CN101049082B - 利用核质互作型雄性不育系的次要恢复基因进行杂交作物育种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用核质互作型雄性不育系的次要恢复基因的杂交作物育种方法，该利用方法包括以下步骤：1)选取核质互作型雄性不育系A、其保持系B、和恢复系R；2)制备雄性不育保持系B的的具有次要恢复基因的近等基因系B’或B”；3)鉴定出完全雄性不育的A/B’F ₁或A/B’//B”F ₁(/表示第一次杂交，//表示第二次杂交，///表示第三次杂交，如此类推。下同)；4)利用A/B’//R或A/B’//B”///R生产杂交作物种子。该方法可以扩大不育细胞质的利用范围，提高核质互作型雄性不育系选育效率，提高不育系异交能力，提高杂种杂交作物F ₁的可育度及其稳定性，提高杂交作物产量水平和实现对亲本不育系的严密控制。

Description

利用核质互作型雄性不育系的次要恢复基因进行杂交作物育种的方法

技术领域

本发明涉及植物育种领域，具体地，本发明涉及一种利用核质互作型雄性不育系的次要恢复基因进行杂交作物育种的方法。

背景技术

人们早已发现各主要农作物的杂种优势现象，并且将其广泛用于玉米、高粱、水稻、油菜等农作物生产实际中。现有农作物杂种优势的利用方式有较多缺陷，选育实用的优良组合难度大，影响了杂种优势潜力的发挥。主要作物中小麦，棉花，大麦，大豆等几乎还没有利用杂种优势。提高配合力，降低种子生产成本，提高强优组合的选育效率，是农作物杂种优势利用研究的发展方向。

三系法是利用杂种优势的重要途径。杂交制种中的三系包括：核质互作型雄性不育系，保持系和恢复系。在自然界中核质互作雄性不育类型非常丰富，植物进化过程中由于生殖隔离等原因，种间，亚种间，甚至品种间杂交等都能产生细胞质核互作雄性不育。一般来说，质的提供亲本和核的提供亲本遗传距离小的不育细胞质，难找到保持系，它们的不育系大多败育不彻底，难以得到利用。质的提供亲本和核的提供亲本遗传距离大的不育细胞质，易找到完全不育保持系，但一般难以恢复，配组欠自由。有很多不育细胞质由于难找到完全恢复系，不能配出结实正常组合，没能得到利用。如普通小麦T型核质互作型雄性不育系，尽管它们败育彻底，不育系容易选育。

影响核质互作型雄性不育性育性恢复的基因有主效恢复基因和次要恢复基因。水稻野败核质互作型雄性不育系的主效恢复基因有两个，T S Bharaj将它们定位于水稻第7和第10染色体上。恢复系中，主效基因和次要恢复基因共同作用能够使核质互作型雄性不育系育性恢复为可育。缺乏次要恢复基因或者次要恢复基因作用弱的恢复系的育性恢复能力差。

核质互作型雄性不育系是目前水稻杂种优势利用的主要遗传工具。所配杂交水稻在中国种植面积接近水稻种植面积的50％。对水稻核质互作型雄性不育系的基本要求是：不育性稳定，败育彻底，受环境条件影响小，花粉不育度＞99.5％；开花习性良好，柱头大而外露，张颖角度大、时间长，花时集中；一般配合力强；株叶型好，抗性和米质好。目前可利用的优良的水稻核质互作型雄性不育系有限，不育系间遗传差异小，类型相似。难以将存在于各种水稻核质互作型雄性不育系中的优良性状综合在一起，导致现有优良杂交水稻组合的产量，适应性、抗病虫性、稻米品质等不能满足各地对水稻生产的不同要求。高产优质的杂交粳稻组合和适合长江流域作双季早稻的早中熟组合较缺乏。

核质互作型雄性不育导致不育系开花习性变差，花时推迟，许多不开颖、时间分散，花时不集中，柱头活力下降。败育程度越高，则开花习性越差，而且更难恢复。败育不彻底的不育系开花习性影响较小，一般表现开花较早，花时集中，开颖好，相对容易恢复。生产上，败育不彻底的核质互作型雄性不育系II-32A、协青早A、川香29A等都具有优良的开花习性。协调不育系不育稳定性、开花习性、和可恢复性是水稻核质互作型雄性不育系选育的一个主要问题。

