CN104115754B

CN104115754B - 一种具有Ogura雄性不育细胞质的萝卜保持系的选育方法

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Publication number: CN104115754B
Application number: CN201410094354.7A
Authority: CN
Inventors: 王效睦; 王俊峰; 白静; 丁汉凤; 孔维国; 李娜娜; 宫永超
Original assignee: Shandong Crop Germplasm Resource Center
Current assignee: Shandong Crop Germplasm Resource Center
Priority date: 2014-03-14
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2015-12-30
Anticipated expiration: 2034-03-14
Also published as: CN104115754A

Abstract

本发明属于作物育种技术领域，特别公开了一种具有Ogura雄性不育细胞质的萝卜保持系及其选育方法。该具有Ogura雄性不育细胞质的萝卜保持系，其特征在于：所述保持系具有Ogura？A型雄性不育细胞质，对具有Ogura？H型雄性不育细胞质的不育系具有保持能力，所述保持系雌、雄性器官发育正常，自交结实性好，雄性不育系，雌蕊发育正常，雄蕊完全退化，无有效花粉。本发明打破了传统保持系的选育范围和方法，从具有Ogura细胞质类型的可育植株中选育出了对Ogura细胞质雄性不育系具有保持能力的保持系，进一步拓宽了保持系的选育范围，对于进一步研究Ogura细胞质雄性不育机理都具有十分重要的意义。

Description

一种具有Ogura雄性不育细胞质的萝卜保持系的选育方法

（一）技术领域

本发明属于作物育种技术领域，特别涉及一种具有Ogura雄性不育细胞质的萝卜保持系的选育方法。

（二）背景技术

十字花科植物存在着明显的杂种优势，由于是它们的花器较小，人工去雄操作费时费力，且一次授粉获得的杂交种子很少，为解决这一问题，育种工作者选用自交不亲和系育种，但自交不亲和系易受环境等因素的影响，亲和性不稳定，经常出现制种纯度不高的现象。利用植物雄性不育系进行杂交制种，较好地解决了自交不亲和系制种的问题，并可提高杂交种子的纯度，增加农作物的产量，己成为国际种业的主要发展方向。

目前在生产上使用的萝卜雄性不育系，通常是由细胞质基因和细胞核基因共同互作，形成的一种雄性不育现象，萝卜的不育细胞质一般有Ogura-CMS(orf138)、Kos-CMS(orf125)和NWB-CMS等类型，但最常见的还是Ogura不育类型；在细胞核中由两对隐性基因控制，不育系基因型为S_ms1ms1ms2ms2，保持系基因型为N_ms1ms1ms2ms2，（S为不育型细胞质，N为正常细胞质)。萝卜雄性不育表现为花药退化，或不能形成具有正常功能的花粉，而雌蕊发育正常。保持系则具有正常的雄性和雌性器官，自交能正常结实，当与不育系杂交时，能够保持不育系的不育性。

萝卜细胞质雄性不育基因存在于线粒体DNA上，主要是由于线粒体基因组分子内或分子间频繁重组所形成的异常嵌合基因造成的，目前研究认为，Ogura不育类型雄性不育的主控基因为orf138,orf138与线粒体基因组中具有正常功能的基因共转录，产生异常转录本和翻译产物，从而在花药发育的某个时期干扰线粒体的正常功能发挥，最终导致雄性不育现象的发生。线粒体基因组的转录和翻译产物尽管只占整个细胞基因组产物的很少部分，但其转录和翻译情况比较复杂。当用恢复系与不育系进行杂交时，恢复系中的恢复基因能够产生一种PPR蛋白，该蛋白抑制orf138的表达，从而达到育性恢复的目的。

到目前为止所知的萝卜雄性不育类型中，Ogura雄性不育是导入率和稳定性方面最优秀的不育材料，同时Ogura雄性不育也是目前研究最为深入的一种雄性不育材料，日本学者Yamagishi通过对萝卜野生种、栽培种等不育材料进行测序，将Ogura雄性不育基因orf138分为九个类型（如表1）。据有关资料研究，A型与F型具有相同的恢复和保持关系，尽管有的碱基变异导致了氨基酸发生了变化，但目前通过试验验证，能够明确导致雄性不育的有A、B、D、F、H型，其它类型还有待验证。

