CN101864415A - 胡杨8种microRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了八种胡杨新的microRNA序列、microRNA前体序列和反义寡核苷酸序列，以及其在调节植物水分利用效率和提高植物抗旱性状中的用途。

Description

胡杨8种microRNA及其应用

技术领域

本发明涉及胡杨(Populus euphratica)8种microRNA及其应用

技术背景

胡杨(Populus euphratica)是唯一能在干旱盐碱和温差剧烈变化的干旱沙漠地区生长的乔木建群树种。作为天然的抗逆性极强的典型植物，胡杨已引起国际学术界的重视。研究、开发和利用胡杨抗逆性基因资源，对于深入林木抗逆性机理以及定向培育抗逆林木新品种具有重要的价值。

MicroRNAs(microRNA)是一类来自真核生物自身基因组的非编码小RNA，长度约为17～25个核苷酸，在mRNA降解，基因翻译抑制和染色体修饰过程中发挥着重要的调控作用。由于不同物种之间microRNA的序列和功能拥有高度的同源性，microRNA很有可能代表着较为原始的生理调控机制。在对植物的研究中发现，microRNA的表达量明显受到逆境环境因子的调节，因此选择具有典型抗逆性植物材料胡杨(Populus euphratica，Oliv)，研究在干旱和高盐胁迫下胡杨中的microRNA的调控机制，对于发现新的microRNA、研究microRNA及其目标蛋白的作用机制、培育高抗逆性新品种具有深远的基础研究和应用研究价值。

发明内容

本发明采用常规分子生物学实验方法，分离得到胡杨总RNA，使用商业试剂盒分离小于40bp的small RNA部分，回收得到的small RNA两端连接RNA-DNA复合接头，经反转录后得到胡杨的small RNA cDNA文库，将此文库连接到载体中克隆测序后获得1780个small RNA序列，通过生物信息学分析最终确定8个胡杨新的microRNA序列命名为：peu-miR1至peu-miR8。同时根据microRNA数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)中的同源序列设计引物，使用荧光定量PCR的方法分析peu-miR1至peu-miR6在胡杨中受干旱胁迫的表达情况及正负调控作用情况。peu-miR7、8在杨树microRNA数据库没有同源序列，为胡杨所特有的microRNA。

本发明的目的是提供8种新的胡杨抗旱相关microRNA、前体及其反义序列，该发明涉及以上所述microRNA、microRNA前体及其反义序列在提高植物抗旱抗逆性状中的应用。

序列如下：

peu-miR1：UUGACAGAAGAUAGAGAGCAC

peu-miR2：UUUUCCCUACUCCACCCAUCCC

peu-miR3：UGCACUGCCUCUUCCCUGG

peu-miR4：UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA

peu-miR5：CAGAAUUGCAGUGCCUUGAUU

peu-miR6：UCGCUUGGUGCAGGUCGGGAA

peu-miR7：UAGUUGGUGGAGCGAUUUGUC

peu-miR8：UCUCGGACCAGGCUUCAUUCCC

前体序列：

peu-miR1前体：

GGUGAUGUUGUUGACAGAAGAUAGAGAGCACAGAUGAUGAUAUGCAAUGGACUCUGCAUCCCACUCCUUUGUGCUCUCUAUGCUUCUGUCAUCACUUUCA

peu-miR2前体：

UUAUCGGGUGGGUGAGCGGGGAAGAUAACUUUGGUUUUUGAGAUAGUACUUGUUAUUUUCCCUACUCCACCCAUCCCAUA

peu-miR3前体：

AGAGACAGAUGAAGACGGGGAACAGGCAGAGCAUGGAUGGAGCUACUAACAGAAGUACUUGUUUUGGCUCUACCCAUGCACUGCCUCUUCCCUGGCUUGUGGCUC

peu-miR4前体：

GGUUCCUUGCUGGAGAAGCAGGGCACGUGCAAAAUCCUGAUGAAGUGCUUACACUUUGCACGCGCUCUUCUUCUCCAACACGGGC

peu-miR5前体：

GAGGCCCUAAUCAGGGCACUGCAAUUCUAAAUGUCUGUUGGCAAGUGGCGAUGCCAGACGUUUGAAAUUUACUUAUCAUUUAUUAGUCAGAAUUGCAGUGCCUUGAUUUGGGCUUU

peu-miR6前体：

GGUCUCUAAUUCGCUUGGUGCAGGUCGGGAACUGAUUCGGCGAUUUGAUUGCCAGAUGGCUAAACACGAUUGGCUGUGAGGCAAAUUAUAAAAAGAAAGAGAAUUGGAUCCCGCCUUGCAUCAACUGAAUCGGAGA