生产上一个优良核质互作型雄性不育系由于繁殖面积大，其保持系容易流失，育种单位的知识产权难以保护，不育系繁殖的保密工作也非常重要。

我们的在研究中发现，水稻野败核质互作型雄性不育系做母本与恢复系杂交，后代中的完全可育株系的育性恢复能力一般仅表现为部分恢复，或者完全无恢复能力，这种“同质恢法”选育恢复系效果不佳；某些与水稻野败核质互作型雄性不育系杂交产生完全不育F₁的亲本，并不是保持系，用这种传统的鉴定保持系的方法是不准确的，将这些亲本的细胞核完全回交到不育细胞质中，后代表现为完全雄性可育。我们进一步发现上述现象是由于许多次要恢复基因的遗传表现隐性、不完全隐性；次要恢复基因在纯合状态下的效应高于杂合状态下的效应的结果。杂合的次要恢复基因可能不表达或者对提高花粉可育度作用很小；纯合的次要恢复基因具有显著提高花粉可育度的作用。

发明内容

本发明的发明人为了解决目前杂种优势利用中存在的核质互作型雄性不育系可恢复性欠佳，异交习性欠理想，杂交种花粉可育度较低以及结实受环境影响较大，和不育系的保密问题而提出并完成本发明。

本发明的目的是提供一种利用核质互作型雄性不育系的次要恢复基因进行杂交作物育种的方法。

根据本发明的利用核质互作型雄性不育系的次要恢复基因进行杂交作物育种方法包括以下步骤：

1)选取核质互作型雄性不育系A、其保持系B、和恢复系R；

2)制备保持系B的具有次要恢复基因的近等基因系B’；

3)A与B’杂交，并鉴定出完全雄性不育的A/B’F₁；

4)利用完全雄性不育的A/B’F₁作为母本与恢复系R杂交制种，生产A/B’//R F₁杂交作物种子。

进一步，根据本发明的利用核质互作型雄性不育系的次要恢复基因进行杂交作物育种的方法包括以下步骤：

1)选取核质互作型雄性不育系A、其保持系B、和恢复系R；

2)制备保持系B的具有次要恢复基因的近等基因系B，；

3)制备B’的近等基因系B”，其中，B’和B”具有不同的次要恢复基因，主要差别在于次要恢复基因在染色体上的位置不同；

4)A与B’杂交，然后A/B’再与B”杂交，并鉴定出完全雄性不育的A/B’//B”F₁；

5)利用完全雄性不育的A/B’//B”F₁作为母本与恢复系R杂交制种，生产A/B’//B”///R F₁杂交作物种子。

根据本发明的方法，其中，所述核质互作型雄性不育系为水稻核质互作型雄性不育系，优选丰源A、或湘8A、Caiapo A；或T型小麦核质互作型雄性不育系，优选小麦T753369A。

本发明根据核质互作型雄性不育系的许多次要恢复基因不表现为显性；次要恢复基因纯合能够显著提高花粉可育率；以及降低不育系A的败育程度能够提高不育系异交能力的原理，将不表现为显性的次要恢复基因转入保持系B中，育成保持系的具有次要恢复基因的近等基因系B’，A/B’(A与B’的杂交后代)作为杂交制种用的母本，与优良恢复系配R组为强优势组合；并可用与B，的次要恢复基因不同的近等基因系B”与A/B’杂交，获得A/B’//B”种子作为杂交制种用的母本，与优良恢复系R配组为强优势组合供生产应用。其利用程序如下：

不育系A/保持系B->不育系A繁殖(A与B细胞核相同)

不育系A/B’或不育系A/B’//B”->生产制种用不育系种子A/B’//R或A/B’//B”///R进行优良杂交组合制种，生产大田用杂交种子。

这些组合不降低A/B//R的杂种优势，能够保持A/B//R的F₁群体农艺性状，并且能够达到异交习性大幅度改善，可恢复性提高，与恢复系配组的杂种F₁可育程度提高，可育稳定性提高，不育系和保持系B能够保密的目的。具体地，本发明所用的不育系A可以是各种不育性稳定的作物核质互作型雄性不育系，例如，野败粳型水稻核质互作型雄性不育系，T型小麦核质互作型雄性不育系，野败型籼型水稻核质互作型雄性不育系等。

本发明中B’和B”以及B基本相似，互为近等基因系。B’以及B”与B的关键差别在于，B’以及B”某些位点含有次要恢复基因。B’与B”的关键差别在于次要恢复基因位置不同。B’和B”以及B之间的差别一般不影响A与A/B’或A与A/B’//B”之间的相似性，不导致A/R与A/B’//R或A/R与A/B’//B”之间出现杂种优势差异。

