CN102417886A

CN102417886A - 一种刀孢蜡蚧菌菌株

Info

Publication number: CN102417886A
Application number: CN2011103817044A
Authority: CN
Inventors: 武侠; 刘爱华; 曹君正; 王凤龙
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2011-11-18
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2012-04-18
Anticipated expiration: 2031-11-18
Also published as: CN102417886B

Abstract

本发明公开一种刀孢蜡蚧菌菌株Lecanicillium psalliotae，保藏编号为：CGMCC NO：5329。该菌株能够定殖根结线虫不同生活阶段的卵、2龄幼虫和雌虫。应用N-乙酰葡萄糖胺法和对硝基苯法分别测定该菌株产生的几丁质降解酶系和外切酶活性，其酶活可达3.98U/h·mL和0.38U/h·mL，产生的几丁质酶在不同温度(27℃～75℃)及不同pH(3.0～7.0)均能检测到较高活性；离体条件下测定该菌产生的几丁质酶粗液对根结线虫卵孵化的影响，酶液对卵的相对孵化抑制率和破坏率分别为94.52％和84.32％。本发明的刀孢蜡蚧菌菌株应用于农作物根结线虫病害的生物防治，为我国北方保护地瓜、果类、蔬菜，特别是严重为害的根结线虫病害的控制提供了有效的途径，具有显著的生态效益、经济价值和社会价值。

Description

一种刀孢蜡蚧菌菌株

技术领域

本发明涉及农作物病害的生物防治，具体说是一株高效产生几丁质酶且对根结线虫具有寄生作用的刀孢蜡蚧菌，属于微生物及微生物应用领域。

背景技术

根结线虫病是世界范围内发生的一种重要的植物寄生线虫病害(Kery B R.An assessmentof progress toward microbial control of plant parasitic nematode.Journal of Nematology，1990，22(4S)：621-631.Stirling G R.Biological control of plant parasitic nematodes：progress，problemsand prospects.Wallingford：CABI，1991：106-108.)。近年来，我国由于根结线虫的为害给农业生产造成了严重损失，特别是北方保护地种植的茄科和葫芦科蔬菜(沈镝，李锡香，冯兰香，王海平，宋江萍，杨翠荣，龚会芝.葫芦科蔬菜种质资源对南方根结线虫的抗性评价.植物遗传资源学报，2007，8(3)：340-342.)。根结线虫寄主范围广，目前尚缺少抗根结线虫的商品化作物品种而且与非寄主植物轮作的措施在保护地难以施(Esmenjaud D，Voisin R，Van G C，Bosselut N，Lafargue B，Di Vito M，Dirlewanger E，Poёssel J L，Kleinhentz M.Geneticdissection of resistance to root-knot nomatodes Meloidogyne spp.in plum，peach，almond andapricot from various segregating interspecific Prunus progenies.Tree Genetics and Genomes，2009，5：279-289.Dube B，Smart G C.Biological control of Meloidogyne incognita byPaecilomyces lilacinus and Pasteuria Penetrans.Journal of Nematology，1987，19(2)：222-227.)。采用传统熏蒸性或非熏蒸性的化学杀线剂防治根结线虫病，由于土壤残留和环境破坏等原因，已经或即将被禁用，迄今为止生产上尚无安全有效防治根结线虫病害措施。寻找和探索根结线虫可持续治理措施的有效途径，解决目前根结线虫控制问题，除加强抗线育种和抗线砧木的研究和利用外，土壤微生态调控和生物防治微生物的释放是国内外研究和应用的热点。生物防治是根结线虫可持续治理的核心内容之一(Kery B R.An assessment of progress towardmicrobial control of plant parasitic nematode.Journal of Nematology，1990，22(4S)：621-631.Stirling G R.Biological control of plant parasitic nematodes：progress，problems andprospects.Wallingford：CABI，1991：106-108.Atkins S D，Hidalgo-Diaz L，Kalisz H，MauchlineT H，Hirsch P R，Kerry B R.Development of a new management strategy for the control ofroot-knot nematodes(Meloidogyne spp)in organic vegetable production.Pest Management Science，2003，59：183-189.)。

