CN112537981A - 一种复合生防微生物菌剂的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合生防微生物菌剂的制备方法，步骤如下：准备包括以下按原料：淡紫紫孢菌、白僵菌、苏云金芽孢杆菌、改性淀粉、改性几丁质、改性壳聚糖、圆褐固氮菌‑西姆芽孢杆菌混合发酵液、黄腐酸钾；将淡紫紫孢菌、白僵菌、苏云金芽孢杆菌分别接种于种子培养基中，进行摇床培养，得摇瓶种子液，将摇瓶种子液接种于已灭菌的发酵罐深层液体发酵培养基中，得液体发酵产物；将液体发酵产物与改性淀粉、改性几丁质、圆褐固氮菌‑西姆芽孢杆菌混合发酵液、黄腐酸钾充分搅拌，均匀混合，制成固体发酵物；干燥至水份为15‑20%，粉碎、过筛，通过淡紫紫孢菌、白僵菌、苏云金芽孢杆菌三者协同配合，能够对多种植物病虫害起到很好的防治的效果。

Description

一种复合生防微生物菌剂的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物菌剂技术领域，具体是一种复合生防微生物菌剂的制备方法。
背景技术
生防即生物防治，是指利用一种生物对付另外一种生物的方法。生物防治大致可以分为以虫治虫、以鸟治虫和以菌治虫三大类。它是降低杂草和害虫等有害生物种群密度的一种方法。它利用了生物物种间的相互关系，以一种或一类生物抑制另一种或另一类生物。它的最大优点是不污染环境，是农药等非生物防治病虫害方法所不能比的。
但是，目前有关植物病害的防治大多还是依赖化学药剂进行防控，对生态环境产生影响，病原微生物抗药性越来越大，还严重影响着农产品品质和人民的身体健康，所以亟需制备出一种复合生防微生物菌剂。
发明内容
本发明的实施例目的在于提供一种复合生防微生物菌剂的制备方法，以解决上述问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种复合生防微生物菌剂的制备方法，步骤如下：
1)按比例准备包括以下按照重量份的原料：淡紫紫孢菌20-30份、白僵菌15-25份、苏云金芽孢杆菌10-20份、改性淀粉6-10份、改性几丁质2-4份、改性壳聚糖1-3份、圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液10-16份、黄腐酸钾1-3份；
2)将淡紫紫孢菌、白僵菌、苏云金芽孢杆菌分别接种于种子培养基中，进行摇床培养，得摇瓶种子液，将摇瓶种子液接种于已灭菌的发酵罐深层液体发酵培养基中，进行发酵培养，得液体发酵产物；
3)将液体发酵产物与改性淀粉、改性几丁质、圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液、黄腐酸钾充分搅拌，均匀混合，发酵7-10天，制成固体发酵物；
4)把固体发酵物干燥至水份为15-20％，粉碎、过筛后得到所需复合生防微生物菌剂。
在一种可选方案中：包括以下按照重量份的原料：淡紫紫孢菌22-28份、白僵菌17-23份、苏云金芽孢杆菌12-18份、改性淀粉7-9份、改性几丁质2.5-3.5份、改性壳聚糖1.5-2.5份、圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液12-14份、黄腐酸钾1.5-2.5份。
在一种可选方案中：包括以下按照重量份的原料：淡紫紫孢菌25份、白僵菌20份、苏云金芽孢杆菌15份、改性淀粉8份、改性几丁质3份、改性壳聚糖2份、圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液13份、黄腐酸钾2份。
