CN205046120U - 绵羊肉用性能特异主效基因等位基因检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本实用新型提供绵羊肉用性能特异主效基因等位基因检测试剂盒，包括盒体（11）、盒盖（10）和衬垫（12），在衬垫（12）上设有9个容器孔，在容器孔中分别放置特异性上下游引物混合溶液和FABP4基因的等位基因的标准样（4）以及PCR反应液（3）；所述FABP4基因的等位基因的标准样由等量的FABP4*A的标准样、FABP4*B的标准样、FABP4*C的标准样、FABP4*D的标准样和FABP4*E的标准样组成。本实用新型的绵羊肉用性能特异主效基因等位基因检测试剂盒将检测过程中所使用的多种试剂存放在一起，使用方便。
Description
技术领域
本实用新型涉及绵羊肉用性能特异主效基因等位基因检测试剂盒。
背景技术
绵羊肉用性能(产肉量)是重要的经济性状，检测并选留具有优良肉用性能的绵羊可以显著提高养殖户经济效益。随着现代生物技术的发展，利用分子遗传学方法能够准确检测并选留具有优良肉用性能的绵羊。基于动物DNA序列影响表型性状的基本生物学原理，应用现代分子遗传学方法，寻找鉴定影响绵羊肉用性能的高效特异等位基因是评价绵羊肉用性能的有效手段之一。绵羊肉用性能(产肉量)是数量性状，受微效多基因调控，也有效应较大的主基因(Majorgene)。目前，检测影响绵羊肉用性能的基因大多数为微效基因，而微效基因数量大且并非随机分布，通过检测微效基因评估绵羊肉用性能的准确性不高，多个微效基因的检测结果可能互相冲突且费时费力。而通过寻找和分析效应较大的主基因DNA序列，检测影响绵羊产肉性能的主基因特异等位基因，可以有效提高绵羊肉用性能评估的准确性，缩短绵羊肉用性能改良进程，进而提高绵羊个体经济效益。
绵羊FABP4基因定位于9号染色体，包括4个外显子和3个内含子，其被认为是影响肉质性状的主要候选基因之一。绵羊FABP4基因具有丰富的变异，而剖析各个等位基因对肉用性能的影响程度有利于开发DNA标记物。
本实用新型采用的绵羊肉用性能分子标记选种技术主要针对特异主效基因FABP4，利用PCR-SSCP技术检测特异等位基因，然后根据检测结果评估携带不同等位基因个体的肉用性能等级，从而判断是否留做种用。上述检测过程需要使用多种试剂，因此很需要有一种存放盒，能够将试剂瓶及主要辅助检测用品集装在一个盒中作为一个单元取用，检测者使用时只需取一次盒即可实施操作，使用完可以存回原盒送检，这将是很方便之举，同时这样也可避免造成二次污染。
实用新型内容
本实用新型提供了绵羊肉用性能特异主效基因等位基因检测试剂盒，将检测过程中所使用的多种试剂存放在一起，方便使用。
本实用新型提供一种绵羊肉用性能特异主效基因等位基因检测试剂盒，包括盒体、盒盖和衬垫，在衬垫12上设有9个容器孔，其特征在于：所述容器孔分3列放置，每列之间设有挡板或凹槽；左列上部设有容器孔9，容器孔9为长方体形，左列下部横向并排设有两个容器孔，分别为容器孔1和容器孔2；中间列设有竖向的两个容器孔，分别为容器孔3和容器孔4，所述容器孔4的直径大于所述容器孔3的直径；右列设有竖向的四个容器孔，分别为容器孔5、容器孔6、容器孔7和容器孔8。
本实用新型提供一种绵羊肉用性能特异主效基因等位基因检测试剂盒，包括盒体(11)、盒盖(10)和衬垫(12)，在衬垫(12)上设有9个容器孔，在容器孔中分别放置特异性上下游引物混合溶液和FABP4基因的等位基因的标准样(4)以及PCR反应液(3)；所述FABP4基因的等位基因的标准样由等量的FABP4*A的标准样、FABP4*B的标准样、FABP4*C的标准样、FABP4*D的标准样和FABP4*E的标准样组成。
优选地，在所述容器孔中还分别放置20mMNaOH试剂(1)、1倍TE溶液(2)、银染液(5)、40％的丙烯酰胺溶液(6)、变性上样缓冲液(7)、TEMED溶液和10％的过硫酸铵溶液(8)和特殊DNA承载滤纸(9)。