peu-miR7前体：

UAGUUGGUGGAGCGAUUUGUCUGGUUAAUUCCGUUAACGAACGAGACCUCAGCCUGCUA

peu-miR8前体：

GGGAAUGCUGUCUGGUUCGAGACCAUUCACCUGAAGAGCACGCAUUCAUCUUUUGAGUGAUCUCGGACCAGGCUUCAUUCCC

据此，本发明所提供的七种胡杨microRNA反义寡核苷酸包含如下任一种序列：

peu-miR1反义寡核苷酸：AACTGTCTTCTATCTCTCGTC

peu-miR2反义寡核苷酸：AAAAGGGATGAGGTGGGTAGGG

peu-miR3反义寡核苷酸：ACGTGACGGAGAAGGGACC

peu-miR4反义寡核苷酸：ACCTCTTCGTCCCGTGCACGT

peu-miR5反义寡核苷酸：GTCTTAACGTCACGGAACTAA

peu-miR6反义寡核苷酸：AGCGAACCACGTCCAGCCCTT

peu-miR7反义寡核苷酸：ATCAACCACCTCGCTAAACAG

peu-miR8反义寡核苷酸：AGAGCCTGGTCCGAAGTAAGGG

据此，本发明提供的8种新型胡杨mirocRNA前提基因在杨树染色体上的定位分别为：peU-miR1前体基因定位于杨树基因组十五号染色体上；peU-miR2前体基因定位于杨树基因组scaffold_131上；peU-miR3前体基因定位于杨树基因组二号染色体上；peU-miR4前体基因定位于杨树基因组二号染色体上；peU-miR5前体基因定位于杨树基因组十三号染色体上；peU-miR6前体基因定位于杨树基因组scaffold_86上；peU-miR7前体基因定位于杨树基因组EST序列gi 52374032；peU-miR8前体基因定位于杨树八号染色体上。

本发明所提供的8种胡杨新型microRNA均来自胡杨成熟叶片细胞，成熟microRNA序列的长度为17～25nt，其前体序列均可形成microRNA前体的典型二级结构，符合microRNA的结构特征。RT-PCR和实时荧光定量PCR检测结果表明，8种新型胡杨microRNA在受到干旱胁迫诱导的胡杨材料中均有表达，且表达程度随干旱胁迫强度的增加呈现规律性变化，说明这8种microRNA在胡杨调节自身水分利用效率时具有重要的生物学功能。因此，在胡杨不同组织中过表达peu-miR-1～peu-miR-8、peu-miR-1～peu-miR-8前体分子或采用microRNA反义寡核苷酸抑制peu-miR-1～peu-miR-8的表达将影响胡杨的水分利用效率和应对水分胁迫的能力。

附图说明

图1为8种胡杨新microRNA序列；

图2为8种胡杨新microRNA前体序列；

图3为8种胡杨新microRNA反义寡核苷酸；

图4为8种胡杨新microRNA的典型hairpin二级结构图；

图5为RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果；

左侧marker从下往上大小依次为20bp，40bp，60bp，80bp，100bp...第二至第九泳道依次为8种杨树microRNA基因RT-PCR产物，据图得知所得PCR产物长度在60bp左右与microRNA加上两侧结头的长度相符合。

图6为不同干旱处理条件下microRNA的实时荧光定量PCR检测结果；

microRNA荧光定量PCR结果显示，peu-miR1，3，5，6表达量在干旱诱导的初期(15分钟～1小时内)明显升高，表明peu-miR1，3，5，6参与胡杨受干旱诱导的正调控。peu-miR2，4表达量在干旱诱导的初期(2小时内)明显降低，表明peu-miR2，4参与胡杨受干旱诱导的负调控。测序结果表明peU-miR7，8为胡杨区别于其他杨树品种的microRNA，其本身与胡杨抗旱生理特性相关。

