CN110997898A - 包括植物乳杆菌cjlp475菌株和植物乳杆菌cjlp17菌株的组合物及其用途 - Google Patents
包括植物乳杆菌cjlp475菌株和植物乳杆菌cjlp17菌株的组合物及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及一种组合物，其包括以获取号KCCM12287P保藏的植物乳杆菌CJLP475菌株和以获取号KCCM12249P保藏的植物乳杆菌CJLP17菌株；及其用途。
Description
技术领域
本公开内容涉及一种组合物，其包括植物乳杆菌CJLP475菌株；和植物乳杆菌CJLP17菌株，其具有耐酸性、耐胆汁性、和抗病毒以及免疫增强活性。
背景技术
在当前的畜牧业中，家畜由于高度传染性的病毒性疾病而被杀死，这通常会给农场造成经济损失。特别是在养猪业中，由病毒和病菌引起的传染病，比如猪呼吸道疾病综合征、断奶后多系统消耗性综合征、猪生殖和呼吸综合征、猪流行性腹泻——其为四大主要慢性消耗性疾病——已引起巨大的经济损失。
其中，猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染引起的猪消化疾病，所述猪流行性腹泻病毒是冠状病毒家族中的成员。该病毒在小肠和大肠的绒毛中增殖，并在各个年龄段的猪，特别是仔猪中引起急性肠炎、呕吐和水样腹泻。具体地，损害主要在冬季——11月至4月——严重，并且已知断奶前仔猪在出生1周内的死亡率约为50％，并且在严重的情况中，由于极端脱水死亡率几乎可以达到100％。
PED病毒于1971年在欧洲被首次识别，并在1976年在比利时进一步鉴定并分离出G1a型PEDV CV777。该病毒于二十世纪八十年代在欧洲传播，并在二十世纪九十年代在包括中国、韩国、日本、台湾在内的东亚国家和地区发生爆发。此外，G2b型PEDV——其比G1a型更具毒性——在2010年首次在中国出现。新型PEDV已传播到北美(美国和加拿大)，并且进一步传播到东南亚和欧洲，这造成了严重损害。2013年，由于美国养猪业生产力的损失，损害估计约为2.2万亿韩元。据报道，在韩国，每年有20％至40％的养猪场爆发PEDV，这造成全部猪的6％被杀死。另据报道，进入和离开屠宰场的车辆的感染率达到约60％(韩国农村经济研究所，韩国猪兽医协会)。
到目前为止，预防G2b型PED病毒的唯一方法是彻底灭菌。许多农场使用人造感染方法或现有的G1a型PEDV疫苗来预防由病毒性疾病引起的损害，但是在预防G2b型PEDV感染方面存在局限性。另外，还正在使用新开发的灭活的G2b型PEDV疫苗。然而，关于PEDV的预防措施已经出现了数个问题，比如显示出灭活疫苗在预防消化疾病方面的局限性，因为仅使用灭活疫苗，而不是开发活疫苗。为了克服这些问题，积极地进行用于预防和治疗PED病毒(疫苗等)和治疗(IgY、精油、有机酸、益生菌等)的试剂的开发。具体地，最近研究了一种使用功能材料增强免疫力的方法，该功能材料在体内刺激免疫系统同时具有抗病毒作用。
免疫通常分为先天免疫和适应性免疫。先天免疫是能够从第一线立即防御病原体感染的系统，其直接作用于侵入物(抗原)或诱导适应性免疫。适应性免疫是更复杂和更精确的系统，其识别并清除侵入物，或者充当相应侵入物的记忆，从而提供与先天免疫相比更永久性的免疫功能。树突细胞(DC)、巨噬细胞和天然杀伤细胞——其为与先天免疫相关的抗原呈递细胞——直接发挥先天免疫功能，并具有辅助激活各种类型的T细胞的受体，从而分泌细胞因子。适应性免疫是针对进入身体的抗原的二级防御系统，并且是由B淋巴细胞和T淋巴细胞进行的特异性免疫应答。由抗原激活的T细胞控制的免疫应答包括细胞毒性T细胞应答和辅助T细胞应答。与先天免疫相关的树突细胞、巨噬细胞和天然杀伤细胞也识别外来侵入性物质并分泌各种类型的细胞因子，比如IL-12和IL-4，从而诱导适当地改变宿主动物的免疫力的应答，并且因此可以在适当的方向上提供免疫防御机制。幼稚(naive)CD4 T细胞——其充当T细胞的前体——通过关键细胞因子分化。例如，如果IL-12(白细胞介素12)以高浓度存在，则CD4 T细胞促进Th1(T辅助1)细胞的分化，从而诱导根除细胞内病原体的CTL(细胞毒性T淋巴细胞)应答，而如果IL-4(白细胞介素4)以高浓度存在，则它们诱导特异性根除细胞外病原体(B细胞的抗体分泌物)的应答。此外，上述列举的免疫细胞通过分泌TGF-β(转化生长因子β)和IL-10抑制过度的免疫应答比如炎症反应，分泌TGF-β以抑制过度的免疫应答并且从而激活调节T细胞，通过响应于TGF-β和IL-6(白细胞介素-6)的分泌将B细胞转化为浆细胞来刺激抗体的产生，或诱导免疫应答(Th17)以根除错误的自身免疫和细胞外病原体，以适当的方式通过详细而复杂的过程对进入身体的侵入物做出反应。然而，由于失衡或差的免疫应答，这种免疫应答有时需要另外的和适当的免疫增强子。
发明内容
技术问题
本发明人通过分离和鉴定能够激活免疫系统同时表现出针对上面提到的病毒的抑制活性的微生物并确认了它们的活性而完成本公开内容。
技术方案
本公开内容的一个目的是提供一种组合物，其包括：
(a)以获取号KCCM12287P保藏的植物乳杆菌CJLP475菌株；和
(b)以获取号KCCM12249P保藏的植物乳杆菌CJLP17菌株。
根据本公开内容的一个实施方式，(a)和(b)的形式可以是菌株本身、其裂解物、其培养物、其浓缩物或其干燥形式。
本公开内容的另一个目的是提供包括上述组合物的饲料或饲料添加剂。
本公开内容的仍另一个目的是提供包括上述组合物的食品。
本公开内容的仍又另一个目的是提供包括上述组合物的化妆品。
本公开内容的仍又另一个目的是提供包括上述组合物的药物。
本公开内容的仍又另一个目的是提供用于增强受试者的免疫力的方法，其包括将上述组合物施用于有需要的受试者。
本公开内容的仍又另一个目的是提供用于预防或治疗受试者的病毒感染的疾病的方法，其包括将上述组合物施用于有需要的受试者。
本公开内容的仍又另一个目的是提供组合物在预防或治疗病毒感染的疾病中的用途。
有益效果
本公开内容的组合物具有高耐酸性和耐胆汁性，并且因此可以作为益生菌提供。该组合物在体内激活免疫细胞，并且从而调节免疫功能，并且特别地展现出针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染的优异抑制活性。另外，可以发现，当将本公开内容的组合物口服施用于母猪，并用PED病毒攻击从该母猪中分娩的仔猪时，仔猪的死亡率可以显著降低。因此，本公开内容可以提供一种组合物，其具有针对PED病毒的抗病毒活性，免疫增强活性，以及在家畜中提高增重和减少腹泻发生率的作用，并且因此，该组合物可以有效地用作饲料组合物或用于饲料添加剂的组合物、食品组合物、化妆品组合物或药物组合物。
附图说明
图1显示了证实植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株无溶血活性的血琼脂平板的图像。
图2是显示包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物没有细胞毒性的图。
图3显示了图解包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物对PED病毒感染的抑制作用的显微镜图像。
