CN114705797B - 一种嗜尸性蝇类种类鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种嗜尸性蝇类种类鉴定的方法，构建嗜尸性蝇类数据库：从26种嗜尸性蝇类的样本中分别提取出碳氢化合物；将提取的碳氢化合物进行GC‑MS分析；将GC‑MS分析的数据进行分析整合构成数据矩阵；样本鉴定：将待测样本采用上述提取碳氢化合物、分析整合的方法获得目标数据；将目标数据与数据库中的数据矩阵导入SIMCA14.1软件，构建正交偏小二乘判别分析模型从而得出待测样本的种类。本发明具有本申请具有可降低柱温，从而延长色谱柱的使用极限，减少色谱柱的损耗和耗时，扩大了鉴定嗜尸性蝇类的种类(揽括了常见嗜尸性蝇类)，同时本申请的检测手段为非浸入性，有利于保存昆虫证据，检测样品广泛，检测物质稳定性强。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测及法医鉴定技术领域，具体涉及一种嗜尸性蝇类种类鉴定的方法。
背景技术
确定昆虫种类是基于昆虫证据解决司法实践关键。形态学方法鉴定昆虫种类是金标准，但需要对昆虫体型、颜色、雄性外生殖器等外显结构了解透彻，这对于实践推广昆虫证据难度较大。目前研究表明，基于DNA的分子鉴定技术在昆虫鉴定方面具有独特优势。线粒体基因与核基因联合可以有效解决昆虫近缘种鉴别的问题。但分子鉴定技术需要考虑DNA含量和鉴别效率问题，此外同源比对技术依赖分子数据库的完善程度，有必要探索高效实用的种类鉴定储备方法，应对法医复杂多变的实践环境。
目前国外有根据GC-MS(气相色谱-质谱联用)鉴定表皮物质进行昆虫种类鉴定的方法，但该方法需要柱温升至320℃，达到色谱柱使用极限，对色谱柱损耗较大，且耗时较长，对于碳氢化合物测定误差较大，无法满足实践需要涉及物种数据丰度不够。
发明内容
鉴于目前存在的上述不足，本发明提供一种嗜尸性蝇类种类鉴定的方法。本申请具有可降低柱温，从而延长色谱柱的使用极限，减少色谱柱的损耗和耗时，扩大了鉴定嗜尸性蝇类的种类(揽括了常见嗜尸性蝇类)，同时本申请的检测手段为非浸入性，有利于保存昆虫证据，检测样品广泛，检测物质稳定性强，昆虫各类组织残片都可以作为检测样品，检测样品可保存上百年等优点。
为了达到上述目的，本发明提供一种嗜尸性蝇类种类鉴定的方法，包括以下步骤：
步骤一：构建嗜尸性蝇类数据库：从嗜尸性蝇类的样本中提取出碳氢化合物；将提取的碳氢化合物进行GC-MS分析；将GC-MS分析的数据进行分析整合构成数据矩阵；其中，所述嗜尸性蝇类包括麻蝇科13种、丽蝇科11种以及蝇科2种；
步骤二：样本鉴定：将待测样本采用步骤一中提取碳氢化合物、分析整合的方法获得目标数据；将目标数据与步骤一中的数据矩阵导入SIMCA 14.1软件，构建正交偏小二乘判别分析模型从而得出待测样本的种类；其中，所述GC-MS分析的程序升温条件为：50℃保持2分钟，25℃/min速率上升至200℃，然后以6℃/min速率上升至260℃，再以3℃/min速率上升至300℃，保持15min。
依照本发明的一个方面，所述麻蝇科13种具体为酱亚麻蝇、棕尾别麻蝇、黑尾黑麻蝇、台湾别麻蝇、绯角亚麻蝇、红尾粪麻蝇、野亚麻蝇、红尾拉麻蝇、埃及亚麻蝇、急钩亚麻蝇、结节亚麻蝇、短脚亚麻蝇、拟东方辛麻蝇；丽蝇科11种具体为绯颜裸金蝇、大头金蝇、广额金蝇、丝光绿蝇、新陆原伏蝇、巨尾阿丽蝇、乌足金蝇、伏蝇、叉叶绿蝇、红头丽蝇、反吐丽蝇；所述蝇科2种为厩腐蝇、裸芒综蝇。
依照本发明的一个方面，所述GC-MS的接口温度为280℃，载气为超纯氦气，压力为11.3psi。
依照本发明的一个方面，所述提取出碳氢化合物的过程具体为：将样本超声清洗后，用滤纸擦干，再将样本完全浸入加有1mL正己烷中的玻璃瓶中，浸泡1小时，C7-C40为外标，萃取液经过0.45μm孔径尼龙膜过滤后，转入新的玻璃瓶，将样品在真空下浓缩待用。
依照本发明的一个方面，所述分析整合具体为：将每种化合物的峰面积除以内标的峰面积，最后除以总值，数据用百分比值表示。
