CN104774939B - 与红麻细胞质不育相关的snp分子标记及其扩增引物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种与红麻细胞质不育相关的SNP分子标记及其扩增引物，所述分子标记来自atp9基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，第290bp处为突变位点，碱基为A或T。当突变位点碱基为T，红麻细胞质不育，当突变位点碱基为A，红麻细胞质可育。所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。利用本发明所提供SNP分子标记和引物，可获得一种新的鉴定红麻不育细胞质的分子方法。

Description

与红麻细胞质不育相关的SNP分子标记及其扩增引物
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体地说，涉及与红麻细胞质不育相关的SNP分子标记及其扩增引物。
背景技术
红麻(Hibiscμs cannabinμs L.)是锦葵科(Malvaceae)木槿属(Hibiscμs)一年生草本韧皮纤维作物，以收获茎秆或韧皮纤维为栽培目的。而杂种优势的利用极大的提高了红麻的茎秆和韧皮纤维产量，红麻表现出强大的杂种优势，其优势率高达35％～40％。长期以来，红麻杂种优势利用是国内外红麻育种的主攻目标，而杂种优势的利用有赖于红麻不育细胞质的发掘，因此，发掘新的、不同类型的不育细胞质成为红麻杂交育种迫切要求。周瑞阳(2008)报道的红麻CMS系均为野败型UG93细胞质，在生产上大面积推广来源于单一细胞质的杂交种存在较大的风险，极可能成为某一病害生理小种的哺育品种，引起这一病害大流行。因此，开发出能准确区别现有的不育细胞质的方法具有重要的意义。
为了选育新的雄性不育细胞质，一般利用现有雄性不育保持系与现有种质资源测交的方法筛选，不但工作量很大，而且带有很大的盲目性。若能找到一种快速准确鉴别红麻雄性不育细胞质的方法，则可利用这种方法对现有种质资源进行鉴定，以发掘出新的雄性不育细胞质资源，继而选育出新的雄性不育系。由此将极大地提高工作效率，并有利于现有雄性不育系及其杂交种的知识产权保护。
SNP(Single Nucleotide Polymorphism,单核苷酸多态性)技术，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP，而将分布在基因编码区的SNP称为cSNP,属功能性突变。
关于利用线粒体基因atp9的编码区的cSNP位点鉴定红麻不育细胞质的方法，目前未见相关报道，该鉴定方法能有效的鉴定出来源UG93野败型突变体的不育细胞质，保护现有雄性不育系及其杂交种的知识产权保护。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与红麻细胞质不育相关的SNP分子标记及其扩增引物。
为了实现本发明的目的，本发明首先提供一种与红麻细胞质不育相关的SNP分子标记，所述分子标记来自atp9基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，第290bp处为突变位点，碱基为A或T。
进一步地，所述突变位点的碱基为T时，红麻细胞质不育；所述突变位点的碱基为A时，红麻细胞质可育。
本发明还提供了用于扩增所述SNP分子标记的引物对，所述引物对中，正向引物atp9QF如SEQ ID No.2所示、反向引物atp9QR如SEQ ID No.3所示。
本发明还提供了用于检测所述SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒含有正向引物atp9QF如SEQ ID No.2所示、反向引物atp9QR如SEQ ID No.3所示。
本发明还提供了一种检测红麻细胞质不育的方法，所述方法为：以待测红麻样品的基因组DNA为模板，利用前述引物对，通过PCR反应进行扩增，并对扩增产物进行测序，根据测序结果第290位点处的碱基判断样品细胞质是否不育。
进一步地，所述碱基为T时，红麻细胞质不育；所述碱基为A时，红麻细胞质可育。
本发明还提供了一种检测红麻细胞质不育的试剂盒，所述试剂盒含有前述引物对。
本发明还提供了所述SNP分子标记在检测红麻细胞质不育中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明基于线粒体基因atp9全长测序的基础上，通过比对红麻不育系、保持系以及F1代材料间的序列，发掘不育细胞质与可育细胞质材料间同一位点的碱基差异即cSNP，从而提供了一种与红麻细胞质不育相关的SNP分子标记及其扩增引物。
