CN111304136B - 一种耐铅贝莱斯芽孢杆菌及其分离方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了微生物分离方法领域的一种耐铅贝莱斯芽孢杆菌及其分离方法与应用。本发明提供的耐铅贝莱斯芽孢杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.19020，该耐铅贝莱斯芽孢杆菌来源于鸡盲肠内容物，通过含铅的LB固体培养基培养筛选得到，该贝莱斯芽孢杆菌可以在高浓度的铅环境生存，并对铅具有较强的吸附效果，可用于去除动物饲料中的铅元素，使动物能够健康成长。

Description

一种耐铅贝莱斯芽孢杆菌及其分离方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物分离方法领域，特别涉及一种耐铅贝莱斯芽孢杆菌及其应用。
背景技术
芽孢杆菌，细菌的一科，能形成芽孢(内生孢子)的杆菌或球菌。包括芽孢杆菌属，芽孢乳杆菌属，梭菌属、脱硫肠杆菌属，和芽孢八叠球菌数等。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。贝莱斯芽孢杆菌在自然界中广泛分布，具有快速生长和稳定的良好特性，易于分离和培养，对人类和动物无害，不污染环境。其代谢产物丰富，具有广谱抗菌活性和较强的抗应激能力，因此该细菌在农业、环境和发酵工业等许多领域发挥着越来越重要的作用。
铅在动物饲料中是一种有毒有害的成分，如果动物摄入铅含量超标，铅会在体内积蓄，损害畜禽的健康，然后通过食物链影响人的健康。铅含量超标带来的危害的具体表现有：对神经系统起作用，出现神经衰弱和中毒性多发神经炎；引起贫血，并影响凝血过程；损害肾脏，而且也会损害免疫系统等。
饲料中的铅主要有如下途径形成，第一，饲料中本身具有一定的本底铅含量，环境污染是饲料铅污染的重要来源，如铅蓄电池乱扔造成土壤中铅污染，汽车尾气造成大气中铅污染，有色金属的冶炼过程中造成铅对环境的污染；第二，饲料加工过程中人为引入，如添加微量元素锌时可能带来铅污染，因为在自然界中，锌、铅、镉是共生矿，锌源中常伴有铅污染，铅属于有毒有害微量元素，在饲料中的含量必须得到有效控制，否则会对动物的健康带来不利影响。
为防范和降低铅对动物和人的危害和风险，有必要寻找到降低饲料铅对动物的危害方法。目前采用的方法如下：1、利用一些螯合剂如乙二胺四乙酸二钠钙与铅螯合后排铅；2、补充维生素如vC、vE，降低铅对机体细胞的氧化损伤。
但是，上述方法依旧产生如下弊端，大剂量使用螯合剂对机体有副作用，补充微量元素和维生素对高剂量的铅有缓解作用，而饲料中的铅在一般情况下难以达到极高的中毒量，其经济性和适用性有待商榷。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种耐铅贝莱斯芽孢杆菌，耐铅贝莱斯芽孢杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.19020，该贝莱斯芽孢杆菌可以在高浓度的铅环境生存，并对铅具有较强的吸附效果，可用于去除动物饲料中的铅元素。
本发明的第二个目的是提供上述的耐铅贝莱斯芽孢杆菌在吸附铅污染基质中的应用。
本发明的第三个目的是提供上述的耐铅贝莱斯芽孢杆菌在制备铅吸附剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种铅吸附剂，包括上述的耐铅贝莱斯芽孢杆菌。
为了实现上述发明目的，本发明耐铅贝莱斯芽孢杆菌及其应用采用的如下技术方案：
一种耐铅贝莱斯芽孢杆菌，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，2019年11月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.19020。
优选的，耐铅贝莱斯芽孢杆菌的耐受胆盐浓度为0.8％。
上述的耐铅贝莱斯芽孢杆菌在吸附铅污染基质中的应用。
优选的，在铅污染基质中加入耐铅贝莱斯芽孢杆菌，控制所述基质的pH为6-7。
上述的耐铅贝莱斯芽孢杆菌在制备铅吸附剂中的应用。
一种铅吸附剂，包括耐铅贝莱斯芽孢杆菌。
上述的耐铅贝莱斯芽孢杆菌在抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌上的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供一种耐铅贝莱斯芽孢杆菌，该贝莱斯芽孢杆菌能够在高浓度的铅环境生存，并对铅具有较强的吸附效果，可用于去除动物饲料中的铅元素，该耐铅贝莱斯芽孢杆菌来源于鸡盲肠内容物，通过含铅的LB固体培养基培养筛选得到；将耐铅贝莱斯芽孢杆菌制备成铅吸附剂，能够大规模的应用在动物饲料中，尤其在pH为6-7的条件下，具有较好的铅吸附率。
附图说明
图1为本发明培养的耐铅贝莱斯芽孢杆菌的菌落形态图；
图2为实施例1中分离的耐铅贝莱斯芽孢杆菌的革兰氏染色结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
一种耐铅贝莱斯芽孢杆菌，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，2019年11月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.19020。