具体实施方式

实施例1，胡杨总RNA的提取、small PNA的分离

在2ml离心管中加入1.5ml、CTAB-PVA buffer，加入2％终体积的巯基乙醇后，65℃温育；用液氮研磨胡杨材料后，按0.1g材料/1ml buffer的比例加入65℃抽提液中，剧烈震荡；65℃，10min水浴，其间振荡2～3次；15000r/min，4℃，10min离心取上清；等体积V(苯酚)∶V(氯仿)∶V(异戊醇)＝25∶24∶1抽提2次，每次充分振荡5min，离心(15000r/min，4℃，10min)；取上清加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2)，2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀，-80℃，沉淀10～30min；离心(15000r/min，4℃，10min)，去上清后用80％乙醇洗沉淀，溶于50μLRNase-free水；-80℃保存备用。

使用Ambion公司出品的的FlashPAGETM Fractionator及FlashPAGETMReaction C1ean-Up Kit，根据标准操作方法从总RNA中分离小于40nt的smallRNA。应用该实施例可以从植物组织中分离得到含有全部mi croRNA的smallRNA.

实施例2，构建胡杨small RNA反转cDNA文库及RT-PCR检测

使用Takara公司出品的small RNA cloning kit，对Small RNA进行反转录克隆。首先将Small RNA进行BAP处理，5’端去磷酸化。BAP处理后的Small RNA的3’端与生物素化的RNA/DNA接头连接。用标记Strepto avidin的磁珠，回收带有生物素的RNA/DNA接头的Small RNA，然后进行5’端磷酸化反应。将5’端连接上RNA/DNA嵌合的接头后，使用RT Primer和M-MLV反转录酶进行反转录反应。从磁珠上回收合成的cDNA后，进行RT-PCR反应，反转录及RT-PCR的引物为：PCR-R&RT-Primer：5’-GTCTCTAGCCTGCAGGATCGATG-3’；5’-AAAGATCCTGCAGGTGCGTCA-3’。PCR片段或经限制酶酶切后的DNA片段的回收、克隆、测序。应用该实施例可以得到包含植物材料microRNA的smallRNA序列信息。

实施例3，胡杨microRNA序列分析

克隆测序得到到胡杨small RNA序列去除接头序列后，使用perl(http://www.perl.org/)程序筛选长度在17～25nt的序列、去除冗余。使用blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)程序将small RNA序列与杨树基因组(http://genome.jgi-psf.org/poplar/)进行比对；使用perl程序于smallRNA在基因组上的位置左右各150bp截取序列，使用RNAfold(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)软件对截取的序列进行hairpin二级结构分析。使用mircheck软件综合分析microRNA前体hairpin二级结构，根据文献(Jones-Rhoades，M.W.，Bartel，D.P.and Bartel，B.(2006)MicroRNAs and their regulatory roles in plants.Annu.Rev.Plant.Biol.57，19-53.)中的方法筛选mircheck的结果，最终获得七种新型胡杨microRNA序列及其二级发卡结构。应用该实施例可以从大量small RNA序列中筛选出microRNA序列。

实施例4，胡杨microRNA实时荧光定量PCR

胡杨的干旱胁迫处理：将一年生胡杨幼苗整株游离土壤，清洗后暴露在37℃培养箱中。在经过15分钟、1小时、2小时、4小时、6小时收集材料立即冻于-80℃液氮中。按照实施例1、2的方法提取材料总RNA、分离small RNA。

用NEB公司的poly(A)聚合酶给从总RNA中分离的得到的small RNA加上poly A尾。在50ul反应体系中加入1.5ug small RNA、5ul poly A polymerase、5ul 10×缓冲液、1mmol/l ATP，37℃反应1小时，使用苯酚/氯仿抽提，-80℃沉淀1小时，15000rpm离心30分钟，弃上清后用70％的乙醇洗涤沉淀，将沉淀重溶于40ul水中，加入50um的oligo dT锚定引物(GCTGTCAACGATACGCTACCTGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTA、GCTGTCAACGATACGCTACCTGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTG、GCTGTCAACGATACGCTACCTGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTC)5ul、MMLV 5ul、10×缓冲液10ul、10um dNTP 10ul、ddH₂O 30ul。42℃反应1小时、72℃15分钟而后置于冰上冷却得到microRNA实时荧光定量PCR的cDNA模板。

