KR20130014719A - 식물병원성 진균에 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 ｓｕｂｓｐ．인하이그루스 균주 및 이를 이용한 항생 물질의 제조방법 - Google Patents

식물병원성 진균에 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 ｓｕｂｓｐ．인하이그루스 균주 및 이를 이용한 항생 물질의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물병원성 진균인 고추 탄저병균 등에 대해 항균효과를 가지는 항생물질인 니피마이신을 생성, 분비하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주 KP6107 (Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus strain KP6107) 및 이 균주로부터 생산되는 항생물질의 제조 방법에 관한 것이다. 상기한 본 발명에 의하면 자연환경에서의 미생물에 의한 생분해성이 큰 환경친화적 살균제 조성물을 제공하는 효과가 있고, 피해 효과가 크고 방제하기 힘든 병원균인 콜레토트리쿰 코코데스가 일으키는 고추 탄저병 등에 대한 방제 효과가 있어 식물병 방제산업상 유용하게 이용될 수 있다.　

Description

식물병원성 진균에 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 ｓｕｂｓｐ．인하이그루스 균주 및 이를 이용한 항생 물질의 제조방법{Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus strain effective against plant pathogenic fungi and method for preparing antibiotics using the same}
본 발명은 식물병원성 진균에 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주 및 이를 이용한 항생 물질의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 고추, 오이 탄저병균, 토마토 시들음병균, 잿빛곰팡이병균 등의 식물병원성 진균에 대해 항균 활성이 우수한 니피마이신을 생성, 분비하여 항균 활성을 가지는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주 및 이 균주에서 생산되는 항생 물질의 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로, 고추 탄저병 (anthracnose)은 전국 고추 재배 지역에 발생하여 역병과 더불어 매년 많은 피해를 주고 있는 대표적인 고추 병해로서 이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
탄저병을 일으키는 콜레토트리쿰 spp. (Colletotrichum spp .) 중 콜레토트리쿰 코코데스 (Colletotrichum cocodes)는 고추 유묘기에 잎과 줄기에 불규칙한 많은 반점을 일으키는 탄저병균이다. 병원균의 균사 또는 포자의 형으로 병든 줄기나 잎 또는 열매 등에서 월동하여 다음해 접종원이 되고, 종자의 표면에 부착하거나 종자내부에 침입 월동하여 1차 접종원이 되기도 한다. 또한 병 부위에 형성된 분생 포자는 2차 접종원이 되는데 이는 분생자층이 습기를 지녀야만 전반되며, 빗물, 곤충, 작업도구에 의해 전반되기도 한다. 병원균의 분생포자는 습기가 있어야만 발아하고, 부착기를 형성하며 기주의 각피를 직접 뚫고 체내에 침입한다. 병원균의 적정 온도는 28-32℃로 고온 다습과 강우 시 병 발생이 많이 일어나므로 여름 장마철에 피해가 크다. 또한 질소질의 과다 사용으로 병 발생을 일으킨다. 병원균 전반 현상은 빠르게 퍼지기 때문에 엄청난 작물손실의 결과를 가져온다 (Lewis Ivey et al. 2004).
탄저병을 방제하기 위해서는 파종을 하기 전에 종자는 무병지 건전한 식물에서 채종하고, 종자 소독 후 파종을 하거나 탄저병이 발생하기 쉬운 곳에서는 저항성 품종 재배하도록 한다. 생육 중에는 병든 잎이나 열매를 일찍 제거하여 포자의 전반을 막아주도록 한다. 제거한 잎, 줄기 열매들은 태워서 전염원을 없애고 질소질 편용을 막고 포장은 배수가 잘 되게 하여 습한 것을 피하고 밀식을 삼가도록 한다. 또한 화학적 방제는 콜레토트리쿰 spp. 주요 방제 법 중 하나로, 몇몇 계열의 살균제가 복합적 또는 대안적으로 탄저병 방제를 위해 끊임없이 사용되었다. 약제방제는 강우 후 즉시 살포하는 것이 가장 효과적이며, 유효 약제로는 다코닐수화제 (유효성분: 클로로탈로닐 75%) 1000배액을 병 발생이 급격히 늘어나면 4-5일 간격으로 수회 살포하고 예방의 경우에는 7-10일 간격으로 1-2회 살포한다.
하지만 최근에 유기합성 살균제에 대한 저항성 식물병원균 출현과 환경에 대한 부작용 때문에 식물병을 방제할 새로운 친환경 살균제에 대한 필요성이 증가하고 있다. 미생물로부터 유래한 2차 대사물질은 다양한 화학구조를 가지고 있을 뿐만 아니라 생물학적인 활성을 지니고 있으며 바이오스피어(생물권)에서 쉽게 분해가 잘된다고 보고되어 있다 (Tanaka and Omura, 1993).　 그러므로, 미생물 유래 2차 대사산물은 가능성 있는 살균제의 원천으로서 중요하다.
일반적으로 세포막 손상을 일으키는데 광범위한 활성을 지닌 마크롤라이드계 항생 물질들은 넓은 범위의 세균 감염을 치료하는데 이용된다. 그러나, 이러한 항생 물질들은 식물병원균 보다 다양한 범위의 진균에 대해서 억제 활성을 지닌다고 더 많이 보고되어있다 (1971).