图4是显示在饲喂包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物的母猪的血清中疫苗特异性IgG抗体的增加速率的图。
图5是显示在饲喂包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物的母猪的血清中疫苗特异性IgA抗体的增加速率的图。
图6是显示在饲喂包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物的母猪的初乳中的中和抗体滴度的图。
图7是显示在由饲喂包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物的母猪所生仔猪中，PED病毒攻击后仔猪血清中的疫苗特异性IgG抗体的含量的图。
图8是显示在由饲喂包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物的母猪所生仔猪中，PED病毒攻击后仔猪血清中的TGF-β含量的图。
图9是显示在由饲喂包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物的母猪所生仔猪中，PED病毒攻击后仔猪空肠的V/C比的图。
图10是显示在由饲喂包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物的母猪所生仔猪中，PED病毒攻击后仔猪结肠的杯形细胞密度的图。
图11是显示在由饲喂包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物的母猪所生仔猪中，PED病毒攻击后7天的平均体温的图。
图12是显示在由饲喂包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物的母猪所生仔猪中，PED病毒攻击后7天腹泻发生率的图。
图13是显示在由饲喂包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物的母猪所生仔猪中，PED病毒攻击后7天的存活率的图。
具体实施方式
在下文中，将更详细地描述本公开内容。同时，本文公开的每个描述和实施方式可以分别应用于其他描述和实施方式。即，本文公开的各种要素的所有组合都落入本公开内容的范围内。此外，本公开内容的范围不受以下描述的具体描述的限制。
为了克服上述目的，本公开内容的一个方面提供了一种组合物，其包括：
(a)以获取号KCCM12287P保藏的植物乳杆菌CJLP475菌株；和
(b)以获取号KCCM12249P保藏的植物乳杆菌CJLP17菌株。
具体地，该组合物可以具有抗病毒性、耐酸性、耐胆汁性和免疫增强活性。
如本文所使用，术语“乳杆菌”是自然界中广泛分布的需氧或兼性厌氧革兰氏阳性杆菌的微生物。属于乳杆菌属的微生物包括植物乳杆菌等。本发明人提供了属于植物乳杆菌的新型菌株，其分别以获取号KCCM12287P和KCCM12249P保藏，并分别被命名为“植物乳杆菌CJLP475”和“植物乳杆菌CJLP17”。它们对应于益生菌菌株，对人体无害，并且可以无副作用地使用。
如本文所使用，术语“益生菌”是指进入身体并提供健康益处的活细菌。迄今为止已知的大多数益生菌通过由乳酸菌比如乳杆菌制成的发酵乳制品消耗(consume)。然而，近年来，益生菌以发酵乳、颗粒剂、粉剂等形式市场上销售，除乳杆菌以外，其还由一些细菌组成，比如双歧杆菌和肠球菌。本公开内容的植物乳杆菌CJLP475和植物乳杆菌CJLP17也可以以发酵乳、颗粒剂、粉剂等形式使用，但不限于此。
如本文所使用，术语“耐酸性”是指禁得起高酸性的性质。如果益生菌是耐酸的，则即使当通过包括口服施用在内的各种施用途径消耗暴露于胃中的强酸性条件时，也可以防止它们被降解或破坏。
如本文所使用，术语“耐胆汁性”是指对胆汁中的消化酶的抗性。胆汁由肝脏制成并储存在胆囊中，并且是有助于消化小肠的十二指肠中的脂肪的弱碱性的棕绿色液体。它乳化脂肪以帮助消化和吸收。胆汁是降低益生菌施用效果的主要原因之一，因为它们对通过包括口服施用等的各种途径摄入的益生菌起作用。
具体地，在本公开内容的组合物中，从酱油(即，传统发酵食品)中分离出植物乳杆菌CJLP475菌株，并且从发生PED病毒的家庭农场中的母猪和仔猪的粪便和初乳中分离出植物乳杆菌CJLP17菌株。该菌株的形态学特征是每种菌株均为革兰氏阳性杆菌，和植物乳杆菌CJLP475菌株由SEQ ID NO：1的16s rDNA核苷酸序列表示，以及植物乳杆菌CJLP17菌株由SEQ ID NO：2的16s rDNA核苷酸序列表示。分析每个核苷酸序列，并且发现与植物乳杆菌约99％同源。因此，本发明人根据布达佩斯条约于2018年4月13日将新型分离的植物乳杆菌CJLP17菌株保藏在国际保藏机构韩国微生物保藏中心，获取号为KCCM12249P，并根据布达佩斯条约于2018年7月11日将植物乳杆菌CJLP475菌株保藏在国际保藏机构韩国微生物保藏中心，获取号为KCCM12287P。
为了长时期稳定地维持本公开内容的植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株，可以通过将细胞溶解在通过在-70℃下将一定量的甘油在水中混合而制备的储存溶液中来储存菌株，或可以通过将细胞悬浮在灭菌的10％脱脂乳中冻干菌株，但不限于此，并且可以通过各种已知方法长时间保存。
本公开内容的组合物可能不展现出针对红细胞的溶血活性。溶血是指红细胞的破坏和血红蛋白向周围区域的释放，并且是由体内有害细菌产生的酶将红细胞溶血的活动。因此，即使该组合物在体内施用，其也不会引起血管中溶血。
另外，本公开内容的组合物可具有弱耐药性或对抗生素没有耐药性。抗生素具体可以为但不限于氨苄西林、克林霉素、庆大霉素、卡那霉素、红霉素、氨苄西林/舒巴坦、氯霉素或链霉素。因此，即使当该组合物用于药物、保健功能食品、饲料添加剂等时，它对抗生素也没有耐药性，并且因此引起相关药理作用或环境问题的可能性很低。
该组合物可以增强免疫细胞的激活以增加细胞因子的分泌，或者可以在体内施用以促进免疫功能。
如本文所使用，术语“免疫细胞”是指在体内起免疫功能作用的所有细胞，并且可以大体上分为T细胞和B细胞。免疫细胞可以包括但不限于Th1或Th2细胞。本公开内容的组合物可具有刺激免疫细胞的活性，并且从而增加细胞因子比如IL-12、IL-10或TGF-β的分泌。
在通常显示高死亡率的病毒性疾病中，由于病毒引起的细胞或组织自身坏死可导致其他细菌诱导的继发感染和败血症，由过度激活的免疫应答引起的炎症性疾病，或食欲下降和脱水。因此，当抑制病毒感染的抗病毒效力(与Th1、Th2相关)和调节继发感染和过度炎症反应的免疫应答(Th2，抗炎)同时增强时，可以实现对于病毒性疾病的有效预防和治疗效果。因此，关于通过益生菌提供免疫增强作用同时增强Th1和Th2的方法在本领域中是未知的，并且本发明人已经新近发现了这种方法。另外，本公开内容的组合物具有调节Th1/Th2失衡的免疫调节能力。
如本文所使用，术语“细胞因子”是指用作控制和刺激身体防御系统的信号物质的糖蛋白，并且可以是例如IL-12、IL-10或TGF-β，但不限于此。