在一种可选方案中：所述改性淀粉的制备方法如下：按重量份计，称取薯类淀粉10份、甲基丙烯酸3份、苯乙烯2份、过氧化氢1份、硬脂酸钠1份，备用；将所述的甲基丙烯酸、苯乙烯和硬脂酸钠在超声波条件下进行乳化反应20-30min，制得乳化液；将所述淀粉原料在超声波条件下，室温环境中通氮气保护，在温度为60-80℃时预热30-40min，维持温度60-80℃并加入过氧化氢反应10-20min，得反应物；向反应物中加入乳化液，进行化学反应20-30min，即制得改性淀粉。
在一种可选方案中：所述改性几丁质的制备方法如下：将几丁质、氢氧化钾和异丙醇混合均匀，升温至30-40℃，保温20-30min，继续升温至50-60℃，保温10-20min，然后加入溴代十六烷混合均匀，于600-800r/min转速搅拌20-40min，接着调节pH至中性，沉淀，过滤，冷却至室温得到改性几丁质，其中几丁质、氢氧化钾、异丙醇和溴代十六烷的重量比为7-9：3-5：3-4：1-2。
在一种可选方案中：所述圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液的制备方法如下：将圆褐固氮菌种子液和西姆芽孢杆菌种子液按照1-2:1的体积比混合，搅拌10-16min后，按照6-8％的体积比接种量接入发酵培养基中，25-35℃培育24-36h，即可得到圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液。
在一种可选方案中：所述改性壳聚糖的制备方法如下：取壳聚糖溶于有机酸或无机酸溶液中，调节pH4-6，加入酰基供体，再加入谷氨酰胺转胺酶，25-35℃充分反应，调节pH6-7，过滤去除沉淀，脱盐，干燥，即得改性壳聚糖。
相较于现有技术，本发明实施例的有益效果如下：
加入淡紫紫孢菌、白僵菌、苏云金芽孢杆菌，淡紫紫孢菌对植物病原菌具有拮抗效能，能够大大抑制菌丝的生长，从而预防病害，对玉米小斑病、小麦赤霉病、黄瓜炭疽病菌、棉花枯萎病和水稻恶苗病等都有很好的防治效果，孢子萌发后，所产生的菌丝可穿透线虫的卵壳、幼虫及雌性成虫体壁，菌丝在其体内吸取营养，进行繁殖，同时分泌毒素和几丁质酶，破坏卵、幼虫及雌性成虫的正常生理代谢，从而导致线虫死亡；白僵菌分生孢子在寄主表皮或气孔、消化道上，遇适宜条件开始萌发，出生芽管。同时产生脂肪酶、蛋白酶、几丁质酶溶解昆虫的表皮，由芽管入侵虫体，在虫体内生长繁殖，消耗寄主体内养分，形成大量菌丝和孢子，布满虫体全身。同时产生各种毒素；苏云金杆菌经害虫食入后，寄生于寄主的中肠内，在肠内合适的碱性环境中生长繁殖，晶体毒素经过虫体肠道内蛋白酶水解，形成有毒效的较小亚单位，它们作用于虫体的中肠上皮细胞，引起肠道麻痹、穿孔、虫体瘫痪、停止进食，随后苏云金杆菌进入血腔繁殖，引起白血症，导致虫体死亡，通过淡紫紫孢菌、白僵菌、苏云金芽孢杆菌三者协同配合，能够对多种植物病虫害起到很好的防治的效果，具有十分广泛的应用前景，通过加入改性淀粉和改性壳聚糖，极大的提高了吸附性和凝胶能力，能够提高各菌种及其代谢产物等的利用率，通过加入改进几丁质作为诱导剂，提高诱导微生物产生几丁质酶的效果，更好的酶解虫体和虫卵外壁完成对根线虫的侵染。
具体实施方式
以下实施例会对本发明进行详述，本发明所列举的各实施例仅用以说明本发明，并非用以限制本发明的范围。对本发明所作的任何显而易知的修饰或变更都不脱离本发明的精神与范围。
实施例1