아잘로마이신 F, 코피아마이신, 네오코피아마이신 A, 그리고 말로락토마이신 C, D와 같은 알킬구아니딜 사이드 체인을 가진 마크롤라이드 계열 물질들은 식물병원균을 포함하여 넓은 항미생물 활성을 지닌다고 보고되었다 (Takesako et al. 1985; Berlinck and Roberto 2002; Inoue et al. 2005). 아잘로마이신 F 화합물은 보트라이티스 시네리아 균사 분지와 같은 형태학적 변화를 일으킨다. 카르복실기 그룹과 고리모양 락톤 구조를 가진 논폴리에닉 항생 물질 코피아마이신은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 크리스탈로제네스 균사로부터 유래되었다. 이것은 실험실 상에서 효모, 진균, 원생동물에 대해 효과적이며, 칸디다, 뮤코(털곰팡이), 크리토코쿠스, 트리코피톤(백선균), 트리코모나스 바기날리스와 같은 일부 병원균의 생장을 억제하고 (Seiga and Yamaji 1971), 아스퍼질러스 니거와 그로메렐라 싱귤라타와 같은 식물병원균에 대해 항균 활성을 가지며 (Nakano and Nishiyama 1974; Barathova and Betina 1976), 말로락톤마이신 C와 D는 세균과 효모에는 비활성적이지만 클라도수포리움, 보트라이티스, 마그나포르테에는 활성이 있다고 보고되었다.
본 발명의 배경이 되는 기술로서 선행기술문헌에 기재된 바와 같이, 1967년에 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-255로부터 구아니딜-폴리올 마크롤라이드계 항생 물질인 니피마이신이 처음으로 분리되었다 (특허문헌 1, 비특허문헌 1). 니피마이신이 수많은 사상균에 대해 항진균 활성을 가짐에도 불구하고, 식물 병원균에 대한 항균 활성은 오직 양파 검은 곰팡이 병을 일으키는 아스퍼질러스 니거에 대해서만 실험실 상 활성이 알려져 있다.
또한, 본 발명의 배경이 되는 기술로 대한민국 특허공보 제10-0750810호(2007.08.14)에 개시된 바와 같이 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스 아종 아스코마이세티구스가 항균제 및 면역억제제 등으로 이용되는 타크로리무스를 생산하는 것이 공개되어 있다.
영국 특허공보 제1,254,721호(1971.11.24) 대한민국 특허공보 제10-0750810호(2007.08.14)
Blinov et al, Studies on antibiotics of endomycin group, Antibiotiki (1967.01.01)
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점 및 요구를 해결하고자 하는 것으로, 그 목적은 콜레토트리쿰 코코데스가 일으키는 고추 탄저병을 포함한 식물병원성 진균에 대한 항균 활성을 가지는 저독성이고 환경에 해가 없는 친환경적인 살균제를 제조할 수 있는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 저독성이고 친환경적인 항생 물질을 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명은 식물병원성 진균에 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주 (Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus , 수탁번호: KACC91654P)를 제공한다.
본 발명에 있어서 상기 식물병원성 진균은 알터나리아 말리 (Alternaria mali), 아스퍼질러스 오라이제 (Aspergillus oryzae), 보트라이티스 시네리아 (Botrytis cinerea), 설코스포라 카네선스 (Cercospora canescens), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum cocodes), 콜레토트리쿰 그로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides), 콜레토트리쿰 오비큘레어 (Colletotrichum orbiculare), 실린드로카르폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans), 푸자리움 옥시스포룸 f.sp 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 푸자리움 옥시스포룸 f.sp. 라이코펄시사이(Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici), 및 라이족토니아 솔라니 (Rhzoctonia solani) 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주 (Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus , 수탁번호: KACC91654P)의 균체, 포자, 이들의 혼합물 또는 상기 균주의 배양액을 부탄올로 추출하는 단계; 및 상기 부탄올 추출물로부터 니피마이신 (niphimycin, 화학식 1)을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 식물병원성 진균에 항균 활성을 갖는 항생물질 제조방법을 제공한다.
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본 발명은 식물병원성 진균에 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주 (Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus, 수탁번호: KACC91654P)의 균체, 포자, 이들의 혼합물 또는 상기 균주의 배양액을 포함하는 식물병원성 진균 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 니피마이신을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식물병원성 진균 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스의 균체, 포자, 이들의 혼합물 또는 상기 균주의 배양액을 식물체 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병원성 진균의 방제방법을 제공한다.
본 발명은 검체 균주의 포자가 1.4 에서 2 ㎛ 크기로 표면은 매끄럽지 않고 사마귀 모양의 돌기를 가지며(warty) 포자의 배열이 나선형(spiral spore) 체인인지를 확인하는 단계; 및 검체 균주의 16S rDNA와 서열번호 1의 염기서열을 대비 분석하는 단계를 포함하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주 (Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus, 수탁번호: KACC91654P)를 동정하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세하게 설명한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 한국 우포 지역의 토양에서 300여개의 방선균을 분리하여 3% TSA 상에서 6가지 식물병원 진균에 대해 검정한 결과 최소 한가지 이상의 항균 활성을 나타낸 균은 125 개였다. 그 중 항균 활성이 뛰어난 구아니딜-폴리올 항생 물질인 니피마이신을 생산하는 균주 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스를 선발하여 동정하고, 식물병원 진균에 대한 인비트로 상(in vitro)에서의 항균 효과와 고추 탄저병에 대한 방제 효과를 온실조건하에서 생물 검정한 결과 유의적으로 높은 수준의 항균활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다(도 1 및 표 1).
