CN107828883A - 一种苯丙酮尿症的检测引物组、试剂盒及基因突变检测方法 - Google Patents
一种苯丙酮尿症的检测引物组、试剂盒及基因突变检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种苯丙酮尿症的检测引物组、试剂盒及基因突变检测方法。本发明首次针对苯丙酮尿症相关的PAH、PTS、GCH1、QDPR、PCBD1、SPR基因，提供了覆盖这6个基因及其上下游约10bp的剪切位点的引物组，所述引物组在多重PCR反应体系中，特异性高，引物相互干扰小，均一性高，扩增子表达深度高。本发明具有快速、全面、准确、操作简单的优点，适用于血液、血斑、白细胞等样本的检测，与现有技术相比，覆盖度更全，检测位点更多，准确率高，可应用于苯丙酮尿症基因突变的检测、携带者的检出及遗传咨询等疾病预防方面，还可应用于疾病治疗的指导。
Description
技术领域
本发明属于基因生物学领域，具体涉及一种检测苯丙酮尿症致病基因的引物组、试剂盒及致病基因检测方法。
背景技术
苯丙酮尿症(Phenylketonuria，PKU)是由于缺乏苯丙氨酸羟化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)所致的一种氨基酸代谢异常的疾病。苯丙酮尿症患儿出生时正常，通常3～6个月时开始出现症状，临床表现通常为智力发育落后，发色由黑变黄，尿和汗液中排出较多苯乙酸，可有明显鼠尿臭味。该病目前尚无有效的根治办法，仅能通过食疗减轻和控制患者的症状，因此，快速、准确的致病基因检测、携带者的检出及遗传咨询是预防本病的关键。
苯丙酮尿症属于常染色体隐性遗传病，病因源于基因突变，可通过基因诊断技术进行筛查和诊断。根据不同病因，在分子水平上可将苯丙酮尿症分为苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)缺乏型苯丙酮尿症和四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)缺乏型苯丙酮尿症，其中PAH缺乏型苯丙酮尿症占了98％～99％，都是由于PAH基因发生突变，主要包括点突变以及重复/缺失突变；BH4缺乏型苯丙酮尿症则是由于PAH的辅助因子BH4缺乏造成，主要是由于6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶(PTS)、鸟苷三磷酸环化水合酶(GCH1)、二氢生物蝶呤还原酶(QDPR)和蝶呤-4-甲醇胺脱水酶(PCBD1)这四个基因突变所致，此外，Sepiapterin还原酶(SPR)是属于醛-酮还原酶的一组酶，催化BH4生物合成的最终步骤，其突变也会导致苯丙酮尿症。现有技术仅实现了针对PAH、GCH1、PTS、QDPR及PCBD1这5个基因的全部外显子及调控区的点突变检测体系，但其缺乏SPR基因的检测位点，覆盖度不够高，检出仍有盲点，因此需要一种覆盖度更广的苯丙酮尿症基因突变检测方法。
发明内容
本发明一方面提供一种检测苯丙酮尿症致病基因的引物组，包含检测PAH、PTS、GCH1、QDPR、PCBD1、SPR基因的引物；
优选的，所述引物组，包含如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:166所示的引物序列。
进一步优选的，引物组中引物混合配比如表1所示。
本发明另一方面提供了一种检测苯丙酮尿症致病基因的试剂盒，包含以上所述引物组。
本发明又一方面提供了一种苯丙酮尿症致病基因检测的文库构建方法，利用以上所述引物组进行多重PCR，基于测序平台构建相应的扩增子文库；所述测序平台为高通量测序平台，其包括但不限于illumina/solxa，Ion PGM，Ion proton，SOILD。
优选的，基于Ion Proton平台构建扩增子文库，包括如下步骤：
(1)利用以上所述引物组，以待测样本基因组DNA为模板，进行多重PCR反应；
(2)将多重PCR扩增产物与引物消化酶反应，得到去除引物的多重PCR扩增产物；
(3)将去除引物的多重PCR扩增产物与接头、特异性标签、连接缓冲液、DNA连接酶反应，得到连接产物；
(4)将连接产物进行纯化，获得扩增子文库，用于Ion Proton测序和生物信息学分析。
优选的，步骤(1)中，待测样本选自血液、血斑、白细胞；采样量一般为外周血0.1～0.2mL、2～3片直径约6mm的血斑、白细胞0.05～0.1mL。
优选的，多重PCR反应的20μL体系为：待测样本基因组DNA 200ng、5×IonAmpliseqTM HiFi Master Mix 2μL、10pM引物混合物2μL、DMSO 1μL、无酶水为余量；反应条件为：95℃预变性5min；30个循环扩增(95℃变性35s，60℃退火90s，72℃延伸30s)，72℃延伸1min，16℃forever。
优选的，接头选自Life technology公司的Ion P1接头，特异性标签选自Lifetechnology公司的Barcode 1～96；不同待测样本采用的标签序列不同；标签用于区别每个样本，以便用于同时检测多个样本。
优选的，步骤(4)中，纯化的方法是磁珠纯化。
本发明是所述的多重PCR，是指在同一PCR反应体系里添加两对及以上的引物对，同时扩增出相应的目标片段的PCR反应，对于多重PCR扩增，只有在引物相互干扰小、均一性好的情况下，才能高效获得目标扩增子。
本发明首次针对苯丙酮尿症相关的PAH、PTS、GCH1、QDPR、PCBD1、SPR基因，提供了覆盖这6个基因及其上下游约10bp的剪切位点的引物组，所述引物组在多重PCR反应体系中，特异性高，引物相互干扰小，均一性高，扩增子表达深度高。本发明具有快速、全面、准确、操作简单的优点，适用于血液、血斑、白细胞等样本的检测，与现有技术相比，覆盖度更全，检测位点更多，准确率高，可应用于苯丙酮尿症基因突变的检测、携带者的检出及遗传咨询等疾病预防方面，还可应用于疾病治疗的指导。
附图说明
图1：各扩增子均一性箱式图，其中，X轴为扩增子，Y轴为reads数。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步理解本发明，本发明的保护范围并不局限于此。本发明实施例中未特别说明的条件均按本领域文献报道或产品说明书进行，未特别说明的仪器或试剂均可市售获得。
实施例1、检测苯丙酮尿症致病基因的引物组
发明人针对苯丙酮尿症致病基因PAH、PTS、GCH1、QDPR、PCBD1、SPR，根据这6个基因及其上下游约10bp的剪切位点设计引物，经过大量的筛选和优化，优选出83对特异性引物，组成多重PCR引物组体系，其核苷酸序列及混合配比如表1所示。
表1、检测苯丙酮尿症致病基因的引物序列及混合比例
实施例2、检测苯丙酮尿症的致病基因的测序文库构建
利用实施例1提供的引物组，提供一种基于Ion Proton平台的测序文库构建方法，用于检测苯丙酮尿症的致病基因突变。
1、待测样本DNA提取
取待测者的外周血样本0.1～0.2mL(或2～3片直径约6毫米的干血斑)采用MagPure Tissue&Blood DNA LQ Kit进行基因组DNA提取，对提取的基因组DNA用Nanodrop2000进行纯度检测及浓度的初步评估，再通过琼脂糖凝胶电泳对提取的基因组DNA进行完整性的验证，，
2、多重PCR扩增反应
以提取的基因组DNA为模板进行多重PCR反应，扩增出目标片段，20μL反应体系为：待测样本基因组DNA 200ng、5×Ion AmpliseqTM HiFi Master Mix 2μL、10pM引物混合物2μL、DMSO 1μL、无酶水为余量；扩增反应条件设置如下：95℃预变性5min；30个循环扩增(95℃变性35s，60℃退火90s，72℃延伸30s)，72℃延伸1min，16℃forever。
3、引物消化
PCR反应完成后，短暂离心5s，向PCR产物中加入2μL引物消化酶(Life technology公司)，总体积为约22μL；反应条件如下：50℃10min；55℃10min；60℃20min；16℃forever。
