KR101778575B1 - 락토바실러스 속 균주를 포함하는 생균제 조성물, 동물사료용 첨가제 및 동물사료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 내산성, 내담즙성, 항균능, 장세포 부착능, 효소 활성 및 면역 증강능을 갖고, 항생제 내성을 갖지 않는 신규한 락토바실러스 속 균주를 포함하는 생균제 조성물, 상기 생균제 조성물을 포함하는 동물사료용 첨가제 및 상기 첨가제를 포함하는 동물사료 조성물에 관한 것이다.

Description

락토바실러스 속 균주를 포함하는 생균제 조성물, 동물사료용 첨가제 및 동물사료 조성물{Probiotics comprising Lactobacillus sp., additives for animal feedstuff and animal feedstuff}

본 발명은 락토바실러스 속 균주를 포함하는 생균제 조성물, 동물사료용 첨가제 및 동물사료 조성물에 관한 것으로 보다 상세하게는 내산성, 내담즙성, 항균능, 장세포 부착능, 효소 활성 및 면역 증강능을 갖고, 항생제 내성을 갖지 않는 신규한 락토바실러스 속 균주를 포함하는 생균제 조성물, 상기 생균제 조성물을 포함하는 동물사료용 첨가제 및 상기 첨가제를 포함하는 동물사료 조성물에 관한 것이다.

과거로부터 다양한 발효 음식의 형태로 섭취되어온 생균제(프로바이오틱스; probiotics)는 인체 쪽에서는 그 유용성이 많이 연구가 진행되어 있다.

프로바이오틱스는 "적당량을 섭취하였을 때 숙주동물에게 건강상 이익을 주는 살아있는 미생물" 로 정의되고 있다 (FAO/WHO, 2001).

생균제의 알려진 잇점들은 여러 감염증, 알러지병, 염증성 질병을 막아주는 것들이다 (Nutr. Clin. Pract. (2009), 24: 227-241).

또한, 생균제는 세균들에 의한 장내 불균형의 위험을 감소시키며 (Inflam. Bowel Dis. (2011) 7: 136-145), 설사를 막아준다 (Scand. J. Gastroenterol. (1997) 222: 28-31).

생균제로 사용 가능한 미생물은 위산 및 담즙산에 대한 저항성 (J. Dairy Sci. (1999) 82: 23-31), 숙주 소장 표피세포의 정착능력 및 증식능력 (Appl. Environ. Microbiol. (2000) 66: 1152-1157; Appl. Environ. Microbiol. (1997) 63: 513-518), 안전성 등의 특징을 갖추어야 한다 (Selection of strains for probiotic use, (1992) pp. 209-224, Chapmann & Hall, London).

그런데, 수의 쪽에서는 돼지, 닭, 소 등 산업 동물을 위주로 생균제의 연구 및 산업화가 활발하게 진행되어 왔으나 (Korean J. Microbiol., Biotechnol., (2014), 42(3), 211-218; 한국공개특허 제10-2011-0065128호 등), 개와 고양이에 대한 생균제 연구는 극히 일부분에 지나지 않는 실정이다.

상기 개에 대한 생균제 연구의 예로서, 여러 종의 숙주에서 분리된 셍균제를 개의 장 점액을 사용한 경쟁적 배제 실험에 사용하였을 때, 병원균에 대하여 다른 숙주에서 분리된 생균제보다 개에서 분리된 생균제가 가장 좋은 효과를 보인다는 보고가 있을 뿐이다 (Vet. Micro. (2003) 92:111-119).

따라서, 본 발명자들은 생균제로서의 조건을 만족하는 신규 유산균을 개발하기 위한 연구를 진행하여, 구강 투여 후 개의 소화기계를 잘 통과해서 장에서 오래 생존할 수 있는 새로운 유산균을 선발하고, 상기 유산균이 내산성 및 내담즙성을 나타내며, 장내 유해 미생물 생육 억제 활성 및 면역증강 활성 등을 나타내므로, 사료 첨가제 또는 동물의 병원성 미생물 감염에 치유 효과가 있는 우수한 생균제로 사용할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다

본 발명의 목적은 신규한 락토바실러스 속 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는 생균제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 생균제 조성물을 포함하는 동물사료용 첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 첨가제를 포함하는 동물사료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 생균제 조성물에 포함되는 신규한 락토바실러스 속 균주를 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 하기 (a) 내지 (f)의 특성을 갖는 락토바실러스 류테리 BCLR-42 (Lactobacillus reuteri BCLR-42) KCCM11717P 균주 및/또는 락토바실러스 플란타룸 BCLP-51 (Lactobacillus plantarum BCLP-51) KCCM11716P 균주, 혹은 상기 균주의 배양액을 포함하는 생균제 조성물을 제공한다.

(a) 내산성 및 내담즙성

(b) 항균능

(c) 장세포 부착능

(d) 항생제 내성이 없음

(e) α-갈락토시데이즈 활성 및 β-갈락토시데이즈 활성

(f) 호증구 포식능, 호중구의 활성 산소 분비능 및 면역세포 활성화능

또한, 본 발명은 상기 생균제 조성물을 포함하는 동물 사료용 첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 첨가제를 포함하는 동물 사료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 류테리 BCLR-42 (Lactobacillus reuteri BCLR-42) KCCM11717P 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 BCLP-51 (Lactobacillus plantarum BCLP-51) KCCM11716P 균주를 제공한다.

본 발명의 락토바실러스 속의 신규 균주는 내산성 및 내담즙성이고, 장내 유해한 병원성 세균을 억제하는 프로바이오틱스로, 기존 항생제를 대체하여 가축에 투여시 장내 미생물 균총의 안정화를 이루어 장내 유해한 미생물의 이상 발효에 의하여 발생할 수 있는 증상들을 치료하거나 사전에 예방할 수 있으며, 건강 상태를 양호하게 하고 애완견 등과 같은 가축의 면역력 증가 등의 효과를 얻을 수 있다.