使用ABI公司的Power SYBR Green Mix试剂盒进行定量PCR反应。在20ul体系中加入cDNA模板1ul、正反向引物各1ul、2.5uM dNTP 1ul、2×Power SYBRGreen Mix 10ul、ddH₂O 6ul。使用如下程序进行定量PCR反应并生成溶解曲线：

Read fluorescence

60℃        30sec

95℃        15sec

60℃        1min

95℃        15sec Read fluorescence every+0.3℃

正向引物：

peu-miR1：TTGACAGAAGATAGAGAGCAC

peu-miR2：TTTTCCCTACTCCACCCATCC

peu-miR3：GCACTGCCTCTTCCCT

peu-miR4：TGGAGAAGCAGGGCACGTGC

peu-miR5：CAGAATTGCAGTGCCTTGAT

peu-miR6：GCTTGGTGCAGGTCGGGAA

反向引物：

通用反向引物：ACGATACGCTACCTAACGGCAT

应用该实施例可以分析特定microRNA在植物应答特定生理胁迫中的作用。

序列表

<110>夏新莉、尹伟伦、李博生

<120>胡杨8种microRNA及其应用

<160>24

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

uugacagaag auagagagca c 21

<210>2

<211>22

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

uuuucccuac uccacccauc cc 22

<210>3

<211>19

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

ugcacugccu cuucccugg 19

<210>4

<211>21

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

uggagaagca gggcacgugc a 21

<210>5

<211>21

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

cagaauugca gugccuugau u 21

<210>6

<211>21

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

ucgcuuggug caggucggga a 21

<210>7

<211>21

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

uaguuggugg agcgauuugu c 21

<210>8

<211>22

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

ucucggacca ggcuucauuc cc 22

<210>9

<211>100

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

ggugauguug uugacagaag auagagagca cagaugauga uaugcaaugg acucugcauc 60

ccacuccuuu gugcucucua ugcuucuguc aucacuuuca 100

<210>10

<211>80

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

uuaucgggug ggugagcggg gaagauaacu uugguuuuug agauaguacu uguuauuuuc 60

ccuacuccac ccaucccaua 80

<210>11

<211>105

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

agagacagau gaagacgggg aacaggcaga gcauggaugg agcuacuaac agaaguacuu 60

guuuuggcuc uacccaugca cugccucuuc ccuggcuugu ggcuc 105

<210>12

<211>85

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

gguuccuugc uggagaagca gggcacgugc aaaauccuga ugaagugcuu acacuuugca 60

cgcgcucuuc uucuccaaca cgggc 85

<210>13

<211>116

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

gaggcccuaa ucagggcacu gcaauucuaa augucuguug gcaaguggcg augccagacg 60

uuugaaauuu acuuaucauu uauuagucag aauugcagug ccuugauuug ggcuuu 116

<210>14

<211>136

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

ggucucuaau ucgcuuggug caggucggga acugauucgg cgauuugauu gccagauggc 60

uaaacacgau uggcugugag gcaaauuaua aaaagaaaga gaauuggauc ccgccuugca 120

ucaacugaau cggaga 136

<210>15

<211>59

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

uaguuggugg agcgauuugu cugguuaauu ccguuaacga acgagaccuc agccugcua 59

<210>16

<211>82

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

gggaaugcug ucugguucga gaccauucac cugaagagca cgcauucauc uuuugaguga 60

ucucggacca ggcuucauuc cc 82

<210>17

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>胡杨microRNA-peu-miR1反义寡核苷酸

<400>

aactgtcttc tatctctcgt c 21

<210>18

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>胡杨microRNA-peu-miR2反义寡核苷酸

<400>

aaaagggatg aggtgggtag gg 22

<210>19

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>胡杨microRNA-peu-miR3反义寡核苷酸

<400>

acgtgacgga gaagggacc 19

<210>20

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>胡杨microRNA-peu-miR4反义寡核苷酸

<400>

acctcttcgt cccgtgcacg t 21

<210>21

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>胡杨microRNA-peu-miR5反义寡核苷酸

<400>

gtcttaacgt cacggaacta a 21

<210>22

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>胡杨microRNA-peu-miR6反义寡核苷酸

<400>