4、接头连接
稀释混合接头，将2μL Ion P1接头(Life technology公司)和2μL特异性标签序列(Life technology公司，Barcode 1～96)用无酶水稀释至8μL，形成接头混合物；将引物消化后的PCR产物短暂离心5sec，加入4μL连接缓冲液，2μL接头混合物，2μL DNA连接酶，总体积为30μL；反应条件如下：22℃30min；72℃10min；16℃forever。
5、扩增子文库纯化
连接产物混合形成扩增子文库，采用磁珠纯化，具体步骤为：取扩增子文库30μL转移至加有15μL磁珠的EP管中，室温孵育5min，磁力架上吸附3min，将上清液转移到新EP管中，加入30μL磁珠，室温孵育5min，磁力架上吸附3min，弃上清，用75％的无水乙醇洗涤两次，弃残留溶液，留磁珠，加入50μL TE Buffer，吸取上清于新离心管中，获得测序文库。
6、高通量测序
将测序文库用于高通量测序，利用Ion OneTouch 2仪器将定量后的混合文库进行测序模板制备，使用Ion OneTouch ES富集测序模板，然后利用Ion ProtonTM测序仪在半导体芯片上进行测序。
测序模板制备方法如下：1)Ion OneTouch 2仪器清洗；2)文库稀释，根据文库的Qubit检测结果，将文库终浓度稀释到25pM，且应保证文库终体积大于100μL；3)安装IonOneTouch2Amplification Plate；4)安装Ion OneTouch 2Oil和Ion OneTouch 2RecoverySolution的圆管；5)安装Ion OneTouch 2Recovery Tubes和Ion OneTouch 2RecoveryRouter；6)配制Amplification Solution；7)安装Reaction Filter Assembly；8)运行IonOneTouch 2仪器；9)回收template-positive ISPs；10)Ion OneTouch 2仪器清洗。
富集测序模板方法如下：1)配制Melt-Off Solution；2)清洗MyOneTMStreptavidin C1Beads；3)配制富集反应体系；4)启动Ion OneTouch ES，富集template-positive ISPs；5)清洗富集后的ISPs。
半导体测序方法如下：将带有模板分子的微珠加载到Ion ProtonTM测序仪的半导体芯片上进行测序。微珠加载过程按照测序仪厂家的操作说明进行，它分为如下几个步骤：1)清洗测序仪；2)设置测序程序；3)测序仪的初始化；4)上机文库准备及芯片检测和清洗；5)芯片加样；6)启动测序。
7、生物信息分析
测序数据中按照特异性标签区分不同样本，对测序数据进行突变分析，获得待测样本的苯丙酮尿症突变基因信息。
图1给出实施例1的引物组对待测样本进行多重PCR和建库测序后的扩增子均一性箱式图，可见本发明的引物能高效扩增出目标片段，并且引物之间相互干扰小，均一性高，测序结果显示扩增子表达深度高，测序覆盖率达100％，可用于同时检测苯丙酮尿症相关的PAH、PTS、GCH1、QDPR、PCBD1、SPR基因突变信息。
表2给出20例来自临床确诊苯丙酮尿症患者的待测样本(包括15例血液、5例血斑)利用实施例2的方法进行检测，结合Sanger测序结果，可见本发明检测结果与sanger结果完全一致，无假阳性和假阴性，准确率高，可检测纯合或杂合的基因突变，适用于苯丙酮尿症的检测和遗传分析。
表2、本发明检测结果和sanger测序结果比对表
基于上述结果，本发明引物组包括检测PAH、PTS、GCH1、QDPR、PCBD1、SPR基因的引物，具体如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:166所示，其准确率高，均一性好，位点覆盖度广，可制备一种检测苯丙酮尿症致病基因的试剂盒，包括本发明所述的引物组，实现优良的苯丙酮尿症致病基因检测效果。
序列表
<110> 东莞博奥木华基因科技有限公司
<120> 一种苯丙酮尿症的检测引物组、试剂盒及基因突变检测方法
<160> 166
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<210> 56
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 56
catagagtgt gctctcagat tgactt 26
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 57
tgctttcata cttgcctcca cat 23
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 58
ccagctggaa gacgtttctc a 21
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 59
gctccaagta gagaaggtaa gagga 25
<210> 60
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 60
gatttgccaa tcagattctc agctatg 27
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 61
tggtagggaa agacagtctt cga 23
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 62
catacaccca aaggattgag gtctt 25
<210> 63
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 63
gtttcaaaga cctgagggcc ata 23
<210> 64
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 64
cccaattaca ggaaattggc ctt 23
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 65
aggaagcacc agcagtcttc 20
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 66
actgcggtcc tggaaaacc 19
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 67
gtggaccagc cagcaatgaa cc 22
<210> 68
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 68
catggatcca agcccatgta tacc 24
<210> 69
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 69
agggtttcaa caatattgaa agcaca 26
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 70
gactccataa aggcatatgg tgct 24
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 71
cgaggtattg tggcagcaaa gt 22
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 72
ggaggtgtcc gtgttcctaa aaa 23
<210> 73
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 73