按比例准备包括以下按照重量份的原料：淡紫紫孢菌20份、白僵菌15份、苏云金芽孢杆菌10份、改性淀粉6份、改性几丁质2份、改性壳聚糖1份、圆褐固氮菌西姆芽孢杆菌混合发酵液10份、黄腐酸钾1份；将淡紫紫孢菌、白僵菌、苏云金芽孢杆菌分别接种于种子培养基中，进行摇床培养，得摇瓶种子液，将摇瓶种子液接种于已灭菌的发酵罐深层液体发酵培养基中，进行发酵培养，得液体发酵产物；将液体发酵产物与改性淀粉、改性几丁质、圆褐固氮菌西姆芽孢杆菌混合发酵液、黄腐酸钾充分搅拌，均匀混合，发酵7天，制成固体发酵物；把固体发酵物干燥至水份为15％，粉碎、过筛后得到所需复合生防微生物菌剂。
其中，所述改性淀粉的制备方法如下：按重量份计，称取薯类淀粉10份、甲基丙烯酸3份、苯乙烯2份、过氧化氢1份、硬脂酸钠1份，备用；将所述的甲基丙烯酸、苯乙烯和硬脂酸钠在超声波条件下进行乳化反应20min，制得乳化液；将所述淀粉原料在超声波条件下，室温环境中通氮气保护，在温度为60℃时预热30min，维持温度60℃并加入过氧化氢反应10min，得反应物；向反应物中加入乳化液，进行化学反应20min，即制得改性淀粉。
所述改性几丁质的制备方法如下：将几丁质、氢氧化钾和异丙醇混合均匀，升温至30℃，保温20min，继续升温至50℃，保温10min，然后加入溴代十六烷混合均匀，于600r/min转速搅拌20min，接着调节pH至中性，沉淀，过滤，冷却至室温得到改性几丁质，其中几丁质、氢氧化钾、异丙醇和溴代十六烷的重量比为7：3：3：1。
所述圆褐固氮菌西姆芽孢杆菌混合发酵液的制备方法如下：将圆褐固氮菌种子液和西姆芽孢杆菌种子液按照1:1的体积比混合，搅拌10min后，按照6％的体积比接种量接入发酵培养基中，25℃培育24h，即可得到圆褐固氮菌西姆芽孢杆菌混合发酵液。
所述改性壳聚糖的制备方法如下：取壳聚糖溶于有机酸或无机酸溶液中，调节pH4，加入酰基供体，再加入谷氨酰胺转胺酶，25℃充分反应，调节pH6，过滤去除沉淀，脱盐，干燥，即得改性壳聚糖。
实施例2
按比例准备包括以下按照重量份的原料：淡紫紫孢菌22份、白僵菌17份、苏云金芽孢杆菌12份、改性淀粉7份、改性几丁质2.5份、改性壳聚糖1.5份、圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液12份、黄腐酸钾1.5份；将淡紫紫孢菌、白僵菌、苏云金芽孢杆菌分别接种于种子培养基中，进行摇床培养，得摇瓶种子液，将摇瓶种子液接种于已灭菌的发酵罐深层液体发酵培养基中，进行发酵培养，得液体发酵产物；将液体发酵产物与改性淀粉、改性几丁质、圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液、黄腐酸钾充分搅拌，均匀混合，发酵8天，制成固体发酵物；把固体发酵物干燥至水份为16％，粉碎、过筛后得到所需复合生防微生物菌剂。
其中，所述改性淀粉的制备方法如下：按重量份计，称取薯类淀粉10份、甲基丙烯酸3份、苯乙烯2份、过氧化氢1份、硬脂酸钠1份，备用；将所述的甲基丙烯酸、苯乙烯和硬脂酸钠在超声波条件下进行乳化反应22min，制得乳化液；将所述淀粉原料在超声波条件下，室温环境中通氮气保护，在温度为65℃时预热32min，维持温度65℃并加入过氧化氢反应12min，得反应物；向反应物中加入乳化液，进行化学反应22min，即制得改性淀粉。
所述改性几丁质的制备方法如下：将几丁质、氢氧化钾和异丙醇混合均匀，升温至32℃，保温22min，继续升温至52℃，保温12min，然后加入溴代十六烷混合均匀，于650r/min转速搅拌25min，接着调节pH至中性，沉淀，过滤，冷却至室温得到改性几丁质，其中几丁质、氢氧化钾、异丙醇和溴代十六烷的重量比为7：3：3：1。