본 발명자들은 계속적인 연구를 통해 16S rDNA(서열번호 1) 분석, 형태적인 특징, 배양학적 특성, 생리 및 생화학적 특성을 기초하여 본 발명에 의한 균주가 길항 방선균 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스라는 것을 동정하였고, 2011년 6월 15일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 수탁번호: KACC91654P)로 기탁하였다 (도 3 ~ 도 5 및 표 2 참조).
본 발명에 의한 균주는 그 포자가 1.4 에서 2 ㎛ 크기로 표면은 매끄럽지 않고 사마귀 모양의 돌기를 가지며(warty) 포자의 배열이 나선형(spiral spore) 체인이다(도 5).
따라서, 본 발명은 검체 균주의 포자가 1.4 에서 2 ㎛ 크기로 표면은 매끄럽지 않고 사마귀 모양의 돌기를 가지며(warty) 포자의 배열이 나선형(spiral spore) 체인인지를 확인하는 단계; 및 검체 균주의 16S rDNA와 서열번호 1의 염기서열을 대비 분석하는 단계를 포함하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주 (Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus, 수탁번호: KACC91654P)를 동정하는 방법을 제공한다. 상기 동정된 균주를 이용하여 식물병원성 진균 방제용 조성물을 제조하거나, 식물병원성 진균의 방제에 이용할 수 있다.
또한, 본 발명자들은 상기 균주 배양액의 부탄올 추출물로부터 항균 활성을 가진 물질을 순화, 정제하여 화학구조를 밝혔으며(도 6 ~ 도 8b), 여러 식물병원 진균에 대한 인비트로 상에서의 항균 효과와 고추 탄저병에 대한 방제 효과를 온실조건하에서 생물 검정하였다(도 9). 그 결과 확인된 항생 물질인 니피마이신이 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스에서 발견된 것은 처음이며, 본 발명자들이 식물병원 진균 특히, 고추 탄저병균, 오이 탄저병균, 토마토 시들음병균 뿐만 아니라 다른 여러 식물병원균에 대해서도 유의적으로 높은 수준의 항균활성을 가지고 있음을 확인하였다. 실험실 상에서 식물 병원균에 대해 넓은 항균 활성을 보인 니피마이신은 넓은 항진균 범위를 지닌 식물병 억제제의 더 많은 개발을 위하여 선도 물질로 전망된다.
또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주 (Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus , 수탁번호: KACC91654P)의 균체, 포자, 이들의 혼합물 또는 상기 균주의 배양액을 부탄올로 추출하는 단계; 및 상기 부탄올 추출물로부터 니피마이신(화학식 1)을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 식물병원성 진균에 항균 활성을 갖는 항생물질 제조방법을 제공한다. 본 발명에 의한 균주를 이용하여 식물병원성 진균에 항균 활성이 우수한 니피마이신(화학식 1)을 분리하여 제조할 수 있다. 니피마이신의 구체적인 분리 및 정제방법은 도 6에 나타나 있다.
상기 제조방법은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주 (Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus, 수탁번호: KACC91654P)를 GSM 배지(glucose starch molasses medium)에서 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 의한 균주는 GSM 배지에서 대량 배양되어 항생 물질 생산량을 높일 수 있다(도 2).
본 발명에 있어서 상기 식물병원성 진균은 알터나리아 말리 (Alternaria mali), 아스퍼질러스 오라이제 (Aspergillus oryzae), 보트라이티스 시네리아 (Botrytis cinerea), 설코스포라 카네선스 (Cercospora canescens), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum cocodes), 콜레토트리쿰 그로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides), 콜레토트리쿰 오비큘레어 (Colletotrichum orbiculare), 실린드로카르폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans), 푸자리움 옥시스포룸 f.sp 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 푸자리움 옥시스포룸 f.sp. 라이코펄시사이(Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici), 라이족토니아 솔라니 (Rhzoctonia solani)로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 병원균임이 바람직하며, 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum cocodes)가 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주 (Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus , 수탁번호: KACC91654P)의 균체, 포자, 이들의 혼합물 또는 상기 균주의 배양액을 포함하는 식물병원성 진균 방제용 조성물을 제공한다. 본 발명에 의한 조성물에 의하면 비교적 안전하고 지속적으로 생물적 방제를 할 수 있다.