本发明应用的次要恢复基因是在杂合状态下导致雄性可育的作用没有或很小，虽然可降低不育系败育程度，产生一定的可育花粉，但不表现出导致不育系产生自交结实的作用，而在纯合条件下，其作用则能够大幅度提高雄性不育系的花粉育性恢复程度，多不表现为显性。

本发明所用的不育系A一般败育彻底，不育性稳定，A/B’不育性株间整齐，A/B’和A/B’//B”的F₁允许有少量可育花粉，但不自交结实。在杂合状态下，本发明中次要恢复基因可允许的导致花粉可育程度高低由不同不育系的遗传背景决定，最关键的指标要求是在生产制种中不导致自交结实。

用回交方法或者转基因方法可将不表现为显性的次要恢复基因转入保持系B中，育成保持系B的具有次要恢复基因的近等基因系，作为B’或B”使用。

本发明可利用分子标记在具有次要恢复基因的分离群体中鉴定出次要恢复基因，找出恢复系或部分恢复系中位于作物不同染色体上的不表现为显性的次要恢复基因。利用与其紧密连锁的分子标记进行辅助选择，将部分次要恢复基因回交转入保持系中，育成保持系B’；另外用同样办法将其他位点的次要恢复基因也转入保持系中，育成保持系B”。

强恢复系中含有主效恢复基因和次要恢复基因。本发明利用不育系A与强恢复系杂交，并用不育系A进行多次回交，各世代选择高度可育的回交后代单株，这些高度可育的回交后代单株除带有主效恢复基因外，还有次要恢复基因，其他遗传成分与不育系A基本相同。利用这些回交后代单株作为父本，与保持系B杂交(换掉不育细胞质)，后代自交，遗传稳定后，选留与保持系相似的具有不表现为显性的次要恢复基因的后代株系。具体筛选方法可以是用这些后代株系作为父本以及轮回亲本，与不育系A测交并回交，进行鉴定。这些后代株系当选：与不育系A的测交F₁表现完全雄性不育，异交习性好，可恢复性好，并且与不育系A的回交F₁表现育性分离(证明父本含有次要恢复基因)。确定最优的株系之一为B’。

用另外一个具有不表现为显性的次要恢复基因的保持系的近等基因系为父本与A/B’F₁杂交，鉴定出雄性不育、不导致自交结实、异交习性好和可恢复性好的复交F₁的作为A/B’//B”使用，该父本作为B”使用。

利用不育系A与B’杂交或A/B’与B”杂交，生产种子供杂交制种用。进而利用A/B’和A/B’//B”与优良恢复系R配组强优势组合用于生产。

本发明对A/B不育系繁殖实行严密控制。繁殖一亩，以供A/B’//R 1万亩制种；A/B’//B”///R 100万亩制种使用。实现对保持系B保密，从而实现对不育系的控制。

本发明的优点和积极效果如下：

扩大不育细胞质的利用范围

通过种间，亚种间或品种间杂交，细胞质和细胞核的互作能够产生雄性不育，从而可以获得新的雄性不育细胞质源。实践中一些不育细胞质源难以找到完全恢复系，没能得到利用，但它们一般败育彻底，不育性稳定，配合力好。通过B’和B”的使用，能够使不育系母本中，增加次要恢复基因，与恢复系杂交后，某些次要恢复基因能够纯合，而提高杂种可育度达到正常可育水平。这样，所谓不能恢复的不育细胞质源也可能得以利用。

提高杂种F₁的可育度

完全恢复系中含有较多次要恢复基因，其中一些与B’和B”中的次要恢复基因等位，在杂交组合F₁中表现纯合，而能够提高杂种育性。A/B//B’中，B’和B”中的次要恢复基因不同，减数分裂后，能够比较均匀地分布到不育系群体中的各个个体中，与恢复系杂交配组，不但能够提高杂交种的可育度，而且能够使单株之间的可育度差异变小。生产上多数杂交水稻组合并没有达到完全可育水平，育性程度低于常规品种，结实受环境影响大，利用本发明的方法制备的不育系与恢复系杂交，能够提高杂交组合的育性水平，提高杂种在各种环境条件下的结实稳定性。T型核质互作型雄性不育系是杂交小麦生产中较好的不育类型，但其恢复源少，完全恢复所需要的恢复基因数目较多，由于恢复基因在纯合和杂合时表现不一样，选育优良恢复系有较大难度。在其不育母本中，加入杂合状态的次要恢复基因，不致引起不育母本败育不彻底，而在与恢复系杂交制种时，某些次要恢复基因能够纯合，而提高杂种育性，解决T型核质互作型雄性不育系难恢复问题，促进杂交小麦研究的成功。

