CN105506077A - 一种检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环含量的方法及试剂盒 - Google Patents

一种检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环含量的方法及试剂盒 Download PDF

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邹琳
刘姗
赵晓东
戴荣欣
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明涉及一种检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环含量的方法及试剂盒。本发明所述方法及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测新生儿滤纸干血斑中δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环的含量，能够满足临床检验实际工作的需要，利用δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环的含量可早期提示罹患免疫缺陷类疾病。

Description

一种检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环含量的方法及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及适用于检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环含量的试剂盒及方法。
背景技术
T细胞受体重排删除环(TREC)是一种在T细胞抗原受体(TCR)基因重排时产生的稳定的环状DNA片段,而70％以上的TREC为δRec-ψ(J)α型TREC。TREC是游离基因，稳定的存在于细胞中，并不随T细胞的进一步增殖而扩增。随着T细胞分裂，TREC水平在细胞群体中逐渐被稀释，但它的数量代表胸腺输出初始T细胞的数量，反应胸腺的功能。而T淋巴细胞的减少，导致免疫功能低下或缺失，产生一系列免疫低下性疾病如：重症联合免疫缺陷(SCID)、X-连锁无丙种球蛋白血症(XLA)、普通变异型免疫缺陷病(CVID)、X-连锁高免疫球蛋白M血症(X-HIGM)等。其中，SCID为早期致死性免疫缺陷综合症,患儿出生后无症状期很短。
SICD是一种体液免疫、细胞免疫同时有严重缺陷的疾病，多为基因突变所致。最新研究成果显示，新生儿SCID总体发病率是1/58000。所有SCID患儿都有T细胞生成缺陷。因此，患有SCID的婴儿更易得威胁生命的重症感染。而80％以上的患儿缺乏阳性家族史，基于人口的筛查是在获得感染前尽早检测出SCID的唯一方式。诊断后接受免疫重构的SCID患儿存活率为87％,接受移植、酶替代治疗和/或基因治疗的患儿存活率为92％。因此通过TREC对新生儿SCID筛查对提高SCID患儿的生存率及生活质量具有重大意义。
目前，TREC的定量检测方法有：实时定量PCR、竞争性RCR及PCR-ELISA。其中实时定量PCR灵敏度及准确性最高。然而，TREC在外周血中丰度低，故目前大多数基础研究采用从静脉血中抽提DNA，用参考基因校正的方法进行检测。但新生儿外周血标本难获得，研发灵敏度及准确性更高的可用于检测干血斑中TREC的试剂盒对新生儿SCID筛查具有重大意义。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环含量的方法，其能够简捷、直观、准确的对δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环的含量进行检测。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环含量的方法，具体包括以下步骤：
1)特异性引物和特异性探针的设计
根据被证实的δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环序列，设计特异性扩增引物和特异性探针；其中，所述探针两端带有荧光基团；
2)标准品构建
合成δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环连接点核心序列双链DNA，并通过TA克隆连接到PMD19-T载体上进行克隆，测序验证序列，并测定质粒溶液浓度，所得到的PMD19-T-δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环质粒作为δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环核酸标准品；将不同摩尔数的PMD19-T-δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环质粒加入高压灭菌处理的Tris-EDTA缓冲液中保存，得到标准品；
3)PCR扩增
将标准品按照梯度稀释后与待测标本同期进行PCR扩增反应，分析结果以获得待测标本的δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环的含量。
将标准品按照梯度稀释后与待测标本同期进行PCR扩增反应是指，将标准品按照梯度稀释后与待测标本一起进行PCR扩增反应。
进一步，上游扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。
进一步，所述特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。
进一步，所述核心序列如SEQIDNO：4所示。
详见下表：
上表中F表示上游引物，R表示下游引物。
进一步，所述待测标本为新生儿滤纸干血斑。