进一步地，耐铅贝莱斯芽孢杆菌的耐受胆盐浓度为0.8％。
上述的耐铅贝莱斯芽孢杆菌在吸附铅污染基质中的应用。
进一步地，在铅污染基质中加入耐铅贝莱斯芽孢杆菌，控制所述基质的pH 为6-7。
上述的耐铅贝莱斯芽孢杆菌在制备铅吸附剂中的应用。
一种铅吸附剂，包括耐铅贝莱斯芽孢杆菌。
上述的耐铅贝莱斯芽孢杆菌在抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌上的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供耐铅贝莱斯芽孢杆菌的分离方法与应用。
耐铅贝莱斯芽孢杆菌的分离方法，包括如下步骤：
(1)取盲肠内容物1g于无菌15ml离心管中，然后加入无菌PBS溶液10ml，震荡30min；
(2)置于离心机中离心，离心机的转速为4000rpm，离心10min，取上清 0.5ml于1ml离心管中；
(3)将步骤(2)中的上清液置于80℃水浴20min；
(4)水浴加热后取出，并用无菌PBS逐级稀释至10-5，分别取100μL各级稀释液涂布在含Pb 500mg/L的LB固体培养基上，37℃培养24h后，挑取单菌落一；
(5)将步骤(4)中挑去的单菌落一继续接种在含Pb 500mg/L的LB固体培养基上，继续培养24h后，挑取单菌落二；
(6)将步骤(5)中挑取的单菌落二重复接种在含Pb 500mg/的LB固体培养基上，培养24h后获得的单菌落为耐Pb 500mg的贝莱斯芽孢杆菌。如图1所示，为本发明培养的耐铅贝莱斯芽孢杆菌的菌落形态图。
将获得的贝莱斯芽孢杆菌进行微生物保藏，保藏信息为：分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，2019年11月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.19020。
将步骤(6)中分离的贝莱斯芽孢杆菌应用于动物饲料中吸附铅，也可以用于制成铅吸附剂，或者应用在抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌上。
实施例2
本实施例提供耐铅贝莱斯芽孢杆菌的分离方法与应用。
耐铅贝莱斯芽孢杆菌的分离方法，包括如下步骤：
(1)取盲肠内容物1g于无菌15ml离心管中，然后加入无菌PBS溶液10ml，震荡30min；
(2)置于离心机中离心，离心机的转速为4000rpm，离心10min，取上清 0.5ml于1ml离心管中；
(3)将步骤(2)中的上清液置于90℃水浴15min；
(4)水浴加热后取出，并用无菌PBS逐级稀释至10-5，分别取100μL各级稀释液涂布在含Pb 500mg/L的LB固体培养基上，37℃培养12h后，挑取单菌落一；
(5)将步骤(4)中挑去的单菌落一继续接种在含Pb 500mg/L的LB固体培养基上，继续培养12h后，挑取单菌落二；
(6)将步骤(5)中挑取的单菌落二重复接种在含Pb 500mg/的LB固体培养基上，培养12h后获得的单菌落为耐Pb 500mg的贝莱斯芽孢杆菌。
将获得的贝莱斯芽孢杆菌进行微生物保藏，保藏信息为：分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，2019年11月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.19020。
将步骤(6)中分离的贝莱斯芽孢杆菌应用于动物饲料中吸附铅，也可以用于制成铅吸附剂，或者应用在抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌上。
实施例3
本实施例提供耐铅贝莱斯芽孢杆菌的分离方法与应用。
耐铅贝莱斯芽孢杆菌的分离方法，包括如下步骤：
(1)取盲肠内容物1g于无菌15ml离心管中，然后加入无菌PBS溶液10ml，震荡30min；
(2)置于离心机中离心，离心机的转速为4000rpm，离心10min，取上清 0.5ml于1ml离心管中；
(3)将步骤(2)中的上清液置于80℃水浴30min；
(4)水浴加热后取出，并用无菌PBS逐级稀释至10-5，分别取100μL各级稀释液涂布在含Pb 500mg/L的LB固体培养基上，37℃培养36h后，挑取单菌落一；
(5)将步骤(4)中挑去的单菌落一继续接种在含Pb 500mg/L的LB固体培养基上，继续培养18h后，挑取单菌落二；
(6)将步骤(5)中挑取的单菌落二重复接种在含Pb 500mg/的LB固体培养基上，培养18h后获得的单菌落为耐Pb 500mg的贝莱斯芽孢杆菌。
将获得的贝莱斯芽孢杆菌进行微生物保藏，保藏信息为：分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，2019年11月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.19020。
将步骤(6)中分离的贝莱斯芽孢杆菌应用于动物饲料中吸附铅，也可以用于制成铅吸附剂，或者应用在抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌上。
一、鉴定