刀孢蜡蚧菌Lecanicillium psalliotae(syn.Verticillium psalliotae)对根结或胞囊类线虫的生物防治具有重要的应用潜力。Gams & Zare根据形态学特征及ITS序列比较分析，将刀孢蜡蚧菌从轮枝菌属中分离出来，定名为刀孢蜡蚧菌(Zare R，Gams W.Arevision of Verticilliumsection Prostrata.IV.The genera Lecanicillium and Simplicium gen.nov.Nova Hedwigia，2001，73(1)：1-50.)。该菌寄主范围很广，既能寄生根结线虫卵(Zare R，Gams W.A revision ofVerticillium section Prostrata.IV.The genera Lecanicillium and Simplicium gen.nov.NovaHedwigia，2001，73(1)：1-50.Nicole M V，George S A.Fungi Parasitic on Juveniles and EggMasses of Meloidogyne hapla in Organic Soils from New York.Supplement to the Journal ofNematology，1998，30(4S)：632-638.甘中伟，杨金奎，陶南，黄静文，张克勤.刀孢轮枝菌胞外几丁质酶的基因克隆及系统发育分析.菌物学报，2008，27(3)：368-376.)、胞囊类线虫(Zare R，Gams W.A revision of Verticillium section Prostrata.IV.The genera Lecanicilliumand Simplicium gen.nov.Nova Hedwigia，2001，73(1)：1-50.)和腐生线虫(Yang J K，HuangX W，Tian B Y，Wang M，Niu Q H，Zhang K Q.Isolation and characterization ofa serine proteasefrom the nematophagous fungus，Lecanicillium psalliotae，displaying nematicidalactivity.Biotechnology Letters，2005，27：1123-1128.)，也能寄生大豆锈病等多种病原真菌(Saksirira W，Hoppe H.Secretion of Extracellular Enzymes by Verticillium psalliotae Treschowand Verticillium lecanii(Zimm.)Viegas During Growth on Uredospores of the Soybean RustFungus(Phakopsora pachyrhizi Syd.)in Liquid Cultures.Journal of Phytopathology，1991，131(1)：161-173.Toshinori N，Kengo N，Kenji K，Tadao A.Antifungal Activity of Oosporein from anAntagonistic Fungus against Phytohthora infestans.Verlag der Zeitschrift für Naturforschung，2004，59c：302-304.Liao Y M，Xiong Y，Luo D P，Wang Z W，Yuan G Q，Zhou C M.AHyperparasitism of Puccinia sp.And Identification of the Mycoparasite.Chinese Journal ofBiological Control，2008，24：85-89.)和商品蘑菇(Treschow C.The Verticillium diseases ofcultivated mushrooms.Dansk Botany Arkiv，1941，11：1-31.)，以及多种农业害虫(Tove S，Richard A H.Entomopathogenic Potential of Verticillium and Acremonium Species(Deuteromycotina：Hyphomycetes).Journal of Invertebrate Pathology，1999，73：309-314.Kurihara Y，Kurihara Y，Machida R，Fukui M，Okuda T，Harayama S.Entomopathogenicfungi isolated from laboratory-reared Baculentulus densus(Acerentomidae，Protura).Edaphologia，2006，80P：25-28.

P，Irena N，D V，Vincas B.Pine defoliator Bupalus piniariaL.(Lepidoptera：Geometridae)and its entomopathogenic fungi[J].EKOLOGIJA，2010，56(1-2)：34-40.Kurihara Y，Sukarno N，Ilyas M，Yuniarti E，Mangunwardoyo W，Saraswati R，Park JY，Inaba S，Widyastuti Y，Ando K.Entomopathogenic fungi isolated fromsuspended-soil-inhabiting arthropods in East Kalimantan，Indonesia.Mycoscience，2008，49：241-249.)。刀孢蜡蚧菌能够产生一种丝氨酸蛋白酶Ver112和几丁质酶LPCHI1对于线虫体壁和卵壳具有明显的消解作用，这两种酶在根结线虫的生物防治过程中发挥重要作用(甘中伟，杨金奎，陶南，黄静文，张克勤.刀孢轮枝菌胞外几丁质酶的基因克隆及系统发育分析.菌物学报，2008，27(3)：368-376.Yang J K，Huang X W，Tian B Y，Wang M，Niu Q H，ZhangK Q.Isolation and characterization of a serine protease from the nematophagous fungus，Lecanicillium psalliotae，displaying nematicidal activity.Biotechnology Letters，2005，27：1123-1128.Gan Z W，Yang J K，Tao N，Liang L M，Mi Q L，Li J，Zhang K Q.Cloning of thegene Lecanicillium psalliotae chitinase Lpchi 1and identification of its potential role in thebiocontrol of root-knot nematode Meloidogyne incognita.Appl Microbiol Biotechnol，2007，76：1309-1317.)。研究表明刀孢蜡蚧菌在PDA或WA上生长3d后能产生粉红或紫红色素。这种色素被认为是一种微毒物质，命名为卵孢霉素。这种毒素可能对线虫也有一定的毒害作用(Zare R，Gams W.A revision of Verticillium section Prostrata.IV.The genera Lecanicillium andSimplicium gen.nov.Nova Hedwigia，2001，73(1)：1-50.)。