본 발명에 의한 식물병원성 진균 방제용 조성물은 본 발명에 의한 균주를 유효량 함유하고 농화학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명에 의한 조성물은 당업계에 공지된 방식의 미생물 농약 제제화 방식에 따라, 예컨대 배양된 균체의 배양액, 동결건조 균체와 전분, 조단백질 및 암석분 등을 포함하도록 분말, 펠렛 또는 과립, 마이크로캡슐 등으로 제형화하여 그대로 사용할 수 있다. 상기 조성물은 표면 활성화제, 비활성 담체, 보존제, 습윤제, 공급 촉진제, 유인제, 캡슐화제, 결합제, 유화제,염료, U.V. 보호제, 완충제 등 목적 병원균 및 작물에 따라 적용하기 용이한 다른 성분을 부가함으로 수득할 수 있다. 본 발명의 조성물은 적용하기 전에 적당한 양의 물 또는 다른 희석제로 희석을 하여 직접 적용하기에 적합한 형태 또는 농축액 또는 1차 조성물일 수 있다. 항진균성 농도는 특히 농축 또는 직접 사용하거나 하는 것은 특정 제제의 성질, 적용 식물의 종류, 재배지역의 토양 및 기후 등에 따라 다양할 수 있음은 당업계에 명백히 이해될 것이다.
본 발명은 상기 제조된 니피마이신을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식물병원성 진균 방제용 조성물을 제공한다. 바람직하게 상기 식물병원성 진균은 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum cocodes)이고 이에 의한 고추 탄저병 방제용 조성물을 제공한다. 본 발명에 의한 조성물에서 상기 니피마이신은 1 ~ 500 ㎍ mL-1을 함유하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 니피마이신의 함유량이 1 ㎍ mL-1 미만이면 방제효과가 낮으며, 500 ㎍ mL-1를 초과하는 경우 부작용이 있을 수 있으며 살균제 조성물의 생산단가가 높아진다.
또한, 본 발명에 의한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주 (Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus , 수탁번호: KACC91654P)의 균체, 포자, 이들의 혼합물 또는 상기 균주의 배양 추출물을 식물체 또는 토양에 처리하여 식물병원성 진균을 친환경적으로 방제할 수 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주 (Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus, 수탁번호: KACC91654P)는 광범위한 항균력을 지닌 방선균으로, 상기 균주를 이용하여 방선균 유래의 천연물질인 항균 물질 니피마이신을 제조할 수 있어 상용 살균제인 클로로탈로닐 수준의 방제효과를 가지고 있으면서도 자연환경에서의 미생물에 의한 생분해성이 큰 환경친화적 살균제 조성물을 제공하는 효과가 있고, 콜레토트리쿰 코코데스가 일으키는 고추에 탄저병 방제 등에 효과가 있어 식물병 방제산업상 유용한 발명인 것이다.
도 1은 6종류의 식물병원성 진균에 대한 본 발명에 의한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주의 항균 활성을 나타내는 도면이다. A: 모잘록병균, B: 토마토 시들음병균, C: 고추 역병균, D: 오이 탄저병균, E: 벼도열병균, F: 잿빛 곰팡이병균
도 2는 본 발명에 의한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주의 배지별 조추출물의 토마토 시들음병균에 대한 저지원 크기를 나타내는 그래프이다. tryptic soy broth (TSB), glucose starch molasses medium (GSM), glucose starch soybean mealmedium (GSS), medium, starch calcium chloride MOPs medium (SCM) and production medium (PM)
도 3은 본 발명에 의한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주의 16S rDNA 염기서열을 보여주는 도면이다.
도 4는 본 발명에 의한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주의 계통도이다.
도 5는 본 발명에 의한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주의 주사 전자현미경 사진이다.
도 6은 본 발명에 의한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주의 부탄올 추출액에서 니피마이신을 정제하는 과정을 보인 블록도이다.
도 7은 본 발명에 의한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주로부터 분리, 정제된 니피마이신의 분자량을 나타낸 그래프이다.
도 8a 및 도 8b는 본 발명에 의한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주로부터 분리, 정제된 니피마이신 구조분석 결과를 보여주는 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9는 온실조건의 폿트 실험에서 본 발명에 의한 항균 물질인 니피마이신(N-1)의 고추 탄저병에 대한 방제효과를 상용살균제인 클로로탈로닐(chlorothalonil)과 비교 실험한 결과를 도시한 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다.　 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
　<실시예 1> 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주의 분리
길항 방선균을 선발하기 위하여 우포 지역의 표토로부터 5-20 cm 깊이의 토양을 채취하여 토양 시료 10 g을 100 mL의 멸균수에 혼합하고 회전 진탕기(170 rpm)에서 3시간 동안 진탕하여 토양 현탁액을 제조하였다. 상기 현탁액을 와트만 제 1 여과지(Whatman No. 1 filter paper)를 통과시켜 여과하고, 멸균수로 1:10 (v:v) 비율로 10-5까지 희석하였다.