도 1은 L. reuteri BCLR-42 균주의 크로모좀(chromosome) 유전자의 염기서열 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 L. reuteri BCLR-42 균주와 다른 스트레인의 클로모좀 유전자의 염기서열을 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 L. plantarum BCLP-51 균주의 크로모좀 유전자의 염기서열 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 L. plantarum BCLP-51 균주와 다른 스트레인의 클로모좀 유전자의 염기서열을 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Lactobacillus 균에 의해 형성되는 억제대(inhibition zone)의 예시를 나타낸 것이다.
도 6은 L. reuteri BCLR-42 균주와 L. plantarum BCLP-51 균주의 장상피세포 부착능 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 7a 및 도 7b는 L. reuteri BCLR-42 균주와 L. plantarum BCLP-51 균주가 호중구의 포식작용에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 8은 L. reuteri BCLR-42 균주와 L. plantarum BCLP-51 균주가 호중구의 활성산소 분비에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 9a 내지 도 9d는 L. reuteri BCLR-42 균주와 L. plantarumBCLP-51 균주가 면역세포의 사이토카인(cytokine) 분비에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

본 발명은 하기 (a) 내지 (f)의 특성을 갖는 락토바실러스 류테리 BCLR-42 (Lactobacillus reuteri BCLR-42) KCCM11717P 균주 및/또는 락토바실러스 플란타룸 BCLP-51 (Lactobacillus plantarum BCLP-51) KCCM11716P 균주, 혹은 상기 균주의 배양액을 포함하는 생균제 조성물에 관한 것이다.

(a) 내산성 및 내담즙성

(b) 항균능

(c) 장세포 부착능

(d) 항생제 내성이 없음

(e) α-갈락토시데이즈 활성 및 β-갈락토시데이즈 활성

(f) 호증구 포식능, 호중구의 활성 산소 분비능 및 면역세포 활성화능

본 발명의 상기 생균제 조성물에서, 상기 항균능은 실모넬라 티피무무리움(Salmonella typhimurium), 대장균(E. coli), 시트로박터 프로인디이(Citrobacter freundii), 엔테로코커스 패시움(Enterococcusfaecium), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 신테르메디우스(Staphylococcu sintermedius), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 코리네박테리움 아우리스카르니스(Corynebacterium auriscarnis) 및 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 균의 생육을 억제하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 생균제 조성물에서, 상기 항균능은 특히 바람직하게는, 시트로박터 프로인디이(Citrobacter freundii), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 균의 생육을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 생균제 조성물에서, 상기 장세포는 장상피 세포(intestinal epithelial cell)일 수 있다.

본 발명의 상기 생균제 조성물에서, 상기 항생제는 메트로니다졸(metronidazole), 반코마이신, 겐타마이신 등과 같은 일부의 항생제를 제외하고는 대부분의 항생제에 대해서는 항생제 내성이 없는 특징을 갖는다.

본 발명의 상기 생균제 조성물에서, 상기 대부분의 항생제의 일예로는 에리쓰로마이신, 옥사실린, 앰피실린, 세포탁심, 테트라싸이클린 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 생균제 조성물에 포함되는 상기 락토바실러스 류테리 BCLR-42 (Lactobacillus reuteri BCLR-42) KCCM11717P 균주 및 락토바실러스 플란타룸 BCLP-51 (Lactobacillus plantarum BCLP-51) KCCM11716P 균주는 호증구 포식능, 호중구의 활성 산소 분비능 및 면역세포 활성화능을 나타냄으로써, 상기 조성물의 면역 증강력을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 상기 생균제 조성물에서, 상기 면역세포는 인터류킨 1β(IL-1β), 인터류킨 6(IL-6), 종양괴사인자(TNF-α), 인터류킨 10(IL-10) 및 인터류킨 4(IL-4)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 상기 생균제 조성물에서, 상기 미생물 배양액 배양액에는 미생물이 생산해 낸 여러 항균성 유기산 및 비단백질성 항균 물질들이 포함되어 있어 생균제 조성물의 유효성분으로 포함되었을 때 균주를 포함한 조성물과 동등한 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 생균제 조성물은 상기 락토바실러스속 유산균과 함께 가축이 섭취하기에 적합하고, 섭취시 유해 미생물의 생육을 억제하며, 장내 균총의 균형을 개선시키는 활성을 가지는 다른 종류의 공지된 미생물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 생균제 조성물은 상기 유효 성분 외에 통상적인 약학적 담체 및 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 조성물은 통상적인 생균제 조성물 제조방법에 따라 동결건조 또는 열건조될 수 있고, 캡슐화된 형태 또는 배양 현탁액이나 건조 분말 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 생균제 조성물은 장내 병원성 세균 억제, 내산성 및 내담즙성 등이 우수한 프로바이오틱 유산균 또는 그 배양액을 포함함으로써, 다양한 장내 병원성 세균들의 감염 억제 및 치료 효과가 우수하고, 숙주의 장내 균총을 정상화시킴으로써 세균성 질병을 예방할 수 있음은 물론, 장내 병원성 세균 억제제, 면역 증강제, 살균제, 소화제, 정장제 및 지사제 등의 생균제 조성물로서 사료, 식품 및 의약품 등에 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명은 바람직하게는 상기 생균제 조성물을 포함하는 동물 사료용 첨가제 및 상기 첨가제를 포함하는 동물사료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 상기 동물 사료용 첨가제 및 동물사료 조성물에서, 상기 동물은 개, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 닭, 오리, 거위, 칠면조 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것이다.

본 발명의 상기 동물 사료용 첨가제 및 동물사료 조성물에서, 상기 개는 애완용 개(반려견)일 수 있다.