该组合物在施用于受试者时可以促进受试者的生长或减少腹泻发生率。
如本文所使用，术语“受试者”可以指其中免疫力减弱或可能减弱的所有动物，包括人类。例如，受试者可以包括除人类之外或包括人类在内的动物。动物不仅可以包括人类，而且还可以包括需要揭示上述效力的所有动物，并且具体地可以是哺乳动物，比如牛、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗、猫等，或者可选地可以是家畜或宠物。
上述施用方法没有特别限制，但是可以通过各种途径施用，其包括口服或肠胃外途径，只要它可以到达靶组织。其实例可以是口服施用。
该组合物可以增加身体内的抗体。可以通过增加参与免疫功能的抗体的分泌来改善受试者的免疫力。可以将组合物施用于受试者，并且施用方法没有特别限制，但是可以通过各种途径施用，其包括口服或肠胃外途径，只要它可以到达靶组织。其实例可以是口服施用。身体可以是体液，比如血液或初乳，但不限于此。抗体可以是IgG、IgA或中和抗体，但不限于此。
组合物在施用于受试者时可以通过母体抗体增强受试者所生后代的免疫力。免疫力的增强可以包括抗体或细胞因子分泌的增加，但不限于此。
组合物在施用于受试者时可缓解受试者所生后代中病毒感染的症状。病毒可以是猪流行性腹泻病毒(PEDV)，并且可以包括但不限于本公开内容的组合物可以抑制其感染的任何病毒。症状的缓解可以包括但不限于缓解消化器官的病症、维持正常体温、减少腹泻和增加存活率。
组合物可以具有针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的抗病毒活性。
如本文所使用，术语“抗病毒”是指抑制病毒感染的性质。益生菌本身不能灭活病毒，但可以通过免疫活性增加病毒感染的受试者的免疫力，从而允许抵抗病毒感染。
猪流行性腹泻病毒是一种冠状病毒，其感染内衬猪小肠的细胞，引起猪流行性腹泻，猪流行性腹泻诱导严重腹泻和脱水。该病毒可以非限制性地包括本公开内容的组合物可以抑制其感染的任何病毒。
在本公开内容的组合物中分别对应于(a)和(b)的菌株的形式可以是菌株本身、其裂解物、其培养物、其浓缩物或其干燥形式。当在受试者上处理菌株时，可以显著抑制PED病毒的活性和感染。因此，该组合物可用作针对PED病毒的抗病毒组合物，或用于预防或改善猪流行性腹泻的药物、功能食品组合物、准药品(quasi-drug)组合物或饲料组合物。
根据本公开内容的一个实施方式，本公开内容的组合物中的(a)和(b)的形式可以是菌株本身、其裂解物、其培养物、其浓缩物或其干燥形式，但不限于此。关于该组合物的进一步细节可以参考以上描述。
本公开内容的菌株可以通过培养乳杆菌菌株的常规方法培养。可以使用天然培养基或合成培养基作为培养基。可以使用例如葡萄糖、蔗糖、糊精、甘油、淀粉等作为培养基的碳源。可以使用蛋白胨、肉膏、酵母提取物、干酵母、大豆、铵盐、硝酸盐和其他有机或无机含氮化合物作为氮源，但不限于此。可以使用镁、锰、钙、铁、钾等作为包括在培养基中的无机盐，但不限于此。除了碳源、氮源和无机盐组分以外，还可以将氨基酸、维生素、核酸和相关化合物添加到培养基中。本公开内容的组合物可以在20℃至40℃的温度范围内培养12小时至4天。
在本公开内容中，培养肉汤可以指完成培养之后的组合物，并且更具体地，培养肉汤可以包括或可以不包括细胞。因此，培养肉汤可以包括培养上清液、从其去除了培养上清液的组合物或其浓缩的组合物。培养肉汤的组合物可以另外地不仅包含乳杆菌的常规培养所需的组分，而且还包含与乳杆菌的生长协同起作用的组分，并且其组成可以由本领域技术人员容易地选择。
另外，菌株可以处于液体状态或干燥状态，并且干燥方法可以包括但不限于风干、自然干燥、喷雾干燥和冻干。
组合物可以是包含两种类型的菌株的复方制剂，其中同时包含(a)以获取号KCCM12287P保藏的植物乳杆菌CJLP475菌株；和(b)以获取号KCCM12249P保藏的植物乳杆菌CJLP17菌株。因此，组合物可以仅由对应于(a)和(b)的两种类型的菌株、其裂解物、其培养物、其浓缩物或其干燥产物组成，但不限于此。在该情况下，对应于上述(a)和(b)的两种类型的菌株在组合物中不一定必须是相同形式，并且可以是多种形式的组合——如果需要的话，(a)的形式可以是菌株本身，和(b)的形式可以是菌株的裂解物，但不限于此。
植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的混合物在组合物中的浓度可以是但不限于105CFU/mL至1010CFU/mL、105CFU/mL至109CFU/mL、105CFU/mL至108CFU/mL、105CFU/mL至107CFU/mL、105CFU/mL至106CFU/mL、106CFU/mL至1010CFU/mL、107CFU/mL至1010CFU/mL、108CFU/mL至1010CFU/mL、109CFU/mL至1010CFU/mL、106CFU/mL至109CFU/mL、106CFU/mL至108CFU/mL、106CFU/mL至107CFU/mL、107CFU/mL至109CFU/mL、107CFU/mL至108CFU/mL或108CFU/mL至109CFU/mL。
组合物可以进一步包括冷冻保护剂或赋形剂。冷冻保护剂或赋形剂可以是非天然存在的物质或天然存在的物质，但不限于此。在另一个实施方式中，冷冻保护剂或赋形剂可以是不与植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株天然接触的物质，或者是与这两种菌株不同时天然包含的物质，但不限于此。在仍另一个实施方式中，组合物可以进一步包括选自甘油、海藻糖、麦芽糊精、脱脂奶粉和淀粉的至少一种冷冻保护剂，和/或选自葡萄糖、糊精和脱脂乳的至少一种赋形剂。基于组合物的总重量，可以包含按重量计0.01％至20％和按重量计0.01％至10％的量的本公开内容的冷冻保护剂。具体地，在组合物中可以包含按重量计5％至20％的量的甘油，可以包含按重量计2％至10％的量的海藻糖，可以包含按重量计2％至10％的量的麦芽糊精，可以包含按重量计0.5％至2％的量的脱脂奶粉，和可以包含按重量计0.1％至1％的量的淀粉。另外，基于组合物的总重量，可以包含按重量计75％至95％或按重量计85％至95％的量的赋形剂。
此外，用于制备组合物的方法可以包括将植物乳杆菌CJLP475和植物乳杆菌CJLP17菌株本身、其裂解物、其培养物、其浓缩物或其干燥产物与添加剂混合。添加剂可以是上面提到的冷冻保护剂或赋形剂。
组合物可用于食品、功能食品、饲料、饲料添加剂、化妆品组合物或药物组合物。
组合物可用于增强免疫力。
组合物可用于提供抗病毒活性。
在另一方面中，提供了一种益生菌组合物，其包括本公开内容的组合物作为活性成分。
益生菌被固定在肠道中消化道的壁上以防止有害细菌的建立并抑制病毒的增殖。另外，通过益生菌产生的有益消化酶通过促进营养物的吸收和利用来促进生长。
用于制备益生菌组合物的方法可以包括制备包括以获取号KCCM12287P保藏的植物乳杆菌CJLP475菌株的组合物和包括以获取号KCCM12249P保藏的植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物中的每一种；和混合包括CJLP475菌株的组合物和包括CJLP17菌株的组合物。
