗；发病后10天，全部实验中，每两天每个动物通过喂食针单独接受1.10⁹菌。对照小鼠接受盐水。

Methetraxate(MTX)；在全部实验中每两天，i.p.注射给药，终浓度为2.5mg/kg的MTX。

分析

为了进一步调查，从动物体分离出不同的器官和材料；脑、脊髓、脾脏、淋巴结(肠系膜，腹股沟)，肠(部位包括Peyer′氏斑)和血液。一些器官用异戊烷处理，用于免疫组织化学分析。一些脾和淋巴结细胞用流式细胞术(FACS)分析或者放置于培养物中用MOG肽、抗CD3和LPS刺激，为了进一步的ELISA的细胞因子研究。

结果

预防性治疗

动物在免疫接种之前，用1.10⁸副干酪乳酸杆菌8700:2或胚芽乳酸杆菌Heal19治疗七天。EAE在短期内明显被抑制。

动物在免疫接种之前，用1.10⁹副干酪乳酸杆菌8700:2或胚芽乳酸杆菌Heal19治疗十二天。EAE的发病被延迟一周以上且EAE的发展变得更缓和(参见图11和12)。

对脊髓的免疫组织化学分析显示了在益生菌治疗的动物中显著更少量的炎性T细胞。体外脾细胞的增殖测定显示相等的T细胞的MOG特异增殖，但是有趣的是它们产生显著更少量的炎性细胞因子TNF-α和IFN-γ和更大量的IL-4和IL-10。Paracasei处理的动物显示出血浆中更高水平的总IgG和IgA抗体。对肠系膜淋巴结的FACS分析显示出CD4⁺CD25⁺T细胞的增多。对脾的免疫组织化学分析显示出Foxp3⁺(T_reg)细胞的增多。

筛选1：

五种不同的乳酸杆菌(副干酪乳酸杆菌8700:2，副干酪乳酸杆菌defacti，胚芽乳酸杆菌Heal 9，胚芽乳酸杆菌Heal 19和胚芽乳酸杆菌299v)被通过预防治疗方案筛选用于抑制EAE。通过使用副干酪乳酸杆菌8700:2，胚芽乳酸杆菌Heal 9和胚芽乳酸杆菌299v达到最佳的抑制。

转移1；

动物用副干酪乳酸杆菌8700:2，胚芽乳酸杆菌Heal 9，或者两种菌株的混合物处理两周。然后收集肠系膜淋巴结细胞并转移至接受者(i.v.)，接受者在转移之后一天对EAE免疫。从两种菌株的混合物处理的动物得到的细胞明显抑制EAE。抑制作用通过除去CD4+T细胞而被破坏。(参见图13)。

包括用含有副干酪乳酸杆菌8700:2，胚芽乳酸杆菌Heal 9和胚芽乳酸杆菌Heal 19的三种菌株的混合物处理的动物的组的实验被再次重复。

动物被针对EAE免疫。EAE发病后10天，它们分别用副干酪乳酸杆菌8700:2，胚芽乳酸杆菌Heal 9和胚芽乳酸杆菌Heal 19的混合物处理。与接受盐水的对照组相比，形成的疾病EAE显著被抑制。实验成功的重复得到相似的结果。用不特定的德氏乳酸杆菌或甲氨蝶呤治疗(组为一种普通抗炎药)无效，显示该方案的独特治疗作用。

这些治疗的作用的抗炎机制仍是未知的，但是我们的结果清楚的显示出CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞群的关键作用(参见图14)。

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Claims (20)

1.至少一种选自乳酸杆菌的益生菌菌株用于制备用于治疗和/或预防自身免疫疾病的药物组合物的用途。

2.根据权利要求1的用途，其中所述的自身免疫疾病选自由例如多发性硬化症(MS)、过敏症、银屑病、风湿性关节炎、Chrohns′病、溃疡性结肠炎、I型糖尿病、炎症性肠病和全身性红斑狼疮的器官特异性自身免疫疾病组成的组。

3.根据权利要求1或2的用途，其中所述的乳酸杆菌菌株选自由胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnsosus)、发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)、副干酪乳酸杆菌(Lactobacillusparacasei)和加氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)组成的组。

4.根据权利要求3的用途，其中所述的胚芽乳酸杆菌选自由胚芽乳酸杆菌299，DSM 6595，胚芽乳酸杆菌299v，DSM 9843，胚芽乳酸杆菌HEAL 9，DSM 15312，胚芽乳酸杆菌HEAL 19，DSM 15313，和胚芽乳酸杆菌HEAL 99，DSM 15316组成的组。

5.根据权利要求3的用途，其中所述的副干酪乳酸杆菌菌株选自由副干酪乳酸杆菌8700:2，DSM 13434，和副干酪乳酸杆菌02A，DSM13432组成的组。

6.根据权利要求3的用途，其中所述的加氏乳酸杆菌选自加氏乳酸杆菌VPG44，DSM 16737。

7.根据权利要求1-6中任一项的用途，其中使用至少两种益生菌菌株用于治疗和/或预防所述自身免疫疾病。

8.根据权利要求7的用途，其中所述的至少两种菌株意图被顺序或同时给药。

9.根据权利要求1-8中任一项的用途，其中所述药物组合物是液体制剂或者固体制剂。

10.根据权利要求9的用途，其中所述固体制剂选自由片剂，含片，糖果，咀嚼片，口香糖，胶囊，小药囊，粉剂，颗粒剂，包衣微粒和包衣片、肠包衣片和胶囊，以及溶条和薄膜组成的组。

11.根据权利要求9的用途，其中所述液体制剂选自由口服溶液，混悬液，乳液和糖浆组成的组。

12.根据权利要求1-9中任一项的用途，其中所述的组合物包括载体材料。

13.根据权利要求1-9中任一项的用途，其中所述的药物组合物是药用食品、功能食品、食品添加剂、营养品或食物制品。

14.根据权利要求12或13的用途，其中所述载体材料独立的选自由燕麦粥、乳酸发酵食品、抗性淀粉、膳食纤维、碳水化合物、蛋白质和糖基化蛋白组成的组。

15.根据权利要求13的用途，其中所述食物制品选自由饮料、酸乳酪、果汁、冰淇淋、面包、饼干、谷类、健康棒和糊组成的组。

16.根据权利要求1-15中任一项的用途，其中所述的每个菌株在所述组合物中以约1×10⁶至约1×10¹⁴CFU，优选自约1×10⁸至约1×10¹²，且更优选自约1×10⁹至约1×10¹¹的量存在。

17.一种治疗自身免疫疾病的方法，其中将至少一种选自乳酸杆菌的益生菌菌株给予个体。

18.根据权利要求17的方法，其中所述的自身免疫疾病是例如多发性硬化症(MS)、过敏症、银屑病、风湿性关节炎、Chrohns′病、溃疡性结肠炎、I型糖尿病、炎症性肠病或全身性红斑狼疮的器官特异性自身免疫疾病。

19.根据权利要求17或18的方法，其中给予个体至少两种益生菌菌株。

20.根据权利要求19的方法，其中所述的菌株被顺序或同时给药。

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