catttgagaa attcaggtca cagaccta 28
<210> 74
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 74
gtctttcagt gacatctgcc atga 24
<210> 75
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 75
gaacatggaa gtttgctacg acattatc 28
<210> 76
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 76
ctgcaatcaa aatggtgcca tatca 25
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 77
gctagtggct cacctttgtc ac 22
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 78
ctggagctgg agaagacagc cat 23
<210> 79
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 79
cttatctcgt gaaagctcat ggaca 25
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 80
ctagaccttc tcgtttaaag aaagatgagt 30
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 81
gtactgtgtg cagtggaaga ct 22
<210> 82
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 82
gtgatgagct ttgagttttc tttcttctt 29
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 83
cctcaacaag caaggcagac tt 22
<210> 84
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 84
aagccttgaa aaatcaggtg tctct 25
<210> 85
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 85
gggttttata caaggacttc agagtcttg 29
<210> 86
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 86
ctgcttgaga cacctatttt gtgc 24
<210> 87
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 87
ccattgaccc tgatgtggac ttac 24
<210> 88
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 88
cttgctatga gtacaatcac atttttcca 29
<210> 89
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 89
ctcacagggt ggtcagcat 19
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 90
gttctgccaa tctgtactca gga 23
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 91
cctggactcc cagttcagtc a 21
<210> 92
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 92
gcctttcaga acgggacata aac 23
<210> 93
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 93
ctaacaagac gtgaagggag aga 23
<210> 94
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 94
aaggccgtga tgccatctt 19
<210> 95
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 95
ggaaggctca ttgttaagtc caaaag 26
<210> 96
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 96
aactggacca ccatcctgaa tg 22
<210> 97
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 97
tggacactgc tacttgttcg atg 23
<210> 98
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 98
agtcagtgga agcagaattt ctgg 24
<210> 99
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 99
acagcatcac tcaccttgtt gt 22
<210> 100
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 100
tagaacacta acctggctct cact 24
<210> 101
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 101
taccctgttg aagtctttga aatgaaact 29
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 102
ctaggctggc aaagcacaca 20
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 103
ggttttgtct ctaggaggcg att 23
<210> 104
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 104
gttttacaat ccacataagg caagatacag 30
<210> 105
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 105
ggagagccta tcacagtaat attcacc 27
<210> 106
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 106
gggaatagca cataataagc acccaa 26
<210> 107
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 107
cagaaagttc ttcctgtagg agttcttta 29
<210> 108
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 108
acacagaaag aaactgggct ttgt 24
<210> 109
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 109