依照本发明的一个方面，所述GC-MS分析过程中，采用的色谱柱为DB-5MS毛细管柱。
本发明的实施优点：
(1)本申请扩大了种类鉴定数据库，揽括了常见嗜尸性蝇类；
(2)本申请的碳氢化合物提取步骤和程序升温条件能降低了柱温，本申请最高柱温300℃，远低于色谱柱使用上限，从而延长色谱柱的使用极限，减少色谱柱的损耗和耗时，因减少了耗时从而减少碳氢化合物测定误差；
(3)本申请的检测手段为非浸入性，有利于保存昆虫证据，检测样品广泛，检测物质稳定性强，昆虫各类组织残片都可以作为检测样品，检测样品可保存上百年。
附图说明
图1为本发明实施例1未知绿蝇属种鉴定结果图；
图2为本发明实施例1的程序升温条件下丝光绿蝇表皮碳氢化合物色谱图；
图3为本发明对比例1的传统程序升温条件下丝光绿蝇表皮碳氢化合物色谱图；
图4为本发明对比例2的PCA聚类模型；
图5为本发明实施例1的OPLS-DA聚类模型。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种嗜尸性蝇类种类鉴定的方法：
S1：数据库构建
蝇类样本：麻蝇科13种：酱亚麻蝇(Sarcophaga dux)、棕尾别麻蝇(Sarcophagaperegrina)、黑尾黑麻蝇(Helicophagella melanura)、台湾别麻蝇(Sarcophagaformosensis)、绯角亚麻蝇(Sarcophaga ruficornis)、红尾粪麻蝇(Sarcophaga africa)、野亚麻蝇(Sarcophaga similis)、红尾拉麻蝇(Ravinia striata)、埃及亚麻蝇(Sarcophaga aegyptica)、急钩亚麻蝇(Sarcophaga portschinskyi)、结节亚麻蝇Sarcophaga tuberose)、短脚亚麻蝇(Sarcophaga brevicornis)、拟东方辛麻蝇(Sarcophaga reciproca)；丽蝇科11种：绯颜裸金蝇(Chrysomya rufifacies)、大头金蝇Chrysomya megacephala)、广额金蝇(Chrysomya phaonis)、丝光绿蝇(Luciliasericata)、新陆原伏蝇(Protophormia terraenovae)、巨尾阿丽蝇(Aldrichinagrahami)、乌足金蝇(Chrysomya nigripes)、伏蝇(Phormia regina)、叉叶绿蝇(Luciliacaesar)、红头丽蝇(Calliphora vicina)、反吐丽蝇(Calliphora vomitoria)；蝇科2种：厩腐蝇(Muscina stabulans)、裸芒综蝇(Synthesiomyia nudiseta)。以上每个物种选取3个样本进行后续操作。
碳氢化合物提取步骤：将上述样本超声清洗后，用滤纸擦干。将滤纸擦干的样本完全浸入加有1mL正己烷中的玻璃瓶中，浸泡1小时。C7-C40(浓度1μg/mL)为外标。接着，萃取液经过0.45μm孔径尼龙膜过滤后，转入新的玻璃瓶，将样品在真空下浓缩待用。上机前需加入100μL正己烷溶解样品。
GC-MS分析：采用GC-MS(安捷伦科技公司，7890B-5977A GC/MSD)进行碳氢化合物检测，色谱柱选取DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。进样量为1μL，进样口温度250℃，不分流。程序升温条件为：50℃保持2分钟，25℃/min速率上升至200℃，接着在6℃/min速率上升至260℃，最后3℃/min升至300℃，保持15min。气相色谱/质谱接口温度为280℃，载气为超纯氦气，压力为11.3psi。
数据库构建：将GC-MS下机数据使用MSD ChemStation(F.01.03)进行分析整合。将每种化合物的峰面积除以内标的峰面积，最后除以总值，数据用百分比值表示，构成数据矩阵。
S2：样本鉴定
对于未知样本，首先需要分析其表皮碳氢化合物组成，再结合S1构建数据矩阵，应用正交偏小二乘判别分析(OPLS-DA)进行数据聚类分析，从而推断出未知样本的种类。