提高不育系选育的效率

一个好的不育系需具备不育性好，配合力好，开花习性优良，株叶型好，抗性和米质好等优点。理论上，只有当一个稳定的品系的细胞核完全被代换到不育细胞质中，才能准确了解开花习性是否优良以及这个品系是否是保持系。因此，在育种实践中鉴定杂交后代单株的不育保持能力和开花习性事先没有预见性，容易造成最后获得的不育系败育欠彻底或开花习性不好。优良核质互作型雄性不育系的选育难度大，效率较低。利用本发明，对不育系的要求降低，其可恢复性和异交习性可较差，而通过B’和B”的使用，解决不育系可恢复性和异交习性较差的问题，这样，能够使大量的配合力好，农艺性状优良的不育系得到利用。

提高不育系异交能力

雄性不育导致不育系开花习性变差，花时推迟，许多不开颖、开花时间分散，花时不集中，柱头活力下降。败育不彻底的不育系影响较小，一般表现开花较早，花时集中，开颖好。B’和B”中的次要恢复基因对改良不育系异交习性作用大，能够从中选择到异交习性非常优异的A/B’和A/B’//B”，协调好异交习性与不育性的关系。本发明的方法关键要求不育母本不自交结实，实践表明，有时3％花粉可育度也不导致自交结实，异交习性则能够得到显著提高。例如绝大部分粳稻对野败是保持的。但一般野败粳稻核质互作型雄性不育系开花习性太差，不具实用性。利用本发明的方法能够解决这一问题。通过B’和B”的使用，降低不育母本的败育程度，能够改善野败粳稻核质互作型雄性不育系异交习性。

实现对亲本不育系的严密控制

过去核质互作型雄性不育系繁殖(A/B)时，由于面积大，容易流失保持系，对育种单位的研究成果难以保护，采用本发明，A/B繁殖一亩，可供A/B//B’100亩生产使用，可供A/B//B’///B”1万亩生产使用，可供100万亩A/B//B’///B”////R制种田使用，可供1亿亩大田种植。即种植1亿亩杂交作物，只需要A/B繁殖一亩，这样，能够很好地将B保密。采用A/B//B’///R方式，也仅需要A/B繁殖繁殖100亩。B也能够很好地保密。只要B不流失，他人则无法生产不育系A。

提高杂种优势水平

父母本亲源关系越远，杂种优势越强。但是一般与恢复系亲源关系太远的不育系难恢复，异交习性差。通过B’和B”的使用，能够协调不育系不育稳定性、异交习性、和可恢复性的关系。所以与恢复系亲源关系远的不育母本能够得到利用。这样能够扩大父母本亲源关系，提高杂种优势水平。如野败粳稻核质互作型雄性不育系的利用，可以将籼型品种间杂交稻优势提高到籼粳亚种间水平。

应用本发明的方法能够解决目前杂种优势利用中存在的核质互作型雄性不育系可恢复性欠佳，异交结实率低，杂交种可育度较低，结实受环境影响大的问题，改变由于不育系遗传单一，生产上缺乏高产优质的杂交粳稻组合和适合长江流域作双季早稻的早中熟组合，杂交中晚稻产量则呈现徘徊局面。有利于杂交水稻再一次飞跃发展。利用该发明有利于培育强优势杂交小麦组合和其他强优势杂交作物，形成我国具有自主知识产权的杂种优势利用技术，保持我国在该领域的领先地位。它的广泛应用，可能使作物杂种优势利用更加普及，在今后粮食安全保障的建立中发挥重大作用。

具体实施方式

本发明中所使用的各小麦或水稻品种均为市售可得的，并且均为育种领域中常规使用的品种。

实施例1丰源A/丰源B’//蜀恢527组合的制备

不育系A：丰源A，籼稻野败核质互作型雄性不育系(杂交水稻，200621(1)：51-53)；

保持系B：丰源B，细胞核与丰源A的相同。

恢复系R：蜀恢527(杂交水稻，2004，19(4)：12-14)

次要恢复基因提供亲本：明恢63，野败型籼稻强恢复系(作物研究，2004，18(4)：26)