본 발명의 상기 동물사료용 첨가제는 기존 항생제의 대체용으로 사용되어 장내 유해균의 생육을 억제하며, 장내 균총을 안정되게 유지하여 가축의 건강상태를 양호하게 하고, 면역력을 증가시킬 수 있다. 이 때, 상기 동물사료용 첨가제를 사료 100 중량부에 대하여 1~20 중량부로 포함할 수 있으나, 필요에 따라 상기 첨가제의 함량을 조절하여 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 동물사료 조성물은 발효 사료, 배합 사료, 펠렛 형태 및 사일리지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 필요에 따라 변형하여 제조할 수 있다.

본 발명의 상기 동물사료 조성물에서, 상기 발효 사료는 본 발명의 상기 첨가제와 여러 가지 미생물 균 또는 효소들을 첨가함으로써, 유기물을 발효시켜 제조될 수 있으며, 상기 배합 사료는 여러 종류의 일반 사료와 본 발명의 상기 첨가제를 혼합하여 제조될 수 있다.

본 발명의 상기 동물사료 조성물에서, 상기 펠렛 형태의 사료는 상기 발효 사료 또는 배합 사료를 펠렛기로 제형화하여 제조될 수 있으며, 상기 사일리지는 청예 사료를 본 발명의 상기 생균제 조성물로 발효시킴으로서 제조될 수 있다.

또한, 본 발명은 신규한 락토바실러스 류테리 BCLR-42 (Lactobacillus reuteri BCLR-42) KCCM11717P 균주에 관한 것이다.

본 발명의 상기 락토바실러스 류테리 BCLR-42 KCCM11717P 균주는 개의 장내 물질로부터 분리되었으며, 간상형의 그람 양성 균주로, 카탈라아제 음성 반응을 보이며, 서열번호 21의 16S rRNA 서열을 갖는다.

또한, 본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 BCLP-51 (Lactobacillus reuteri BCLR-42) KCCM11717P 균주에 관한 것이다.

본 발명의 상기 락토바실러스 플란타룸 BCLP-51 KCCM11716P 균주는 개의 장내 물질로부터 분리되었으며, 간상형의 그람 양성 균주로, 카탈라아제 음성 반응을 보이며, 서열번호 22의 16S rRNA 서열을 갖는다.

본 발명의 상기 락토바실러스 류테리 BCLR-42 균주 및 락토바실러스 플란타룸 BCLP-51 균주의 생화학적 특성에 대해서는 상기 생균제 조성물에서 설명한 바와 같으므로, 이의 상세한 내용은 생략하기로 한다.

이하 본 발명의 내용을 실험예 및 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실험예>

1. 실험 방법

1-1. L.reuteri BCLR-42와 L.plantarum BCLP-51의 균주 분리 및 동정 생화학적인 특성 분석

(1). 균주의 분리

수집한 개 분변을 PBS 버퍼(phosphate buffered saline)에 십진 희석한 후 10^-4 또는 10^-5 만큼 희석된 샘플을 MRS 아가 (Man-Rogasa-Sharpe agar; Oxoid사)에 스프레딩하였다.

혐기 조건에서 자라는 유산균을 위하여, BBL anerobic GasPak (BD)을 넣어 37℃에 36시간 동안 혐기 배양하였다. 상기 배양 후 배지에서 자란 모양이 다른 각 콜로니를 새 MRS 아가에 스트리킹하여 분리하였다.

(2). 균주의 동정

Colony PCR로 16S rRNA의 염기서열을 증폭시키기 위하여, 하기 표 1의 프라이머를 사용하였으며, 유전자 분석 프로그램인 Geneious^TM로 유산균의 염기서열을 분석하여 Lactobacillus reuteri BCLR-42와 Lactobacillus plantarum BCLP-51을 분리 및 동정하였다.

동정된 Lactobacillus reuteri BCLR-42와 LactobacillusplantarumBCLP-51의 유전자적 특징을 파악하기 위하여, PacBio platform^TM을 사용하여 전장(full length) 유전체 염기서열을 분석하였다.

1-2. L. reuteri BCLR -42와 L. plantarum BCLP - 51의 생화학적인 특성 분석

(1). 위장관 내 환경과 비슷한 pH와 bile 저항성 시험

pH 저항성 시험을 위하여, v-바톰 96 마이크로웰 플레이트(v-bottom 96 microwell plate)에 pH가 2, 3, 4, 5로 조절된 MRS 브로쓰를 250 ㎕씩 분주한 후, 탁도가 McFarland standard 약 0.5가 되도록 맞춰진 L. reuteri BCLR-42와 균액을 25 ㎕씩 접종하였다.

또한, 상기와 동일한 방법으로, v-바톰 96 마이크로웰 플레이트에 L. plantarum BCLP-51 균액을 25 ㎕씩 접종하였다.

그 후, 담즙(bile)에 대한 저항성 시험을 위하여, 담즘염(bile salt)이 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 %(w/v) 첨가된 MRS 브로쓰를 v-바톰 96 마이크로웰 플레이트에 250 ㎕씩 분주하고, 탁도가 McFarland standard가 약 0.5가 되도록 맞춰진 균액을 25 ㎕씩 접종한 다음, 혐기 조건으로 37℃에서 36시간 동안 배양하였다.

(2). 분리한 유산균주들의 항균 능력 시험

Agar spot test (by Strompfova and Laukova, Anaerobe, 2014) 방법으로 항균 활성을 시험하였다.

MRS 브로쓰에 하루 동안 배양한 균 3 ㎕를 MRS 아가(1.5 %(w/v) 아가)에 떨어뜨린 후, 혐기 조건으로 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 병원성을 지니는 균을 포함하고, 아가가 0.8 %(w/v)인 TSA 아가(tryptic soy agar)를 덮었다.