碳氢化合物提取步骤：将未知样品超声清洗后，用滤纸擦干。将样本完全浸入加有1mL正己烷中的玻璃瓶中，浸泡1小时。C7-C40(浓度1μg/mL)为外标。接着，萃取液经过0.45μm孔径尼龙膜过滤后，转入新的玻璃瓶，将样品在真空下浓缩待用。上机前需加入100μL正己烷溶解样品。
GC-MS分析：采用GC-MS(安捷伦科技公司，7890B-5977A GC/MSD)进行碳氢化合物检测，色谱柱选取DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。进样量为1μL，进样口温度250℃，不分流。程序升温条件为：50℃保持2分钟，25℃/min速率上升至200℃，接着在6℃/min速率上升至260℃，最后3℃/min升至300℃，保持15min。气相色谱/质谱接口温度为280℃，载气为超纯氦气，压力为11.3psi。
OPLS-DA分析：将GC-MS下机数据使用MSD ChemStation(F.01.03)进行分析整合。分析整合具体为将每种化合物的峰面积除以内标的峰面积，最后除以总值。将分析整合后的未知样本数据同上述S1构建的数据矩阵一同导入SIMCA 14.1软件，构建OPLS-DA模型分析，scaling选择ctr。根据聚类分析结果可推断出未知样本种类。
实施例1
未知绿蝇属种鉴定：
将上述S1的数据矩阵采用OPLS-DA模型分析，scaling选择ctr，结果如图5。
碳氢化合物提取步骤：将未知绿蝇属种样本超声清洗后，用滤纸擦干。将样本完全浸入加有1mL正己烷中的玻璃瓶中，浸泡1小时。C7-C40(浓度1μg/mL)为外标。接着，萃取液经过0.45μm孔径尼龙膜过滤后，转入新的玻璃瓶，将样品在真空下浓缩待用。上机前需加入100μL正己烷溶解样品。
GC-MS分析：采用GC-MS(安捷伦科技公司，7890B-5977A GC/MSD)进行碳氢化合物检测，色谱柱选取DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。进样量为1μL，进样口温度250℃，不分流。程序升温条件为：50℃保持2分钟，25℃/min速率上升至200℃，接着在6℃/min速率上升至260℃，最后3℃/min升至300℃，保持15min。气相色谱/质谱接口温度为280℃，载气为超纯氦气，压力为11.3psi。如图2为实施例1的程序升温条件下丝光绿蝇表皮碳氢化合物色谱图。
OPLS-DA分析：将GC-MS下机数据使用MSD ChemStation(F.01.03)进行分析整合。分析整合具体为将每种化合物的峰面积除以内标的峰面积，最后除以总值。将分析整合后的未知绿蝇属数据上述S1构建的数据矩阵一同导入SIMCA 14.1软件，构建OPLS-DA模型分析，scaling选择ctr，发现未知绿蝇属同丝光绿蝇成分相似性高，聚集在一起，提示该绿蝇属为丝光绿蝇，如图1所示。
对比例1
传统程序升温条件下检测丝光绿蝇：
碳氢化合物提取步骤：将丝光绿蝇的样本超声清洗后，用滤纸擦干。将样本完全浸入加有1mL正己烷中的玻璃瓶中，浸泡1小时。C7-C40(浓度1μg/mL)为外标。接着，萃取液经过0.45μm孔径尼龙膜过滤后，转入新的玻璃瓶，将样品在真空下浓缩待用。上机前需加入100μL正己烷溶解样品。
GC-MS分析：采用GC-MS(安捷伦科技公司，7890B-5977A GC/MSD)进行碳氢化合物检测，色谱柱选取DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。进样量为1μL，进样口温度250℃，不分流。气相色谱/质谱接口温度为280℃，载气为超纯氦气，压力为11.3psi。传统柱温条件：程序升温条件为：40℃保持2分钟，20℃/min速率上升至200℃，接着在3℃/min速率上升至320℃，保持8min。本发明柱温条件：50℃保持2分钟，25℃/min速率上升至200℃，接着在6℃/min速率上升至260℃，最后3℃/min升至300℃，保持15min。如图3为对比例1的传统程序升温条件下丝光绿蝇表皮碳氢化合物色谱图。