1)利用丰源A与明恢63杂交，并用丰源A回交，获得丰源A//丰源A/明恢63的杂交种子。在F₁群体中选择结实高的单株，作父本用丰源A回交，获得丰源A///丰源A//丰源A/明恢63杂交种子。

2)在丰源A///丰源A//丰源A/明恢63的F₁群体中选择结实高的单株，作父本用丰源A回交，获得丰源A////丰源A///丰源A//丰源A/明恢63杂交种子。

3)在丰源A////丰源A///丰源A//丰源A/明恢63的F₁群体中选择结实高的单株，作父本用丰源A回交，获得丰源A/////丰源A////丰源A///丰源A//丰源A/明恢63杂交种子。

4)在丰源A/////丰源A////丰源A///丰源A//丰源A/明恢63的F₁群体中选择结实高的单株，作父本用丰源A回交，获得丰源A//////丰源A/////丰源A////丰源A///丰源A//丰源A/明恢63杂交种子。

5)在丰源A//////丰源A/////丰源A////丰源A///丰源A//丰源A/明恢63的F₁群体中选择结实高的单株，作父本用丰源B回交，获得丰源B///////丰源A//////丰源A/////丰源A////丰源A///丰源A//丰源A/明恢63杂交种子。

6)在丰源B///////丰源A//////丰源A/////丰源A////丰源A///丰源A//丰源A/明恢63的F₁(即BC₆F₁)群体中选择性状与丰源B完全相似的单株。在BC₆F₂中仍然选择性状与丰源B完全相似的单株，这些单株中，有较大部分含有主效恢复基因和次要恢复基因。BC₆F₂自交结实得到BC₆F₃，它们的次要恢复基因能够继续纯合，选择性状整齐的BC₆F₃株系中的单株与丰源A测交。

丰源A/BC₆F₃的F₁中，筛选保持完全不育(即该BC₆F₃不含有主效恢复基因和显性次要恢复基因)、异交习性变优的组合，并当选该BC₆F₃株系，同时用丰源A/BC₆F₃的F₁作母本与该株系回交，以及丰源A/BC₆F₃的F₁作母本与恢复系蜀恢527杂交，如果上述回交F₁育性发生分离，说明BC₆F₃株系含有不表现为显性的次要恢复基因；如果与恢复系杂交的F₁比丰源A/蜀恢527可育程度高以及可育性更加稳定，说明次要恢复基因的存在提高了杂种育性；当选作为杂交亲本的BC₆F₃株系，在其中选择单株作为丰源B’。

丰源A/丰源B’F₁，在自然条件下表现完全不育，异交能力提高，与优良恢复系蜀恢527制种，制种产量较丰源A/蜀恢527提高31.3％。丰源A/丰源B’//蜀恢527 F₁自交结实率高，群体整齐，外形与丰源A/蜀恢527F₁一致。受抽穗期低温影响，丰源A/蜀恢527 F₁的自交结实率仅为76.8％，丰源A/丰源B’//蜀恢527 F₁自交结实率达到88.5％，提高了杂种结实稳定性。丰源A/丰源B’//蜀恢527 F₁产量较丰源A/蜀恢527提高了4.8％。

实施例2湘8A/湘8B’//湘8B”///蜀恢527组合的制备

协青早A是一个核质互作型水稻雄性不育系，零轮是一个具有次要恢复基因的水稻品系。我们发现，协青早A/零轮F₁仅表现0.12％的花粉可育度，自交结实为0，将零轮细胞核完全回交到协青早A细胞质中，则表现为完全雄性可育。表明在杂合状态下，零轮的次要恢复基因基本上不起雄性可育的作用，而在纯合条件下，其作用则能够导致完全雄性可育。

我们利用121个在染色体上比较均匀分布的SSR分子标记在232个协青早A/零轮///协青早A/零轮//零轮的杂种F₁植株中，发现了零轮6个次要恢复基因，分布于第2、5、6、8、10、12染色体上，它们分别与SSR分子标记(Cornell大学植物育种系Susan McCouch实验室)RM211、BM55、RM275、BM189、RM244、RM270紧密连锁，将它们分别定名为Pf1、Pf2、Pf3、Pf4、Pf5、Pf6。这些次要恢复基因的遗传表现隐性和不完全隐性。次要恢复基因纯合后，提高花粉可育度的效应表现为极显著。我们利用这6个分子标记进行辅助选择，将零轮的次要恢复基因Pf1、Pf2、Pf3通过回交转入湘8B中，育成湘8B’；将零轮的次要恢复基因Pf4、Pf5、Pf6也通过回交转入湘8B中，育成湘8B”。过程如下。