이때, 상기 실험에 사용된 지표균은 1.3~1.8x10⁶ CFU/ml의 Salmonella typhimurium (1), E . coli (2), Citrobacterfreundii (3), Enterococcusfaecium (4), Staphylococcusaureus (5), Staphylococcusintermedius (6), Listeriamonocytogenes (7), Corynebacteriumauriscarnis (8), Bacilluscirculans (9)이었다.

소프트 아기(soft agar)를 덮은 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 유산균주 콜로니들을 중심으로 생성된 억제대(inhibition zone)의 직경을 측정하였다.

(3). 장상피 부착능 시험

사람 장상피 유래인 Caco-2 세포를 사용하여 분리한 유산균주들이 장 상피에 잘 부착하여 장내에 오래 머무를 수 있는지를 시험하였다.

(3-1). Caco-2 세포의 준비

20 %(w/w)의 소태아 혈청(fetal bovine serum) 및 1%(w/v)의 항-항 용액(anti-anti solution)이 보충된 Modified Eagle‘s minimal essential medium(MEM)에서 37℃의 온도, 5%의 CO₂ 및 95%의 습도 조건으로 Caco-2 세포를 배양하였다.

상기 세포가 75T 플라스크에서 80-90% 정도 덮이면, 6 웰 배양 플레이트로 옮기고 2~3일 동안 배양하였다. 이때, 초기 세포밀도는 3.4× 10⁴ cells/㎠이었다.

(3-2). 유산균 Caco-2 세포 부착 시험

Caco-2 세포에 부착하기 전에 CFU를 측정하기 위하여, 유산균(L. reuteri BCLR-42, L. plantarum BCLP-51와 대조균인 Lactococcus lactis)을 하루 동안 배양한 10ml의 MRS 브로쓰에서 400 ㎕를 덜어 3.6ml의 PBS 버퍼에 희석시켰다.

남은 9.6ml의 MRS 브로쓰를 3,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 각 펠렛을 상기 MEM 배지 1ml에 풀어 Caco-2 세포 위에 도포하여 90분간 상기 유산균을 세포에 부착시켰다.

그 후, 상기 세포의 상층액을 버리고, 세포에 부착된 균을 탈락시키기 위하여, PBS 버퍼에 혼합되어 있는 1% Triton X-100 계면활성제 용액(Sigma, USA) 1ml을 상기 세포에 처리하였다.

세포에 부착시키기 전과 후의 균수를 측정하기 위하여, 원심분리하기 전에 덜어놓은 균과 세포에 부착시킨 후 떨어뜨린 균을 PBS 바퍼에 단계적으로 희석하여 MRS 아가에 스프레딩하고, 혐기 조건으로 37℃에서 36시간 동안 배양하였다.

(4). 항생제 내성 실험

M.I.C. evaluator strip을 이용하여 유산균주들의 항생제 저항성 및 내성 실험을 실시하였다.

MRS 브로쓰에서 하루 동안 충분히 배양한 유산균을 MRS 아가의 전면에 골고루 도포한 후, 각 항생제 스트립, 즉 에리쓰로마이신(E256ug/mL), 옥사실린(OX256), 반코마이신(VA256), 겐타마이신(CN256), 앰피실린(AMP256), 세포탁심(CTX256), 메트로니다졸(MTZ256), 테트라싸이클린(TE256))을 배지위에 올려 놓고, 혐기 조건으로 37℃에서 36시간 동안 배양하였다.

상기 배양 후 최소 저해농도(minimum inhibitory concentrations; MICs)를 측정하였다.

(5). 효소활성 실험

API-ZYM kit를 이용하여 균의 효소 활성화 능력을 시험하였다.

하루 동안 배양한 균을 PBS 버퍼에 희석하며, 상기 균의 탁도가 McFarland standard 1이 되도록 맞추고, 키트의 웰에 65 ㎕씩 떨어뜨린 후, 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 다름, 색의 변화로 효소 활성도(0-5)를 평가하였다.

이때, 사용한 효소는 하기 표 2와 같다.

2. 면역 증강 효과 확인 실험

(1). 균주의 준비

(1-1). 생균(live bacteria)

Lactobacillus strains를 MRS 브로쓰에 16시간 동안 배양시킨 후, Libra S22 스펙트로포토미터로 O.D 값을 측정하여, O.D 값을0.6~0.8 사이의 값으로 맞추어 생균을 조제하였다.

(1-2). 불할성화 균(inactivated bacteria)

O.D 값이 0.8~1인 Lactobacillus strains를 원심분리한 뒤, 가라앉은 균을 6mM 바이너리 에틸렌이민(BEI)과 0.06% 포름알데하이드가 포함된 PBS 버퍼에 다시 띄워, 37℃에서 16시간 동안 배양하여 불활성화시켰다.

그 후 BEI와 같은 양의 1M sodium thiosulfate를 첨가하여 반응을 종료한 다음, 30분 뒤 원심분리시켜 가라앉은 균을 최종적으로 RPMI 1640 배지에 띄워 불할성화 균을 조제하였다.

(1-3). 세포벽(cell wall)

MRS 브로쓰에서 충분히 자란 Lactobacillus strains를 원심분리한 후, 가라앉은 균 부피(packed cell volume, 이하 PCV)의 10배가 되는 양의 4% 소디움도데실설페이트(SDS)가 함유된 PBS에 띄워 30분간 끓였다.

PBS로 잘 세정한 후 PCV의 2배가 되는 5㎍/ml DNAse I을 포함한 PBS에 띄워 37℃에서 2시간 동안 정치한 후, 다시 세정한 다음 200㎍/ml의 트립신(trypsin)과 400㎍/ml의 리소자임(lysozyme)이 함유되어 있고, PCV의 2배가 되는 PBS에 띄워 37℃에서 3시간 동안 정치하였다.

그 후, 잘 세정하여 PBS에 띄운 다음, 브랜포드 어세이(Bradford assay)로 상기 수용액의 총단백질량을 정량하여 실험에 사용하였다.