利用本发明所提供的SNP分子标记能将具有红麻不育细胞质的材料区别开来，非常适用于鉴别材料间不育细胞质的真实性，对保护红麻细胞质雄性不育系的知识产权起到重要作用。
附图说明
图1为本发明实施例1中红麻线粒体基因atp9扩增图谱；
其中，M：marker，泳道1：不育系P3A；泳道2：保持系P3B；泳道3：F1。
图2为本发明实施例1中具有不育细胞质和可育细胞质材料的atp9序列比对部分截图。
图3为本发明实施例2中已知不育细胞质和可育细胞质材料的atp9序列比对部分截图。
图4为本发明实施例2中未知不育细胞质和可育细胞质材料的atp9序列比对部分截图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下列实施例中所用方法如无特殊说明均为常规方法。所用原料都可从商业途径获得。引物合成及测序工作均由华大基因完成。
实施例1与红麻细胞质不育相关的SNP分子标记的发掘
本实施例的试验材料为红麻细胞质雄性不育系P3A、保持系P3B及F1代，其中P3A、P3B均为公知公用品种，具体信息如下：
P3A：又名粤丰1号A，见发明专利ZL 200510019454.4(公开号CN100415083C)。
P3B：又名粤丰1号B，广西大学周瑞阳老师选育的细胞质雄性不育系P3A的雄性不育保持系，见发明专利ZL 200510019454.4(公开号CN100415083C)。
F1代：以红麻细胞质雄性不育系P3A为母本，恢复系福红992为父本组配的杂交F1代，F1代的细胞质在理论上与亲本不育系具有相同的雄性不育细胞质。
1.基于测序发掘线粒体atp9基因的特异cSNP位点
(1)线粒体atp9基因编码区引物设计
基于红麻细胞质雄性不育系P3A线粒体基因atp9全长的序列
SEQ ID No.1，设计了atp9基因编码区特异引物：
atp9QF：ATGAATGATAAAGCGCGTGACGAGA；
atp9QR：TCAGCACGGTGCAGTCTCCACTTTA。
(2)atp9基因编码区扩增
分别以红麻不育系P3A、保持系P3B和F1代的gDNA为模板进行PCR扩增，扩增的20μL反应体系包括20-50ng/μL的gDNA模板，2μL的10×Bμffer，0.6μM的上下游引物，用水补足20μL。该反应混合物首先95℃预变性3min，然后94℃40s，63℃20s，72℃20s，扩增35个循环，最后72℃终延伸3min，PCR反应产物用1％的琼脂糖检测。红麻线粒体基因atp9的扩增结果显示，这三个材料均获得了大小约为300bp的电泳条带，经测序得知此这三条带大小均为339bp(见图1)。
(3)已知不育细胞质和可育细胞质材料间特异cSNP位点发掘
分别选取上述材料3个gDNA克隆子进行测序，采用DNAMAN软件进行序列比对，结果显示，具有不育细胞质的不育系和F1代与具有可育细胞质的保持系材料在第290位点处存在碱基差异，其中具有不育细胞质的材料均为碱基T，而具有可育细胞质的材料在相应位点为碱基A。因此，基于atp9基因的第290位点处存在的T/A碱基转换的cSNP位点可以鉴定出红麻不育细胞质(见图2)。
实施例2对已知不育细胞质和可育细胞质的检测
选择2类材料进行检测：(1)现有红麻细胞质雄性不育系K03A，722A，L23A，917A，F3A，均为雄性不育细胞质；(2)现有保持系K03B，722B，L23B，917B，F3B，均为可育细胞质。上述材料均为公知公用品种，具体信息如下：
K03A：桂科鉴字第[2004]152号，广西大学周瑞阳老师选育的细胞质雄性不育系，见发明专利ZL 200510019454.4(公开号CN100415083C)。
722A：桂科鉴字第[2004]152号，广西大学周瑞阳老师等选育的细胞质雄性不育系，以UG93为细胞质供体，722为细胞核供体，经饱和回交选育而成，完全叶，茎秆绿色。
L23A：桂科鉴字第[2007]177号，广西大学周瑞阳老师选育的细胞质雄性不育系。
917A：桂科鉴字[2004]第152号，广西大学周瑞阳老师等选育的细胞质雄性不育系，以UG93为细胞质供体，917为细胞核供体，经饱和回交选育而成，裂叶，茎秆浅红色。
F3A：又名福红3号，见发明专利ZL 200510019454.4，公开号CN100415083C。
K03B：广西大学周瑞阳老师选育的细胞质雄性不育系K03A的雄性不育保持系，见发明专利ZL 200510019454.4(公开号CN100415083C)。