不育系A：籼稻野败核质互作型雄性不育系湘8A(杂交水稻，2002，17(2)：3)

保持系B：湘8B，细胞核与湘8A的相同

恢复系R：蜀恢527(杂交水稻，2004，19(4)：12-14)

次要恢复基因提供亲本：零轮(杂交水稻，1997，12(1)：7-10)1)湘8B’的制备

湘8B为母本与零轮杂交，获得湘8B/零轮F₁。

湘8B/零轮F₁与湘8B回交，获得湘8B/湘8B//零轮回交群体BC₁F₁利用RM211、BM55、RM275分子标记鉴定BC₁F₁，选择具有次要恢复基因Pf1、Pf2、Pf3的单株作父本，再与湘8B杂交，获得回交群体BC₂F₁。

利用RM211、BM55、RM275分子标记鉴定BC₂F₁，选择具有次要恢复基因Pf1、Pf2、Pf3的单株作父本，再与湘8B杂交，获得回交群体BC₃F₁。

利用RM211、BM55、RM275分子标记鉴定BC₃F₁，选择具有次要恢复基因Pf1、Pf2、Pf3的单株作父本，再与湘8B杂交，获得回交群体BC₄F₁。

利用RM211、BM55、RM275分子标记鉴定BC₄F₁，选择具有次要恢复基因Pf1、Pf2、Pf3的单株作父本，再与湘8B杂交，获得回交群体BC₅F₁。

利用RM211、BM55、RM275分子标记鉴定BC₅F₁，选择具有次要恢复基因Pf1、Pf2、Pf3的单株作父本，再与湘8B杂交，获得回交群体BC₆F₁，自交产生BC₆F₂。

在BC₆F₂中利用RM211、BM55、RM275分子标记鉴定，选择具有纯合次要恢复基因Pf1、Pf2、Pf3的性状与湘8B完全相似的单株，自交产生BC₆F₃。BC₆F₃株系为父本与湘8A测交。当选保持完全不育，异交习性优良的测交F₁。同时用该测交F₁与恢复系杂交，如果与恢复系杂交的F₁比湘8A/蜀恢527可育程度高以及可育性更加稳定，说明次要恢复基因的存在提高了杂种育性。当选作为杂交亲本的BC₆F₃株系，在其中选择单株作为湘8B’。同时测定湘8A/湘8B’//湘8B’F₁不表现雄性不育。

2)湘8B”的制备

采用上述同样原理和程序，利用BM189、RM244、RM270分子标记，将Pf4、Pf5、Pf6次要恢复基因转入湘8B中，育成湘8B”。同时测定湘8A/湘8B”//湘8B”的F₁不表现雄性不育，

湘8A/湘8B’//湘8B”F₁，在自然条件下表现雄性不育，其异交能力和可恢复性均高于湘8A。与优良恢复系蜀恢527制种，制种产量较湘8A/蜀恢527提高22.4％。湘8A/湘8B’//湘8B”///蜀恢527 F₁自交结实率高，可育性稳定。湘8A/蜀恢527 F₁自交结实率仅为74.5％，湘8A/湘8B’//湘8B”///蜀恢527F₁自交结实率达到91.5％，产量较湘8A/蜀恢527 F₁提高了6.2％。

实施例3Caiapo A/CaiapoB’//CaiapoB”///广亲26窄早组合的制备

不育系A：Caiapo A。细胞核与Caiapo B的相同。Caiapo A是一个粳稻野败核质互作雄性不育系，开花习性差，闭颖率达43％，开花迟，花时分散，不能够用于商业制种。与广亲和恢复系广亲26窄早杂交，F₁结实仅为67.3％。

保持系B：CaiapoB，爪哇型粳稻品种。(Theoretical and Applied Genetics，2001，102(1)：41-52)。

恢复系R：广亲26窄早(杂交水稻，1996，7(6)：4-7)

次要恢复基因提供亲本：明恢63，野败型籼稻强恢复系(作物研究，2004，18(4)：26)

1)Caiapo B’的制备

1)利用Caiapo A与明恢63杂交，并用Caiapo A回交，获得Caiapo A//CaiapoA/明恢63的杂交种子。在F₁群体中选择结实高的单株，作父本用Caiapo A回交，获得Caiapo A///Caiapo A//Caiapo A/明恢63杂交种子。

2)在Caiapo A///Caiapo A//Caiapo A/明恢63的F₁群体中选择结实高的单株，作父本用Caiapo A回交，获得CaiapoA////CaiapoA///Caiapo A//CaiapoA/明恢63杂交种子。

