CN117925850A - 一种与泥蚶血红素浓度相关的snp位点及其在亲本选育中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明于提供一种与泥蚶血红素浓度相关的SNP位点及其在亲本选育中的应用，所述的是与泥蚶血红素浓度相关的SNP位点，所述的SNP位点位于序列为SEQ ID NO:1的Rpl35a基因的第301位，为T/A。本发明所发现的SNP标记能够用于筛选高血红素含量的泥蚶亲本，从而能快速获得泥蚶血红素含量高且遗传稳定的个体用于生产繁育。
Description
技术领域
本发明属于遗传育种技术领域,具体涉及一种与泥蚶血红素浓度相关的SNP位点及其在亲本选育中的应用。
背景技术
泥蚶(Tegillarca granosa)是我国四大传统养殖贝类之一，亦是江、浙、闽地区人民喜食的海鲜佳品。近几年，仅浙江省的泥蚶养殖面积已达到20万亩，年产量在10万吨以上，产值近40亿元。由于泥蚶含有无脊椎动物罕见的红色血液，故又被称为“血蚶”。而红血性状是衡量泥蚶是否健康的重要可视指标，通常红血充盈鲜亮的泥蚶生理状态越好，越受食客们的欢迎。而泥蚶血液中的红色来源主要为血红蛋白辅基血红素卟啉环中的铁原子，因此血红素浓度对泥蚶血液色泽的影响至关重要。并且泥蚶血红素铁的生物利用率远高于牛、羊、猪等畜牧动物的血红素铁，其鲜食或酒渍的食用方式更易被人体吸收，是人类补铁极好的食物来源。因此，培育高血红素品系具有重要的经济价值，是未来泥蚶育种的主要方向。
此前在其他模式动物的研究中发现，包括血红素在内的红血性状可受遗传因素影响。而随着分子生物学与基因组学领域的迅猛发展，包括泥蚶在内的贝类育种研究正逐步实现从传统的选择育种和杂交育种向基于基因组信息的分子育种的重要转型。单核苷酸多态性(SNP)标记因其在基因区广泛分布和高通量检测的优势，成为了遗传育种研究的首选遗传标记。将这些标记与生产经济性状关联，即可实现DNA水平的选择育种。与传统育种方法相比，SNP遗传标记育种不仅能摒除传统育种中人为因素的影响，还能实现在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选出优良的后备亲本，从而缩短育种周期，提高育种效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与泥蚶血红素浓度相关的SNP位点及其在亲本选育中的应用。
本发明首先提供一种与泥蚶血红素浓度相关的SNP位点，所述的SNP位点位于序列为SEQ ID NO:1的Rpl35a基因的第301位，为T/A；
GTCAAGGTGGTCATTTCTTGGATGTTTGAAGAAAACGGAATACCTGAAGGAAACCAACAAGTAAATTGACAAATTTTCTCGCTGCAATCTTGTTGACATGGGAGTGGTATGGATAAATTGTGTTTAATGCCCCAGTCAAGATTCTGTCACTTACATGGAGGCAATCAGTTATGGGATGGTTGAGGAAAGCGGGGTACCTAGTGAAAGCTACTAACCTTCAGCAAGCAAACTGACAAACTTTCTCACACTAGGATCTGCCAGAATGGGATTTGATCCTAGGTTAAGATTGAGTGCAAAGATWACATCACTTGTCCACCCAAGTGGGATTTGAACCTAAGCTGAGAGTGGCACTGTGGTACTACTAAAGTGCATGCTTTAGAGCCCTTTACTGTGTTGTAGACTTAGCACACATCCCAGCTTGGCCATGGGCCTGTGACTGCAGTAATTTCTGTTACTGTAACCACTCTTTCCACACCCTTATAGGAATGAAATTATAAACTAAGCAGTTTGTGGAGGTGGCCACAAGCTAAAAACTGTCGAAGTTCTTTTGTATCATAAATAATGAACAAAATCAATTTTTTTTGGTTTATTTTTTTTTTTT；
本发明再提供一种可用于检测上述SNP位点的方法，即采用引物扩增待检测的泥蚶样品的核酸，扩增产物再通过测序来确定是否存在目标SNP的基因型；
其中一种引物对的核苷酸序列信息如下：
Rpl35a-F：5'-TGGGATGGTTGAGGAAAGCG-3'(SEQ ID NO:2)；
Rpl35a-R：5'-GCCAAGCTGGGATGTGTGC-3'(SEQ ID NO:3)；
本发明同时提供一种包含上述的引物对的，可用于检测该SNP位点的试剂盒。
本发明提供的SNP位点可用于筛选泥蚶高血红素的亲本，其一种具体方法如下：
1)通过活体取样方法取待检测泥蚶样品的基因组DNA；
2)以提取获得的样品DNA为模板，利用特异性引物对(Rpl35a-F和Rpl35a-R)进行PCR扩增，得到PCR产物；
3)对PCR产物进行测序，通过测序结果确定样品SNP标记的基因型来筛选基因型为AT的个体作为高血红素浓度的亲本。
本发明所发现的SNP标记能够用于筛选高血红素含量的泥蚶亲本，从而能快速获得泥蚶血红素含量高且遗传稳定的个体用于生产繁育。
附图说明
图1：泥蚶血红素浓度的全基因组关联分析图，其中图A为泥蚶血红素浓度的分布情况图，图B为全基因组关联分析的Manhattan图，图C为全基因组关联分析的QQ图；
图2：不同Rpl35a基因型的泥蚶个体的血红素浓度数据图。
具体实施方式
本发明获得的泥蚶血红素浓度相关SNP位点，可用于筛选泥蚶高血红素的亲本进行繁育，并预测子代血红素浓度性状，以提高获得优良品种的效率。
本发明所筛选的SNP位点位于基因Rpl35a的下游区域(downstream)，在泥蚶参考基因组中的位置为第12号染色体自5'端起第32057574位(Hic_asm_12:32057574)，即序列为SEQ ID NO:1的序列的第301位，其碱基为T或A。其中杂合的AT基因型个体的血红素浓度显著高于纯合的TT基因型。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：获得与泥蚶血红素相关的SNP标记