刀孢蜡蚧菌不仅能寄生根结线虫生活史中定居态的雌虫和卵，还能寄生侵染态2龄幼虫。该菌对根结线虫具有高效生物防治效能，其产生的几丁质酶和蛋白酶酶系是防治根结线病的关键因素。

发明内容

本发明的目的在于提供一种刀孢蜡蚧菌菌株，该菌株对根结线虫具有高效生物防治功能。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种刀孢蜡蚧菌菌株，分类命名：Lecanicillium psalliotae，于2011年10月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC NO：5329。

本发明的基本技术方案为：从采自青岛市城阳区感染根结线虫病害的丝瓜根分离出虫卵，置培养皿上培养，待长出菌丝后，经菌落形状形态学观察及分子生物学鉴定、ITS序列比对、系统发育分析，确定该菌为刀孢蜡蚧菌。

通过大量的生物学实验证明，本发明的刀孢蜡蚧菌不仅能寄生根结线虫生活史中定居态的雌虫和卵，还能寄生侵染态2龄幼虫，且能产生几丁质酶，对根结线虫控制效果达85％以上，具体包括下列步骤：

1、刀孢蜡蚧菌菌株的分离：

将采自青岛市城阳区感染根结线虫病害的丝瓜根用水冲洗去泥沙，在Nikon SMZ1000解剖镜下挑取新鲜的卵块，在2％NaClO震荡解离，在500目筛子上收集卵，再经2％NaClO表面消毒后，将卵悬液涂于备好的WA培养基上，每皿含卵约50个。然后将培养皿置于27℃的恒温培养箱内培养，定期观察，将长出的菌丝挑至PDA培养基上，菌丝长满后-4℃保存待以后观察鉴定；

2、菌株的菌落性状培养和形态学鉴定：

(1)菌落性状培养：将保存于4℃冰箱中的菌株移入直径9cm的PDA平板上，27℃活化5d，用直径6mm的打孔器在菌落边缘切去菌块，转接到新的PDA平板上，27℃暗箱培养，3次重复。从第2d开始记录菌落形态、颜色和菌落生长情况，直至菌落长满平板。

(2)形态学鉴定：采用玻片培养法，PDA培养基分成5mm×5mm的薄薄的小片，挑于载玻片上，再将已活化的该菌菌丝挑于培养基上。置于27℃恒温培养箱保湿培养，在Nikon 80i显微镜系统连续观察该菌的分生孢子、瓶梗、晶体等的形成情况，测量并照相；

3、菌株的分子生物学鉴定、rDNA-ITS序列比对、系统发育分析；

4、刀孢蜡蚧菌菌株对根结线虫不同生活阶段的定殖：挑取PDA平板上27℃、6d的该菌菌落边缘直径6mm菌块，置于WA培养基上，将卵、卵块、2龄幼虫、雌虫接于该菌上，3d-7d观察其寄生情况；

5、刀孢蜡蚧菌菌株产生的几丁质酶活性测定：应用N-乙酰葡萄糖胺(NAG)法和对硝基苯(pNP)法分别测定该菌株产生的几丁质降解酶系和外切酶活性；

6、刀孢蜡蚧菌菌株的几丁质酶粗提液离体条件下对根结线虫卵的影响：刀孢蜡蚧菌产生的几丁质酶粗提液对南方根结线虫卵孵化具有抑制和破坏作用，根结线虫卵在几丁质酶粗提液(菌培养滤液)25％、50％、75％、100％浓度下28℃孵化观察。

