CN113462802A - 一种与棉花细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的ssr标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与棉花细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的SSR标记及应用。属于分子生物学技术领域。本发明的一种与棉花细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的SSR标记K2126可以通过如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的特异性引物对扩增得到，其中，可育株中哈克尼西棉雄性不育恢复系、三裂棉雄性不育恢复系比不育系相比多出210bp的特异性序列，如SEQ ID NO.6所示。本发明的分子标记与棉花细胞质雄性不育恢复基因连锁紧密，特异性强，鉴定可靠，可有效的进行分子标记辅助选择，加快优良恢复系的培育进程。

Description

一种与棉花细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的SSR标记及 应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记；还涉及该分子标记的应用。

背景技术

棉花是世界上最重要的经济作物，我国是世界上重要的棉花产区。长期以来，我国在棉花种植面积，产量，消费量以及进出口贸易等各方面均列于世界前茅。棉花生产不仅对我国农业乃至国民经济的发展有着重要的影响，而且在世界棉花贸易市场上也起着举足轻重的作用。

棉花杂种优势十分明显，可有效提高产量、纤维品质与抗病、抗逆性。植物细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)是一种不能产生有活力花粉的遗传现象，属母性遗传，在植物杂种优势利用中具有重要价值。利用胞质雄性不育系及恢复系和保持系的三系配套制种方式具有省工、方便、种子纯度高、成本较低等优点，将成为杂种棉商业化制种最有效的途径之一。但由于棉花综合农艺性状优良恢复力强的恢复系很难获得使得棉花CMS的应用受到极大的限制，“三系法”制种仍未实现产业化。开发与棉花细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁，稳定遗传的SSR标记用于强恢复系的选育和杂交制种，为分子标记辅助选择育种提供与目标基因共分离的标记，借助分子标记辅助选择育种获得强恢复力的恢复系奠定坚实的基础。

含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质(CMS-D2)的陆地棉不育系和含有恢复基因的恢复系是棉花杂种优势利用中主要的三系配套系统之一。目前育种家采用常规育种技术以及分子标记辅助选择育种方法选育优良的恢复系。利用分子标记辅助育种技术可以直接在分子水平上鉴定恢复基因，可在苗期进行早期鉴定，不受发育阶段和外界环境的影响，无需通过测交鉴定后代表型，极大地缩短了育种周期。选育恢复系比常规育种具有更多的困难，主要表现在恢复基因的有无只能在测交后代中鉴定，加上分离世代不可能逐株测交，造成农艺性状优良的品系常常不含有恢复基因，且恢复力稳定较慢。利用与恢复基因紧密连锁的分子标记不仅有利于直接、方便、快速的筛选恢复材料，并且也将促进恢复基因的高效转育，培育出多样性恢复系以满足杂交种生产要求。目前对哈克尼西棉CMS育性恢复的遗传机理尚不清楚；Zhang等人在研究三裂棉CMS的育性恢复中发现，其雄性不育特性既能被三裂棉恢复系的恢复基因Rf2所恢复，又能被来自哈克尼西棉恢复系的恢复基因Rf1所恢复，但恢复基因Rf2不能恢复哈克尼西棉CMS-D2-2的育性，目前所用恢复基因的分子标记有：6个与Rf1紧密连锁的EST-SSR标记(NAU2650、NAU2924、NAU3205、NAU3652、NAU3938和NAU4040)表现为共分离,均与Rf1基因相距0.327cM，其中NAU3205为显性标记,其它5个都是共显性标记(《南京农业大学》，杨路明，2009)

恢复基因在染色体特定区域以多个同源基因成簇存在的方式说明它们很可能有共同的起源，并在进化中通过基因复制和同源重组产生了具体的功能分化，这种分化与线粒体中相应目标基因的进化是对应的，反映了核基因与线粒体基因的协同进化关系和互作关系。目前已发表的棉花基因组数据中在棉花恢复区段未获得高质量的组装序列，并且存在缺失。因此，到目前为止，已报道的分子标记与主效恢复基因遗传距离仍相对较远。