(1-4). 대사 산물(metabolite)

MRS 브로쓰에서 충분히 자란 Lactobacillus strains를 원심분리한 후, 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 speed vacuum type의 동결건조기에서 10배 농축시키고, RPMI 1640 배지에 띄워 실험에 사용하였다.

(2). 호중구의 포식작용(phagocytosis) 확인

건강한 개에서 채취한 혈액에서 적혈구를 제거한 후, RPMI 1640에 띄워 준비하였. E-튜브에 혈액 100㎕, 균 샘플 100㎍과 green-fluorescent FluoroSpheres 100㎍를 첨가하고, 37℃에서 30분 인큐베이션하였다.

그 후, 1 %(w/v)의 소태아 혈청과 0.1 %(w/v)의 소디움 아자이드(sodium azide)를 포함하는 PBS 버퍼로 2번 세정하고, 다시 버퍼에 띄워 FACS 튜브로 옮겨 플로우 사이토메트리(flow cytometry)를 진행하였다.

(3). 호중구의 활성산소 분비(oxidative burst) 확인

E-튜브에 적혈구가 제거된 개의 혈액 100㎕, 균 샘플 또는 120ng/ml PMA 25㎕와 30㎍/ml DHR(Dihydrorhodamine123) 용액 25㎕를 넣고 30분 동안 인큐베이션하였다.

그 후, 1 %(w/v)의 소태아 혈청과 0.1 %(w/v)의 소디움 아자이드(sodium azide)를 포함하는 PBS 버퍼로 2번 세정하고, 다시 버퍼에 띄워 FACS 튜브로 옮겨 플로우 사이토메트리(flow cytometry)를 진행하였다.

(4). 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 통한 사이토카인의 발현 확인

사이토카인(cytokine)의 발현을 확인하기 위하여, One-step SYBR real-time PCR 방법을 사용하였다. 신선한 개 혈액을 적혈구를 제거한 뒤, RPMI 1640 배지에 띄워 3x10⁶/웰의 농도로 6 웰에 분주하고, Lactobacillus strains의 세포벽 성분을 최종 10㎍/ml이 되도록 첨가하였다.

그 후, 37℃에서 4시간이 지난 후 RNeasy Mini kit(Qiagen)를 이용하여 총 RNA를 추출하고, ABI7500^TM을 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다.

이때, 사용된 프라이머 서열은 하기 표 3 및 표 4와 같다.

2. 실험 결과

2-1. Lactobacillus reuteri BCLR -42와 Lactobacillus plantarum BCLP -51의 동정 및 전장 유전체 염기서열 분석

(1). Lactobacillus reuteri BCLR-42의 유전자 염기서열 특징

하기 표 5 및 도 1에서 보는 바와 같이, L. reuteri BCLR-42는 약 2 Mbp 크기의 크로모좀(chromosome)과 51 kbp의 플라스미드를 갖고 있는 것이 확인되었다. 또한, 유전자 염기서열 중 GC의 비율은 약 38%이며, 총 1,997개의 단백질을 코딩하고 있는 것으로 확인되었다.

한편, 기존에 알려져 있는 다른 L. reuteri 스트레인들과 전장 유전체 염기서열을 비교한 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, L. reuteri BCLR-42는 L. reuteri DSM20016 스트레인과 비슷한 유전자들을 가지고 있으나, 매우 다른 유전자 구조를 보이는 것을 확인하였다.

상기 Lactobacillus reuteri BCLR-42 균주를 한국미생물보존센터에 2015년 6월 30일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM11717P를 부여받았다.

(2). Lactobacillus plantarum BCLP-51의 유전자 염기서열 특징

하기 표 6 및 도 3에서 보는 바와 같이, L. plantarum BCLP-51는 약 3.2 Mbp 크기의 크로모좀과 76, 48, 36, 29 kbp의 4개의 플라스미드를 갖고 있는 것이 확인되었다. 또한, 유전자 염기서열 중 GC의 비율은 약 44%이며, 총 3,354개의 단백질을 코딩하고 있는 것으로 확인되었다.

한편, 기존에 알려져 있는 다른 L. plantarum 스트레인들과 전장 유전체 염기서열을 비교한 결과 도 4에서 보는 바와 같이, L. plantarum BCLP-51는 다른 스트레인과는 차이가 있는 유전자 및 그 구조를 포함하는 것을 확인하였다.

상기 Lactobacillus plantarum BCLP-51 균주를 한국미생물보존센터에 2015년 6월 30일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM11716P를 부여받았다.

2-2. L. reuteri BCLR -42와 L. plantarum BCLP - 51의 생화학적 특성 분석

(1). pH 및 담즙 저항성 결과

L. reuteri BCLR-42와 L. plantarum BCLP-51 모두 pH 4와 0.2 %(w/v)의 담즙염(bile salt)에서 성장하였다.

(2). 항균 시험 결과

L. reuteri BCLR-42와 L . plantarum BCLP-51의 항균 시험 결과로서, 억제대(inhibition zone)는 도 5와 같이 나타나며, 상기 결과를 표 7에 나타내었다.

하기 표 7에서 보는 바와 같이, 상기 두 균주는 대부분의 균을 억제하는 것으로 보이며, 특히 Citrobacter freundii, Staphylococcusaureus와 Listeria monocytogenes에 높은 항균 능력을 갖음을 알 수 있다.

(3). 장상피 부착능 시험 결과

도 6에서 보는 바와 같이, L. reuteri BCLR-42와 L. plantarum BCLP-51 두 균주 모두 대조균인 Lactococcus lactis 보다 두배 이상의 부착능을 보임을 알 수 있다. 상기 대조균인 Lactococcus는 장상피(intestinal epithelial cell)에 잘 부착하지 않는 균으로 알려져 있다.