在一个实施方式中，制备方法可以包括将添加剂添加至上述组合物中的至少一种，比如包括CJLP475菌株的组合物、包括CJLP17菌株的组合物或益生菌组合物。
在另一个实施方式中，添加剂可以是冷冻保护剂，并且该方法可以进一步包括在添加添加剂之后的冻干步骤。
本文冻干组合物中的细菌可以处于存活状态。
在仍另一个实施方式中，制备方法可以包括在混合步骤之后将预定量的组合物制备成包装。
本文在包装步骤中组合物可以制备成包装，使得包括CJLP475菌株和CJLP17菌株的菌株的总量为106CFU/g或更多。
在本公开内容的仍另一方面中，提供了包括该组合物的饲料或饲料添加剂。
上面描述了上述组合物。具体地，出于促进生长、减少腹泻发生率和抑制病毒活性的目的，可以将本公开内容的组合物添加至饲料添加剂或包括饲料添加剂的饲料组合物。
如本文所使用，术语“饲料添加剂”是指出于提供各种效果的目的比如补充营养物和防止体重减轻、促进饲料中纤维素的消化率、改善牛奶质量、防止生殖障碍和提高怀孕率以及防止在夏季期间的高温胁迫(high-temperature stress)而添加到饲料中的物质。根据家畜和鱼类饲料控制法(the Control of Livestock and Fish Feed Act)，本公开内容的饲料添加剂属于补充饲料，并且可以进一步包括矿物质制品，比如碳酸氢钠、膨润土、氧化镁、复合矿物质，和痕量矿物质，其包括锌、铜、钴和硒；维生素，比如胡萝卜素、维生素E、维生素A、D、E、烟酸和维生素B复合物；氨基酸保护剂，比如甲硫氨酸和赖氨酸；脂肪酸保护剂，比如脂肪酸钙；以及活细菌和酵母制品，比如益生菌(乳酸菌)、酵母培养物和真菌发酵产物。
如本文所使用，术语“饲料”是指动物进食、摄食和消化或适合于进食、摄食和消化的任何天然或人造饮食、单餐等，或单餐的组分。可以将包括作为活性成分的根据本公开内容用于预防或治疗代谢疾病的组合物的饲料制备成本领域已知的各种形式的饲料，并且可以具体地包括浓缩饲料、粗饲料和/或特种饲料。
出于本公开内容的目的，待饲养的受试者可以包括可以摄食本公开内容的饲料的任何生物，并且可以包括猪。
根据待施加的受试者的种类和年龄、施加形式、期望效果等，可以适当地控制根据本公开内容的饲料组合物中的组合物的含量。例如，可以包含按重量计0.01％至20％、按重量计0.01％至15％、按重量计0.01％至10％、按重量计0.01％至5％、按重量计0.01％至1％、按重量计1％至20％、按重量计1％至15％、按重量计1％至10％、按重量计1％至5％、按重量计5％至20％、按重量计5％至15％、按重量计5％至10％、按重量计10％至20％、按重量计10％至15％或按重量计15％至20％的量的组合物，但不限于此。
为了施用，本公开内容的饲料组合物可以进一步包括下列一种或多种的混合物：有机酸，比如柠檬酸、富马酸、己二酸、乳酸等；磷酸盐，比如磷酸钾、磷酸钠、多磷酸盐等；和天然抗氧化剂，比如多酚、儿茶素、生育酚、维生素C、绿茶提取物、壳聚糖、鞣酸等。如果需要的话，可以添加其他典型的添加剂，比如抗流感剂、缓冲剂、抑菌剂等。此外，可以另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂或润滑剂以将该组合物配制成可注射制品(比如水溶液、悬浮液、乳剂等)、胶囊、颗粒剂或片剂。
此外，本公开内容的饲料组合物可以与下列成分一起使用：营养补充剂、生长促进剂、消化吸收促进剂和预防剂，另外各种助剂比如氨基酸、无机盐、维生素、抗氧化剂、抗真菌剂、抗微生物剂等作为辅助组分，和主要成分，其包括植物蛋白饲料比如粉碎的或破碎的小麦、大麦、玉米等，动物蛋白饲料比如血粉、肉粉、鱼粉等，动物脂肪和植物脂肪。
当本公开内容的饲料组合物用作饲料添加剂时，饲料组合物可以被单独添加或与其他组分组合添加，并且可以根据常规方法适当地使用。饲料组合物可以与无毒的、药学上可接受的载体组合制备成速释或缓释制剂的施用形式。载体可以是非天然存在的物质或天然存在的物质，但不限于此。在另一个实施方式中，载体可以是不与植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株天然接触的物质，或者是与这两种菌株不同时天然包含的物质，但不限于此。可食用载体可以是玉米淀粉、乳糖、蔗糖或丙二醇。固体载体可以是片剂、粉剂、锭剂等施用形式，并且液体载体可以是糖浆剂、液体悬浮液、乳剂、溶液等施用形式。进一步，施用剂可以包括防腐剂、润滑剂、溶液促进剂或稳定剂，并且还可以包括用于改善炎症性疾病的其他试剂和可用于预防病毒的物质。
基于饲料的干重，根据本公开内容的饲料组合物可以以每1kg约10g至500g，具体地10g至100g的量与饲料混合。在完全混合之后，饲料组合物可以提供为糊状物，或可以进一步经历粒化、扩大化(extensification)或挤出过程，但不限于此。
在本公开内容的仍又另一方面中，提供了包括该组合物的食品或功能食品。
具体地，出于促进生长、促进免疫、减少腹泻发生率和抑制病毒活性的目的，可以将本公开内容的组合物添加到食品中。组合物为如上所述。食品可以包括饮食学(sitologically)可接受的载体。载体可以是非天然存在的物质或天然存在的物质，但不限于此。在另一个实施方式中，载体可以是不与植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株天然接触的物质，或者是与这两种菌株不同时天然包含的物质，但不限于此。
本公开内容的食品包括所有形式的功能食品、营养补充剂、保健食品和食品添加剂，并且这些类型的食品可以根据常规方法制备成各种形式。
当该组合物被用作食品添加剂时，该组合物可以被单独添加或与其他食品或食品成分组合使用，并且可以根据常规方法适当地使用。可以根据使用目的(预防、保健或治疗处理)适当地确定混合的活性成分的量。通常，在制备食品或饮料时，基于包括该组合物的原料组合物，该组合物以按重量计0.0001％至1％，具体地按重量计0.0001％至0.1％的量添加。然而，在出于保健和卫生目的或出于控制健康的目的长期施用的情况下，该量可以小于上述范围。
食品的类型没有具体限制。可以将该组合物添加到其中的食品的实例包括肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、小吃、甜食、比萨饼、方便面、其他面条、口香糖、乳制品(包括冰淇淋)、各种汤、饮品、茶、饮料、酒精饮料、维生素复合物等，并且包括在普通意义上的所有保健功能食品。
本公开内容的保健饮料组合物可以进一步包含如在常规饮料中的各种调味剂或天然碳水化合物作为另外的组分。上述天然碳水化合物可以包括单糖，比如葡萄糖、果糖等；二糖，比如麦芽糖、蔗糖等；多糖，比如糊精、环糊精等；和糖醇，比如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等。天然甜味剂，比如奇异果甜蛋白、甜叶菊提取物等；和合成甜味剂，比如糖精、天冬甜素等可以用作甜味剂。基于按重量计100份的本公开内容的组合物，另外的组分的比例的范围可以为按重量计0.01至0.04份，具体地按重量计0.02至0.03份。