agcgaaccac gtccagccct t 21

<210>23

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>胡杨microRNA-peu-miR7反义寡核苷酸

<400>

atcaaccacc tcgctaaaca g 21

<210>24

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>胡杨microRNA-peu-miR8反义寡核苷酸

<400>

agagcctggt ccgaagtaag gg 22

<110>夏新莉、尹伟伦、李博生

<120>胡杨8种microRNA及其应用

<160>24

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

uugacagaag auagagagca c 21

<210>2

<211>22

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

uuuucccuac uccacccauc cc 22

<210>3

<211>19

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

ugcacugccu cuucccugg 19

<210>4

<211>21

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

uggagaagca gggcacgugc a 21

<210>5

<211>21

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

cagaauugca gugccuugau u 21

<210>6

<211>21

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

ucgcuuggug caggucggga a 21

<210>7

<211>21

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

uaguuggugg agcgauuugu c 21

<210>8

<211>22

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

ucucggacca ggcuucauuc cc 22

<210>9

<211>100

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

ggugauguug uugacagaag auagagagca cagaugauga uaugcaaugg acucugcauc 60

ccacuccuuu gugcucucua ugcuucuguc aucacuuuca 100

<210>10

<211>80

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

uuaucgggug ggugagcggg gaagauaacu uugguuuuug agauaguacu uguuauuuuc 60

ccuacuccac ccaucccaua 80

<210>11

<211>105

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

agagacagau gaagacgggg aacaggcaga gcauggaugg agcuacuaac agaaguacuu 60

guuuuggcuc uacccaugca cugccucuuc ccuggcuugu ggcuc 105

<210>12

<211>85

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

gguuccuugc uggagaagca gggcacgugc aaaauccuga ugaagugcuu acacuuugca 60

cgcgcucuuc uucuccaaca cgggc 85

<210>13

<211>116

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

gaggcccuaa ucagggcacu gcaauucuaa augucuguug gcaaguggcg augccagacg 60

uuugaaauuu acuuaucauu uauuagucag aauugcagug ccuugauuug ggcuuu 116

<210>14

<211>136

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

ggucucuaau ucgcuuggug caggucggga acugauucgg cgauuugauu gccagauggc 60

uaaacacgau uggcugugag gcaaauuaua aaaagaaaga gaauuggauc ccgccuugca 120

ucaacugaau cggaga 136

<210>15

<211>59

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

uaguuggugg agcgauuugu cugguuaauu ccguuaacga acgagaccuc agccugcua 59

<210>16

<211>82

<212>RNA

<213>杨属胡杨(Populus euphratica)

<400>

gggaaugcug ucugguucga gaccauucac cugaagagca cgcauucauc uuuugaguga 60

ucucggacca ggcuucauuc cc 82

<210>17

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>胡杨microRNA-peu-miR1反义寡核苷酸

<400>

aactgtcttc tatctctcgt c 21

<210>18

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>胡杨microRNA-peu-miR2反义寡核苷酸

<400>

aaaagggatg aggtgggtag gg 22

<210>19

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>胡杨microRNA-peu-miR3反义寡核苷酸

<400>

acgtgacgga gaagggacc 19

<210>20

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>胡杨microRNA-peu-miR4反义寡核苷酸

<400>

acctcttcgt cccgtgcacg t 21

<210>21

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>胡杨microRNA-peu-miR5反义寡核苷酸

<400>

gtcttaacgt cacggaacta a 21

<210>22

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>胡杨microRNA-peu-miR6反义寡核苷酸

<400>

agcgaaccac gtccagccct t 21

<210>23

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>胡杨microRNA-peu-miR7反义寡核苷酸

<400>

atcaaccacc tcgctaaaca g 21

<210>24

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>胡杨microRNA-peu-miR8反义寡核苷酸

<400>

agagcctggt ccgaagtaag gg 22

Claims (6)