本发明的刀孢蜡蚧菌菌株在PDA培养基培养10d直径为56～61mm，正面观白色棉状，菌落背面红色或紫红色，3～5d产生红色或粉红色色素，色素常常扩散到琼脂内；瓶梗细胞着生于菌丝形成的葡匐分生孢子梗上，单生或3～4根轮生，大小为13.70～32.03(23.24±3.75)μm×1.16～2.40(1.76±0.21)μm，基部较粗至尖端逐渐变细；瓶梗顶端形成与瓶梗垂直的镰刀形大分生孢子，镰刀形的大分生孢子弯曲，一般具有尖锐的末端，大小为4.15～7.53(5.87±0.83)μm×1.43～3.76(2.20±0.34)μm，菌丝体具有一个隔，少数具有两个隔；还能产生卵圆形或椭圆形小分生孢子，小分生孢子大小为2.7～3.7μm×1.0～1.5μm 20d后老熟菌丝形成汇聚的膨大细胞；菌丝体可产生大量八面体的晶体。

本发明的刀孢蜡蚧菌菌株能够寄生根结线虫卵、2龄幼虫和雌虫。

本发明的刀孢蜡蚧菌菌株具有产生几丁质酶的特性，其所产生的几丁质降解酶系和外切酶在温度为27℃～75℃，及pH为3.0～7.0的条件下均具有高水平的酶切活性。

本发明的刀孢蜡蚧菌菌株的rDNA内转录间隔区DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的有益效果和优点是：本发明的刀孢蜡蚧菌菌株对根结线虫卵、2龄幼虫、雌虫具有很高的寄生能力；并具有高效产生几丁质酶的特性，产生的几丁质酶在不同温度和pH条件下均有较高的酶活性；本发明的刀孢蜡蚧菌产生的几丁质酶粗提液对根结线虫卵孵化具有明显的抑制和破坏作用，本发明的刀孢蜡蚧菌菌株对根结线虫的生物防治具有很大的应用潜力。

附图说明

图1：是本发明的刀孢蜡蚧菌菌株的形态特征及培养性状图，图中A：分生孢子梗和瓶梗；B-C：瓶梗和镰刀形孢子；D：卵圆形小分生孢子；E：老熟菌丝形成的菌丝膨大体；F：菌丝体产生的晶体；G：正面观；H：背面观；

图2：是本发明的刀孢蜡蚧菌菌株PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，图中M：泳道为DNA分子量标准；1：刀孢蜡蚧菌；

图3：是基于rDNA-ITS序的刀孢蜡蚧菌菌株菌株类群系统发育树及相关类群系统发育树；

图4：是本发明的刀孢蜡蚧菌菌株对南方根结线虫卵的寄生过程图，图中A：菌丝经过并接触到卵表面；B；菌丝对卵形成网状结构；C：卵壳变形，卵质外渗，卵被完全破坏；D：即将孵化出的2龄幼虫的卵也被寄生；E、F：对照组；

图5：是本发明的刀孢蜡蚧菌菌株对南方根结线虫2龄幼虫和雌虫的寄生图，图中A：2龄幼虫被菌丝所缠绕；B：2龄幼虫体壁被破坏产生大量镰刀形孢子；D、E：雌虫虫体形成侵染结构，体壁皱缩变形，内容物外渗；C、F：对照组；

图6：是本发明的刀孢蜡蚧菌菌株产生的几丁质酶在不同温度下的酶切活性测定；

图7：是本发明的刀孢蜡蚧菌菌株产生的几丁质酶在不同pH下的酶切活性测定；

图8：是本发明的刀孢蜡蚧菌菌株的产几丁质降解酶系活性(37℃，pH4.5)测定；

图9：是本发明的刀孢蜡蚧菌菌株的产几丁质外切酶活性(37℃，pH4.5)测定；

图10：是本发明的刀孢蜡蚧菌菌株不同浓度的几丁质酶粗提液对根结线虫虫卵的相对孵化抑制率：

图11：是本发明的刀孢蜡蚧菌菌株不同浓度的几丁质酶粗提液对根结线虫虫卵壳的破坏率。

具体实施方式

实施例1.本发明的刀孢蜡蚧菌菌株的分离

(1)培养基：采用水琼脂培养基(WA)，加热溶化后，冷却至约45℃，加入链霉素(0.1mg/ml)，摇匀后倒至直径9cm培养皿中，待用。

(2)分离方法：将采自青岛市城阳区感染根结线虫病害的丝瓜根用水冲洗去泥沙，在Nikon SMZ1000解剖镜下挑取新鲜的卵块，在2％NaClO震荡解离，在500目筛子上收集卵，再经2％NaClO表面消毒后，将卵悬液涂于备好的WA培养基上，每皿含卵约50个，然后将培养皿置于27℃的恒温培养箱内培养，定期观察，将长出的菌丝挑至PDA培养基上，菌丝长满后4℃保存待以后观察鉴定。