각각의 희석액 100 μＬ를 휴믹 애시드 비타민 한천배지(humic acid vitamin agar medium: 1.0g humic acid, 0.5g Na2HPO4 , 1.71g KCl, 0.05g MgSO4·7H2O, 0.01g FeSO4·7H2O, 0.02g CaCO3, 0.5mg thiamine-HCl, 0.5mg riboflavin, 0.5mg niacin, 0.5mg pyridoxin-HCl, 0.5mg inositol, 0.5mg Ca-pantothenate, 0.5mg p-aminobenzoic acid, 0.25mg biotin, 50mg cycloheximide, 18g agar, 1 L H2O, adjusted to pH 7.2; vitamins and cycloheximide were filter-sterilized)에 접종하고, 접종된 휴믹 애시드 비타민 한천배지를 28℃ 배양기에서 14일간 균총(colony)이 발생될 때 까지 배양시켰다. 상술한 바와 같이하여 발생한 균총들 가운데 방선균으로 보이는 균총, 즉 일반 세균과는 달리 기질균사를 형성하며 한천 배지상에서 딱딱한 균총을 형성한 균총을 선택하여 모잘록병균, 토마토 시들음병균, 고추 역병균, 오이 탄저병균, 벼도열병균, 잿빛 곰팡이병균에 대한 항균 활성을 시험하였다.
이를 위하여 선발된 방선균류를 3% TSA (tryptic soybean agar)의 중앙에 도말하고 (streaking)하고 28℃에서 2일간 배양한 후, 그 배지 중앙으로부터 30mm 떨어진 곳에 증식중인 모잘록병균, 토마토 시들음병균, 고추 역병균, 오이 탄저병균, 벼도열병균, 잿빛 곰팡이병균 등 식물병원 진균의 배양체로부터 떼어낸 균사절편 (mycelia disk, 직경 5mm)을 놓고 다시 7일간 배양한 뒤 저지원을 측정하였다.
그 결과 6개의 모든 식물병원성 진균의 균사 생장을 강하게 저해하는 것으로 나타났다 (도 1).
한편, 상기 선발된 길항 방선균의 보관방법은 다음과 같다. 일일 사용을 위해서는 3% TSA 배지에 접종하여 사용하였고, 장기보관을 위해서 3% TSB에서 2일간 순수 배양하여 40% 글리세롤과 혼합하고 -80℃에서 보관하였다.
　<실시예 2> 길항 방선균이 생성하는 항생 물질의 항균 활성 검정과 항생 물질 생산을 위한 최적 배지 결정
선발된 길항 방선균이 생성하는 항생 물질의 항균 활성과 항생 물질 생산을 위한 최적 배지를 미리 검정하기 위하여 다음과 같은 방법으로 항생 물질 조추출물을 추출하여 제조하였다.
이와 같이 조추출물을 추출하는 것은 미생물이 생성하는 항생물질의 완전 순화에는 시간과 비용이 많이 투자되므로 검정 초기 단계에서 항생물질 생산을 위한 최적배지를 결정하고, 과연 이 균주가 생성하는 물질이 실제로 식물상에서 병방제 효과가 있는지를 검정하기 위한 것이다. 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스가 생성하는 이차 대사산물을 회수하기 위해서는 부탄올을 사용한 유기용매 추출법을 사용하였다.
상기 길항 방선균은 진탕 플라스크 배양으로 3% tryptic soy broth (BactoTM), production medium (PM : 30 g glucose, 30 g soybean meal, 5 g pharmamedia, 1 g yeast extract, 3 g CaCO3, in 1 L distilled water, pH to 8.0), glucose starch molasses medium (GSM : 10 g soluble starch, 20 g glucose, 5 mL molasses, 5 g yeast extract, 5 g peptone, 2 g CaCO3 in 1 L distilled water, pH to 7.0), glucose starch soybean meal medium (GSS : 10 g starch, 20 g glucose, 25 g soybean meal, 4 g yeast extract, 1 g beef extract, 2 g NaCl, 0.5 g KH2PO4 in 1 L distilled water, pH to 7.0)과 starch calcium chloride MOPS medium (SCM : 15 g soluble starch, 20 g soytone(Difco), 0.1 g CaCl2, 1.5 g yeast extract, 10.5 g MOPS in 1 L distilled water, pH to 7.2)에서 발효시켜, 28℃에서 5일간 배양한 후, 상기 배양액들을 10,000g로 원심분리(cetrifuse)하여 배양 여액을 가라앉은 세포로부터 분리하여 부탄올을 사용하여 추출하였다. 또한, 상기 유기용매 층은 37℃ 감압 증류기에서 농축한 후, 남아있는 잔류물을 최소량의 메탄올에 용해시켜 4℃에서 보관하였다.
이렇게 제조된 길항 방선균의 항생 물질 조추출물들을 가지고 다음과 같은 방법으로 생물학적 검정(bioassay)을 실시하였다. 항생 물질 조추출물들의 생물학적 검정은 토마토 시들음병균이 접종된 PDA(prtato dextrose agar: 24 g potato destrose, 0.7% agar and distilled water 1 L) 배지에서 페이퍼디스크법(paperdisk method)을 이용하여 수행한 것으로, 이를 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
토마토 시들음병균의 경우 100 mL PDA (agar 0.7%) 배지에 토마토 시들음병균의 분생포자 현탁액 (108 conidia mL-1)을 각각 혼합하여 생물검정 평판 배지를 만들었다. 그리고 상기 항생 물질 조추출물들을 적신 멸균여과지 (filter paper disk, 8mm)을 상온에서 1시간 건조하여 대상 병원진균이 접종된 배지(seeded media)에 올려놓고, 그 평판을 28℃ 배양기에서 24시간 배양한 결과 생성된 저지원의 지름으로 저지원 크기를 평가하였다(도 2).