3)在Caiapo A////Caiapo A///Caiapo A//Caiapo A/明恢63的F₁群体中选择结实高的单株，作父本用Caiapo A回交，获得Caiapo A/////Caiapo A////CaiapoA///CaiapoA//CaiapoA/明恢63杂交种子。

4)在CaiapoA/////CaiapoA////CaiapoA///CaiapoA//CaiapoA/明恢63的F₁群体中选择结实高的单株，作父本用Caiapo B回交，获得Caiapo B//////CaiapoA/////Caiapo A////Caiapo A///CaiapoA//CaiapoA/明恢63杂交种子。

5)在Caiapo B //////CaiapoA /////CaiapoA////CaiapoA///CaiapoA//CaiapoA/明恢63的F₁(即BC₅F₁)群体中选择性状与CaiapoB完全相似的单株。在BC₅F₂中仍然选择性状与CaiapoB完全相似的单株，这些单株中，有较大部分含有主效恢复基因和次要恢复基因。BC₅F₂自交结实得到BC₅F₃，它们的次要恢复基因能够继续纯合，选择性状整齐的BC₅F₃株系中的单株作为父本和轮回亲本与CaiapoA测交并回交。以及用CaiapoA/BC₅F₃的F₁作母本与恢复系广亲26窄早杂交。这些BC₅F₃株系当选为与Caiapo B相似的具有不表现为显性的次要恢复基因的近等基因系：与Caiapo A的测交F₁表现完全雄性不育，异交习性好，可恢复性好；并且与Caiapo A的回交F₁表现育性分离(证明父本含有次要恢复基因)；并且与恢复系杂交的复交F₁比CaiapoA/广亲26窄早F₁可育程度高以及可育性更加稳定(说明次要恢复基因的存在提高了杂种育性)。确定一个优良的具有不表现为显性的次要恢复基因的近等基因系作为B’。

2)Caiapo A的B”的制备

用另外一个具有不表现为显性的次要恢复基因的保持系的近等基因系为父本与Caiapo A/B’F₁杂交，鉴定出雄性不育、不导致自交结实、异交习性好和可恢复性好的复交F₁，该近等基因系作为Caiapo A的B”使用。

Caiapo A/Caiapo B’//Caiapo B”F₁在自然条件下表现完全不育，异交习性改善，闭颖率仅17％，开花与恢复系基本同步，与恢复系广亲26窄早的制种异交率达到33.2％，制种产量较Caiapo A/广亲26窄早提高87.6％。CaiapoA/CaiapoB’//CaiapoB”///广亲26窄早杂种F₁自交结实率高，达到83.4％。而Caiapo A/广亲26窄早F₁自交结实率仅为67.3％。Caiapo A/Caiapo B’//CaiapoB”///广亲26窄早F₁产量较Caiapo A/广亲26窄早F₁提高了27.6％。

Caiapo A/Caiapo B’//Caiapo B’F₁和CaiapoA/Caiapo B”//CaiapoB”F₁不表现雄性不育，只要Caiapo B保密，可以实现对Caiapo A的控制。实施例4小麦T753369A/T753369B’//T恢7269-10组合的制备

不育系A：T753369A，(华北农学报，200419(4)：21-23)

小麦T型核质互作型雄性不育系T753369A是一个小麦T型核质互作型雄性不育系，性状优良、配合力好，但是与恢复系T恢7269-10杂交，所配杂种结实不正常。

保持系B：T753369B，细胞核与T753369A的相同。

恢复系R：T恢7269-10(遗传学报，2003，30(5)459-464)

次要恢复基因提供亲本：原恢3号(核农学报，2000，14(1)：1-5)

1、T753369B’的制备

1)利用T753369A与原恢3号杂交，并用T753369A回交，获得T753369A//T753369A/原恢3号的杂交种子。在F₁群体中选择结实高的单株，作父本用T753369A回交，获得T753369A///T753369A//T753369A/原恢3号杂交种子。

2)在T753369A///T753369A//T753369A/原恢3号的F₁群体中选择结实高的单株，作父本用T753369A回交，获得T753369A////T753369A///T753369A//T753369 A/原恢3号杂交种子。

3)在T753369A////T753369A///T753369A//T753369A/原恢3号的F₁群体中选择结实高的单株，作父本用T753369A回交，获得T753369A/////T753369A////T753369A///T753369A//T753369A/原恢3号杂交种子。