除了上述组分以外，本公开内容的组合物可以包含各种营养补充剂、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸和其盐、藻酸和其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH控制剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。这种添加剂的比例并不重要，但是基于按重量计100份的本公开内容的组合物，通常在按重量计0.01至0.1份的范围内选择。而且，本公开内容的组合物可以包括用于制备天然果汁、果汁饮料或蔬菜饮料的果肉。这种果肉的比例并不重要，但是基于按重量计100份的本公开内容的组合物，通常在按重量计0.01至10份的范围内选择。这种组分可以单独使用或组合使用。
在本公开内容的仍又另一方面中，提供了包括该组合物的化妆品。
具体地，本公开内容的组合物通过免疫刺激而具有抗炎作用和抗病毒活性抑制作用，并且因此可以用作化妆品。组合物为如上所述。
当将根据本公开内容的组合物用作化妆品时，该组合物可以制备成化妆品领域中已知的常规制剂的各种化妆品。在制备成每种制剂时，其可以通过添加载体或赋形剂来制备，该载体或赋形剂在制造每种制剂的化妆品中是可接受的和必需的。载体可以是非天然存在的物质或天然存在的物质，但不限于此。在另一个实施方式中，载体可以是不与植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株天然接触的物质，或者是与这两种菌株不同时天然包含的物质，但不限于此。
在本公开内容的仍又另一方面中，提供了包括该组合物的药物。具体地，本公开内容的组合物通过促进生长、减少腹泻发生率和刺激免疫而具有抗炎作用和抗病毒活性抑制作用，并且因此可以用作药物。组合物为如上所述。
当将根据本公开内容的组合物用作药物时，该组合物可以制备成本领域已知的常规药物制剂。药物可以具体地制备成用于口服施用的制剂，比如液体、悬浮液、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、丸剂或提取物。在制备成每种制剂时，它可以通过添加载体或赋形剂来制备，该载体或赋形剂在制造每种制剂的化妆品中是可接受的和必需的。载体可以是非天然存在的物质或天然存在的物质，但不限于此。在另一个实施方式中，载体可以是不与植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株天然接触的物质，或者是与这两种菌株不同时天然包含的物质，但不限于此。典型地，当将该组合物制备成用于口服施用的制剂时，可以使用选自稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、甜味剂、稳定剂和防腐剂的至少一种载体，并且可以使用选自调味剂、维生素和抗氧化剂的至少一种添加剂。可以使用任何药学上可接受的赋形剂或添加剂。具体地，能够使用乳糖、玉米淀粉、大豆油、微晶纤维素或甘露醇作为稀释剂；硬脂酸镁或滑石作为润滑剂；和聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素作为粘合剂。另外，能够使用羧甲基纤维素钙、羧甲基淀粉钠、波拉克林钾或交聚维酮作为崩解剂；白糖、果糖、山梨糖醇或天冬甜素作为甜味剂；羧甲基纤维素钠、β-环糊精、白蜡或黄原胶作为稳定剂；和对氧苯甲酸甲酯、对氧苯甲酸丙酯或山梨酸钾作为防腐剂。
在本公开内容的仍又另一方面中，提供了用于将本公开内容的组合物施用至受试者的步骤。组合物和受试者为如上所述。
通过施用，受试者可以展现该组合物的效力，即，免疫增强活性、抗病毒活性等。
基于植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的混合物，施用剂量可以是但不限于106CFU/天或更多、107CFU/天或更多、108CFU/天或更多、109CFU/天或更多、1010CFU/天或更多或1011CFU/天或更多。
在本公开内容的仍又另一方面中，提供了用于增强受试者的免疫力的方法，包括将该组合物施用于有需要的受试者。组合物和受试者为如上所述。
如本文所使用，术语“施用”意思是通过任何合适的方法将本公开内容的组合物引入受试者，并且组合物的施用途径可以包括各种途径，比如口服或肠胃外施用，只要它可以到达靶组织。
在本公开内容的仍又另一方面中，提供了用于预防或治疗受试者的病毒感染疾病的方法，包括将该组合物施用于有需要的受试者。组合物和受试者为如上所述。
如本文所使用，术语“预防(prevention或preventing)”意思是旨在通过施用本公开内容的组合物来抑制、阻抑或延迟病毒感染疾病的所有活动。此外，如本文所使用，术语“治疗(treatment或treating)”意思是旨在通过施用本公开内容的组合物来减轻或有益地改变病毒感染疾病的症状的所有活动。
实施例
在下文中，将通过实施例更详细地描述本公开内容。然而，这些实施例仅出于说明性目的，并且本发明的范围不旨在被这些实施例限制。
实施例1：菌株的分离和选择
1-1.植物乳杆菌CJLP475菌株的样品收集和分离
将从酱油中分离的植物乳杆菌CJLP475菌株涂在含有1.5％琼脂的固体MRS培养基(Difco，USA)上，并在37℃下温育24小时。通过将从每个样品中分离出的菌株转移到新鲜培养基中而使它们被纯化地分离，并且在-70℃或更低下将如此分离出的菌株储存在补充有20％甘油的营养培养基中。结果，总共收集了1,552个菌株，并通过以下实施例选择具有优异的抗病毒活性的菌株。
作为16S rDNA测序分析的结果，植物乳杆菌CJLP475菌株显示与植物乳杆菌标准菌株(NBRC1589，GenBank获取号AB326351)最高的同源性(99.9％)，并且因此被鉴定为植物乳杆菌，并命名为“植物乳杆菌CJLP475”，并根据布达佩斯条约于2018年7月11日保藏在国际保藏机构韩国微生物保藏中心，获取号为KCCM12287P。分析的植物乳杆菌CJLP475的16SrDNA核苷酸序列由SEQ ID NO：1表示。
同时，发现作为革兰氏染色的结果，植物乳杆菌CJLP475菌株为革兰氏阳性的。此外，为了分析生化特征，通过API 50CHL系统(biomerieux Vitek，Inc.，France)分析了菌株的糖发酵模式(表1)。
表1植物乳杆菌CJLP475的糖发酵模式分析
+：阳性，-：阴性
1-2.植物乳杆菌CJLP17菌株的样品收集和分离
母猪和仔猪的粪便和初乳样品是从发生了PED病毒慢性爆发的家庭农场中收集的。使如此收集的样品经历连续稀释，涂在固体MRS和BHI培养基上，并在37℃下温育48小时。通过将从每个样品中分离出的菌株转移到新鲜培养基中而使它们被纯化地分离，并在-70℃或更低下将如此分离出的菌株储存在补充有20％甘油的营养培养基中。结果，总共收集了1,552个菌株，并通过下述实施例选择具有优异抗病毒活性的菌株。作为16S rDNA测序分析的结果，植物乳杆菌CJLP17菌株显示出与植物乳杆菌标准菌株(NBRC15891，GenBank获取号AB326351)最高的同源性(99.9％)，并且因此鉴定为植物乳杆菌，并命名为“植物乳杆菌CJLP17”，并根据布达佩斯条约于2018年4月13日保藏在国际保藏机构韩国微生物保藏中心，获取号为KCCM12249P。分析的植物乳杆菌KCCM12249P的16S rDNA核苷酸序列由SEQ IDNO：2表示。