实施例2.本发明的刀孢蜡蚧菌菌株的菌落性状培养和形态学鉴定

(1)菌落性状培养：将保存于4℃冰箱中的菌株移入直径9cm的PDA平板上，27℃活化5d，用直径6mm的打孔器在菌落边缘切去菌块，转接到新的PDA平板上，27℃暗箱培养，3次重复。从第2d开始记录菌落形态、颜色和菌落生长情况，直至菌落长满平板。刀孢蜡蚧菌菌落生长较快，在PDA培养基培养10d直径为56～61mm，正面观白色棉状(见图1G)，菌落背面红色或紫红色，3-5d便可产生色素，红色或粉红色色素常常扩散到琼脂内(见图1H)。

(2)菌株形态学鉴定：采用玻片培养法，PDA培养基分成5mm×5mm的薄薄的小片，挑于载玻片上，再将已活化的该菌菌丝挑于培养基上；置于27℃恒温培养箱保湿培养，在Nikon 80i显微镜系统连续观察该菌的分生孢子、瓶梗、晶体等的形成情况，测量并照相。

瓶梗细胞着生于菌丝形成的葡匐分生孢子梗上，单生或3-4根轮生(见图1A-C)，大小为13.70～32.03(23.24±3.75)μm×1.16～2.40(1.76±0.21)μm，基部较粗至尖端逐渐变细；瓶梗顶端形成与瓶梗垂直的镰刀形大分生孢子(见图1B)，镰刀形的大分生孢子弯曲，一般具有尖锐的末端(见图1C)，大小为4.15～7.53(5.87±0.83)μm×1.43～3.76(2.20±0.34)μm，菌丝体具有一个隔，少数具有两个隔；还能产生卵圆形或椭圆形小分生孢子，小分生孢子大小为2.7～3.7μm×1.0～1.5μm(见图1D)；20d后老熟菌丝形成汇聚的膨大细胞(见图1E)；菌丝体可产生大量八面体的晶体(见图1F)。

实施例3.本发明的刀孢蜡蚧菌菌株的分子生物学鉴定、rDNA-ITS序列比对及系统发育分析

(1)扩增引物的合成：由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

通用PCR扩增引物：

ITS1-F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGT-3’

ITS4-R：5’-CCTCCGCTTATTGATATGC-3’

(2)基因组DNA的提取：采用CTAB法提取刀孢蜡蚧菌的DNA；

(3)PCR反应体系(20μl)：模板DNA 1μl、PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific)10μl、上下游引物各1μl，补充去离子水至20μl。反应条件：94℃4min预变性；94℃1min，55℃30s，72℃90s，35个循环；72℃延伸10min。

(4)刀孢蜡蚧菌的基因测序：PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2；将PCR产物送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序引物同上述PCR引物，测序结果5’端至3’序列为：

1GGGGTTTGGTGACCAGCGGAGGGATCATTACAGAGTTTACAACTCCCAAA

51CCCTTATGTGAACATACCAAGATGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCGGCGTC

101CGGACGGCCTAGCGCCGCCCGCGGCCCGGACTCAGGCGGCCGCCGGAGA

151CCACCAAACTCTTTTGTATCATGAGTATCTTCTGAATCCGCCGCAAGGCAA

201AACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGAT

251GAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGA

301ATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCAT

351GCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACTTCCCTTTGGGGAAATCGGCG