发明内容

针对目前已报道的分子标记与主效恢复基因相距较远的不足，本发明旨在提供了在哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系中与恢复基因遗传距离较近表现为共分离的SSR分子标记。

本发明提供的一种棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，所述SSR标记K2126同时与棉花细胞质雄性不育恢复基因Rf1和恢复基因Rf2紧密连锁。

本发明还提供了上述SSR分子标记的引物，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了上述的SSR分子标记引物在鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系中的应用。

进一步地，该应用具体为：

若扩增所述SSR标记K2126的引物对在待测棉花的基因组DNA中的扩增产物为包含如SEQ ID NO.6所示的210bp特异性重复序列，则待测棉花包含棉花细胞质雄性不育恢复基因Rf1和/或恢复基因Rf2，可作为棉花细胞质雄性不育恢复系，否则待测棉花为不包含棉花细胞质雄性不育恢复基因Rf1和恢复基因Rf2的材料。

本发明还提供了上述的SSR分子标记引物鉴定和筛选棉花细胞质雄性不育恢复基因的方法，具体为：

1)利用特异性引物对对棉花材料(哈克尼西棉细胞质雄性不育三系(不育系，恢复系，保持系)以及三裂棉细胞质雄性不育恢复系和陆地棉TM-1、军棉1号、泗棉2号等)的总DNA进行PCR扩增。

2)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析以及条带测序分析。

如果待测棉花材料中检测到该特异性序列，则该待测棉花材料含有棉花细胞质雄性不育恢复基因，如果待测棉花材料中未检测到该特异性序列，则该棉花材料不含有棉花细胞质雄性不育恢复基因。

进一步的，上述的PCR扩增的反应体系为：正向引物(10μM)1μl，反向引物(10μM)1μl，2x Phanta Max Buffer 10μl，dNTP Mix 1μl,Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 1μl，超纯水5μl，模板DNA(50ng/μl)1μl，反应体系总体积为20μl。

所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃预变性30s，60℃退火30s；72℃延伸45s，72℃彻底延伸10min；34个循环。

所述扩增产物在1％琼脂糖凝胶、电压120V条件下电泳30min，在凝胶成像分析系统中记录结果。

本发明提供的鉴定方法，用于哈克尼西棉细胞质雄性不育相配套的恢复系和三裂棉细胞质雄性不育相配套的恢复系的恢复基因的鉴定，可以显著减少田间材料的鉴定工作量，降低育种成本，提高准确性，确保恢复系材料和棉花恢复系种子的纯度。该方法用于恢复系的选育和改良不受外界环境的影响，可以加速育种进程，提高鉴定效率。该方法用于三系杂交制种，可以保证三系杂交种种子纯度。

有益效果

本发明提供的分子标记与棉花细胞质雄性不育恢复基因连锁紧密，利用本发明的分子标记鉴定棉花恢复基因准确率高，可从分子水平上鉴定恢复基因，不受植株发育时期和生存环境的影响，提高恢复基因鉴定的准确性和高效性。利用本发明的分子标记可在苗期对棉花单株检测是否含有恢复基因，检测速度快，可大规模对待测棉花材料进行鉴定，大大缩短育种周期，并且本发明的分子标记具有共显性好，稳定性高，PCR扩增简单高效，节省人力财力，简单实用等优点。

附图说明

图1为哈克尼西棉细胞质雄性不育三系、三裂棉细胞质雄性不育恢复系和陆地棉TM-1的序列比对结果，其中R2、3A、3B、8R、TM-1、分别代表哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系、不育系、保持系、三裂棉恢复系、陆地棉TM-1参考基因组对应的D05染色体上含有差异序列的片段。

图2为用该SSR分子标记K2126的引物对鉴定12种棉花材料的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱。其中R2、3A、3B、8R、HA、TM1、JUN1、SI2、X19、KK1543、108、C1470分别代表哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系、不育系、保持系、三裂棉恢复系、哈克尼西棉、陆地棉TM-1、军棉1号、泗棉2号，新陆中19号，克克1543、108Ф、司1470。

