CN110257501B - 一种快速检测α血红蛋白X区段拷贝数的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测α血红蛋白X区段拷贝数的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括一对可以同时扩增α‑珠蛋白基因簇中X1区段和X2区段的的引物X1X2‑F和X1X2‑R，一条特异性检测X1区段的荧光探针X1‑prob，以及一条特异性检测X2区段的荧光探针X2‑prob。本发明所述试剂盒无需外源性参考基因即可实现相对定量，且对快速诊断α‑珠蛋白基因簇中X1和X2区段的比值测定具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性。

Description

一种快速检测α血红蛋白X区段拷贝数的试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种快速检测α血红蛋白X区段拷贝数的试剂盒。
背景技术
地中海贫血简称地贫，是最常见的单基因遗传疾病之一，常见的地贫种类有α-地贫和β-地贫，分别由α-珠蛋白基因簇(NG_000006.1)和β-珠蛋白基因簇异常表达引起。在我国，广西、广东和海南是地中海贫血的高发省份，其中广西α-地贫的发病率是15.5％。
常规地贫基因检测手段是采用Gap-PCR法分析--SEA型，--THAI型，-α3.7，-α4.2等常见地贫基因。在日常研究中，本申请发明人团队检出了多种罕见地贫等位基因，包括-α2.4，-α21.9等。现有常规的发现罕见地贫等位基因的方法是根据常规地贫基因分析结果，综合其血红蛋白电泳、血常规等表型进行分析，当常规地贫基因分析结果与表型不一致时，采用MLPA、基因芯片等技术进行检测。
同源基因定量技术是一种根据基因的同源性，采用共同的扩增引物对同源基因进行扩增，最后采用荧光标记法或者探针法对基因的含量进行相对定量的方法。α-珠蛋白基因簇由调控因子(HS-40)，α基因(α1和α2)，ζ基因(ζ2)，假基因(Ψζ1,Ψα2andΨα1)和θ组成，其排列顺序为：HS40–ζ2–Ψζ1–Ψα2–Ψα1–α2–α1–θ。α地中海贫血基因据其同源性，可划分为X1，X2，Y1，Y2，Z1和Z2区间。
地贫检测涉及产前诊断，但常规检测实验无法提示罕见地贫等位基因的存在。由于α地贫基因簇自身的同源性较高，因此很多罕见地贫等位基因是由自身同源重组产生，进而产生同源重组部分的拷贝数变异。X区段作为同源重组的重要部分，对其同源性较高的X1区段和X2区段进行快速的拷贝数变异的检测，有助于提示罕见地贫等位基因的存在。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种无需外源性参考基因即可实现相对定量，且具有高度灵敏性、稳定性、准确性及良好特异性的快速检测α血红蛋白X区段拷贝数的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种快速检测α血红蛋白X区段拷贝数的试剂盒，包括一对可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中X1区段和X2区段的的引物X1X2-F和X1X2-R，一条特异性检测X1区段的荧光探针X1-prob，以及一条特异性检测X2区段的荧光探针X2-prob；所述的引物及探针具体如下：
X1X2-F：5’-CCCTCCACACTCACAGTACT-3’；
X1X2-R：5’-CAACAATTCAGAGAGGTCCATG-3’；
X1-prob：5’6-FAM-CCAGAAGGAAAGCAGTGACAGGGTC-3’BHQ-1；
X2-prob：5’ROX-CCAGAAGAAAAGCGGTGACAGGGTC-3’BHQ-2。
本发明所述的荧光探针中，FAM指羧基荧光素，ROX指羧基-X-罗丹明，BHQ-1和BHQ-2是指荧光淬灭基团。
本发明所述技术方案中，所述X1区段的序列为：5’-ccctccacactcacagtactggattgagctttggggagggtggagaggaccctgtcactgctttccttctggacatggacctctctgaattgttg-3’；所述X2区段的序列为：5’-ccctccacactcacagtactgaattgagctttgggtagggtggagaggaccctgtcaccgcttttcttctggacatggacctctctgaattgttg-3’。
本发明所述快速检测α血红蛋白X区段拷贝数的试剂盒还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如缓冲液、酶液(DNA聚合酶)、Mg2+(MgCl2)和dNTPs等。其中酶液优选为采用康为世纪所生产的GoldStar Taq DNA Po lymerase，缓冲液为与上述酶液配套的缓冲液；MgCl2和dNTPs优选为康为世纪的相关产品。
采用上述试剂盒快速检测快速检测α血红蛋白X区段拷贝数的方法，包括以下步骤：
1)抽提样本基因组DNA，制备DNA模板；
2)配制反应体系，具体为：