401TTGGGGACCGGCAGCATACCGCCGGCCCCGAAATGGAGTGGCGGCCCGTC

451CGCGGCGACCTCTGCGTAGTAATCCAACCTCGCACCGGAACCCCGACGTG

501GCCACGCCGTAAAACACCCCACTTTCTGAACGTTGACCTCGGATCAGGTA

551GGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAAAGCGGAGGA

(5)rDNA-ITS序列比对及系统发育分析

将上述步骤(4)测得的序列提交GenBank获得登入号JN797793，并通过Blast程序与GenBank中已有的核酸序列进行比对，结果表明，该菌株的rDNA-ITS序列和Lecanicilliumpsalliotae xsd08038(EU918702)的相应序列同源性高达99％。为确定该菌株与同属及其他种的亲缘关系，选择GenBank中已公布的代表性的7株菌的DNA序列，用ClustalX匹配排列后，通过MEGA4.1进行分析，通过邻接法(Neigbor-joining method)构建系统发育树可见，与Lecanicillium psalliotae又以99％的置信度属一类群(见图3)。Bootstrap值大于70％就相当于统计学概率的95％，一般75％以上认为是可信(叶利芹，吴小芹，叶建仁.竹叶锈病重寄生现象及重寄生菌鉴定.菌物学报，2011，30(3)：414-420)。

实施例4.本发明的刀孢蜡蚧菌菌株对根结线虫不同生活阶段的定殖

(1)根结线虫卵、2龄幼虫、雌虫的制备：将感染南方根结线虫(Meloidigyne incognita)的新鲜番茄根，经水冲去土壤后，在解剖镜下直接解剖病根，挑出卵块和雌虫，卵块置于2％NaClO中震荡解离制成浓度为3000eggs/ml的卵悬液，将新鲜根结切成小块置于贝曼漏斗过夜，收集底部滤液制成1500J2/ml。将制备好的卵、2龄幼虫、雌虫置于2％NaClO表面消毒2min后经灭菌水清洗待用。

(2)本发明的刀孢蜡蚧菌菌株对根结线虫不同生活阶段的定殖：

挑取PDA平板上27℃、6d的纯培养物边缘直径6mm菌块，置于90×15mm 2％WA(加入链霉素)平板培养基中央。27℃暗箱培养直至菌落长到4～5cm时，在菌落边缘1mm平铺4片经消毒的18×18mm盖玻片并用WA埋入培养基内，分别取30μl含有约100个卵悬液、30μl含有约50个2龄幼虫悬液、3～5个雌虫加在对应的盖玻片上，分别重复7～10次。对照组为不接菌的WA(加入链霉素)培养基。处理后的3～7d观察卵、2龄幼虫、雌虫的寄生情况，并拍照记录。

结果表明：刀孢蜡蚧菌对南方根结线虫卵的寄生从第2d开始，随时间的延长寄生率增加，到第6d达到高峰值85.76％。接菌的培养基上，初期菌丝与卵壳接触形成侵入钉；然后穿透卵壳，有的卵壳皱缩凹陷甚至破裂，内容物外渗(见图4A、B)；菌丝侵入卵内，在卵内生长，使卵内容物凝集，胚胎发育停止，卵壳变形，卵壳内充满菌丝(见图4B、C)，有时可发现菌丝上形成瓶梗，其上着生镰刀形分生孢子(见图4D)。刀孢蜡蚧菌对胚后发育期即将孵化2龄幼虫的卵亦形成侵染钉，菌丝侵入卵内，幼虫停止生长发育畸形。2龄幼虫体内布满菌丝，体壁皱缩变形(见图4D)。未接菌的卵壳初期表面光滑，内容物均匀(见图4E)，3d后可见明显的胚胎发育(见图4F)，5d后孵化出2龄幼虫破壳而出。

5d后观察，接菌的2龄幼虫被菌丝所缠绕(见图5A)，在体壁上形成侵染钉并穿透体壁，体壁皱缩变形，有的2龄幼虫被完全分解(见图5B)，并且产生的镰刀形孢子高于寄生卵时候产生的。5天后的寄生率高达79.23％。

接菌培养基上的年轻雌虫，菌丝接触雌虫体壁形成致密菌网和侵染钉(见图5E)，穿透雌虫体壁，体壁皱缩变形，内含物外渗(见图5D)。未接菌培养基上的雌虫，外壳表面光滑，内含物均匀完整(见图5F)。

实施例5.本发明的刀孢蜡蚧菌菌株产生几丁质酶的制备

(1)胶体几丁质的制备：称取10g几丁质(Sigma)于100ml 85％H₃PO₄中，充分溶解，4℃下过夜，加入500ml超纯水，电动搅拌使其充分分散，用超纯水洗至pH5.0～5.5左右，4℃下保存备用。