同时，发现作为革兰氏染色的结果，植物乳杆菌CJLP17菌株为革兰氏阳性的。此外，为了分析生化特征，通过API 50CHL系统(biomerieux Vitek，Inc.，France)分析了菌株的糖发酵模式(表2)。
表2植物乳杆菌CJLP17的糖发酵模式分析
+：阳性，-：阴性
实施例2：菌株的耐酸性和耐胆汁性的评估
为了选择可用作益生菌的菌株，评估了所获得菌株的耐酸性和耐胆汁性。
制备了人造胃液培养基以评估耐酸性。更具体地，通过将胃蛋白酶添加到液体MRS培养基中以将pH调节至2.5，然后灭菌来制备人造胃液培养基。
第二次继代培养后，在37℃下将实施例1的菌株在液体MRS培养基中经历静态培养18小时。将1％的预温育的(pre-incubated)菌株接种到人造胃液培养基中，并在37℃下经历静态培养，并且在0小时和3小时对培养肉汤进行取样。将取样的培养肉汤连续稀释并涂在固体MRS培养基上，并在37℃下温育48小时以测量活细胞数。
制备了人造胆汁培养基用于评估耐胆汁性。更具体地，通过将0.5％牛胆汁(公牛胆汁)添加到液体MRS培养基中，随后灭菌来制备人造胆汁培养基。
第二次继代培养后，在37℃下将实施例1的菌株在液体MRS培养基中经历静态培养18小时。将1％的预温育的菌株接种到人造胆汁培养基中，并在37℃下经历静态培养，并在0小时和24小时对培养肉汤取样。将取样的培养肉汤连续稀释并涂在固体MRS培养基上，并在37℃下温育48小时以测量活细胞数。
通过上述评估，选择了具有最高耐酸性和耐胆汁性的菌株，并将其命名为植物乳杆菌CJLP475和植物乳杆菌CJLP17。为了比较植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的耐酸性和耐胆汁性与常规已知菌株的耐酸性和耐胆汁性，以与上述方法相同的方式评估了从韩国微生物保藏中心获得的植物乳杆菌标准菌株(KCCM12116)的耐酸性和耐胆汁性。
表3耐酸性评估(单位：CFU/mL)
表4耐胆汁性评估(单位：CFU/mL)
根据上述表3和表4，在人造胃液培养基和人造胆汁培养基中的植物乳杆菌标准菌株(KCCM12116)中的细胞数量减少。因此，可以看出并非所有通常已知的植物乳杆菌都具有耐酸性和耐胆汁性。
同时，在耐酸性评估中，在植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株中的细胞数量反而增加，这表明该菌株具有优异的耐酸性。
在耐胆汁性评估中，与植物乳杆菌标准菌株(KCCM12116)相比，植物乳杆菌CJLP17菌株中的细胞数量增加，并且植物乳杆菌CJLP475菌株的细胞数量具有较小的减少，这表明这两种菌株都具有优异的耐胆汁性。
另外，因为每种菌株均具有优异的耐酸性和耐胆汁性，所以可以暗示包括这两种菌株的组合物具有优异的耐酸性和耐胆汁性。
实施例3：菌株的安全性评估
3-1.菌株的溶血活性的确认
β-溶血是其中红细胞提供的磷脂被由有害细菌产生的磷脂酶水解，这导致红细胞溶血的现象。为了确定植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的溶血活性，使用了血琼脂平板(绵羊血5％琼脂，Hanilkomed，Korea)。将每个菌株划线接种至制备的血琼脂平板中，并在37℃下温育24小时以确认溶血。
结果，如图1中所显示，确认植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株没有显示溶血。这些结果表明它们在体内不充当有害细菌。
3-2.抗生素敏感性的评估
将植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株独立地接种到液体MRS培养基中，并在37℃下经历静态培养，持续24小时。将如此培养的细菌吸入灭菌棉拭子中，并涂在固体Mueller Hinton II培养基(Difco)上，并且然后将抗生素片置于该培养基上，并在37℃下温育24小时。将氨苄西林、克林霉素、庆大霉素、卡那霉素、红霉素、氨苄西林/舒巴坦、氯霉素和链霉素片(Oxoid，UK)用作用于抗生素测试的抗生素片。
作为植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的抗生素敏感性测试的结果，每个菌株对上述抗生素都没有耐药性(表5)。因此，可以发现，即使在药物、保健功能食品、饲料添加剂等中使用植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株，考虑到它们对抗生素没有耐药性，也不太可能出现关于耐药性的问题和环境问题。
表5根据抗生素抑制细菌生长
实施例4：细胞毒性的评估
为了研究菌株对细胞存活率的影响，使用(3-(4,5-二甲基-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(promega，USA)进行MTS试验以评估对IPEC-J2细胞(肠道猪上皮细胞)的细胞毒性水平。将每种细胞在96孔细胞培养板上温育，并用菌株混合物处理，其中植物乳杆菌CJLP475和植物乳杆菌CJLP17在105CFU/mL至107CFU/mL的不同的浓度下以1∶1的比例混合。在24小时之后将MTS溶液添加到细胞培养肉汤中，并将细胞温育2小时，并且用酶标仪通过在490nm处测量吸光度来计算细胞存活率(％)。
结果，如图2中所显示，当在三种不同浓度下处理细胞时，确认在107CFU/mL或更低的浓度下几乎观察不到细胞死亡。因此，可以看出，在107CFU/mL或更低的浓度下组合物基本上不显示细胞毒性。
实施例5：针对病毒感染的抑制作用
为了测量包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物对病毒感染的抑制作用，制备了猪流行性腹泻病毒(PEDV)。具体地，病毒在Vero细胞(CCL-81，从绿猴属提取的肾上皮细胞)中增殖，并且MEM(伊格尔最低必需培养基，Gibco BRL，USA)、热灭活的10％FBS(胎牛血清，v/v)和1％(v/v)青霉素/链霉素作为用于培养Vero细胞的培养基。将Vero细胞作为单层温育，用培养基冲洗两次，并且然后除去所有溶液。将病毒以0.1MOI(感染复数)的水平在包含胰蛋白酶的不含FBS的MEM中混合，用5μg/ml TPCK(N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮)处理、用最小体积的制备的培养细胞处理，并且然后在37℃的含有5％CO2的细胞培养箱中温育2至3天。
通过形成病毒合胞体来确定病毒感染。当形成病毒合胞体时，在3至6小时内收集病毒培养肉汤，并使用离心机除去细胞并储存在-80℃下。为了计算病毒的感染滴度，将Vero细胞以2×104个细胞/0.1ml的密度在96孔板中温育，并用PBS冲洗细胞。随后，向细胞添加培养肉汤，其中使病毒经历2倍连续稀释，并温育24至48小时以确认病毒感染，并通过Reed&Muench方法计算病毒滴度。