进一步，所述PCR扩增反应的条件为：先于50℃温度下处理2分钟，再在95℃温度下预变性5分钟；以95℃变性30秒、58℃退火60秒为一个循环，共循环40次。
本发明的目的之二在于提供一种试剂盒，能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环的含量，能够满足临床检验实际工作的需要，利用δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环的检测对新生儿SCID筛查对提高SCID患儿的生存率及生活质量具有重大意义。
为实现以上目的，本发明的技术方案如下：
用于检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环含量的试剂盒，所述试剂盒包括δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环的特异性扩增引物、特异性探针、δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环核酸标准品、PCR反应液。
进一步，所述特征性扩增引物如SEQIDNO：1-2所示。
进一步，所述特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。
本发明的有益效果在于：
本发明所述方法及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环的含量，能够满足临床检验实际工作的需要，利于δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环含量检测预测疾病的发生、发展风险。
附图说明
图1为标准品倍比稀释后进行扩增反应的扩增曲线；
图2为微调阈值，使标准曲线斜率(约3.3)、相关性(约0.99)及PCR扩增效率达最佳时的标准曲线；
图3为待测标本的扩增曲线。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1PCR扩增引物和特异性探针的设计及合成
利用primer5.0软件，根据引物设计一般原则筛选较好引物三对，PCR扩增、电泳后根据目的条带确定最优引物。最优引物上游扩增引物3’端后第二位碱基开始根据碱基互补原则设计30个碱基的探针序列。引物和探针委托成都擎科梓熙生物技术有限公司合成，最优的PCR扩增引物与探针详见表1。
表1TREC扩增引物与探针
上游扩增引物 CACATCCCTTTCAACCATGCT
下游扩增引物 GCCAGCTGCAGGGTTTAGG
探针 FAM-ACACCTCTGGTTTTTGTAAAGGTGCCCACT-TAMRA
实施例2标准品构建
委托成都擎科梓熙生物技术有限公司人工合成δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环的连接点核心序列双链DNA，并通过TA克隆连接到PMD19-T载体上进行克隆，测序验证序列，并测定质粒溶液浓度，所得到的PMD19-T-T细胞受体重排删除环质粒作为δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环核酸标准品；将不同摩尔数的PMD19-T-δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环质粒加入高压灭菌处理的Tris-EDTA缓冲液中保存，得到浓度为109copy/ul的标准品。核心序列如表2所示。
表2核心序列
实施例3DNA提取
选取200例新生儿滤纸干血斑及43例原发性免疫缺陷综合症基因检测阳性患儿滤纸干血斑(包括12例WAS综合症WASP基因分析、6例X连锁高IgM综合征CD40L基因突变分析、6例X连锁慢性肉芽肿病CYBB基因分析、16例XLA疾病BTK基因分析及3例X连锁重症联合免疫缺陷病gamac基因分析)作为研究标本。自动打孔仪打干血斑3个，从干血斑中提取DNA。
实施例4PCR扩增反应
(1)PCR扩增反应
倍比稀释标准品，使δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环拷贝数达到106，105，104，103，102，101，copy/ul。与标本一起扩增。
PCR扩增反应体系为：2.5×RealMasterMix(probe)10ul，EnhancerSolution1ul,10uM上游引物1.5ul，10uM下游引物1.5ul，10uM探针0.3ul，模板DNA8ul，1％BSA0.2ul,25mMMgCl21.5ul,其余为无核酸酶的灭菌高纯双蒸水，终体积为25ul。
PCR扩增反应条件为：(1)先在50℃温度下处理2分钟，再在95℃温度下预变性5分钟；(2)以95℃变性30秒、58℃退火60秒为一个循环，共循环40次。
(2)PCR扩增反应结果分析
标准品梯度稀释后进行PCR扩增反应的扩增曲线如图1所示，微调阈值，使标准曲线斜率(约3.3)、相关性(约0.99)及PCR扩增效率达最佳，标准曲线如图2所示。待测标本的扩增曲线如图3所示。
由图3可以看出，200例新生儿血片筛查结果均为>1000copy/孔。50例原发性免疫缺陷综合症基因检测阳性患儿中：1例X连锁慢性肉芽肿病患儿>1000copy/孔,3例X连锁重症联合免疫缺陷病患儿<75copy/孔，其它患儿标本检测结果均在75-1000copy/孔。而直径为3.2mm的血斑中δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环<75copy/孔视为筛查阳性，故此次利用滤纸干血斑进行δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环筛查检测出阳性标本3例。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (9)