所述圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液的制备方法如下：将圆褐固氮菌种子液和西姆芽孢杆菌种子液按照1:1的体积比混合，搅拌12min后，按照6％的体积比接种量接入发酵培养基中，27℃培育28h，即可得到圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液。
所述改性壳聚糖的制备方法如下：取壳聚糖溶于有机酸或无机酸溶液中，调节pH4，加入酰基供体，再加入谷氨酰胺转胺酶，28℃充分反应，调节pH6，过滤去除沉淀，脱盐，干燥，即得改性壳聚糖。
实施例3
按比例准备包括以下按照重量份的原料：淡紫紫孢菌25份、白僵菌20份、苏云金芽孢杆菌15份、改性淀粉8份、改性几丁质3份、改性壳聚糖2份、圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液13份、黄腐酸钾2份；将淡紫紫孢菌、白僵菌、苏云金芽孢杆菌分别接种于种子培养基中，进行摇床培养，得摇瓶种子液，将摇瓶种子液接种于已灭菌的发酵罐深层液体发酵培养基中，进行发酵培养，得液体发酵产物；将液体发酵产物与改性淀粉、改性几丁质、圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液、黄腐酸钾充分搅拌，均匀混合，发酵9天，制成固体发酵物；把固体发酵物干燥至水份为18％，粉碎、过筛后得到所需复合生防微生物菌剂。
其中，所述改性淀粉的制备方法如下：按重量份计，称取薯类淀粉10份、甲基丙烯酸3份、苯乙烯2份、过氧化氢1份、硬脂酸钠1份，备用；将所述的甲基丙烯酸、苯乙烯和硬脂酸钠在超声波条件下进行乳化反应25min，制得乳化液；将所述淀粉原料在超声波条件下，室温环境中通氮气保护，在温度为70℃时预热35min，维持温度70℃并加入过氧化氢反应15min，得反应物；向反应物中加入乳化液，进行化学反应25min，即制得改性淀粉。
所述改性几丁质的制备方法如下：将几丁质、氢氧化钾和异丙醇混合均匀，升温至35℃，保温25min，继续升温至55℃，保温15min，然后加入溴代十六烷混合均匀，于700r/min转速搅拌30min，接着调节pH至中性，沉淀，过滤，冷却至室温得到改性几丁质，其中几丁质、氢氧化钾、异丙醇和溴代十六烷的重量比为4：4：3：2。
所述圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液的制备方法如下：将圆褐固氮菌种子液和西姆芽孢杆菌种子液按照2:1的体积比混合，搅拌13min后，按照7％的体积比接种量接入发酵培养基中，30℃培育30h，即可得到圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液。
所述改性壳聚糖的制备方法如下：取壳聚糖溶于有机酸或无机酸溶液中，调节pH5，加入酰基供体，再加入谷氨酰胺转胺酶，30℃充分反应，调节pH7，过滤去除沉淀，脱盐，干燥，即得改性壳聚糖。
实施例4
按比例准备包括以下按照重量份的原料：淡紫紫孢菌28份、白僵菌23份、苏云金芽孢杆菌18份、改性淀粉9份、改性几丁质3.5份、改性壳聚糖2.5份、圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液14份、黄腐酸钾2.5份；将淡紫紫孢菌、白僵菌、苏云金芽孢杆菌分别接种于种子培养基中，进行摇床培养，得摇瓶种子液，将摇瓶种子液接种于已灭菌的发酵罐深层液体发酵培养基中，进行发酵培养，得液体发酵产物；将液体发酵产物与改性淀粉、改性几丁质、圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液、黄腐酸钾充分搅拌，均匀混合，发酵9天，制成固体发酵物；把固体发酵物干燥至水份为19％，粉碎、过筛后得到所需复合生防微生物菌剂。