表1：

注：表中Δ^a栏的“+”为基因中缺失39个碱基对。Orf138类型中A为最早发现的测序的序列。其它栏中“””为与A型没有变化。

在使用Ogura雄性不育系进行作物育种时，科技人员往往选择从不具有Ogura雄性不育细胞质的植株中选育保持系，从目前文献及相关材料看，Ogura雄性不育系的保持系的细胞质类型只有两种，一是正常细胞质类型（N型），另一种是NWB细胞质类型，还没有人从具有Ogura细胞质的植株中选育出保持系。

（三）发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种对Ogura雄性不育系具有保持能力的具有Ogura雄性不育细胞质的萝卜保持系的选育方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种具有Ogura雄性不育细胞质的萝卜保持系，其特征在于：所述保持系具有OguraA型雄性不育细胞质，对具有OguraH型雄性不育细胞质的不育系具有保持能力，所述保持系雌、雄性器官发育正常，自交结实性好，雄性不育系，雌蕊发育正常，雄蕊完全退化，无有效花粉，其保藏号为P201401，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏日期为2014年01月15日，分类命名为RaphanussativusL.HF17-5-1-1。

该具有Ogura雄性不育细胞质的萝卜保持系的选育方法，包括如下步骤：

（1）选择具有OguraH型雄性不育材料作母本；

（2）选择具有OguraA型雄性不育细胞质的可育植株作为拟选保持系材料；

（3）对母本和拟选保持系材料进行细胞质类型的PCR分子标记与片断测序，保证两者具有要求的Ogura细胞质类型；

（4）检测PCR分子标记后的母本和拟选保持系材料，两者存在碱基序列上的微小差别；

（5）在纱网隔离条件下，将母本材料和拟选保持系材料进行测交，同时拟选保持系材料进行自交；

（6）下一季，先对测交和自交所得的种子用温水浸泡，然后放入纸基培养皿中，待种子萌动后进行春化处理，将春化处理后的种子播种于隔离网室中，待开花后，对测交后代的雄性不育情况进行观察统计，选择雄性不育率高的组合的不育株，继续与选出该不育株的亲本自交后代进行测交；

（7）连续进行测交、自交和选择不育株的工作，在测交中选择保持能力高的单株进行测交选择，直到选育出保持率100%的保持系。

其更优方案为：

步骤（3）中，选用Ogura特异引物ORF-F5'-TTCAAATCCTGTCCCCGCACC-3'和ORF-R5'-GCCTTACACCATTGGGATACTTC-3'，对母本和拟选保持系材料进行PCR分子标记，每份材料取5株，10个样本在1000bp前后的位置出现一条明亮、清晰的条带，确定两者皆为Ogura细胞质类型，通过对PCR琼脂糖凝胶割胶回收，进行分子测序，分别得到母本材料OguraH型和拟选保持系材料OguraA型。

步骤（4）中，母本材料OguraH型和拟选保持系材料OguraA型在orf138区段碱基序列的第61和第99碱基上出现差异，母本材料在第61个碱基由A变为C，第99个碱基由A变为G，两者存在微小的差别。

步骤（5）中，每个测交组合的有效结荚数不少于10个，结籽粒数50粒以上，拟选保持系自交的有效结籽数同样在50粒以上。

步骤（6）中，先对测交和自交所得的种子每份取50粒，用35℃温水浸泡3小时，然后放入纸基培养皿中，待种子萌动后，放入2-4℃的冰箱中进行春化处理25天，将春化处理后的种子播种于隔离网室中，待开花后，对测交后代的雄性不育情况进行观察统计，选择雄性不育率高的组合的不育株，继续与选出该不育株的亲本自交后代进行测交，同时保证测交和自交的结籽数量。