722B：又名722，中国农业科学院麻类研究所选育的红麻品种，为722A的轮回亲本(细胞核供体亲本)，722A的相应保持系。
L23B：L23A的轮回亲本(细胞核供体亲本)，为L23A的相对应保持系。
917B：又名917，中国农业科学院麻类研究所选育的红麻品种，为917A的轮回亲本(细胞核供体亲本)，917A的相应保持系。
F3B：广西大学周瑞阳老师选育的细胞质雄性不育系F3A的雄性不育保持系，见发明专利ZL 200510019454.4，公开号CN100415083C。
选用atp9基因的cSNP位点，操作方法参见实施例1，所用引物对为atp9QF/atp9QR。
基于不同材料atp9基因测序和比对的基础，具有不育细胞质的不育系和F1代与具有可育细胞质的保持系材料在第290位点处存在碱基差异，其中具有不育细胞质的材料均为碱基T，而在相应位置具有可育细胞质的材料为碱基A，因此，第290位点存在的T/A碱基转换的cSNP位点可以鉴定出红麻不育细胞质。
结果显示，所有含不育细胞质材料的在第290位点为碱基T，而具有可育细胞质的材料在相应位点处为碱基A，与图2所标位置完全一致。说明该cSNP位点完全可用于不育细胞质和可育细胞质的鉴别。
实施例3对未知细胞质育性的红麻品种资源的细胞质检测
随机挑选6份红麻品种资源进行了cSNP位点检测工作，具体如下：
选用atp9基因的cSNP位点，操作方法参见实施例1，所用引物对为atp9QF/atp9QR。
结果显示，筛选出5份与不育细胞质一致的资源，这5份资源分别为：UG93-2MS-1，UG93-2MS-2，UG93-2MS-3，UG93-2-22，KN250(图4)，其中UG93-2-22是UG93野生型材料，在田间表现为可育，但检测显示其为不育细胞质，推测UG93-2-22具有恢复基因。利用上述不育细胞质资源为母本，以现有保持系为父本，已成功选育出了新的雄性不育系。由此表明上述cSNP位点用于鉴别红麻细胞质育性是可靠的。而品种福红992在第290位点具有与可育细胞质一致cSNP位点(图4)。
综上所述，本发明基于线粒体atp9基因测序的基础上发掘的cSNP位点对红麻已知和未知细胞质资源进行了检测，从本发明的结果中可以看出，具有不育细胞质的材料在第290位点的碱基为T，而具有可育细胞质材料在相应位点为碱基A，这些材料的atp9基因都经过了3次重复测序，在第290位点处碱基表现出稳定的T/A碱基转换，因此本发明的方法非常适用于对含红麻雄性不育细胞质的红麻细胞质雄性不育系材料进行鉴定和进行新红麻细胞质雄性不育系材料的分子标记辅助选育。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种与红麻细胞质不育相关的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记来自atp9基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，第290bp处为突变位点，碱基为A或T。
2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述突变位点的碱基为T时，红麻细胞质不育；所述突变位点的碱基为A时，红麻细胞质可育。
3.用于扩增权利要求1或2所述SNP分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对中，正向引物atp9QF如SEQ ID No.2所示、反向引物atp9QR如SEQ ID No.3所示。
4.用于检测权利要求1或2所述SNP分子标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有正向引物atp9QF如SEQ ID No.2所示、反向引物atp9QR如SEQ ID No.3所示。
5.一种检测红麻细胞质不育的方法，其特征在于，所述方法为：
以待测红麻样品的基因组DNA为模板，利用权利要求3所述的引物对，通过PCR反应进行扩增，并对扩增产物进行测序，根据测序结果第290位点处的碱基判断样品细胞质是否不育。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碱基为T时，红麻细胞质不育；所述碱基为A时，红麻细胞质可育。
7.一种检测红麻细胞质不育的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求3所述引物对。
8.权利要求1或2所述的SNP分子标记在检测红麻细胞质不育中的应用。
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