具体实施方式

实施例1

哈克尼西棉细胞质雄性不育三系、三裂棉细胞质雄性不育恢复系和陆地棉TM-1的序列比对结果如图1所示，从图1可以看出，哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系和三裂棉细胞质雄性不育恢复系中扩增条带大小为2088bp，哈克尼西棉细胞质雄性不育系中扩增条带大小为1877bp。

根据该序列，和PCR引物设计原则，在上下游设计特异性引物，将其转化为SSR标记引物，扩增该SSR分子标记的引物对如表1所示：

表1：SSR分子标记引物对。

在哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系和三裂棉细胞质雄性不育恢复系材料中扩增出的条带含有210bp的特异性重复序列(SEQ ID NO.6)，而在不含有恢复基因的材料中没有扩增到该特异性重复序列。由此，可以利用该SSR分子标记鉴定细胞质雄性不育恢复系，例如：

哈克尼西棉雄性不育三系材料：若利用该SSR分子标记能扩增出含有210bp特异性重复序列的材料即含有恢复基因Rf1的哈克尼西棉雄性不育恢复系，若未能扩增出210bp特异性序列则为不含有恢复基因Rf1的材料(保持系和不育系)。

三裂棉雄性不育三系材料：若利用该SSR分子标记能扩增出含有210bp特异性重复序列的材料即含有恢复基因Rf2的三裂棉雄性不育恢复系，若未能扩增出210bp特异性序列则为不含有恢复基因Rf2的材料(保持系和不育系)。

实施例2

利用哈克尼西棉细胞质雄性不育三系、三裂棉细胞质雄性不育恢复系、哈克尼西棉、陆地棉TM-1、军棉1号、泗棉2号，新陆中19号，108Ф、司1470等12种材料进行验证。每个材料采集3-4片未展开的叶片放入1.5ml的离心管中，并加入预冷的新鲜配制的提取缓冲液600μl，用研磨仪研磨，应用CTAB法提取DNA，用SSR分子标记K2126引物对(如表1所示)进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系为：正向引物(10μM)1μl，反向引物(10μM)1μl，2x Phanta MaxBuffer 10μl，dNTP Mix 1μl,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl，超纯水5μl，模板DNA(50ng/μl)1μl，反应体系总体积为20μl。94℃预变性3min；94℃预变性30s，60℃退火30s；72℃延伸45s，72℃彻底延伸10min；34个循环。所述扩增产物在1％琼脂糖凝胶、电压120V条件下电泳30min，在凝胶成像分析系统分析结果。

电泳结果如图2所示，可以看出，所使用的哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系和不育系、保持系及三裂棉雄性不育恢复系、陆地棉TM-1、军棉1号、泗棉2号、哈克尼西棉、新陆中19号、克克1543、108Ф、司1470等棉花材料PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果都显示单一条带，测序结果所得在哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系和三裂棉细胞质雄性不育恢复系中扩增条带为2088bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1-2所示，哈克尼西棉细胞质雄性不育系扩增条带为1877bp、陆地棉TM-1、泗棉3号B军棉1号、泗棉2号、哈克尼西棉、新陆中19号、克克1543、108Ф、司1470等中扩增条带为1878bp。其中，在哈克尼西棉细胞质雄性不育系泗棉3号A中扩增得到1877bp特异性条带，其核苷酸序列SEQ ID NO.3所示。可育株恢复系中均含有一段210bp的特异性条带。不育系中不含有该段特异序列。说明本发明具有很好的鉴定效果。利用本发明的分子标记可在苗期对棉花单株检测是否含有恢复基因，检测速度快，可大规模对待测棉花材料进行鉴定，大大缩短育种周期，并且本发明的分子标记具有共显性好，稳定性高，PCR扩增简单高效，节省人力财力，简单实用等优点。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种与棉花细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的SSR标记及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2088

<212> DNA

<213> 棉花(Gossypium hirsutum)