本发明由于采用以上技术方案，具有以下优点：

（1）拓宽了Ogura雄性不育保持系的选育范围，原来只是从非Ogura细胞质类型的材料中选育保持系，通过该方法，同样可以从具有Ogura细胞质类型的材料中选育保持系，有效解决了一些性状优良的具有Ogura细胞质材料的三系利用问题；特别是随着雄性不育系制种的不断增加，该类型材料将会越来越多；

（2）本发明涉及的一种新型具有Ogura细胞质类型的保持系，对进一步研究Ogura细胞质雄性不育机理提供一个十分重要的材料；

（3）本发明涉及的雄性不育保持系同样具有一般保持系功能，能够进行杂交种的配制与选育。

本发明打破了传统保持系的选育范围和方法，从具有Ogura细胞质类型的可育植株中选育出了对Ogura细胞质雄性不育系具有保持能力的保持系，进一步拓宽了保持系的选育范围，对于进一步研究Ogura细胞质雄性不育机理都具有十分重要的意义。

（四）附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为本发明选育方法的流程示意图；

图2为对不育系和保持系各选取5株，用Ogura特异引物进行PCR分子标记，在1000bp处出现一条一致的明亮条带，标明两者都含有orf138的基因；

图3-5为不育系RBY与保持系HF17-5-1-1测序结果比较示意图。

（五）具体实施方式

下面结合附图和实施实例对本发明进行详细的描述。

首先选择雄性不育材料和拟选保持系材料，本发明选用的雄性不育材料是引进国外的RBY，RBY为日本青首萝卜类型；拟选保持系材料为山东地方品种枣庄大红袍，枣庄大红袍为红皮白心萝卜。选定好材料后，进行细胞质类型的PCR分子标记与片断测序。要求不育系具有OguraH型细胞质，保持系具有OguraA型细胞质。

用Ogura特异引物：ORF-F5'-TTCAAATCCTGTCCCCGCACC-3'和ORF-R5'-GCCTTACACCATTGGGATACTTC-3'，对不育材料RBY及拟选保持系材料枣庄大红袍进行PCR分子标记，为防止出现取样错误，每份材料取5株，1、2、3、4、5为不育材料RBY，6、7、8、9、10为拟选保持系材料枣庄大红袍，PCR标记结果如图2，10个样本都在大约1000bp处出现了一条明亮、清晰的条带，说明两者皆为Ogura细胞质类型。对图2中的4、5、6、7四份样品，通过对PCR琼脂糖凝胶割胶回收，进行分子测序。

