CN112391492A - 一种木犀属专用引物及快速鉴定木犀属物种的方法 - Google Patents

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王贤荣
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Abstract

本发明涉及植物鉴定技术领域，具体涉及一种木犀属专用引物及快速鉴定木犀属物种的方法。本发明公开了一种木犀属物种鉴定专用引物及其检测和鉴定方法，该专用引物具体引物序列为：rpl32‑trnL F=SEQ ID NO.1=5’‑TTGGAATAATCTGAATCTGAATCGACTTGAC‑3’，rpl32‑trnL R=SEQ ID NO.2=5’‑TAAGTATCCGATAATACTCAAGTTC‑3’；利用本发明提供的引物对疑似木犀属物种的DNA进行扩增，仅木犀属物种可以特异性扩增出323bp的条带。本发明可用于快速检测本属物种，对木犀属物种的整理、分类研究,种质资源的保护利用和分子鉴定都起十分重要的作用。

Description

一种木犀属专用引物及快速鉴定木犀属物种的方法
技术领域
本发明涉及植物鉴定技术领域，具体涉及一种木犀属专用引物及快速鉴定木犀属物种的方法。
背景技术
木犀属（Osmanthus Lour.）属于木犀科（Oleaceae），最新的分子系统学研究表明，木犀属包括26个物种，其中有中国分布22个种。木犀属物种都为多年生常绿木本植物，花芳香而美丽，具有很高的观赏价值和经济价值，广泛应用于园林、食品、香精香料行业。
随着对木犀属的研究逐渐深入，快速且准确地鉴定木犀属物种是亟需解决的一大难题。目前，判断一个物种是否为木犀属的方法多是通过树势、叶片形态和着生方式、节间、花形态等传统手段，易受环境因素和人为因素影响。且木犀属物种的某些形态特征与木犀科其他属类似，传统方法难以准确鉴别。
分子鉴定方法可以直接检测出不同物种在DNA水平上的差异，不受生长阶段、环境和人为因素的影响，具有较高的特异性和准确性，能快速准确鉴定传统手段难以鉴定的物种。目前，还未有快速鉴定木犀属物种的分子鉴定方法。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种木犀属物种鉴定专用引物，克服以往形态学鉴定上存在的不足，提供准确可靠、简单快捷且灵敏度高的分子鉴定方法，对木犀属物种的整理、分类研究、种质资源的保护和分子鉴定都具有重要意义。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的方案为：
一种木犀属物种鉴定的专用引物，目标基因区域为rpl32与trnL基因间隔区，其具体引物序列如下：
rpl32-trnL F=SEQ ID NO.1=5’-TTGGAATAATCTGAATCTGAATCGACTTGAC-3’
rpl32-trnL R=SEQ ID NO.2=5’-TAAGTATCCGATAATACTCAAGTTC-3’
一种应用所述的专用引物快速鉴定木犀属物种的方法，包括以下步骤：
1）提取待测样品DNA；
2）使用rpl32-trnL引物对，以提取的DNA为模板，进行PCR扩增；
3）PCR产物利用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，根据扩增产物的有无判断待测样品是否为木犀属物种。
步骤1）中，使利用天根生化科技有限公司的高效植物基因组DNA提取试剂盒（DP305）完成待测样品的DNA提取。
步骤2）中，25μL PCR扩增反应体系包括：2μL DNA模板；1μL正向引物；1μL反向引物；12.5μL Mix；7.5μL DDH2O。
步骤2）中，PCR扩增反应程序为：预变性97℃ 2min；30循环，97 °C 1min，57.3 °C1min，72 °C 1min；延伸72℃ 7min。
步骤3）中，琼脂糖凝胶电泳的制胶比例为：30mL TBE 1× ；0.45g琼脂糖；3μL核酸染料。
步骤3）中，根据待测样品PCR产物判断其是否为木犀属物种。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
1）结果准确，可靠性高：利用本发明对疑似木犀属物种进行检测和鉴定，检测结果100%准确，可准确鉴定出待测物种是否为木犀属物种；
2）采样方便，实用性强：在植物的各个组织和发育时期，均可取样检测，不受取样部位、季节、地点和其他环境的限制；
3）操作简单快捷：利用本发明对待测样品进行DNA提取、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳后即可判断其是否为木犀属物种，整个鉴定过程一般可在4小时之内完成；
4）专用引物特异性高，适用范围广：本发明可对所有疑似木犀属的物种进行鉴定，根据琼脂糖凝胶电泳结果即可得出结论。
附图说明
图1是专用引物扩增所得产物的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合具体附图对本发明做进一步说明。
实施例1
一种木犀属物种鉴定的专用引物，其设计过程包括以下步骤：
采用Illumina HiSeq 2500高通量测序平台，对桂花叶片进行叶绿体全基因组测序。木犀属物种叶绿体基因组中的rpl32基因与trnL基因间隔区中出现323bp的基因特异性丢失，根据这一特性，利用Primer 5.0 软件对目标基因序列进行引物设计。最终选择1对多态性号、重复性高的引物作为木犀属物种鉴定的专用引物，引物序列如下：
rpl32-trnL F=SEQ ID NO.1=5’-TTGGAATAATCTGAATCTGAATCGACTTGAC-3’
rpl32-trnL R=SEQ ID NO.2=5’-TAAGTATCCGATAATACTCAAGTTC-3’
实施例2
应用实施例1专用引物快速鉴定木犀属物种的方法，包括以下步骤：