1.一种检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环含量的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)特异性引物和特异性探针的设计
根据被证实的δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环序列，设计特异性扩增引物和特异性探针；其中，所述探针两端带有荧光基团；
2)标准品构建
合成δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环连接点核心序列双链DNA，并通过TA克隆连接到PMD19-T载体上进行克隆，测序验证序列，并测定质粒溶液浓度，所得到的PMD19-T-δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环质粒作为δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环核酸标准品；将不同摩尔数的PMD19-T-δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环质粒加入高压灭菌处理的Tris-EDTA缓冲液中保存，得到标准品；
3)PCR扩增
将标准品按照梯度稀释后与待测标本同期进行PCR扩增反应，分析结果以获得待测标本的δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环的含量。
2.根据权利要求1所述的一种检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环含量的方法，其特征在于：上游扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。
3.根据权利要求1所述的一种检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环含量的方法，其特征在于：所述特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。
4.根据权利要求1所述的一种检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环含量的方法，其特征在于：所述核心序列如SEQIDNO：4所示。
5.根据权利要求1所述的一种检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环含量的方法，其特征在于：所述待测标本为新生儿滤纸干血斑。
6.根据权利要求1所述的一种检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环含量的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的条件为：先于50℃温度下处理2分钟，再在95℃温度下预变性5分钟；以95℃变性30秒、58℃退火60秒为一个循环，共循环40次。
7.用于检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环含量的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环的特异性扩增引物、特异性探针、δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环核酸标准品、PCR反应液。
8.根据权利要求7所述的用于检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环含量的试剂盒，其特征在于：所述特征性扩增引物如SEQIDNO：1-2所示。
9.根据权利要求7所述的用于检测δRec-ψ(J)α型T细胞受体重排删除环含量的试剂盒，其特征在于：所述特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103173533A (zh) * 2012-11-20 2013-06-26 无锡联合利康临床检验所有限公司 一种定量检测TRECs和KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒以及应用
CN103173534A (zh) * 2012-11-20 2013-06-26 无锡联合利康临床检验所有限公司 一种定量检测TRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒及应用
WO2014160797A1 (en) * 2013-03-26 2014-10-02 Genetag Technology, Inc. Dual probe:antiprobe compositions for dna and rna detection
US20150050661A1 (en) * 2009-10-08 2015-02-19 Dartmouth-Hitchcock Clinic System and method for monitoring and optimizing immune status in transplant recipients

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150050661A1 (en) * 2009-10-08 2015-02-19 Dartmouth-Hitchcock Clinic System and method for monitoring and optimizing immune status in transplant recipients
CN103173533A (zh) * 2012-11-20 2013-06-26 无锡联合利康临床检验所有限公司 一种定量检测TRECs和KRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒以及应用
CN103173534A (zh) * 2012-11-20 2013-06-26 无锡联合利康临床检验所有限公司 一种定量检测TRECs基因的实时荧光定量PCR试剂盒及应用
WO2014160797A1 (en) * 2013-03-26 2014-10-02 Genetag Technology, Inc. Dual probe:antiprobe compositions for dna and rna detection

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李扬秋等: "胸腺输出功能的评价手段―T细胞受体重排删除环的定量分析", 《中国实验血液学杂志》 *
韩素芳: "T细胞受体删除环定量检测的意义及应用现状", 《国外医学.免疫学分册》 *

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