gatgaagaaa acttgaaact gtttgggaa 29
<210> 110
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 110
tgctgaatac tctttcatcc ttattgaagg 30
<210> 111
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 111
gcggagacgc acttccta 18
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 112
ccaccttccg tgctcatctt 20
<210> 113
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 113
tcttatagca cgactgaaaa tgtagctg 28
<210> 114
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 114
cccaatagct attctccttt ataaaccaca 30
<210> 115
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 115
gataaggtga ggtttagagg cataagtg 28
<210> 116
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 116
gcacatccat atccagattc ttatgatca 29
<210> 117
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 117
gggtttgaat gtgatacttg tgtcat 26
<210> 118
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 118
tttataattg tgcccatggc catttg 26
<210> 119
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 119
ttgctaactt gtgcttggat gttg 24
<210> 120
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 120
cccagcaatc tgcaaaaacc ac 22
<210> 121
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 121
ttacagaaaa cacaaggctg gacaa 25
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 122
caggtggtaa ccacagaagg aag 23
<210> 123
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 123
gaagctgctc agtcatggac at 22
<210> 124
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 124
tatctgtgtc cattgcaggg ttac 24
<210> 125
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 125
aagaacatac agccaaagga agaacata 28
<210> 126
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 126
catcattgtt aaaatgacag actcgttca 29
<210> 127
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 127
gtgcaaaccc aatccttgtc ag 22
<210> 128
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 128
gaagagaagg tggatgcaat tctttg 26
<210> 129
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 129
cacagatagg gaaataaagg cttacca 27
<210> 130
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 130
tggaagcaga gcatatggac atc 23
<210> 131
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 131
gtgaacagca cccttggcca t 21
<210> 132
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 132
gaatagagat ctcaagagaa gattgcatgt 30
<210> 133
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 133
gtgtttcaga accagaggtg aga 23
<210> 134
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 134
catcgctgtg ctcccgtaa 19
<210> 135
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 135
actgagatga ggcctaaaaa tatgctg 27
<210> 136
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 136
ttccagaact ttccatgact ggatc 25
<210> 137
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 137
ctcaggcatt gatttcctgt tcatc 25
<210> 138
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 138
tgctgtatgt ttgcgttttc ctg 23
<210> 139
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 139
ggactcacac ttggatttgg cat 23
<210> 140
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 140
tttttgttct tgtgttgaag gtgact 26
<210> 141
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 141
gggccttttt gaaactacct ggt 23
<210> 142
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 142
ccaaagctgt tttctccttc cagt 24
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 143
cttgagatgc ttggtagcca gat 23
<210> 144
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 144