为了测量包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物对病毒感染的抑制作用，将该组合物和外周血单核细胞(PBMC)以及从21日龄断奶仔猪提取的肠系膜淋巴结(mLN)中的淋巴细胞反应20至24小时，并且然后在其中温育IPEC-J2的96孔细胞培养板上独立地处理，并在37℃的含有5％CO2的细胞培养箱中温育2至4小时。将剂量为100TCID50/mL(组织细胞感染剂量的50％)的PED病毒(SM98或KPEDV9)等分到每个平板上，并温育48小时。为了确认病毒感染，在培养完成后，用甲醇固定细胞培养板，用结晶紫染色，然后用显微镜检查其中细胞变性的孔，从而确认病毒感染。
表6通过激活免疫细胞植物乳杆菌CJLP475、植物乳杆菌CJLP17和其混合物对PED病毒感染的抑制作用
++：完全的抑制，+：部分抑制，-：感染的
结果，如表6和图3中所显示，当将包括两种植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物与猪免疫细胞一起处理时，可以判断通过该组合物激活的免疫细胞可以抑制肠道猪上皮细胞(IPEC-J2)中的PED病毒感染。
考虑到表6中的三个实验组(CJLP475、CJLP17、CJLP17和CJLP475)中的每一个的菌株总数相同，与包括CJLP475菌株和CJLP17菌株中的每一种的组合物对PED病毒感染的抑制作用相比，包括两种植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物对PED病毒感染的抑制作用显著更高。
实施例6：确认对母猪的免疫力和初乳的作用
由于在实施例5中确认了包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物的抗病毒作用，因此进行实验以便确认当将该组合物饲喂给母猪时其对母猪的免疫力和初乳的作用，如下：从没有发生PED病毒的农场中为每个实验组随机选择在相同分娩期的分娩前6周的15头母猪。实验中使用的所有母猪均在分娩前8周和3周接种PED病毒疫苗。在总共两个实验组中进行该实验，即，不饲喂菌株的对照组和饲喂包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物的组。饲料以不含抗生素的普通粉碎饲料形式提供，并且提供水以自由地饮用。植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株以冻干粉的形式产生并储存在冰箱中，并且然后在饲喂给母猪时添加到饲料上面，从而每天饲喂给每只母猪的组合物的量为1010CFU或更多。母猪总共饲喂6周，并且以便确认菌株对母猪的免疫力和初乳的作用，测量了母猪血清中疫苗特异性IgG抗体的增加速率和疫苗特异性IgA抗体的增加速率，以及初乳中的中和抗体滴度，并且将结果分别显示在图4、5和6中。
作为实验的结果，与对照组相比，包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物增加了母猪血清中的疫苗特异性IgG和IgA。此外，当检查根据组合物的饲喂而在分娩期间初乳中的中和抗体滴度的变化时，确认包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物显示出比对照组中更高的中和抗体滴度。
实施例7：根据母猪中组合物的饲喂提高仔猪免疫力的作用
为了确认包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物对从用该组合物饲喂的母猪所生仔猪的免疫力的影响，使用母猪如实施例6进行了实验，并且此外，在给予初乳后4天从母猪所生仔猪中收集血液，以使用IgG ELISA试剂盒进行免疫学分析。图7显示了组合物饲喂对从母猪所生仔猪的免疫力的影响，总共6周。
结果，发现与对照组相比，在饲喂包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物的组中仔猪血清中的疫苗特异性IgG的含量更高(图7)。
这些结果表明，仔猪从母猪的初乳中得到了高疫苗特异性IgG，并且因此可以发现通过用包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物饲喂母猪可以提高仔猪的免疫力。
实施例8：攻击试验对用该组合物饲喂的母猪所生仔猪的影响
为了确认当用包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物饲喂的母猪所生仔猪感染PED病毒时对仔猪死亡率的影响，使用母猪按照实施例6进行了实验。因为该实验需要用PED病毒对仔猪进行攻击试验，因此根据动物保护和使用委员会的建议，将实验组最小化，以这样的方式，不对包含单一菌株的实验组进行测试，而仅对含有包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物的组进行测试。
对于每个治疗组，选择从用包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物饲喂的母猪分娩后的20只4日龄的仔猪，并用PED病毒(PEDv QIAP 1401，100LD50/ml)攻击。在攻击后每天测量体温和腹泻评分(0-3，0：正常大便，1：苍白大便，2：正常腹泻，3：严重腹泻)，总共7天。仔猪被给予代乳品并自由地饮用水，并且通过与代乳品混合，以每天1×1010CFU的量向每只仔猪饲喂包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物。当仔猪死亡时，进行尸检，并对空肠和结肠取样，用中和的福尔马林固定，通过用石蜡处理包埋，并且显微切片，然后将组织切片脱蜡并水合。在H&E染色后，测量绒毛高度与隐窝深度的比，以检查V/C比。通过对结肠粘膜取样来确认每mm2杯形细胞的数量。另外，从每个受试者收集血液并从其中分离血清以比较每个治疗组的炎症抑制程度。在这方面，使用ELISA(R&D Systems，USA)测量典型的炎症抑制因子TGF-β的水平，并将攻击试验的结果显示在图8至13中。
发现与对照组相比，在饲喂该组合物的组中，仔猪血清中的TGF-β较高。因此，确认在饲喂包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物的组中，抗炎反应被进一步激活(图8)。
与对照组相比，在饲喂该组合物的组中仔猪空肠的V/C比较高，并且因此确认与对照组相比，病毒对绒毛的去除减轻(图9)。
与对照组相比，在饲喂该组合物的组中仔猪结肠中的杯形细胞以更高的含量存在，并且因此确认由PED病毒感染引起的肠粘膜形成抑制显著降低(图10)。
作为检查在PED病毒攻击后仔猪的体温变化的结果，确认与对照组相比，在饲喂该组合物的组中体温维持在正常范围内。具体地，在5、6和7dpi时，与对照组相比，用该组合物饲喂的母猪所生仔猪的体温变化显著维持在平均体温(图11)。
作为确认由PED病毒引起的仔猪的腹泻评分(临床显著性评分)的结果，在6和7dpi下用该组合物饲喂的实验组中的腹泻评分显著低于对照组的腹泻评分(图12)。
直到PED病毒攻击之后7天观察仔猪的存活率。结果，当感染PED病毒时，对照组的存活率为55％，而用PED病毒饲喂的母猪所生仔猪的存活率为65％，从而显示出与对照组相比更优异的抗病毒作用(图13)。