其中，所述改性淀粉的制备方法如下：按重量份计，称取薯类淀粉10份、甲基丙烯酸3份、苯乙烯2份、过氧化氢1份、硬脂酸钠1份，备用；将所述的甲基丙烯酸、苯乙烯和硬脂酸钠在超声波条件下进行乳化反应28min，制得乳化液；将所述淀粉原料在超声波条件下，室温环境中通氮气保护，在温度为75℃时预热380min，维持温度75℃并加入过氧化氢反应18min，得反应物；向反应物中加入乳化液，进行化学反应28min，即制得改性淀粉。
所述改性几丁质的制备方法如下：将几丁质、氢氧化钾和异丙醇混合均匀，升温至38℃，保温28min，继续升温至58℃，保温18min，然后加入溴代十六烷混合均匀，于750r/min转速搅拌35min，接着调节pH至中性，沉淀，过滤，冷却至室温得到改性几丁质，其中几丁质、氢氧化钾、异丙醇和溴代十六烷的重量比为9：4：4：2。
所述圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液的制备方法如下：将圆褐固氮菌种子液和西姆芽孢杆菌种子液按照2:1的体积比混合，搅拌15min后，按照8％的体积比接种量接入发酵培养基中，33℃培育33h，即可得到圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液。
所述改性壳聚糖的制备方法如下：取壳聚糖溶于有机酸或无机酸溶液中，调节pH6，加入酰基供体，再加入谷氨酰胺转胺酶，32℃充分反应，调节pH7，过滤去除沉淀，脱盐，干燥，即得改性壳聚糖。
实施例5
按比例准备包括以下按照重量份的原料：淡紫紫孢菌30份、白僵菌25份、苏云金芽孢杆菌20份、改性淀粉10份、改性几丁质4份、改性壳聚糖3份、圆褐固氮菌西姆芽孢杆菌混合发酵液16份、黄腐酸钾3份；将淡紫紫孢菌、白僵菌、苏云金芽孢杆菌分别接种于种子培养基中，进行摇床培养，得摇瓶种子液，将摇瓶种子液接种于已灭菌的发酵罐深层液体发酵培养基中，进行发酵培养，得液体发酵产物；将液体发酵产物与改性淀粉、改性几丁质、圆褐固氮菌西姆芽孢杆菌混合发酵液、黄腐酸钾充分搅拌，均匀混合，发酵10天，制成固体发酵物；把固体发酵物干燥至水份为20％，粉碎、过筛后得到所需复合生防微生物菌剂。
其中，所述改性淀粉的制备方法如下：按重量份计，称取薯类淀粉10份、甲基丙烯酸3份、苯乙烯2份、过氧化氢1份、硬脂酸钠1份，备用；将所述的甲基丙烯酸、苯乙烯和硬脂酸钠在超声波条件下进行乳化反应30min，制得乳化液；将所述淀粉原料在超声波条件下，室温环境中通氮气保护，在温度为80℃时预热40min，维持温度80℃并加入过氧化氢反应20min，得反应物；向反应物中加入乳化液，进行化学反应30min，即制得改性淀粉。
所述改性几丁质的制备方法如下：将几丁质、氢氧化钾和异丙醇混合均匀，升温至40℃，保温30min，继续升温至60℃，保温20min，然后加入溴代十六烷混合均匀，于800r/min转速搅拌40min，接着调节pH至中性，沉淀，过滤，冷却至室温得到改性几丁质，其中几丁质、氢氧化钾、异丙醇和溴代十六烷的重量比为9：5：4：2。
所述圆褐固氮菌西姆芽孢杆菌混合发酵液的制备方法如下：将圆褐固氮菌种子液和西姆芽孢杆菌种子液按照2:1的体积比混合，搅拌16min后，按照8％的体积比接种量接入发酵培养基中，35℃培育36h，即可得到圆褐固氮菌西姆芽孢杆菌混合发酵液。
所述改性壳聚糖的制备方法如下：取壳聚糖溶于有机酸或无机酸溶液中，调节pH6，加入酰基供体，再加入谷氨酰胺转胺酶，35℃充分反应，调节pH7，过滤去除沉淀，脱盐，干燥，即得改性壳聚糖。