(2)产几丁质酶培养条件：250ml的锥形瓶内盛有120ml的液体培养基(0.2％胶体几丁质，0.3％KNO₃，0.2％Na₂HPO₄，0.1％KH₂PO₄，0.03％NaCl，0.05％MgSO₄·7H₂O，0.001％FeSO₄和0.3％Tryptone(Sigma))，调pH值为6.0，0.15Mpa，121℃灭菌30min备用。将活化5d的刀孢蜡蚧菌落边缘菌块(直径5mm)5块接种于装有120mL几丁质液体培养基的250mL锥形瓶中，27℃150rpm摇培，3次重复实验。

从第2d开始每隔2d取1.5ml培养滤液直到第16d，将培养滤液11000rpm离心15min，上清液为几丁质酶粗提液，-20℃保存，供几丁质酶活性测定。

实施例6.本发明的刀孢蜡蚧菌菌株的产几丁质酶特性及几丁质酶活性测定

(1)刀孢蜡蚧菌菌株产生的几丁质降解酶系在不同温度和pH下的活性：

几丁降解酶系活性依据胶体几丁质生成的N-乙酰葡萄糖胺(NAG，N-acetyglucosamine)含量测定。酶促反应体系包括：0.1mL刀孢蜡蚧菌培养滤液(上述实施例5制备的几丁质酶粗提液)、0.5ml1.0％胶体几丁质和0.4mL 0.1mol·L-1pH4.5醋酸钠缓冲液(最适pH)，以加200μL 1mol·L-1NaOH不反应为对照。置于摇床中在不同温度27℃、37℃、50℃、75℃，150rpm反应1h，反应后立即加200μl 1mol·L-1NaOH终止反应，11000rpm离心10min，分别取上清液500μl于1ml Schales’液，沸水中显色反应15min，420nm波长测其吸光度(OD值)。3次重复实验。以已知含量N-乙酰葡萄糖胺(NAG)(0-100μg)制作标准曲线，以1h产生1μmol NAG量计算为1个酶活单位(U)。

几丁质降解酶系活性依据胶体几丁质生成的N-乙酰葡萄糖胺(NAG，N-acetyglucosamine)含量测定。酶促反应体系包括：0.1mL刀孢蜡蚧菌第4d(酶活性最高)培养滤液(上述实施例5制备的几丁质酶粗提液)、0.5ml1.0％胶体几丁质和0.4mL 0.1mol·L^-1不同pH(3.0、3.5(柠檬酸钠缓冲溶液)4.0、4.5、5.0、5.5(醋酸钠缓冲溶液)6.0、6.5、7.0(磷酸钠缓冲溶液))，以加200μL 1mol·L^-1NaOH不反应为对照。置于摇床中在37℃(最适温度)，150rpm反应1h，反应后立即加200μl 1mol·L^-1 NaOH终止反应，11000rpm离心10min，分别取上清液500μl于1ml Schales’液，沸水中显色反应15min，420nm波长测其吸光度(OD值)。3次重复实验。以已知含量N-乙酰葡萄糖胺(NAG)(0～100μg)制作标准曲线，以1h产生1μmol NAG量计算为1个酶活单位(U)。

结果显示：在温度27℃、37℃、50℃、75℃和pH3.0～7.0下均表现出较高的几丁质酶活性，并且在温度为37℃、pH为4.5条件下刀孢蜡蚧菌表现的几丁质酶活性最强为3.98μmol/hml，结果见图6、7所示。

(3)刀孢蜡蚧菌菌株产几丁质降解酶系活性测定：几丁质降解酶系活性依据胶体几丁质生成的N-乙酰葡萄糖胺(NAG，N-acetyglucosamine)含量测定。酶促反应体系包括：0.1mL刀孢蜡蚧菌培养滤液(上述实施例5制备的几丁质酶粗提液)、0.5ml1.0％胶体几丁质和0.4mL0.1mol·L^-1pH4.5醋酸钠缓冲液，以加200μL 1mol·L^-1NaOH不反应为对照。置于摇床中37℃，150rpm反应1h，反应后立即加200μl 1mol·L^-1NaOH终止反应，11000rpm离心10min，分别取上清液500μl于1ml Schales’液，沸水中显色反应15min，420nm波长测其吸光度(OD值)。3次重复实验。以已知含量N-乙酰葡萄糖胺(NAG)(0～100μg)制作标准曲线，以1h产生1μmol NAG量计算为1个酶活单位(U)。