4、5两个样品测序结果完全相同，其序列为（TTCAAATCCTGTCCCCGCACCGTAGTTTCATTCTGCATCACTCTCCCTGTCGTTATCGACCTCGCAAGGTTTTTGAAACGGCCGAAACGGGAAGTGACAATACCGCTTTTCTTCAGCATATAAATGCAATGATTACCTTTTTCGAAAAATTGTCCACTTTTTGTCATAATCTCACTCCTACTGAATGTCAAGTTAGTGTAATAAGTTTCTTTCTTTTAGCTTTTTTGCTAATGGCCCATATTTGGCTAAGCTGGTTTTCTAACAACCAACATTGTTTACGAACCATGAGACATCTAGAGAAGTTAAAAATTCCATATGAATTTCAGTATGGGTGGCTAGGTGTCAAAATTACAATAAAATCAAATGTACCTAACGATGAAGTGACGAAAAAAGTCTCACCTATCATTAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGTGGAAAATGGACCGAGAAAATAATGCTTTGTGAACCCAATTGCTTTGACAAAAATAAAGAAAGAAGCAAAATCTCATTCAATTTGAAATAGAAGAGATCTCTATGCCCCCTGTTCTTGGTTTTCTCCCATGCTTTTGTTGGTCAACAACCAACCACAACTTTCTATAGTTCTTCACTACTCCTAGAGGCTTTGGTAATGAAGCTGTCTGGAGGGATTTGTTGAAATCAATTAATCTAATCATGCCTCAACTGGATAAATTCACTTATTTTTCACAATTCTTCTGGTTATGCCTTTTCTTCTTTACTTTCTATATTTTCATATGCAATGATGGAGATGGAGTACTTGGGATCAGCAGAATTCTAAAACTACGGAACCAACTGCTTTCACACCGGGGGAAGACCATCCAGAGCAAGGACCCCAACAGTTTGGAAGATCTCTTGAGAAAAGGTTTTAGCACTGGTGTATCCTATATGTATGCTAGTTTATTCGAAGTATCCCAATGGTGTAAGGC）；6、7两个样品测序结果完全相同，其序列为（TTCAAATCCTGTCCCCGCACCGTAGTTTCATTCTGCATCACTCTCCCTGTCGTTATCGACCTCGCAAGGTTTTTGAAACGGCCGAAACGGGAAGTGACAATACCGCTTTTCTTCAGCATATAAATGCAATGATTACCTTTTTCGAAAAATTGTCCACTTTTTGTCATAATCTCACTCCTACTGAATGTAAAGTTAGTGTAATAAGTTTCTTTCTTTTAGCTTTTTTACTAATGGCCCATATTTGGCTAAGCTGGTTTTCTAACAACCAACATTGTTTACGAACCATGAGACATCTAGAGAAGTTAAAAATTCCATATGAATTTCAGTATGGGTGGCTAGGTGTCAAAATTACAATAAAATCAAATGTACCTAACGATGAAGTGACGAAAAAAGTCTCACCTATCATTAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGTGGAAAATGGACCGAGAAAATAATGCTTTGTGAACCCAATTGCTTTGACAAAAATAAAGAAAGAAGCAAAATCTCATTCAATTTGAAATAGAAGAGATCTCTATGCCCCCTGTTCTTGGTTTTCTCCCATGCTTTTGTTGGTCAACAACCAACCACAACTTTCTATAGTTCTTCACTACTCCTAGAGGCTTTGGTAATGAAGCTGTCTGGAGGGATTTGTTGAAATCAATTAATCTAATCATGCCTCAACTGGATAAATTCACTTATTTTTCACAATTCTTCTGGTTATGCCTTTTCTTCTTTACTTTCTATATTTTCATATGCAATGATGGAGATGGAGTACTTGGGATCAGCAGAATTCTAAAACTACGGAACCAACTGCTTTCACACCGGGGGAAGACCATCCAGAGCAAGGACCCCAACAGTTTGGAAGATCTCTTGAGAAAAGGTTTTAGCACTGGTGTATCCTATATGTATGCTAGTTTATTCGAAGTATCCCAATGGTGTAAGGC），不育材料RBY和枣庄大红袍在orf138区段的第61和第99个碱基上出现差异（图3），不育材料RBY属于OguraH型细胞质在第61个碱基由A变为C（A→C），第99个碱基由A变为G（A→G）；而枣庄大红袍则属于OguraA型细胞质。符合本发明对雄性不育材料及拟选保持系材料的要求。

2010年春在纱网隔离条件下，以雄性不育材料RBY作母本，以枣庄大红袍作父本进行测交，做测交组合203个，同时203株枣庄大红袍进行自交，每个测交组合的有效结籽粒数都在50粒以上；枣庄大红袍自交的有效结籽数也在50粒以上。

2010年秋，先对测交和自交所得的种子每份取50粒，用35℃的温水浸泡3小时，然后放入纸基培养皿中，待种子盟动后，放入2-4℃的冰箱中进行春化处理25天，通过春化后的种子播种于隔离网室中，待开花后，对测交后代的雄性不育情况进行观察统计。雄性不育株的标准为，雌蕊发育正常，雄蕊完全退化或不能形成有效花粉。

在测交一代中出现具有部分保持能力的单株4株，其保持能力分别在20-60%之间；选择出现雄性不育株的枣庄大红袍自交后代分别与雄性不育株进行测交，每株自交后代的测交组合数不少于25个；枣庄大红袍进行自交。