(4). 항생제 내성 검사 결과

하기 표 8 (L. reuteri BCLR-42와 L. plantarum BCLP-51에 대한 항생제들의 최소 억제 농도)에서 보는 바와 같이, L. reuteri BCLR-42와 L. plantarum BCLP-51 두 균주 모두 메트로니다졸과 반코마이신에는 높은 농도에도 생존 가능하며, 겐타마이신에도 어느 정도 저항성을 갖음을 알 수 있다.

즉, 상기 세가지의 항생제에는 내성을 갖는다고 볼 수 있는데, 이미 발표된 논문 자료(Strompfova and Laukova, Anaerobe, 2014)를 참고하면, Lactobacillus strains은 기본적으로 빈코마이신에 내성을 갖는다고 알려져 있다.

그러나, 그 외 대부분의 항생제에서는 적은 농도에도 성장이 억제되어 항생제 내성이 없음을 알 수 있다.

(5). 효소 활성 시험 결과

API-ZYM 키트를 이용한 효소활성 시험의 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

하기 표 9에서, 0~5의 수치는 색의 변화 정도에 따라 0에서 5까지 등급을 나는 것으로서, 수치가 커질수록 활성도가 높음을 의미한다. 다만, lipase(5), β-glucuronidase(15), α-mannosidase(19) 및 α-fucosidase(20)의 활성은 0 이며, 하기의 표 9에는 표시되어 있지 않다.

상기 표 9를 참조하면, 특히 L. reuteri BCLR-42의 경우 높은 αgalactosidase 활성과 β-galactosidase 활성을 나타냄을 알 수 있는데, 상기 βgalactosidase의 유익한 효과는 락토오즈 소화(lactose digestion) 기능을 증진시키는 효소로 알려져 있다.

2-3. 면역 증강 효과 확인 실험

(1). 호중구의 포식 작용 증가

도 7a에서 보는 바와 같이, 전체 세포에서 호중구 구역만 설정하여 FL1 형광값이 10²을 넘는 비율(%)이 Lactobacillus reuteri와 Lactobacillus plantarum 처리 전후로 어떻게 변하는지를 확인하였다. 이때, 참고 균주로는 Lactococcus lactis를 사용하였는 바, 그 결과는 도 7b에 나타내었다.

도 7b에서 생균을 첨가했을 때(a), 첨가 전(beads)보다 L. reuteri BCLR-42은 30.55%, L. plantarum BCLP-51는 35.55%가 평균적으로 증가하였다.

또한, 불활성화 균을 첨가했을 때(b), 첨가 전보다 L. reuteri BCLR-42은 거의 증가하지 않았으나, L. plantarum BCLP-51는 33.53% 증가하였다.

한편, 세포벽 성분을 첨가했을 때(c), L. reuteri BCLR-42은 21.4%, L. plantarum BCLP-51는 43.45% 증가하였다. 이와 같은 결과는 참고 균주(18.7%)보다 높은 수치임을 알 수 있다.

그러나, 대사산물(metabolites)을 첨가했을 때(d)는, L. reuteri BCLR-42과 L. plantarum BCLP-51 모두 크게 증가하지 않았음을 알 수 있다.

(2). 호중구의 활성 산소 분비 증가

상기 실험과 동일하게 호중구 구역만 설정하여 FL1의 MFI(Mean Fluorescence Intensity)값을 대조군(DHR+PMA)과 비교한 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8을 참조하면, 생균을 첨가했을 때(a), MFI가 L. reuteri BCLR-42은 787, L.plantarumBCLP-51는 1981이 평균적으로 증가하였다.

또한, 불활성화 균을 첨가했을 때(b), MFI가 L. reuteri BCLR-42은 7.6, L.plantarum BCLP-51는 2975가 증가하였다. 이는 참고 균주(Lactococcus lactis, 2982)와도 유사한 증가 수치이다.

한편, 세포 성분을 첨가했을 때(c), MFI가 L. reuteri BCLR-42은 421, L. plantarum BCLP-51는 2591이 증가하였다. 이는 참고 균주(818)보다 높은 수치임을 알 수 있다.

그러나, 대사산물을 첨가했을 때(d), MFI가 L. reuteri BCLR-42은 2788, L. plantarum BCLP-51는 4095가 증가하였는 바, 이는 참고 균주(984)보다 높은 수치임을 알 수 있다.

(3). 면역세포의 사이토카인 분비 증가

7가지 사이토카인(IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10,IL-12p40, TNF-α, IFN-γ)의 분비량을 확인하여 균주 처리군과 대조군(-)을 비교한 결과를 도 9a 내지 도 9d에 나타내었다. 도 9a 내지 도 9d에서, ddCt는 2진법을 나타낸다.

인터류킨 4(IL-4)의 경우, L. reuteri BCLR-42는 0.2 증가시켰고, L. plantarum BCLP-51는 1.15 증가시켰으며, 이는 LPS 처리군(1.12)과 유사한 증가치이었다.

인터류킨 10(IL-10)의 경우, L. reuteri BCLR-42은 1.14, L. plantarum BCLP-51은 4.03 증가시켰으며, 이는 LPS 처리군(1.92)과 참고 균주(Lactococcus lactis)의 3.27에 비해 높은 수치임을 알 수 있다.

인터류킨 12p40(IL-12p40)과 인터페론 감마(IFN-γ)의 경우, 모든 실험군에서 1 미만의 증가세를 보였다.

또한, 인터류킨 1β(IL-1β)의 경우, L. reuteri BCLR-42은 2.11, L. plantarum BCLP-51는 2.9 증가시켰으며, 이는 참고 균주(Lactococcus lactis)의 2.7보다 높은 증가치를 나타내었다.

인터류킨 6(IL-6)의 경우, L. reuteri BCLR-42은 1.27 증가시켜, LPS 처리군(1.92)과 유사한 증가를 보였으며, L. plantarum BCLP-51는 3.51 증가시켜, LPS 처리군과 참고 균주(2.85)보다 높은 증가를 보였다.