　<실시예 3> 16S rDNA 분석과 생리 및 생화학적 특성을 기초로 한 길항 방선균 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp . 인하이그루스 균주의 동정
PCR 프라이머 fwd_seq: agagtttgatcctggctcag(서열번호 2)와 rev_seq: acggctaccttgttacgactt(서열번호 3)를 이용한 상기 길항 방선균 균주의 16S rDNA 분석을 기초로 하여, 본 발명에 의한 방선균 균주의 16S rDNA 염기서열 (서열번호 1, GeneBank accession number: HQ441251)은 Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus 균주 NBRC13978의 염기서열과 99.6% 일치하였다. (GeneBank accession number: AB184558) (도 3 및 4).
상기 선발된 본 발명의 방선균 균주는 기질 균사를 배지상에서 생성하는 방선균의 특징을 갖고 있으며, 상기 방선균 균주의 동정(identification)을 위한 생리 및 생화학적 그리고 형태학적 시험은 모두 버지스 매뉴얼 시스테메틱 박테리올로지 (bergey`s manual of systematic bacteriology)에서 서술한 방법에 따라 시행하였다.
본 발명의 길항 방선균 균주의 배양학적 특성을 6가지 ISP 배지에서 알아보았다. 상기 길항 방선균 균주는 ISP6 배지를 제외한 모든 배지에서 생장이 좋았으며 ISP4를 제외한 모든 배지상에서 기중 균사의 색이 흰색을 보였으며 ISP4배지에서 기중 균사의 색이 시간이 지날수록 흰색에서 회색으로 변하였다. 기저 균사의 색은 ISP1, ISP2 그리고 ISP6 배지에서는 노란색, ISP3와 ISP5 배지에서는 노르스름한 흰색, ISP4 배지에서는 회색이 도는 흰색을 보였다. 그러나 배양 10일 후 모든 배지에서 색소를 분비하지 않았다. 표 1에 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주의 배양학적 특성을 나타내었다.
　 Cultural characteristic
Media Aerial
mycelium		 Substrate
mycelium		 Soluble
pigment		 Growth
ISP1
(trypton-yeast extract agar)		 White Yellow None Moderate
ISP2
(yeast-malt extract agar)		 White Yellow None Good
ISP3
(oatmeal agar)		 White Yellowish white None Good
ISP4
(inorganic salts starch agar)		 Gray and white Grayish white None Good
ISP5
(glycerol asparagine agar)		 White Yellowish white None Good
ISP6
(peptone-yeast extract agar)		 None Yellow None Bad
본 발명에 의한 방선균 균주의 균사 모양을 주사 전자 현미경을 통해 확인하였다 (도 5). 본 발명에 의한 방선균 균주의 포자는 1.4 에서 2 ㎛ 크기로 포자의 배열은 나선형(spiral spore) 체인이며, 표면은 매끄럽지 않고 사마귀 모양의 돌기를 갖는다(warty).
방선균의 세포벽 구성성분의 하나인 디아미노 피메릭 엑시드 (DAP) 이성질체 확인을 위해, 본 발명에 의한 방선균 균주의의 세포벽 구성성분을 분석한 결과, LL-form의 DAP를 가지고 있는 것으로 확인되었다.
이상의 결과와 전자현미경하에서의 형태적인 특성, 및 배양학적 특성을 종합하여, 본 발명에 의한 길항 방선균 균주를 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 (Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus) 균주로 동정하였다.
　<실시예 4> 항생 물질 니피마이신의 분리 및 정제
본 발명자들은 한국 우포지역에서 수집한 토양시료로부터 약 90여 개의 미생물을 분리하여 3% TSA 배지에서 병방제 효과를 검정한 결과 토마토 시들음병균에 대하여 항균효과가 뛰어난 방선균 균주를 선발하여 항균 활성 물질 니피마이신(niphimycin)을 분리, 정제하고, 그 구조를 결정하였다.
방선균 균주 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 (Stretomyces hygroscopicus subsp. enhygrus)를 28℃에서 5일간 GSM (glucose starch molasses medium: 10 g soluble starch, 20 g glucose, 5 mL molasses, 5 g yeast extract, 5 g peptone, 2 g calcium carbonate, in 1 L distilled water, pH to 7.0)에서 배양한 후 원심 분리하여 방선균 균체와 분리한 배양 여액을 부탄올을 이용하여 추출하였다.
분리한 추출액은 감압 농축한 후 Diaion? HP-20 크로마토그래피를 행하였다. 각 분획은 물과 메탄올을 일정비율로 섞어 전개 시켰으며, 그 중 활성 분획을 모아 C18 크로마토그래피를 실시하였다. 각 분획은 물과 메탄올을 일정비율로 섞어 전개시켰으며, 그 중 활성 분획을 모아 동결 건조기를 사용하여 건조시킨 후 메탄올로 녹인 후 유속 2 mL min-1, UV 검출기 230nm, 용매 0.1% 포믹엑시드를 포함한 20-72.5% 메탄올을 이용하는 분취 조건으로, C18 역상 column을 이용한 HPLC 시스템을 통해 항균 물질 니피마이신을 분리 정제하였다 (도 6).