1、革兰氏染色
挑一个实施例1中分离到的耐铅贝莱斯芽孢杆菌单菌落于10μL无菌PBS 溶液中混匀，涂布在无菌载玻片上，快速在火焰上固定，冷却后，按照革兰氏染色步骤操作，在显微镜下用油镜观察，确定为两端浓染革兰氏阳性杆菌，如图2所示。
2、16S rRNA生物学鉴定
上述实施例1中分离到的耐铅贝莱斯芽孢杆菌经LB液体培养基37℃震荡培养18h后，取1mL培养液，按照TaKaRa细菌DNA提取试剂盒(No：9763) 的要求，提取菌株DNA；
并利用细菌16S rRNA基因通用引物PCR扩增菌株16S rRNA基因，上游引物序列为27F：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇；下游引物序列为1492R： 5＇-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3＇；产物大小为1451；PCR扩增程序为： 95℃:1min，95℃:30s，52℃:30s，72℃:2min，重复35个循环；4℃保存；
取4μL PCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳，剩余PCR产物送生物技术公司测序，测序得到的基因序列如SEQ ID NO.1所示。将测序得到的基因序列与NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)比对，确定芽孢杆菌种属。测序结果如下(SEQ ID NO.1)：
GTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTG ATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGAC TGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGC ATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGC GGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGT AGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCA GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTC TGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTC TGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGG TACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGG CGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCA TTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGT GTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCG ACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAAC AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTT AGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCT GGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCG CACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTA CCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGG GGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATG TTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATT CAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGG GGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTA CAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCA CAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCT GGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGG CCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTC GGTGAGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGAT
根据革兰氏染色和16S rRNA生物学鉴定，确定本发明实施例1中分离的菌株为贝莱斯芽孢杆菌。
二、最大铅耐受量
将实施例1得到的耐铅贝莱斯芽孢杆菌按1％的接种量接种至5mL的LB液体培养基中培养18h，调吸光度为1(OD600)，逐级稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、 10-5，分别取10μL滴至含Pb 100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1000mg/L 的LB固体培养基上，37℃培养24h观察结果，确定贝莱斯芽孢杆菌耐受最大铅浓度，将最大耐铅浓度的贝莱斯芽孢杆菌株接种在无铅LB固体培养基上，37℃培养24h。结果显示其可耐受最大铅浓度1000mg/L的生长。
三、对溶液中铅离子的吸附性
将实施例1得到的贝莱斯芽孢杆菌按1％的接种量接种至5mL的LB液体培养基震荡培养18h后，以10000r/min转速离心10分钟，去上清，超纯水清洗沉淀后，调吸光度为1(OD600)，取0.5mL溶液仍以10000r/min转速，离心10分钟，去上清，在沉淀物质中分别加入0.5mL pH为2.6、4.0、6.0和7.0的50mg/L 铅溶液悬浮沉淀，37℃，中速震荡2h后，10000r/min转速，离心10分钟，取上清液，经适当倍数稀释后，用石墨炉法测定溶液中的铅含量。利用公式(1)计算贝莱斯芽孢杆菌铅吸附率。
公式(1)如下：
吸附率(％)＝100％-(C1/C0)×100％
其中，C0为初始铅液浓度，C1为最终上清液中铅液浓度。
结果见下表1
表1本发明实施例1分离得到的贝莱斯芽孢杆菌对铅溶液的吸附率
Figure RE-GDA0003145048890000091
根据上表1的结果显示，pH值对菌株吸附铅的影响较大。在pH值为2.6 时，贝莱斯芽孢杆菌对50mg/L铅溶液铅的吸附率低于30％，pH为4.0时，铅吸附率接近40％，随着pH值的升高，铅的吸附率上升，pH为7.0时铅吸附率最高，超过85％。
四、抑菌性质
将实施例1得到的耐铅贝莱斯芽孢杆菌按1％的接种量接种至5mL的LB液体培养基中培养18h，调吸光度为1(OD600)，取1mL LB培养液于无菌管中，将6mm的无菌滤纸片分别浸入LB培养液中。调节金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌吸光度为0.08-0.1(OD600)，分别取50μL金葡菌、大肠杆菌、沙门氏菌均匀涂满LB培养基，将滤纸片分别铺在细菌培养板上，金葡菌、大肠杆菌、沙门氏菌37℃培养24h后观察结果，确定贝莱斯芽孢杆菌的抑菌性质。
结果显示下表2
表2本发明实施例1分离得到的贝莱斯芽孢杆菌抑菌试验结果
Figure RE-GDA0003145048890000092
根据上表2的结果显示：该贝莱斯芽孢杆菌可抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的生长。
五、胆盐耐受性
将实施例1得到的耐铅贝莱斯芽孢杆菌按1％的接种量接种至5mL的LB液体培养基中培养18h，调吸光度为1(OD600)，逐级稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、 10-5，分别取10μL滴至含牛胆盐0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、 0.8％、0.9％、1.0％的LB固体培养板上，以无胆盐LB培养板为对照，37℃培养 48h观察结果，确定贝莱斯芽孢杆菌耐受胆盐浓度。
结果显示，该贝莱斯芽孢杆菌可耐受0.8％的胆盐。
综上，本发明实施例1分离的贝莱斯芽孢杆菌最大耐受铅浓度为1000mg/L，对50mg/L铅溶液(pH7)铅吸附率大于85％，且耐受0.8％的胆盐，可抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的生长。

Claims (7)

1.一种耐铅贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，2019年11月27日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNO.19020。
2.根据权利要求1所述的耐铅贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于：所述耐铅贝莱斯芽孢杆菌的耐受胆盐浓度为0.8％。
3.根据权利要求1所述的耐铅贝莱斯芽孢杆菌在吸附铅污染基质中的应用。
4.根据权利要求3所述的耐铅贝莱斯芽孢杆菌在吸附铅污染基质中的应用，其特征在于：在铅污染基质中加入耐铅贝莱斯芽孢杆菌，控制所述基质的pH为6-7。
5.根据权利要求1所述的耐铅贝莱斯芽孢杆菌在制备铅吸附剂中的应用。
6.一种铅吸附剂，其特征在于：包括权利要求1所述的耐铅贝莱斯芽孢杆菌。
7.根据权利要求1所述的耐铅贝莱斯芽孢杆菌在抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌上的应用。
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