1）提取[s1] [L2] （其中1到10号为木犀属样品1-3：桂花Osmanthus fragrans，4：山桂花Osmanthus delavayi，5：野桂花Osmanthus yunnanensis，6：美丽木犀Osmanthus decorus，7：柊树Osmanthus heterophyllus，8：红柄木犀Osmanthusarmatus，9：短丝木犀Osmanthusserrulatus，10：石山桂花Osmanthus fordii；11-12为外类群物种11：流苏树Chionanthus retusus，12：云南木犀榄Olea tsoongii）DNA，使用天根生化科技有限公司的高效植物基因组DNA提取试剂盒（DP305）完成。
2）根据rpl32-trnL引物，以待测样品DNA为模板，按照如下的PCR反应体系和反应程序，进行PCR扩增。
25μL PCR扩增反应体系包括：2μL DNA模板；1μL正向引物；1μL反向引物；12.5μLMix；7.5μL DDH2O; 所用Mix为天根生化科技有限公司的2×Taq PCR预混试剂（KT201）；
PCR扩增反应程序为：预变性97℃ 2min；30循环，97 °C 1min，57.3 °C 1min，72 °C1min；延伸72℃ 7min；所用PCR仪为卡尤迪CF-F9677。
3）1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，具体步骤如下：
1. 制胶：在锥形瓶中放入30mL 1×TBE和0.45g琼脂糖，微波炉加热至琼脂糖完全熔化后加入3μL核酸染料；所用核酸染料为根生化科技有限公司的10000×GeneGreen（RT210）；
2. 倒胶：将制好的胶迅速沿着胶板一侧倒入，并放置梳子，静置约30min；待胶板充分凝固后，垂直拔起梳子，转移至移至电泳槽内，电泳液为1×TBE；
3. 点样：取5μL待测样品的PCR产物，点入胶孔中，并点入3μL Maker做对照；
4. 接通电源，200V 30min；所用电泳仪为DL-EP300；
5. 电泳结束后，关掉电源，取出胶板，将凝胶置入紫外透射检测仪上，打开紫外灯，观察条带；
6. 拍照记录，判断扩增产物的大小，若323bp（双链在646bp处左右[s3] ）则确定其为木犀属物种，1所示1到10号泳道可鉴定为木犀属物种。[s4] [L5]
实施例3
1）提取待测样品 DNA，使用天根生化科技有限公司的高效植物基因组DNA提取试剂盒（DP305）完成。
2）根据rpl32-trnL引物，以待测样品DNA为模板，按照如下的PCR反应体系和反应程序，进行PCR扩增。
25μL PCR扩增反应体系包括：2μL DNA模板；1μL正向引物；1μL反向引物；12.5μLMix；7.5μL DDH2O; 所用Mix为天根生化科技有限公司的2×Taq PCR预混试剂（KT201）；
PCR扩增反应程序为：预变性95℃ 2min；30循环，95 °C 1min，57.0 °C 1min，70 °C1min；延伸70℃ 10min；所用PCR仪为卡尤迪CF-F9677。
3）1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，具体步骤如下：
1. 制胶：在锥形瓶中放入30mL 1×TBE和0.45g琼脂糖，微波炉加热至琼脂糖完全熔化后加入3μL核酸染料；所用核酸染料为根生化科技有限公司的10000×GeneGreen（RT210）；
2. 倒胶：将制好的胶迅速沿着胶板一侧倒入，并放置梳子，静置约30min；待胶板充分凝固后，垂直拔起梳子，转移至移至电泳槽内，电泳液为1×TBE；
3. 点样：取5μL待测样品的PCR产物，点入胶孔中，并点入3μL Maker做对照；
4. 接通电源，200V 30min；所用电泳仪为DL-EP300；
5. 电泳结束后，关掉电源，取出胶板，将凝胶置入紫外透射检测仪上，打开紫外灯，观察条带；
6. 拍照记录，判断扩增产物的大小，确定其是否为木犀属物种。
实施例4
1）提取待测样品 DNA，使用天根生化科技有限公司的高效植物基因组DNA提取试剂盒（DP305）完成。
2）根据rpl32-trnL引物，以待测样品DNA为模板，按照如下的PCR反应体系和反应程序，进行PCR扩增。
25μL PCR扩增反应体系包括：2μL DNA模板；1μL正向引物；1μL反向引物；12.5μLMix；7.5μL DDH2O; 所用Mix为天根生化科技有限公司的2×Taq PCR预混试剂（KT201）；
PCR扩增反应程序为：预变性99℃ 2min；30循环，99 °C 1min，58.0 °C 1min，70 °C1min；延伸74℃ 5min；所用PCR仪为卡尤迪CF-F9677。
3）1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，具体步骤如下：
1. 制胶：在锥形瓶中放入30mL 1×TBE和0.45g琼脂糖，微波炉加热至琼脂糖完全熔化后加入3μL核酸染料；所用核酸染料为根生化科技有限公司的10000×GeneGreen（RT210）；
2. 倒胶：将制好的胶迅速沿着胶板一侧倒入，并放置梳子，静置约30min；待胶板充分凝固后，垂直拔起梳子，转移至移至电泳槽内，电泳液为1×TBE；
3. 点样：取5μL待测样品的PCR产物，点入胶孔中，并点入3μL Maker做对照；
4. 接通电源，200V 30min；所用电泳仪为DL-EP300；
5. 电泳结束后，关掉电源，取出胶板，将凝胶置入紫外透射检测仪上，打开紫外灯，观察条带；
6. 拍照记录，判断扩增产物的大小，确定其是否为木犀属物种。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京林业大学
<120> 一种木犀属专用引物及快速鉴定木犀属物种的方法
<130> 2020
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial
<400> 1
ttggaataat ctgaatctga atcgacttga c 31
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial
<400> 2
taagtatccg ataatactca agttc 25