분리된 활성물질의 분자량 및 스펙트럼 분석을 하였다(도 7 ~ 도 8b). 상기 분석을 통해 본 발명에 분리된 물질은 니피마이신임을 확인하였다.
　<실시예 5> 항균 물질 니피마이신의 여러 가지 식물병원성 진균에 대한 억제시험
알터나리아 브라시콜라 (Alternaria brassicicola), 알터나리아 말리 (Alternaria mali), 아스퍼질러스 오라이제 (Aspergillus oryzae), 보트라이티스 시네리아 (Botrytis cinerea), 설코스포라 카네선스 (Cercospora canescens), 콜레토트리쿰 코코데스 (Colletotrichum cocodes), 콜레토트리쿰 그로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides), 콜레토트리쿰 오비큘레어 (Colletotrichum orbiculare), 실린드로카르폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans), 디아포르테 시트리 (Diaporthe citri), 푸자리움 옥시스포룸 f.sp 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 푸자리움 옥시스포룸 f.sp. 라이코펄시사이 (Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici), 스크렐로티니아 스크렐로티오름 (Sclerotinia sclerotiorum), 라이족토니아 솔라니 (Rhzoctonia solani) 등의 식물병원 진균들을 2.4% PDA (potato dextrose agar) 배지에서 배양했다.
상기 실시예 4에서 분리 및 정제한 니피마이신을 마이크로 웰 플레이트(micro-well plate)에 4 X PDA 및 멸균수와 섞어 일련의 농도 (1 ~ 100 ㎍ mL-1) 로 담은 후, 각각의 분생 포자 및 세균 현탁액을 4 X 106개 mL-1의 농도로 맞추어서 각각의 웰 (well)에 넣었다. 접종된 마이크로 웰 플레이트는 28℃에서 1일 내지 3일간 배양한 후, 곰팡이 생장이 일어나지 않는 농도 중 가장 낮은 농도를 최소억제농도 (minimum inhibitory concentration; MIC)로 평가하였으며, 그 결과는 하기 표 2 여러 식물병원성 진균에 대한 니피마이신의 최소억제 농도 (MIC)로 나타냈다. 상기 니피마이신은 알터나리아 브라시콜라 (Alternaria brassicola), 디아포르테 시트리 (Diaporthe citri), 스크렐로티니아 스크렐로티오름 (Sclerotinia sclerotiorum)을 제외한 대부분의 식물병원 진균에 대해 높은 수준의 항균활성을 보여주는 것을 확인하였다.
식물병원 미생물 최소억제농도 (μg mL-1)
Alternaria brassicicola >100
Alternaria mali 10
Aspergillus oryzae 10
Botrytis cinerea 10
Cercospora canescens 50
Colletotrichum cocodes 10
Colletotrichum gloeosporioides 10
Colletotrichum orbiculare 50
Cylindrocarpon destructans 10
Diaporthe citri >100
Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum 10
Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici 10
Rhizoctonia solani 10
<실시예 6> 온실조건의 고추 유묘에서 니피마이신과 고추 탄저병 방제용 살균제인 클로로탈로닐의 방제효과 비교
온실조건하에서 고추 유묘에서의 고추 탄저병에 대한 니피마이신 그리고 농용살균제인 클로로탈로닐 방제효과를 비교하기 위하여, 니피마이신과 클로로탈로닐을 농도별로 처리한 후 고추 탄저병균을 접종하여 각 처리구와 약제 처리를 하지 않은 무처리구에서의 병피해도를 평가하였다. 병피해도는 고추의 잎의 반점 정도를 평가하여 비교하였다.
보다 구체적으로 살펴보면, 고추 식물에서 고추 탄저병균의 감염에 대한 본 발명에 의한 길항 방선균 균주 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 (Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus)가 생성하는 항진균 활성물질인 니피마이신의 병발생 억제 효과는 다음과 같이 평가하였다.
먼저, 고추 탄저병에 이병성 품종인 고추 종자 (품종: 녹광)를 고압 증기 멸균한 혼합토양 (peat moss, perlite, and vermiculite, 5:3:2. v/v/v)이 담긴 36-플라스틱 폿트에 파종하였다. 6엽기까지 자란 유묘(seedling)를 니피마이신 각각의 농도별로 고추 식물 잎에 처리 한 후 하루 뒤에 고추 탄저병균의 분생포자 현탁액을 니피마이신을 처리한 잎에 똑같이 접종하여 36시간의 습실 처리를 하였다. 병피해도 (disease severity)는 고추 탄저병균을 접종한 후 10일 후에 니피마이신을 처리한 고추 유묘에서 나타난 병징을 보고 반점의 면적을 평가하여 3반복 실험을 실시하였다.
실험 결과, 고추 탄저병균 접종 후 5일 째 약제를 처리하지 않은 고추 식물과 대조약제인 클로로탈로닐과 니피마이신 1 ㎍ mL- 1 를 처리한 식물의 잎에 반점이 생성된 것을 볼 수 있었으며, 다른 농도로 처리한 고추 식물에서는 어떤 병징도 관찰되지 않았다. 접종 후 10일 후에 약제를 처리하지 않은 식물에서 대부분 많은 반점 생성과 함께 황화현상을 보였고, 클로로탈로닐과 니피마이신을 1 - 10 ㎍ mL-1 처리한 고추 식물에서 약간의 반점 발생만 관찰되었을 뿐 다른 농도에서는 뚜렷한 병징이 관찰되지 않았다 (도 9 참조).