또한, 종양괴사인자(TNF-α)의 경우, L. reuteri BCLR-42은 1.56 증가시켜, LPS 처리군(2.04)과 유사하고, L. plantarum BCLP-51는 5.13 증가시켜, LPS 처리군이나 참고 균주(2.85)보다 높은 상승치를 나타내었다.

3. 결론

(1). L. reuteri BCLR-42와 L. plantarum BCLP-51 모두 pH 4와 0.2% 담즙염에서 성장하였다. 위(stomach) 내의 환경은 위산(HCl)에 의해 pH가 1에서 2로 조성되지만, 음식물과 함께 섭취시 위 내의 pH는 약 4에서 5 정도를 보이게 된다.

따라서, 유산균만을 섭취시에는 위내 환경에 저항하지 못할 수도 있지만, 사료에 배합하여 사료와 함께 섭취시에는 충분히 위의 낮은 pH에도 저항할 수 있을 것으로 사료된다.

(2). 호중구의 포식 작용 증가 평가 실험에서 대사산물을 제외한 4가지 균 성분이 모두 포식 작용을 증가시킴을 확인하였다. L. reuteri BCLR-42은 생균(live bacteria) 상태일 때, 또한 L. plantarum BCLP-51는 세포벽(cell wall) 상태에서 가장 포식 작용을 증가시켰다.

(3). 호중구의 활성 산소 분비 증가 평가 실험에서는 PMA 또한 활성 산소 분비를 증가시키는 물질이므로, 대조군과 비슷한 값을 나타내는 균도 호중구를 활성화시키는 균으로 평가된다.

따라서, 두 균주의 모든 성분이 호중구의 활성 산소 분비를 자극하는 것으로 분석되었다. L. reuteri BCLR-42과 L. plantarum BCLP-51 모두 대사산물(metabolites) 상태일 때 활성 산소 분비를 가장 많이 증가시켰다.

(4). 면역 세포의 사이토카인 분비 증가 평가 실험에서 LPS는 염증 유발 물질이므로, 대조군 만큼 사이토카인이 발현된 것도 면역 세포가 활성화된 것으로 판단된다.

두 균주 모두 IL-10, IL-1β, IL-6, TNF-α 4 가지의 사이토카인 분비를 증가시켰으며, L. plantarum BCLP-51는 IL-4의 분비도 증가시키는 것이 확인되었다.

따라서, 염증성 사이터카인(IL-1β, IL-6, TNF-α)과 면역 조절 사이토카인(IL-10), Th2 cytokine(IL-4)의 분비를 증가시켜 면역세포를 활성화시키는 것으로 판단된다.

<실시예 1> 생균제 조성물의 제조 (1)

유산균으로 락토바실러스 류테리 BCLR-42 (KCCM11717P)를 2.0×10⁸ 수준으로 1% 종균 접종하기 위하여, 이스트 엑기스 2.5 중량%, 포도당 1.5 중량% 및 설탕 2 중량%를 포함하는 배지에 35℃에서 48시간 동안 정치 배양을 하여 생균제 조성물을 제조하였다. 이때, 동결 방지를 위한 첨가제로, 상기 생균제 조성물에 대하여 글루타민산 0.1 중량% 및 염화나트륨 1 중량%를 첨가하였다.

<실시예 2> 생균제 조성물의 제조 (2)

유산균으로 락토바실러스 플란타룸 BCLP-51 (KCCM11716P)를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 실시하여 생균제 조성물을 제조하였다.

<실시예 3> 생균제 조성물의 제조 (3)

유산균으로 락토바실러스 류테리 BCLR-42 (KCCM11717P)와 락토바실러스 플란타룸 BCLP-51 (KCCM11716P)이 1:1의 중량비로 혼합된 균주를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 실시하여 생균제 조성물을 제조하였다.

<실시예 4> 사료 첨가제의 제조 (1)

배합사료 제조용 믹서기에, 실시예 1에서 제조한 생균제 조성물 6.4kg, 프락토올리고당 3.0kg, 구연산 5.0kg을 첨가하고, 10분간 혼합하여 사료 첨가제를 제조하였다.

<실시예 5> 사료 첨가제의 제조 (2)

실시예 1에서 제조한 생균제 조성물 대신에, 실시예 2에서 제조한 생균제 조성물을 사용한 것 이외에는 실시예 4와 동일하게 실시하여 사료 첨가제를 제조하였다.

<실시예 6> 애완견용 사료 조성물의 제조 (1)

대두박 15 중량％, 쌀 5 중량％, 우육 골분 15 중량％, L-카르니틴 0.05 중량％, 비타민 C 0.2 중량％, 식염 0.25 중량％ 및 잔부의 옥수수 분말을 첨가하여 사료 조성물을 혼합하였다.

상기의 사료 조성물에 실시예 4에서 제조한 사료 첨가제를 상기 사료 조성물의 전체 중량 대비 0.5 중량％ 첨가하고 혼합하였다.

그런 다음, 상기 생균제 조성물을 포함하는 사료 조성물을 익스트루더(extruder)에 투입하고 압출 후 절단한 다음 건조하여, 생균제 조성물을 포함하는 애완견용 사료 조성물을 제조하였다.