对比图2和图3可明确，本发明实施例1的程序升温条件下，丝光绿蝇表皮碳氢化合物检测丰度高，检测碳氢化合物种类更加全面。
对比例2
蝇类样本：如S1中的所述的麻蝇科13种、丽蝇科11种、蝇科2种，以上每种选择3个样本进行后续分析。
碳氢化合物提取步骤：将样品超声清洗后，用滤纸擦干。将样本完全浸入加有1mL正己烷中的玻璃瓶中，浸泡1小时。C7-C40(浓度1μg/mL)为外标。接着，萃取液经过0.45μm孔径尼龙膜过滤后，转入新的玻璃瓶，将样品在真空下浓缩待用。上机前需加入100μL正己烷溶解样品。
GC-MS分析：采用GC-MS(安捷伦科技公司，7890B-5977A GC/MSD)进行碳氢化合物检测，色谱柱选取DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。进样量为1μL，进样口温度250℃，不分流。程序升温条件为：50℃保持2分钟，25℃/min速率上升至200℃，接着在6℃/min速率上升至260℃，最后3℃/min升至300℃，保持15min。气相色谱/质谱接口温度为280℃，载气为超纯氦气，压力为11.3psi。
模型构建：将GC-MS下机数据使用MSD ChemStation(F.01.03)进行分析整合。分析整合具体为：将每种化合物的峰面积除以内标的峰面积，最后除以总值，构建数据矩阵。选择PCA模型分析，scaling选择ctr，结果如图4。
结果显示：实施例1中的图5中麻蝇科、丽蝇科、蝇科区分明显，鉴别效能高。图4中，麻蝇科、丽蝇科、蝇科无法区分开来，无法进行鉴别。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (5)
1.一种嗜尸性蝇类种类鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：构建嗜尸性蝇类数据库：从嗜尸性蝇类的样本中提取出碳氢化合物；将提取的碳氢化合物进行GC-MS分析；将GC-MS分析的数据进行分析整合构成数据矩阵；其中，所述嗜尸性蝇类包括麻蝇科13种、丽蝇科11种以及蝇科2种；
步骤二：样本鉴定：将待测样本采用步骤一中提取碳氢化合物、分析整合的方法获得目标数据；将目标数据与步骤一中的数据矩阵导入SIMCA 14.1软件，构建正交偏小二乘判别分析模型从而得出待测样本的种类；其中，所述GC-MS分析的程序升温条件为：50℃保持2分钟，25℃/min速率上升至200℃，然后以6℃/min速率上升至260℃，再以3℃/min速率上升至300℃，保持15min；所述GC-MS分析过程中，采用的色谱柱为DB-5MS毛细管柱。
2.根据权利要求1所述的嗜尸性蝇类种类鉴定的方法，其特征在于，所述麻蝇科13种具体为酱亚麻蝇、棕尾别麻蝇、黑尾黑麻蝇、台湾别麻蝇、绯角亚麻蝇、红尾粪麻蝇、野亚麻蝇、红尾拉麻蝇、埃及亚麻蝇、急钩亚麻蝇、结节亚麻蝇、短脚亚麻蝇、拟东方辛麻蝇；丽蝇科11种具体为绯颜裸金蝇、大头金蝇、广额金蝇、丝光绿蝇、新陆原伏蝇、巨尾阿丽蝇、乌足金蝇、伏蝇、叉叶绿蝇、红头丽蝇、反吐丽蝇；所述蝇科2种为厩腐蝇、裸芒综蝇。
3.根据权利要求1所述的嗜尸性蝇类种类鉴定的方法，其特征在于，所述GC-MS的接口温度为280℃，载气为超纯氦气，压力为11.3psi。
4.根据权利要求1所述的嗜尸性蝇类种类鉴定的方法，其特征在于，所述提取出碳氢化合物的过程具体为：将样本超声清洗后，用滤纸擦干，再将样本完全浸入加有1mL正己烷中的玻璃瓶中，浸泡1小时，C7-C40为外标，萃取液经过0.45μm孔径尼龙膜过滤后，转入新的玻璃瓶，将样品在真空下浓缩待用。
5.根据权利要求1所述的嗜尸性蝇类种类鉴定的方法，其特征在于，所述分析整合具体为：将每种化合物的峰面积除以内标的峰面积，最后除以总值，数据用百分比值表示。
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