Claims (8)

1.一种木犀属物种鉴定的专用引物，其特征在于：目标基因区域为rpl32与trnL基因间隔区，其具体引物序列如下：
rpl32-trnL F=SEQ ID NO.1=5’-TTGGAATAATCTGAATCTGAATCGACTTGAC-3’
rpl32-trnL R=SEQ ID NO.2=5’-TAAGTATCCGATAATACTCAAGTTC-3’。
2.应用如权利要求1所述木犀属物种专用引物快速鉴定木犀属物种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取待测样品DNA；
2）使用rpl32-trnL引物对，以提取的DNA为模板，进行PCR扩增；
3）PCR产物利用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，根据扩增产物的有无判断待测样品是否为木犀属物种。
3.根据权利要求2所述的快速鉴定木犀属物种的方法，其特征在于，所述步骤1中，使利用天根生化科技有限公司的高效植物基因组DNA提取试剂盒（DP305）完成待测样品的DNA提取。
4.根据权利要求2所述的快速鉴定木犀属物种的方法，其特征在于，所述步骤2中，25μLPCR扩增反应体系包括：2μL DNA模板；1μL正向引物；1μL反向引物；12.5μL Mix；7.5μLDDH2O。
5.根据权利要求2所述的快速鉴定木犀属物种的方法，其特征在于，所述步骤2中，PCR扩增反应程序为：预变性95-99℃ 2min；30循环，95-99 °C 1min，57-58 °C 1min，70-74 °C1min；延伸70-74℃ ，5-10min。
6.根据权利要求2所述的快速鉴定木犀属物种的方法，其特征在于，所述步骤2中，PCR扩增反应程序为：预变性97℃ 2min；30循环，97 °C 1min，57.3 °C 1min，72 °C 1min；延伸72℃ 7min。
7.根据根据权利要求2所述的快速鉴定木犀属物种的方法，其特征在于，所述步骤3中，琼脂糖凝胶电泳的制胶比例为：30mL TBE 1× ；0.45g琼脂糖；3μL核酸染料。
8.根据权利要求2所述的快速鉴定木犀属物种的方法，其特征在于，所述步骤3中，根据待测样品PCR产物判断其是否为木犀属物种。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105603095A (zh) * 2016-02-23 2016-05-25 兰州大学 草木樨属18个物种植物条形码的目标条形码基因及其制备方法
CN106244700A (zh) * 2016-08-24 2016-12-21 山东省林业科学研究院 一种利用ssr标记技术对绒毛白蜡和美国红梣杂交种进行快速鉴定的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105603095A (zh) * 2016-02-23 2016-05-25 兰州大学 草木樨属18个物种植物条形码的目标条形码基因及其制备方法
CN106244700A (zh) * 2016-08-24 2016-12-21 山东省林业科学研究院 一种利用ssr标记技术对绒毛白蜡和美国红梣杂交种进行快速鉴定的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOEY SHAW ET AL.: "COMPARISON OF WHOLE CHLOROPLAST GENOME SEQUENCES TO CHOOSE NONCODING REGIONS FOR PHYLOGENETIC STUDIES IN ANGIOSPERMS: THE TORTOISE AND THE HARE III", AMERICAN JOURNAL OF BOTANY, vol. 94, no. 3, pages 1 *
SHI-QUAN GUO ET AL.: "Molecular phylogenetic reconstruction of Osmanthus Lour.(Oleaceae) and related genera based on three chloroplast intergenic spacers", PLANT SYST EVOL, pages 58 *
杨绪勤等: "基于matK 序列的木犀属植物系统发育初步研究", 北京林业大学学报, vol. 31, no. 6 *

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