1、泥蚶血红素浓度的全基因组关联分析
在泥蚶基因组全测序已完成的基础上，对300个泥蚶的血红素浓度进行了测定，发现其呈正态分布(图1A)。通过全基因组关联分析(GWAS)，对其血红素浓度相关的SNP位点进行了筛选，发现在12号染色体的32057574位置(Hic_asm_12:32057574)，即基因Rpl35a的downstream区域存在高于GWAS筛选阈值的SNP突变(图1B-C)。所筛选的SNP位点位于序列为SEQ ID NO:1的序列的第301位，其碱基为T或A。
2、Rpl35a的基因分型
选择另一个群体中的32个泥蚶个体，首先通过试剂盒测量其血红素浓度，并使用序列为SEQ ID NO:2的Rpl35a-F和序列为SEQ ID NO:3的Rpl35a-R特异性引物对这些泥蚶个体目标SNP所在位点进行序列扩增并基因分型。
分型结果显示，AT基因型的泥蚶血红素浓度显著高于TT型的泥蚶个体(图2)，具体数据如表1所示。
表1：泥蚶Rpl35a不同基因型位点的血红素浓度差异分析
注：表中数值为平均值±标准误差。
实施例2：SNP标记在筛选高血红素泥蚶亲本中的应用
制作评估筛选高血红素浓度泥蚶亲本SNP标记的试剂盒，用于检测Rpl35a基因的SNP位点Hic_asm_12:32057574。
试剂盒含有所需检测SNP位点的特异性扩增引物和特异性延伸引物的试剂，位点Hic_asm_12:32057574的特异性扩增引物序列为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。试剂盒内还包括PCR技术所需的常用试剂，包括10×PCR(含Mg2+)缓冲液、dNTP(10mM)、ddH2O、Taq酶，以及标准品内参基因。检测的扩增反应体系如表2所示，扩增反应的条件如表3所示。
表2：PCR扩增反应体系表
表3：PCR扩增反应条件表
将扩增PCR产物将进行测序，并基因分型。
利用试剂盒来检测目标SNP位点，筛选高血红素泥蚶亲本。步骤如下所示：
(1)通过微创取血法，从待测泥蚶亲本中抽取血液，提取DNA；
(2)以提取获得的DNA为模板，利用试剂盒中的特异性引物(序列为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)构建PCR扩增反应体系(参照表2)，进行PCR扩增(扩增反应条件参照表3)，得到PCR扩增产物；
(3)对得到的PCR产物进行测序分析，获得测序结果后根据结果确定待测泥蚶Rpl35a基因的SNP标记基因型是否为AT杂合体，由此来筛选泥蚶高血红素亲本个体。
结果显示，经过SNP试剂盒筛选出的泥蚶亲本育种后的子一代，取50个进行基因分型，发现AT型杂合体的血红素浓度显著大于TT纯合型个体，证明本发明所筛选的SNP位点及构建的筛选试剂盒是可用于快速选育高血红素品系的泥蚶亲本，提高育种效率。
表4：泥蚶子一代不同基因型位点的血红素浓度(HEME)差异分析
注：表中数值为平均值±标准误差。
上述反应体系、反应条件和后续的基因分型及评估方法，可以根据本领域公知常识或者惯用技术手段进行变化或者替换。该试剂盒的价值在于能够快速获得有高血红素SNP基因型标记的泥蚶亲本，从而进行分子标记辅助育种，提高优良品种的育种效率。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但这并不代表对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种与泥蚶血红素浓度相关的SNP位点，其特征在于，所述的SNP位点位于序列为SEQID NO:1的Rpl35a的基因的第301位，为T/A。
2.权利要求1所述的SNP位点作为靶位点在筛选高血红素含量的泥蚶亲本中的应用。
3.一种检测权利要求1所述的SNP位点的方法，其特征在于，所述的方法是使用引物扩增待检测的泥蚶样品的核酸，扩增产物再通过测序来确定是否存在目标SNP的基因型。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的引物，其上游引物的序列为SEQ IDNO:2，下游引物的序列为SEQ ID NO:3。
5.一种检测权利要求1所述的SNP位点的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有用于扩增包含权利要求1所述SNP位点的核酸片段的引物对。
6.如权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒为PCR扩增测序试剂盒。
7.如权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:2，下游引物的序列为SEQ ID NO:3。
8.一种筛选泥蚶高血红素含量亲本的方法，其特征在于，所述的方法是检测待筛选权利要求1所述的SNP位点的基因型为AT的泥蚶个体。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)通过活体取样方法取待检测泥蚶样品的基因组DNA；
2)以提取获得的DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
3)对PCR产物进行测序，通过测序结果确定样品SNP标记的基因型来筛选基因型为AT的个体作为高血红素浓度的亲本。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的活体取样方法为微创取血法。
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