对比例1
在实施例3的基础上，不含淡紫紫孢菌；
对比例2
在实施例3的基础上，不含白僵菌；
对比例3
在实施例3的基础上，不含苏云金芽孢杆菌；
对比例4
实施例3的基础上，不含淡紫紫孢菌、白僵菌和苏云金芽孢杆菌；
对比例5
一种市售复合生防微生物菌剂。
以作物品种西瓜、桃树和梨树作为对象，每个品种选取40亩地进行实验，分为十组，分别采用实施例1-5以及对比例1-5的微生物菌剂，每亩浇灌量为微生物菌剂15L兑1000kg水浇灌一次，共浇灌3次，分别是萌芽开花前一次，幼果期一次，膨果期一次，计算防治效果。
组别 西瓜防效％ 桃树防效％ 梨树防效％
实施例1 96.5 97.6 97.2
实施例2 97.0 98.8 98.5
实施例3 98.4 99.1 98.9
实施例4 97.8 98.3 98.6
实施例5 97.3 98.1 98.2
对比例1 70.6 72.7 74.2
对比例2 71.3 73.2 75.3
对比例3 71.1 71.4 74.4
对比例4 60.3 62.2 63.6
对比例5 64.8 65.6 68.4
从以上结果可以看出，本发明制备的微生物菌剂防治病虫害效果好，通过淡紫紫孢菌、白僵菌和苏云金芽孢杆菌具有很好的协同增效作用，能够极大的提高防治效果。
加入淡紫紫孢菌、白僵菌、苏云金芽孢杆菌，淡紫紫孢菌对植物病原菌具有拮抗效能，能够大大抑制菌丝的生长，从而预防病害，对玉米小斑病、小麦赤霉病、黄瓜炭疽病菌、棉花枯萎病和水稻恶苗病等都有很好的防治效果，孢子萌发后，所产生的菌丝可穿透线虫的卵壳、幼虫及雌性成虫体壁，菌丝在其体内吸取营养，进行繁殖，同时分泌毒素和几丁质酶，破坏卵、幼虫及雌性成虫的正常生理代谢，从而导致线虫死亡；白僵菌分生孢子在寄主表皮或气孔、消化道上，遇适宜条件开始萌发，出生芽管。同时产生脂肪酶、蛋白酶、几丁质酶溶解昆虫的表皮，由芽管入侵虫体，在虫体内生长繁殖，消耗寄主体内养分，形成大量菌丝和孢子，布满虫体全身。同时产生各种毒素；苏云金杆菌经害虫食入后，寄生于寄主的中肠内，在肠内合适的碱性环境中生长繁殖，晶体毒素经过虫体肠道内蛋白酶水解，形成有毒效的较小亚单位，它们作用于虫体的中肠上皮细胞，引起肠道麻痹、穿孔、虫体瘫痪、停止进食，随后苏云金杆菌进入血腔繁殖，引起白血症，导致虫体死亡，通过淡紫紫孢菌、白僵菌、苏云金芽孢杆菌三者协同配合，能够对多种植物病虫害起到很好的防治的效果，具有十分广泛的应用前景，通过加入改性淀粉和改性壳聚糖，极大的提高了吸附性和凝胶能力，能够提高各菌种及其代谢产物等的利用率，通过加入改进几丁质作为诱导剂，提高诱导微生物产生几丁质酶的效果，更好的酶解虫体和虫卵外壁完成对根线虫的侵染。
以上所述，仅为本公开的具体实施方式，但本公开的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本公开的保护范围之内。因此，本公开的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种复合生防微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1）按比例准备包括以下按照重量份的原料：淡紫紫孢菌20-30份、白僵菌15-25份、苏云金芽孢杆菌10-20份、改性淀粉6-10份、改性几丁质2-4份、改性壳聚糖1-3份、圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液10-16份、黄腐酸钾1-3份；
2）将淡紫紫孢菌、白僵菌、苏云金芽孢杆菌分别接种于种子培养基中，进行摇床培养，得摇瓶种子液，将摇瓶种子液接种于已灭菌的发酵罐深层液体发酵培养基中，进行发酵培养，得液体发酵产物；