将引物X1X2-F、X1X2-R和GAPDH-R，荧光探针X1-prob和X2-prob；以及PCR缓冲液、酶液、MgCl2、dNTP、水和DNA模板等配制成反应体系；
3)样本检测：分别将配制的反应体系进行PCR扩增，记录每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环次数Cq(Cq值的大小可以反映所检测模板数的多少)；
4)数据分析及结果判定：根据定量检测所获得的Cq值，以正常基因型(αα/αα)样本为对照标本，按下述公式进行计算：
待检样本(或对照样本)的基因ΔCq＝Cq_A2-Cq_A1；
待检样本目的基因ΔΔCq＝ΔCq_待检样本-ΔCq_正常样本；
待检样本目的X1和X2区段相对拷贝数比值R＝2-ΔΔCq；
根据R的值结合下述表1进行结果判定：
表1：
Figure BDA0002108744100000021
Figure BDA0002108744100000031
其中，当R在0.75-1.26范围时，其结果应匹配理论值中的“1”；当R在0.55-0.37范围时，其结果应匹配理论值中的“0.5”。若检测值不在定义的R值范围内时，应采用其他方法进行辅助判断，即当检测结果为“需要进一步复核的阳性比值”时，需要采用其他方法进行进一步复核。由于TaqMan荧光定量技术在使用时，其定量结果并不是遵循完美的理论值，其结果是在理论值的左右浮动，上述R值在适当范围与理论值的匹配问题是本申请发明人团队通过已知基因型的样本验证后所得。
本发明的基本原理是基于α珠蛋白基因缺失是导致α地贫根本原因的发病机制。本试剂盒设计的理论依据为很多罕见地贫等位基因是由自身同源重组产生，进而产生同源重组部分的拷贝数变异。X区段作为同源重组的重要部分，对其同源性较高的X1部分(即X1区段)和X2部分(即X2区段)进行快速的拷贝数变异的检测，有助于提示罕见地贫等位基因的存在。
在执行荧光定量实验室，大部分检测体系使用的是不同引物、探针扩增不同的区段，再根据其检测结果进行相对定量。但在实际检测中，由于不同引物、探针的效率很难保证完全一致，因此容易导致假阴性或者假阳性。而本申请采用同源片段定量法，有助于避免不同引物、不同探针间扩增效率的差异，进而使检测结果更加准确。
与现有技术相比，本发明的特点在于：
1、本发明无需使用外源性参考基因即可实现相对定量。
2、本发明需要定量的基因片段只采用1组引物既可完成扩增，保障了扩增效率的一致性及定量的准确性。
3、相对于现有荧光定量检测体系在实际操作中因不同引物、探针的效率难以保证完全一致而容易导致假阴性或者假阳性，本发明采用同源片段定量法，有助于避免不同引物、不同探针间扩增效率的差异，进而使检测结果更加准确。
4、本发明具有高通量性，可同时进行92个样本的检测，减少人为操作失误。
5、本发明所述试剂盒中的引物及探针有良好的特异性，以及实验的可重复性。
6、本发明所述试剂盒对快速诊断α-珠蛋白基因簇中X1和X2区段的比值测定具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
(1)、试剂盒的组成：
(1.1)一对可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中X1区段和X2区段的的引物X1X2-F和X1X2-R：
X1X2-F：5’-CCCTCCACACTCACAGTACT-3’(SEQ ID NO：1)；
X1X2-R：5’-CAACAATTCAGAGAGGTCCATG-3’(SEQ ID NO：2)；
(1.2)一条特异性检测X1区段的荧光探针X1-prob：
X1-prob：5’6-FAM-CCAGAAGGAAAGCAGTGACAGGGTC-3’BHQ-1(SEQ ID NO：3)；
(1.3)一条特异性检测X2区段的荧光探针X2-prob：
X2-prob：5’ROX-CCAGAAGAAAAGCGGTGACAGGGTC-3’BHQ-2(SEQ ID NO：4)；
(1.4)α-珠蛋白基因簇中X1区段和X2区段：
所述X1区段的序列为：5’-ccctccacactcacagtactggattgagctttggggagggtggagaggaccctgtcactgctttccttctggacatggacctctctgaattgttg-3’(SEQ ID NO：5)；
所述X2区段的序列为：5’-ccctccacactcacagtactgaattgagctttgggtagggtggagaggaccctgtcaccgcttttcttctggacatggacctctctgaattgttg-3’(SEQ ID NO：6)；
(1.5)其它组成成分：
DNA聚合酶及与其配套的缓冲液、MgCl2和dNTPs等，其中GoldStar Taq DNAPolymerase、与GoldStar Taq DNA Polymerase配套的缓冲液和d NTPs均购自康为世纪，MgCl2购自Life Technology。
按下述表2配制PCR反应体系：
表2：(mM表示mmol/L)
表2：
Figure BDA0002108744100000041
(2)、实施方法