<400> 1

atgcgtaagc ttccttcttc ttttattctt cgttccgttg ttaatgctgg aagccatctt 60

tctaatttcc actctttttc ttcttcttct aacaccattg ctacccacat cgaatgccta 120

agtaagaaac ccatgtccat gcctgttaga ggaaagggaa aaacagacca ccgcttcgat 180

aatgttgatc atgctttgat tttgttcaat aatttgattg aaaagtaccc aaagccttca 240

attgtggaat tcaataaatt attaggagcc attgttaaga tgaaacatta tgccattgtt 300

gtttctaagt ataggcagat tgaattattg ggagtttccc acaatggtta ttctatgagc 360

atcttgatta attgcttttg tcaattaggt cgaattgatt ttgggttttc tgttttgggg 420

aaaatgctga agttaggtgt tgaacctagt gctgtaactt tttcaacttt gattaatggg 480

ctttgtaatc aaagtaagat ttctgaggcc gtttgtatgt tcgatgaaat gactgaaaga 540

gggtatcaac ctaatttgat tgcttacaat atagtactta aggggttgtg taagaccggt 600

aatactggta gagcagttag gtttctaagg ttgatggaaa gcagaggtta tgaacccgat 660

attgtagcat ataataccat ccttgaccgt ctttgtaaga acgggttgtt gaaggaggct 720

cttgatctct tcttcgaagt gaaggttaaa ggcattagac cagatatctt tacttacact 780

tgcttaattc atggtatgtg taattcgggc cagcaggagg aggcaacaag gctcttgaat 840

gaaatggtgg ataacaatat ttcacttaat attgtcatgt ataatacatt ggttgatgct 900

ctttgcaagg aaggaacgat ttctaaagcc gtagagaccg ttgacatgat gagaaagcaa 960

ggcattgagc ccgatgttgt cacgtatagt acattggttg atgcactttg caaggaagga 1020

acgatttcta aagctgtaga gaccgttgac atgatgagaa agcaaggcat tgagcctaat 1080

gttgtcacgt atagtacatt ggttgatgca ctttgcaagg aaggaacgat ttctaaagct 1140

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ggttgtgcac ctgatatagt tacttacagc accatgatca atggatattg caaagataaa 1440

aggttagacg aagcaatgga actctttcat gaagtatctc gaaagggacc aatcccgaat 1500

attgtcacat acagcactct tatgcagagt atgtttcagt tagggaaagt ttcaactgca 1560

tgtgaacttt ttagaaagat gcttgcttca ggacaagttc cagatatagc gacctgtttg 1620

attttgctgg atggtttatg caaaacaggt catatcaaag aggcattgaa actttttcaa 1680

gcaatgcgaa acagtgggtt ggaacttgat attgtcccat ataatatcct aattgatggg 1740

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acacaacttg ttacggaaat ggttggtaag ggcttttctg cagaaatatt cactgccacc 2040

ttatttatgg agcttatcat atactctaat aaatcaatct tgctctga 2088

<210> 2

<211> 2088

<212> DNA

<213> 棉花(Gossypium hirsutum)

<400> 2

atgggtaagc ttccttcttt ttttattctt cgtttggttg ttaatgctgg aagccatctt 60

tctaatttcc actctttctc ttcttcttct aacaccattg ctacctatat cgactgccta 120

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attttgctgg atggtttatg caaaacaggt catatcaaag aggcattgaa acattttcaa 1680

gcaatgcgaa acagtgggtt ggaacttgat attgtcccat ataatatcct aattgatggg 1740

ttgtgcaaag ctgggcatat cgaatttgcc aaggaattat ttcatcaact ctcagacaat 1800

ggcttaaaac cggatgttta cacatattgt ataatgatta atggactgtg taaagaggga 1860

ttgccagatg aagcatacag gttgtttggg agcatgggag aaaatgactg tttgcctaat 1920

agctgctgtt ataatgtaat gattcggggg ttccttcgca acagctatac ctcaaaggca 1980

acacaacttg ttacggaaat ggttggtaag ggcttttctg cagatatatt cactgccacc 2040

ttatttatgg agcttatcat atactctaat aaatcaatct tgctctga 2088

<210> 3

<211> 1877

<212> DNA

<213> 棉花(Gossypium hirsutum)