1.八种胡杨新microRNA，其特征在于包含如下任一种microRNA序列：

1)peu-miR1：UUGACAGAAGAUAGAGAGCAC

2)peu-miR2：UUUUCCCUACUCCACCCAUCCC

3)peu-miR3：UGCACUGCCUCUUCCCUGG

4)peu-miR4：UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA

5)peu-miR5：CAGAAUUGCAGUGCCUUGAUU

6)peu-miR6：UCGCUUGGUGCAGGUCGGGAA

7)peu-miR7：UAGUUGGUGGAGCGAUUUGUC

8)peu-miR8：UCUCGGACCAGGCUUCAUUCCC

2.根据权利要求1所述的八种胡杨microRNA的前体RNA包含如下序列：

peu-miR1前体：

GGUGAUGUUGUUGACAGAAGAUAGAGAGCACAGAUGAUGAUAUGCAAUGGACUCUGCAUCCCACUCCUUUGUGCUCUCUAUGCUUCUGUCAUCACUUUCA

peu-miR2前体：

UUAUCGGGUGGGUGAGCGGGGAAGAUAACUUUGGUUUUUGAGAUAGUACUUGUUAUUUUCCCUACUCCACCCAUCCCAUA

peu-miR3前体：

AGAGACAGAUGAAGACGGGGAACAGGCAGAGCAUGGAUGGAGCUACUAACAGAAGUACUUGUUUUGGCUCUACCCAUGCACUGCCUCUUCCCUGGCUUGUGGCUC

peu-miR4前体：

GGUUCCUUGCUGGAGAAGCAGGGCACGUGCAAAAUCCUGAUGAAGUGCUUACACUUUGCACGCGCUCUUCUUCUCCAACACGGGC

peu-miR5前体：

GAGGCCCUAAUCAGGGCACUGCAAUUCUAAAUGUCUGUUGGCAAGUGGCGAUGCCAGACGUUUGAAAUUUACUUAUCAUUUAUUAGUCAGAAUUGCAGUGCCUUGAUUUGGGCUUU

peu-miR6前体：

GGUCUCUAAUUCGCUUGGUGCAGGUCGGGAACUGAUUCGGCGAUUUGAUUGCCAGAUGGCUAAACACGAUUGGCUGUGAGGCAAAUUAUAAAAAGAAAGAGAAUUGGAUCCCGCCUUGCAUCAACUGAAUCGGAGA

peu-miR7前体：

UAGUUGGUGGAGCGAUUUGUCUGGUUAAUUCCGUUAACGAACGAGACCUCAGCCUGCUA

peu-miR8前体：

GGGAAUGCUGUCUGGUUCGAGACCAUUCACCUGAAGAGCACGCAUUCAUCUUUUGAGUGAUCUCGGACCAGGCUUCAUUCCC

3.根据权利要求1所述的八种胡杨microRNA的反义寡核苷酸包含如下任一种序列：

1)peu-miR1反义寡核苷酸：AACTGTCTTCTATCTCTCGTC

2)peu-miR2反义寡核苷酸：AAAAGGGATGAGGTGGGTAGGG

3)peu-miR3反义寡核苷酸：ACGTGACGGAGAAGGGACC

4)peu-miR4反义寡核苷酸：ACCTCTTCGTCCCGTGCACGT

5)peu-miR5反义寡核苷酸：GTCTTAACGTCACGGAACTAA

6)peu-miR6反义寡核苷酸：AGCGAACCACGTCCAGCCCTT

7)peu-miR7反义寡核苷酸：ATCAACCACCTCGCTAAACAG

8)peu-miR8反义寡核苷酸：AGAGCCTGGTCCGAAGTAAGGG

4.权利要求3所述的八种胡杨microRNA的反义寡核苷酸可以是DNA或RNA。

5.权利要求3所述的八种胡杨microRNA的反义寡核苷酸可以进行硫代、甲氧基修饰。

6.权利要求1～3所述的任一种寡核苷酸在改变植物性状和培育抗旱植物中的用途。

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