PCR反应所用仪器为Bio-Rad实时热循环仪CFX96。PCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃15sec+60℃1min，40个循环，于60℃退火步骤末采集荧光信号。
样品处理：DNA样本采用双蒸水稀释至20ng-200ng备用。DNA样本可采用Lab-AidDNA mini extraction kid(Bio-V,Xiamen)试剂盒，或者其他常规DNA提取方法提取。
样本检测：将待检样本，以及3份正常基因型(αα/αα)样本，根据上述反应体系和反应程序，于荧光定量PCR仪上进行扩增检测，记录Cq值。将上述3份样本(3份正常基因型样本)的平均ΔCq值作为ΔCq_正常样本，根据公式ΔΔCq＝ΔCq_待检样本-ΔCq_正常样本计算ΔΔCq值，通过公式R＝2-ΔΔCq计算A1和A2的比值，结合前述表1进行判断：
(3)、样本来源
样本来源自经普通DNA样本。
(4)、结果分析
根据本发明所述的数据分析公式进行计算，并按其结果判断标准确定检测所获得的目的基因拷贝数。结果如下述表3和表4所示：
表3：
Figure BDA0002108744100000051
表4：
Figure BDA0002108744100000052
Figure BDA0002108744100000061
上述表4中，结果为“正常”的囊括--SEA/αα基因型、--THAI/αα基因型和αα/αα基因型；结果为“-A/AA”的为-α/αα基因型(兼并-α4.2/αα和-α3.7/αα)；结果为“-A/-A或-A/--”的表示为-A/-A或-A/--两种情况均有可能。
序列表
<110> 钦州市妇幼保健院
<120> 一种快速检测α血红蛋白X区段拷贝数的试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccctccacac tcacagtact 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
caacaattca gagaggtcca tg 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ccagaaggaa agcagtgaca gggtc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ccagaagaaa agcggtgaca gggtc 25
<210> 5
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ccctccacac tcacagtact ggattgagct ttggggaggg tggagaggac cctgtcactg 60
ctttccttct ggacatggac ctctctgaat tgttg 95
<210> 6
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ccctccacac tcacagtact gaattgagct ttgggtaggg tggagaggac cctgtcaccg 60
cttttcttct ggacatggac ctctctgaat tgttg 95

Claims (4)

1.一种检测的引物和探针在制备用于检测α血红蛋白X区段拷贝数用于诊断地中海贫血的试剂盒中的应用，其特征在于：该试剂盒包括一对可以同时扩增α-珠蛋白基因簇中X1区段和X2区段的引物X1X2-F和X1X2-R，一条特异性检测X1区段的荧光探针X1-prob，以及一条特异性检测X2区段的荧光探针X2-prob；所述的引物及探针具体如下：
X1X2-F：5’- CCCTCCACACTCACAGTACT -3’；
X1X2-R：5’- CAACAATTCAGAGAGGTCCATG -3’；
X1-prob：5’6-FAM-CCAGAAGGAAAGCAGTGACAGGGTC-3’BHQ-1；
X2-prob：5’ROX-CCAGAAGAAAAGCGGTGACAGGGTC-3’BHQ-2；
所述地中海贫血为缺失型--SEA型、--THAI型、-α3.7和-α4.2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述X1区段的序列为：5’-ccctccacactcacagtactggattgagctttggggagggtggagaggaccctgtcactgctttccttctggacatggacctctctgaattgttg-3’。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述X2区段的序列为：5’-ccctccacactcacagtactgaattgagctttgggtagggtggagaggaccctgtcaccgcttttcttctggacatggacctctctgaattgttg-3’。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：试剂盒还包括酶液、Mg2+和dNTPs。
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