<실시예 7> 사료 조성물의 제조 (2)

실시예 4에서 제조한 사료 첨가제 대신에, 실시예 5에서 제조한 사료 첨가제를 사용한 것 이외에는 실시예 6과 동일하게 실시하여 애완견용 사료 조성물을 제조하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에 의한 락토바실러스 속의 신규 균주는 내산성 및 내담즙성이고, 장내 유해한 병원성 세균을 억제하는 프로바이오틱스로, 기존 항생제를 대체하여 가축에 투여시 장내 미생물 균총의 안정화를 이루어 장내 유해한 미생물의 이상 발효에 의하여 발생할 수 있는 증상들을 치료하거나 사전에 예방할 수 있으며, 건강 상태를 양호하게 하고 애완견 등과 같은 가축의 면역력 증가 등의 효과를 얻을 수 있기 때문에, 본 발명이 속하는 기술분야에 유용하게 적용될 수 있다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM11716P 20150630 한국미생물보존센터(국외) KCCM11717P 20150630

<110> Binggrae Co. Ltd. University-Industry Cooperation Foundation, Konkuk University <120> Probiotics comprising Lactobacillus sp., additives for animal feedstuff and animal feedstuff <130> 10164/10175 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of 357F <400> 1 cctacgggag gcag 14 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of 926Rb <400> 2 ccgtcaatty mtttragt 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for beta-actin <400> 3 ccgcgagaag atgacccaga 20 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for beta-actin <400> 4 gtgaggatct tcatgaggta gtcgg 25 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GAPDH <400> 5 tgtccccacc cccaatgtat c 21 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GAPDH <400> 6 ctccgatgcc tgcttcacta cctt 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IL-4 <400> 7 catcctcaca gcgagaaacg 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IL-4 <400> 8 ccttatcgct tgtgttcttt gga 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IL-10 <400> 9 cgctgtcacc gatttcttcc 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IL-10 <400> 10 ctggagctta ctaaatgcgc tct 23 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IL-12p40 <400> 11 cagcagagag ggtcagagtg g 21 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IL-12p40 <400> 12 acgacctcga tgggtaggc 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IFN-gamma <400> 13 gcgcaaggcg ataaatgaac 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IFN-gamma <400> 14 ctgactcctt ttccgcttcc t 21 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IL-1beta <400> 15 tctcccacca gctctgtaac aa 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IL-1beta <400> 16 gcagggcttc ttcagcttct c 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IL-6 <400> 17 tcctggtgat ggctactgct t 21 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IL-6 <400> 18 gactatttga agtggcatca tcctt 25 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for TNF-alpha <400> 19 gagccgacgt gccaatg 17 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TNF-alpha <400> 20 caacccatct gacggcacta 20 <210> 21 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA of BCLR-42 <400> 21 aaacagttac ttctcacgcc acgtttcttt ctcccaacaa cagagcttta cgagccgaaa 60 acccttcttc actcacgcgg tgttgctccc attcaggctt gccccccatt gtggaagatt 120 tcctacgggg gggacagcag tagggaatct tccacaatgg gcgcaagcct gatggagcaa 180 caccgcgtga gtgaagaagg gtttcggctc gtaaagctct gttgttggag aagaacgtgc 240 gtgagagtaa ctgttcacgc agtgacggta tccaaccaga aagtcacggc taactacgtg 300 ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg gatttattgg gcgtaaagcg 360 agcgcaggcg gttgcttagg tctgatgtga aagccttcgg cttaaccgaa gaagtgcatc 420 ggaaaccggg cgacttgagt gcagaagagg acagtggaac tccatgtgta gcggtggaat 480 gcgtagatat atggaagaac accagtggcg aaggcggctg tctggtctgc aactgacgct 540 gaggctcgaa agcatgggta gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca tgccgtaaac 600 gatgagtgct aggtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc cggagctaac gcattaagca 660 ctccgcctgg ggagtacgac cgcaaggttg aaactc 696 <210> 22 <211> 565 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA of BCLP-51 <400> 22 acagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag 60 aagggtttcg gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac atatctgaga gtaactgttc 120 aggtattgac ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 180 tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt 240 taagtctgat gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg catcggaaac tgggaaactt 300 gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa 360 gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagtatg 420 ggtagcaaac aggattagat accctggtag tccataccgt aaacgatgaa tgctaagtgt 480 tggagggttt ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta agcattccgc ctggggagta 540 cggccgcaag gctgaaacta gaaaa 565

Claims (12)

1. 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 16S rRNA를 가지며, 하기 (a) 내지 (f)의 특성을 갖는 락토바실러스 플란타룸 BCLP-51 (Lactobacillus plantarum BCLP-51) KCCM11716P 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 생균제 조성물:
   (a) 내산성 및 내담즙성
   (b) 항균능
   (c) 장세포 부착능
   (d) 에리쓰로마이신, 옥사실린, 앰피실린, 세포탁심 및 테트라싸이클린으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 항생제에 대한 내성이 없음
   (e) β-갈락토시데이즈 활성
   (f) 호증구 포식능, 호중구의 활성 산소 분비능 및 면역세포 활성화능
2. 제1항에 있어서, 상기 항균능은 실모넬라 티피무무리움(Salmonella typhimurium), 대장균(E. coli), 시트로박터 프로인디이(Citrobacter freundii), 엔테로코커스 패시움(Enterococcusfaecium), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 신테르메디우스(Staphylococcu sintermedius), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 코리네박테리움 아우리스카르니스(Corynebacterium auriscarnis) 및 바실러스 서큘란스(Bacillus circulans)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 균의 생육을 억제하는 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 장세포는 장상피 세포(intestinal epithelial cell)인 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 면역세포는 인터류킨 1β(IL-1β), 인터류킨 6(IL-6), 종양괴사인자(TNF-α), 인터류킨 10(IL-10) 및 인터류킨 4(IL-4)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
6. 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항의 생균제 조성물을 포함하는 동물 사료용 첨가제.
7. 제6항에 있어서, 상기 동물이 개, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 닭, 오리, 거위 및 칠면조로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 동물 사료용 첨가제.
8. 제7항에 있어서, 상기 개가 애완용 개인 것을 특징으로 하는 동물 사료용 첨가제.
9. 제6항의 첨가제를 포함하는 동물 사료 조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 동물이 개, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 닭, 오리, 거위 및 칠면조로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 동물 사료 조성물.
11. 제10항에 있어서, 상기 개가 애완용 개인 것을 특징으로 하는 동물 사료 조성물.
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