<400> 3

atgggtaagc ttccttcttc ttttattctt cgttcggttg ttaatgctgg aagccatctt 60

tctaatttcc actctttttc ttcttcttct agcactattg ctacccacat cgaatgccta 120

agtaagaaac ccatgtccat gcctgttaga ggaaagggaa aaagagacca ccacttcgat 180

aatgttgatc atgctttgag tttgttcaat aatatgattg aaaagtaccc aaagccttca 240

attgtggaat tcaataaatt attaggagcc attgttaaga tgaaacatta tgccattgtt 300

gtttctaagt atagacagat cgaattattg ggaatttccc ataatgttta ttctataaac 360

atcttgatta attgcttttg tcattaggtc gaattgattt tgggttttct gttttgggga 420

aaatgctgaa gttaggtgtt gagcctgatg ttgtagtttt ttcaactttg attaatgggc 480

tttgtaatca aagtaaaatt tttgaggccg tttgtatgtt cgatgaaatg actgaaaaag 540

ggtatcaacc taatttgatt gtttactgta caatgcttaa ggggttgtgt aagactggta 600

atactggtag agttgttagg tttctaaggc tgatggaaag ccgaggttat gaacccgata 660

ttgtagcata tagcactgtc attgactgcc tttgtaagaa cggtttgtta caggaggctc 720

tcaatctctt atctgaaatg aaggttaagg gcattagacc aaatatcttt acttacactt 780

gcttaattca tggcatgtgt aattcgggcc agcagcagga ggcaacaagg ctcttgaatg 840

aaatggtgga taacaatatt tcacttaata ttgtcacgta tagtacattg gttgatgctc 900

tttgcaagga aggaacgatt tctaaagctg tagagaccgt tgacacaatg agaaagcaag 960

gcattgagcc cgatgttgtc acgtatagta cattggttga tgcgcattgc aaggaaggga 1020

tggtctctga agctgaggat attgttgacg caatgataaa gcgaggcatt gagcctaatg 1080

ttgttaccta taatacatta gttaatggtc attgcttgca gaacaaaatg gataaagcta 1140

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atatggagga ggcattgaaa ctttttcaag caatgcgaaa cagtgggttg gaacttgata 1500

ttgtcccata taatatccta attgatgggt tgtgcaaagc tgggcatctc gaatttgcca 1560

aggaattatt tcatcaactc tcagacaatg gtttaaaacc gaatgttgtc acatattgta 1620

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gcatgggaga taatgactgt ttgcctatta gctgctgtta taatgtaatg attcggggtt 1740

tccttcgcaa cagctatacc tcaaaggcaa cgcaacttct tatggaaatg gttggtaagg 1800

gcttttctgc agatatattc actgccacct tatttttgga gtttatcata tactctaata 1860

aatcaatctt gctctga 1877

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgggtaagc ttccttcttc tttta 25

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcagagcaag attgatttat tagagtatat g 31

<210> 6

<211> 210

<212> DNA

<213> 棉花(Gossypium hirsutum)

<400> 6

actttgcaag gaaggaacga tttctaaagc tgtagagacc gttgacatga tgagaaagca 60

aggcattgag cctaatgttg tcacgtatag tacattggtt gatgcacttt gcaaggaagg 120

aacgatttct aaagctatag agactgttga catgatgaga aagcaaggca ttgagcctaa 180

tgttgtcacg tatagtacat tggttgatgc 210

Claims (4)

1.一种与棉花细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的SSR标记K2126，其特征在于：所述SSR标记K2126同时与棉花细胞质雄性不育恢复基因Rf1和恢复基因Rf2紧密连锁，其中，扩增所述SSR标记K2126的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.用于扩增权利要求1所述的SSR标记K2126所用的引物对，其特征在于：所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

3.一种权利要求1所述的SSR标记K2126在棉花细胞质雄性不育恢复系鉴定上的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，该应用具体为：

若扩增所述SSR标记K2126的引物对在待测棉花的基因组DNA中的扩增产物为包含如SEQ ID NO.6所示的210bp特异性重复序列，则待测棉花包含棉花细胞质雄性不育恢复基因Rf1和/或恢复基因Rf2，可作为棉花细胞质雄性不育恢复系，否则待测棉花为不包含棉花细胞质雄性不育恢复基因Rf1和恢复基因Rf2的材料。

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