ggtttctttc ctgggaatgc tga 23
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 145
ttacgggagc acagcgatgg 20
<210> 146
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 146
cccatttccc aggtatgatc g 21
<210> 147
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 147
atctatctgt taagcagctt agagggta 28
<210> 148
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 148
cctggatggg actcctggta 20
<210> 149
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 149
gcagcgactg ctgcttatca 20
<210> 150
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 150
ctttagattt ctaggcgtcc tatctgac 28
<210> 151
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 151
agtgactcca ctcaagtgaa caac 24
<210> 152
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 152
cgagatgtta accacggttc tgtt 24
<210> 153
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 153
ggacacagac atgcagcagt t 21
<210> 154
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 154
cttttccagt aagctcagca gtttc 25
<210> 155
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 155
gcccacgtgg acttctatga 20
<210> 156
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 156
gcttctatgt gtaaggcagg actg 24
<210> 157
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 157
ggaacctaat gtgagggtgc t 21
<210> 158
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 158
cctgtgggtt gtttcctgga g 21
<210> 159
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 159
gcctgcactg agttactcct aa 22
<210> 160
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 160
gcagagcatg gaggtcaagt tc 22
<210> 161
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 161
cagggacctg aaaccttctg t 21
<210> 162
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 162
cagccctttt cgcatgtct 19
<210> 163
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 163
ggaagctggt ggattgcaag 20
<210> 164
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 164
aaaggttcag gaagccaaaa acatg 25
<210> 165
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 165
cgtggttaac atctcgtccc t 21
<210> 166
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 166
gggcatagtt cagcaccctc 20
Claims (10)
1.一种检测苯丙酮尿症致病基因的引物组，其特征在于：包含检测PAH、PTS、GCH1、QDPR、PCBD1、SPR基因的引物。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：包含如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:166所示的引物序列。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于：所述引物组中各引物混合配比如表1所示。
4.一种检测苯丙酮尿症致病基因的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1～3任一项所述的引物组。
5.一种苯丙酮尿症致病基因检测的文库构建方法，其特征在于：利用权利要求1～3任一项所述的引物组进行多重PCR，基于测序平台构建相应的扩增子文库；所述测序平台为高通量测序平台。
6.根据权利要求5所述的文库构建方法，其特征在于：基于Ion Proton平台构建扩增子文库，包括如下步骤：
(1)利用权利要求1～3任一项所述的引物组，以待测样本基因组DNA为模板，进行多重PCR反应；
(2)将多重PCR扩增产物与引物消化酶反应，得到去除引物的多重PCR扩增产物；
(3)将去除引物的多重PCR扩增产物与接头、特异性标签、连接缓冲液、DNA连接酶反应，得到连接产物；
(4)将连接产物进行纯化，获得扩增子文库，用于Ion Proton测序和生物信息学分析。
7.根据权利要求6所述的文库构建方法，其特征在于：步骤(1)中，待测样本选自血液、血斑、白细胞。
8.根据权利要求6所述的文库构建方法，其特征在于：多重PCR反应的20μL体系为：待测样本基因组DNA 200ng、5×Ion AmpliseqTM HiFi Master Mix 2μL、10pM引物混合物2μL、DMSO 1μL、无酶水为余量；反应条件为：95℃预变性5min；30个循环扩增(95℃变性35s，60℃退火90s，72℃延伸30s)，72℃延伸1min，16℃forever。
9.根据权利要求6所述的文库构建方法，其特征在于：接头选自Life technology公司的IonP1接头，特异性标签选自Life technology公司的Barcode 1～96。
10.根据权利要求6所述的文库构建方法，其特征在于：步骤(4)中，纯化的方法是磁珠纯化。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711291126.9A CN107828883B (zh) | 2017-12-08 | 2017-12-08 | 一种苯丙酮尿症的检测引物组、试剂盒及基因突变检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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