이상과 같은 시험결과를 볼 때, 본 발명에 사용되는 니피마이신은 상용 살균제인 클로로탈로닐과 비교하여 고추 탄저병 방제효과의 면에서 차이를 보이지 않았다. 따라서 니피마이신은 고추 탄저병 방제용 약제로서 탁월한 효과를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.　
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.　 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
농업생명공학연구원 KACC91654P 20110615
<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus strain effective against plant pathogenic fungi and method for preparing antibiotics using the same <130> P11-110609-01 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1380 <212> DNA <213> Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus <400> 1 acgaacgctg gcggcgtgct taacacatgc aagtcgaacg atgaaccggt ttcggccggg 60 gattagtggc gaacgggtga gtaacacgtg ggcaatctgc cctgcactct gggacaagcc 120 ctggaaacgg ggtctaatac cggatatgac acgctcccgc atgggatgcg tgtggaaagc 180 tccggcggtg caggatgagc ccgcggccta tcagcttgtt ggtggggtga tggcctacca 240 aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg cgaccggcca cactgggact gagacacggc 300 ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgaaa gcctgatgca 360 gcgacgccgc gtgagggatg acggccttcg ggttgtaaac ctctttcagc agggaagaag 420 cgagagtgac ggtacctgca gaagaagcgc cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 480 tacgtagggc gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agagctcgta ggcggcttgt 540 cgcgtcggat gtgaaagccc ggggcttaac cccgggtctg cattcgatac gggcaggcta 600 gagttcggta ggggagatcg gaattcctgg tgtagcggtg aaatgcgcag atatcaggag 660 gaacaccggt ggcgaaggcg gatctctggg ccgatactga cgctgaggag cgaaagcgtg 720 gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgttggg aactaggtgt 780 gggcgacatt ccacgtcgtc cgcgccgcag ctaacgcatt aagttccccg cctggggagt 840 acggccgcaa ggctaaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gcggagcatg 900 tggcttaatt cgacgcaacg cgaagaacct taccaaggct tgacatacac cggaaacctc 960 tggagacagg ggcccccttg tggtcggtgt acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt 1020 gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgttctgt gttgccagca 1080 tgcctttcgg ggtgatgggg actcacagga gactgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg 1140 ggacgacgtc aagtcatcat gccccttatg tcttgggctg cacacgtgct acaatggccg 1200 gtacaatgag ctgcgaagcc gtgaggtgga gcgaatctca aaaagccggt ctcagttcgg 1260 attggggtct gcaactcgac cccatgaagt cggagtcgct agtaatcgca gatcagcatt 1320 gctgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacgtcac gaaagtcggt 1380 1380 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 acggctacct tgttacgact t 21

Claims (7)

  1. 식물병원성 진균에 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주(Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus , 수탁번호: KACC91654P).
  2. 제1항에 있어서, 상기 식물병원성 진균은 알터나리아 말리 (Alternaria mali), 아스퍼질러스 오라이제 (Aspergillus oryzae), 보트라이티스 시네리아 (Botrytis cinerea), 설코스포라 카네선스 (Cercospora canescens), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum cocodes), 콜레토트리쿰 그로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides), 콜레토트리쿰 오비큘레어 (Colletotrichum orbiculare), 실린드로카르폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans), 푸자리움 옥시스포룸 f.sp 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 푸자리움 옥시스포룸 f.sp. 라이코펄시사이(Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici), 및 라이족토니아 솔라니 (Rhzoctonia solani) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주.
  3. 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주 (Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus , 수탁번호: KACC91654P)의 균체, 포자, 이들의 혼합물 또는 상기 균주의 배양액을 부탄올로 추출하는 단계; 및
    상기 부탄올 추출물로부터 니피마이신을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 식물병원성 진균에 항균 활성을 갖는 항생물질 제조방법.
  4. 식물병원성 진균에 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주(Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus , 수탁번호: KACC91654P)의 균체, 포자, 이들의 혼합물 또는 상기 균주의 배양액을 포함하는 식물병원성 진균 방제용 조성물.
  5. 니피마이신을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식물병원성 진균 방제용 조성물.
  6. 식물병원성 진균에 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주(Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus , 수탁번호: KACC91654P)의 균체, 포자, 이들의 혼합물 또는 상기 균주의 배양액을 식물체 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병원성 진균의 방제방법.
  7. 검체 균주의 포자가 1.4에서 2 ㎛ 크기로 표면은 매끄럽지 않고 사마귀 모양의 돌기를 가지며(warty) 포자의 배열이 나선형(spiral spore) 체인인지를 확인하는 단계; 및
    검체 균주의 16S rDNA와 서열번호 1의 염기서열을 대비 분석하는 단계를 포함하는 하이그로스코피쿠스 subsp. 인하이그루스 균주(Streptomyces hygroscopicus subsp. enhygrus , 수탁번호: KACC91654P)를 동정하는 방법.
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