2011年春将经过春化处理的种子播种于网室中，从中选育出具有保持能力的枣庄大红袍11株，保持能力在20-80%，选保持能力在60%以上的5个单株自交后代继续进行测交，同时测交亲本进行自交。

2011年秋对测交后代进行雄性不育鉴定，在后代中出现了3株保持能力为100%的单株，用其测交亲本的自交后代继续进行测交，和亲本自交。

在2012年春、秋与2013年春、秋的观察和继续测交中，其保持能力一直稳定地保持100%，形成了一套稳定的、同时具有Ogura细胞质的不育系（HF17-5-1-1A）和保持系（HF17-5-1-1）。

Claims

1.一种具有Ogura雄性不育细胞质的萝卜保持系的选育方法，所述保持系具有OguraA型雄性不育细胞质，对具有OguraH型雄性不育细胞质的不育系具有保持能力，所述保持系雌、雄性器官发育正常，自交结实性好，雄性不育系，雌蕊发育正常，雄蕊完全退化，无有效花粉，其保藏号为CCTCCNo：P201401，其特征为，包括如下步骤：（1）选择具有OguraH型雄性不育材料作母本；（2）选择具有OguraA型雄性不育细胞质的可育植株作为拟选保持系材料；（3）对母本和拟选保持系材料进行细胞质类型的PCR分子标记与片段测序，保证两者具有要求的Ogura细胞质类型；（4）检测PCR分子标记后的母本和拟选保持系材料，两者存在碱基序列上的微小差别；（5）在纱网隔离条件下，将母本材料和拟选保持系材料进行测交，同时拟选保持系材料进行自交；（6）下一季，先对测交和自交所得的种子用温水浸泡，然后放入纸基培养皿中，待种子萌动后进行春化处理，将春化处理后的种子播种于隔离网室中，待开花后，对测交后代的雄性不育情况进行观察统计，选择雄性不育率高的组合的不育株，继续与选出该不育株的亲本自交后代进行测交；（7）连续进行测交、自交和选择不育株的工作，在测交中选择保持能力高的单株进行测交选择，直到选育出保持率100%的保持系。

2.根据权利要求1所述的具有Ogura雄性不育细胞质的萝卜保持系的选育方法，其特征在于：步骤（3）中，选用Ogura特异引物ORF-F5'-TTCAAATCCTGTCCCCGCACC-3'和ORF-R5'-GCCTTACACCATTGGGATACTTC-3'，对母本和拟选保持系材料进行PCR分子标记，每份材料取5株，10个样本在1000bp前后的位置出现一条明亮、清晰的条带，确定两者皆为Ogura细胞质类型，通过对PCR琼脂糖凝胶割胶回收，进行分子测序，分别得到母本材料OguraH型和拟选保持系材料OguraA型。

3.根据权利要求1所述的具有Ogura雄性不育细胞质的萝卜保持系的选育方法，其特征在于：步骤（4）中，母本材料OguraH型和拟选保持系材料OguraA型在orf138区段碱基序列的第61和第99碱基上出现差异，母本材料在第61个碱基由A变为C，第99个碱基由A变为G，两者存在微小的差别。

4.根据权利要求1所述的具有Ogura雄性不育细胞质的萝卜保持系的选育方法，其特征在于：步骤（5）中，每个测交组合的有效结荚数不少于10个，结籽粒数50粒以上，拟选保持系自交的有效结籽数同样在50粒以上。

5.根据权利要求1所述的具有Ogura雄性不育细胞质的萝卜保持系的选育方法，其特征在于：步骤（6）中，先对测交和自交所得的种子每份取50粒，用35℃温水浸泡3小时，然后放入纸基培养皿中，待种子萌动后，放入2-4℃的冰箱中进行春化处理25天，将春化处理后的种子播种于隔离网室中，待开花后，对测交后代的雄性不育情况进行观察统计，选择雄性不育率高的组合的不育株，继续与选出该不育株的亲本自交后代进行测交，同时保证测交和自交的结籽数量。