3）将液体发酵产物与改性淀粉、改性几丁质、圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液、黄腐酸钾充分搅拌，均匀混合，发酵7-10天，制成固体发酵物；
4）把固体发酵物干燥至水份为15-20%，粉碎、过筛后得到所需复合生防微生物菌剂。
2.根据权利要求1所述的复合生防微生物菌剂的制备方法，其特征在于，按比例准备包括以下按照重量份的原料：淡紫紫孢菌22-28份、白僵菌17-23份、苏云金芽孢杆菌12-18份、改性淀粉7-9份、改性几丁质2.5-3.5份、改性壳聚糖1.5-2.5份、圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液12-14份、黄腐酸钾1.5-2.5份。
3.根据权利要求1所述的复合生防微生物菌剂的制备方法，其特征在于，按比例准备包括以下按照重量份的原料：淡紫拟青霉菌二次菌液15份、地衣芽孢杆菌-鞘氨醇杆菌混合发酵液8份、革兰氏阳性放线菌-蜡状芽孢杆菌混合发酵液6份、固氮菌7份、巨大芽孢杆菌4份、光合菌3份、氨基酸10份、腐殖酸2份、单糖2份、几丁质5份、改性硅藻土5份。
4.根据权利要求1所述的复合生防微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述改性淀粉的制备方法如下：按重量份计，称取薯类淀粉10份、甲基丙烯酸3份、苯乙烯2份、过氧化氢1份、硬脂酸钠1份，备用；将所述的甲基丙烯酸、苯乙烯和硬脂酸钠在超声波条件下进行乳化反应20-30min，制得乳化液；将所述淀粉原料在超声波条件下，室温环境中通氮气保护，在温度为60-80℃时预热30-40min，维持温度60-80℃并加入过氧化氢反应10-20min，得反应物；向反应物中加入乳化液，进行化学反应20-30min，即制得改性淀粉。
5.根据权利要求1所述的复合生防微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述改性几丁质的制备方法如下：将几丁质、氢氧化钾和异丙醇混合均匀，升温至30-40℃，保温20-30min，继续升温至50-60℃，保温10-20min，然后加入溴代十六烷混合均匀，于600-800r/min转速搅拌20-40min，接着调节pH至中性，沉淀，过滤，冷却至室温得到改性几丁质，其中几丁质、氢氧化钾、异丙醇和溴代十六烷的重量比为7-9：3-5：3-4：1-2。
6.根据权利要求1所述的复合生防微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液的制备方法如下：将圆褐固氮菌种子液和西姆芽孢杆菌种子液按照1-2:1的体积比混合，搅拌10-16min后，按照6-8%的体积比接种量接入发酵培养基中，25-35℃培育24-36h，即可得到圆褐固氮菌-西姆芽孢杆菌混合发酵液。
7.根据权利要求1所述的复合生防微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述改性壳聚糖的制备方法如下：取壳聚糖溶于有机酸或无机酸溶液中，调节pH4-6，加入酰基供体，再加入谷氨酰胺转胺酶，25-35℃充分反应，调节pH6-7，过滤去除沉淀，脱盐，干燥，即得改性壳聚糖。
8.如权利要求1-7所述的复合生防微生物菌剂的制备方法制得的生防微生物菌剂在对植物抗病作用中的应用。
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