结果显示：本发明的刀孢蜡蚧菌菌株从第2d就开始产生几丁质降解酶系，表现出酶活性，且酶活性上升迅速，第4d达到酶活性高峰为3.98μmol/h ml，之后缓慢下降，见图8所示。

(4)刀孢蜡蚧菌菌株产几丁质外切酶活性测定：几丁质外切酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase)活性测定以pNP-NAG为底物，测定酶促反应生成的对硝基苯酚(pNP，p-nitrophenol)的含量。酶促反应体系包括：50μl刀孢蜡蚧菌培养滤液(上述实施例5制备的几丁质酶粗提液)、50μl pNP-NAG(1mg/ml)、100μl 0.1M pH4.5醋酸缓冲液，以加1ml 1mol·L^-1NaOH不反应为对照。置于摇床中37℃，150rpm反应2h，反应后立即加1ml 1mol·L^-1NaOH终止反应。混匀后立即在405nm下测量其吸光度(OD值)。3次重复实验。以已知含量对硝基苯酚(pNP)作标准曲线制作标准曲线，以1h产生1μmolpNP需要的酶量计算为1个酶活单位(U)。

结果显示：本发明的刀孢蜡蚧菌菌株从第2d开始就产生几丁质外切酶，所产生的几丁质外切酶的活性从第4到16d一直保持较高水平，最高为0.38μmol/h ml，结果见图9所示。

实施例7.本发明的刀孢蜡蚧菌菌株产生的几丁质酶粗提液离体条件下对根结线虫卵的影响

刀孢蜡蚧菌对南方根结线虫卵孵化具有抑制和破坏作用作用，根结线虫卵在本发明的刀孢蜡蚧菌菌株产生的几丁质酶粗提液25％、50％、75％、100％浓度下28℃孵化观察，在几丁质酶粗提液第7d的卵孵化抑制率达和破坏率分别为94.52％(见图10)和84.32％(见图11)。

本发明的刀孢蜡蚧菌菌株不仅能寄生根结线虫生活史中定居态的雌虫和卵，还能寄生侵染态2龄幼虫，还具有产生几丁质酶的特性，其产生的几丁质酶是防治根结线虫病的关键因素，研制的菌剂已进行田间生产应用，对根结线虫控制效果达85％以上。

Claims

1.一种刀孢蜡蚧菌菌株，其特征在于：该菌株是刀孢蜡蚧菌Lecanicillium psalliotae，于2011年10月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC NO：5329。

2.根据权利要求1所述的刀孢蜡蚧菌菌株，其特征在于：所述的刀孢蜡蚧菌菌株在PDA培养基培养10d直径为56～61mm，正面观白色棉状，菌落背面红色或紫红色，3～5d产生红色或粉红色色素，色素扩散到琼脂内；

瓶梗细胞着生于菌丝形成的葡匐分生孢子梗上，单生或3～4根轮生，大小为13.70～32.03(23.24±3.75)μm×1.16～2.40(1.76±0.21)μm，基部较粗至尖端逐渐变细；瓶梗顶端形成与瓶梗垂直的镰刀形大分生孢子，镰刀形的大分生孢子弯曲，具有尖锐的末端，大小为4.15～7.53(5.87±0.83)μm×1.43～3.76(2.20±0.34)μm，菌丝体具有一个隔，少数具有两个隔；产生卵圆形或椭圆形小分生孢子，小分生孢子大小为(2.7～3.7)μm×(1.0～1.5)μm；20d后老熟菌丝形成汇聚的膨大细胞；菌丝体产生大量八面体的晶体。

3.根据权利要求1所述的刀孢蜡蚧菌菌株，其特征在于：所述的刀孢蜡蚧菌菌株具有寄生根结线虫虫卵、2龄幼虫和雌虫的特性。

4.根据权利要求1所述的刀孢蜡蚧菌菌株，其特征在于：所述的刀孢蜡蚧菌菌株具有产生几丁质酶的特性，其所产生的几丁质酶在温度为27℃～75℃，及pH为3.0～7.0的条件下具有酶切活性。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的刀孢蜡蚧菌菌株，其特征在于：所述的刀孢蜡蚧菌菌株的rDNA内转录间隔区DNA序列如SEQ ID NO：1所示。