根据上述结果，确认在感染病毒之后降低了仔猪的死亡率，因为通过给母猪饲喂该组合物提高母猪的免疫力和初乳中的抗体，并且因此对仔猪的免疫力起作用。
实施例9：包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的益生菌的制备
实施例1中鉴定的益生菌植物乳杆菌CJLP475菌株和益生菌植物乳杆菌CJLP17菌株被大规模生产并冻干以使益生菌适合用作药物、食品、饲料、饲料添加剂或化妆品的原料。
为了生产每个菌株，在37℃下将每个菌株在液体MRS培养基(Difco)中温育18小时，同时用25％的NaOH溶液将pH调节至6.0，然后通过离心收获菌株。在-40℃下将每个收获的菌株冷冻，其中将5％糊精和10％脱脂乳用作冷冻保护剂，在37℃下干燥，并用混合器粉末化。将每个粉状存活菌株彼此混合以将菌株数量调节至期望的水平。将混合物与适量的赋形剂比如葡萄糖、乳糖和脱脂乳混合，用于储存，并包装在可密封的铝袋中。
益生菌可以根据本领域的常规方法应用于各种领域，比如药物、食品、饲料、化妆品等。例如，制备的益生菌可以与用作饲料原料的颗粒粉末混合以用作饲料的益生菌，可以与赋形剂或添加剂混合以用作片剂、胶囊形式的药物以及食品的益生菌，或可以按预定量与化妆品原料混合以用作化妆品的益生菌。
虽然已经参考具体的说明性实施方式描述了本公开内容，但是本公开内容所属领域的技术人员将理解，在不脱离技术精神或本质特征的情况下，可以以其他特定形式来体现本公开内容。因此，上述实施方式在所有方面都被认为是说明性的而不是限制性的。此外，本公开内容的范围由所附权利要求书限定而不是由具体实施方式来限定，并且应当理解，从本公开内容的含义和范围及其等同物得出的所有修改或变化都包括在所附权利要求的范围内。
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
国际表格
原始保藏接收证明
由该页下部确定的国际保藏机构根据第7.1条发出
至：CJ第一制糖株式会社
CJ第一制糖中心
330，DONGHO-RO，JUNG-GU，首尔100-400
大韩民国
证明上述翻译与原文内容没有相互违背
2018年7月18日
专利代理人Son Min印
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专利代理人Son Min印
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 包括植物乳杆菌CJLP475菌株和植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物及其用途
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<223> 植物乳杆菌CJLP17
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tcaaatgtaa atc 1333
PCT/RO/134表
Claims (21)
1.一种组合物，其包括：
(a)以获取号KCCM12287P保藏的植物乳杆菌CJLP475菌株；和
(b)以获取号KCCM12249P保藏的植物乳杆菌CJLP17菌株。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物具有耐酸性、耐胆汁性和免疫增强活性，并通过促进免疫细胞的激活增加细胞因子的分泌。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述细胞因子是选自IL-10、IL-12和TGF-β中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物具有针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的抗病毒活性。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在施用于受试者时增强免疫力。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述受试者是家畜或宠物。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在施用于受试者时增加体内抗体。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在施用于受试者时增强所述受试者所生后代的免疫力。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在施用于受试者时缓解所述受试者所生后代中病毒感染的症状。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中(a)和(b)的形式为菌株本身、其裂解物、其培养物、其浓缩物或其干燥形式。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述组合物进一步包括冷冻保护剂或赋形剂。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述冷冻保护剂是选自甘油、海藻糖、麦芽糊精、脱脂奶粉和淀粉的至少一种，并且
所述赋形剂是选自葡萄糖、糊精和脱脂乳的至少一种。
13.根据权利要求10所述的组合物，其中所述组合物的用途选自用于增强免疫力和提供抗病毒活性的用途，在药物、饲料或饲料添加剂、食品和化妆品中的用途。
14.一种用于增强受试者的免疫力的方法，其包括将根据权利要求1至13中任一项所述的组合物施用于受试者。
15.用于预防或治疗受试者的病毒感染疾病的方法，其包括将根据权利要求1至13中任一项所述的组合物施用于受试者。
16.一种用于制备益生菌组合物的方法，其包括：
制备包括以获取号KCCM12287P保藏的植物乳杆菌CJLP475菌株的组合物；和包括以获取号KCCM12249P保藏的植物乳杆菌CJLP17菌株的组合物中的每一种；和
混合所述包括CJLP475菌株的组合物和所述包括CJLP17菌株的组合物。
17.根据权利要求16所述的方法，进一步包括将添加剂添加至所述包括CJLP475菌株的组合物、所述包括CJLP17菌株的组合物或所述益生菌组合物中的至少一种。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述添加剂是冷冻保护剂，并且所述方法进一步包括在添加所述添加剂之后的冻干步骤。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述冻干组合物中的菌株处于存活状态。
20.根据权利要求16所述的方法，包括在所述混合步骤之后将预定量的所述组合物制备成包装。
21.根据权利要求20所述的方法，其中在所述包装步骤中将所述组合物制备成包装，使得包括所述CJLP475菌株和所述CJLP17菌株的菌株的总量为106CFU/g或更多。
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