4)在T753369A/////T753369A////T753369A///T753369A//T753369A/原恢3号的F₁群体中选择结实高的单株，作父本用T753369B回交，获得T753369B //////T753369A/////T753369A////T753369A///T753369A//T753369A/原恢3号杂交种子。

5)在T753369 B //////T753369A/////T753369A////T753369A///T753369A//T753369A/原恢3号的F₁(即BC₅F₁)群体中选择性状与T753369B完全相似的单株。在BC₅F₂中仍然选择性状与T753369B完全相似的单株，这些单株中，有较大部分含有主效恢复基因和次要恢复基因。BC₅F₂自交结实得到BC₅F₃它们的次要恢复基因能够继续纯合，选择性状整齐的BC₅F₃株系中的单株作为父本和轮回亲本与T753369A测交并回交。以及T753369A/BC₅F₃的F₁作母本与恢复系T恢7269-10杂交。这些BC₅F₃株系当选为与T753369B相似的具有不表现为显性的次要恢复基因的近等基因系：与T753369A的测交F₁表现完全雄性不育；并且与T753369A的回交F₁表现育性分离(证明父本含有次要恢复基因)；并且与恢复系T恢7269-10杂交的复交F₁比T753369A/T恢7269-10 F₁可育程度高以及可育性更加稳定(说明次要恢复基因的存在提高了杂种育性)。确定一个优良的具有不表现为显性的次要恢复基因的近等基因系作为B’。

2、T753369B”的制备

用另外一个具有不表现为显性的次要恢复基因的保持系的近等基因系为父本与T753369A/B’F₁杂交，鉴定出雄性不育、不导致自交结实和可恢复性好的复交F₁，该近等基因系作为T753369A的B”使用。

T753369A/T753369B’//T753369B”F₁在自然条件下表现雄性不育，与恢复系T恢7269-10杂交，杂种F₁结实率正常，达到90.4％，产量较T753369A/T恢7269-10 F₁提高了12.1％。而T753369A/T恢7269-10 F₁的自交结实率仅为73.9％。

Claims (7)

1.一种利用核质互作型雄性不育系的次要恢复基因进行杂交作物育种方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)选取核质互作型雄性不育系A、其保持系B、和恢复系R；

2)制备保持系B的具有次要恢复基因的近等基因系B’：

利用分子标记在具有次要恢复基因的分离群体中鉴定出次要恢复基因，找出恢复系或部分恢复系中位于作物不同染色体上的隐性或不完全隐性的次要恢复基因，利用与其紧密连锁的分子标记进行辅助选择，将上述隐性或不完全隐性的次要恢复基因通过回交转入保持系B中，育成保持系B’；

3)A与B’杂交，并鉴定出完全雄性不育的A/B’F₁；

4)利用完全雄性不育的A/B’F₁作为母本与恢复系R杂交制种，生产A/B’//R F₁杂交作物种子。

2.一种利用核质互作型雄性不育系的次要恢复基因进行杂交作物育种方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)选取核质互作型雄性不育系A、其保持系B、和恢复系R；

2)制备保持系B的具有次要恢复基因的近等基因系B’以及B’的近等基因系B”：

利用分子标记在具有次要恢复基因的分离群体中鉴定出次要恢复基因，找出恢复系或部分恢复系中位于作物不同染色体上的隐性或不完全隐性的次要恢复基因，利用与其紧密连锁的分子标记进行辅助选择，将部分上述隐性或不完全隐性的次要恢复基因通过回交转入保持系B中，育成近等基因系B’，将其余的上述隐性或不完全隐性的次要恢复基因通过回交转入B’中，育成近等基因系B”，其中，B’和B”具有不同的或者在染色体上的位置不同的次要恢复基因；

3)A与B’杂交，然后A/B’再与B”杂交，并鉴定出完全雄性不育的A/B’//B”F₁；

4)利用完全雄性不育的A/B’//B”F₁作为母本与恢复系R杂交制种，生产A/B’//B”///R F₁杂交作物种子。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述核质互作型雄性不育系为各种不育性稳定的作物核质互作型雄性不育系。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述核质互作型雄性不育系为不育性稳定的水稻核质互作型雄性不育系或小麦核质互作型雄性不育系。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述水稻核质互作型雄性不育系为丰源A、或湘8A、Caiapo A。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述小麦核质互作型雄性不育系为T型小麦核质互作型雄性不育系。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述T型小麦核质互作型雄性不育系为小麦T753369A。