进一步地，在所述容器孔中分别放置5ml20mMNaOH试剂(1)、5ml1倍TE溶液(2)、2mlPCR反应液(3)、0.5ml特异性上下游引物混合溶液和0.5ml等位基因标准DNA样本、5ml银染液(5)、10ml40％的丙烯酰胺溶液(6)、0.5ml变性上样缓冲液(7)、2mlTEMED溶液和2ml10％的过硫酸铵溶液(8)和特殊DNA承载滤纸(9)。
应用本实用新型的试剂盒检测绵羊肉用性能特异主效基因等位基因的方法如下：
(一)收集具有产肉性能指标(腿部肉重、腰部肉重、肩部肉重、总肉重或腿部肉比例、腰部肉比例和肩部肉比例)的绵羊DNA血样。
(二)PCR扩增所收集的DNA血样。
PCR扩增时所使用引物为：
上游引物18bp核苷酸，下游引物20bp核苷酸，扩增片段大小约为350bp，具体引物序列如下：
上游引物Up:TGTGGGCTTTGCTACCAG；
下游引物Dn：ACTTAGATGAAGGTGCTCTG。
PCR反应体系为：
上述特异等位基因扩增引物的PCR反应条件为：预变性95℃5分钟，变性94℃30秒，退火温度60℃30秒，延伸温度72℃45秒，最后延伸温度72℃10分钟。
(三)对PCR产物进行SSCP检测判断等位基因SSCP带型。
SSCP检测试剂为：去离子水，10％过硫酸铵，变性上样缓冲液，TEMED(四甲基乙二胺)，非变性聚丙烯酰胺(Acr:Bis＝37.5:1)，等位基因标准DNA样本。等位基因标准DNA样本的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.1-5，与检测出的5种等位基因在序列上完全相同。等位基因标准DNA样本是制备的单链DNA，其唯一特点是标样单链DNA在SSCP电泳时条带非常清晰明亮，标样DNA与待检测DNA双链样本同步进行SSCP电泳时，可以用肉眼直接比较标样DNA与待测DNA样本带型差别，以此来判断待测样本DNA是否存在特异等位基因。
为保证检测样本DNA等位基因判读的准确性，等位基因标准DNA与待测样本DNA同时进行SSCP电泳，参照等位基因标准DNA样本判定检测样本等位基因类型。
SSCP检测方法为：将20μlPCR产物与60μl变性上样缓冲液(98％去离子甲酰胺、10mMEDTA、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯青FF)混合，105℃变性5分钟，立即冰浴冷却10分钟，14％非变性聚丙烯酰胺凝胶在室温7.5℃、冷循环4.2℃、390V电压下电泳19小时，银染后显色拍照。
25ml非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法为：40％的非变性聚丙烯酰胺8.75毫升、10倍TBE1.25毫升、10％APS150微升、TEMED13.64微升和蒸馏水14.84毫升。
(四)克隆、测序判定等位基因序列。
具体如下：
PCR产物回收纯化(按宝生物试剂盒说明书进行)、T载体连接(pGEM-TEasy载体，普洛麦格(Promega)公司，按说明书进行操作)、感受态细胞制备和转化(大肠杆菌DH5α感受态试剂盒，宝生物公司，按试剂盒说明书进行)、质粒DNA提取(宝生物公司，按试剂盒说明书进行)、重组质粒鉴定(酶切鉴定，使用限制性内切酶EcoR1)、等位基因阳性克隆的SSCP鉴定，送北京六合华大公司测序鉴定。
(五)结果判断：电泳结果发现5种等位基因(A、B、C、D和E)，SSCP带型图如图1所示，通过上述方法检测绵羊个体FABP4特异等位基因带型和测序，结合产肉性能表型资料，确定影响产肉性能的特异等位基因。
绵羊产肉性能指标(腿部肉重、腰部肉重、肩部肉重、总肉重或腿部肉比例、腰部肉比例和肩部肉比例)中最具代表性的指标为总肉重，即腿部肉重、腰部肉重和肩部肉重总和。等位基因E被检出率很小，建议淘汰。表1对罗姆尼羊FABP4等位基因A、B、C和D对总产肉量的影响进行了分析，结果表明等位基因A对总产肉量有显著影响(P<0.05)，等位基因存在时总产肉量最高(51.730Kg)；等位基因B和C对总产肉量有影响趋势(P<0.1)；等位基因D对总产肉量无影响(P>0.15)。
表1FABP4等位基因变异对罗姆尼绵羊总产肉量的影响
分析方法如下:选择无亲缘关系的优良父本(基于新西兰SIL协会评定)用于绵羊配种(采用人工授精方法)，每一只公羊与40到60只母羊(随机选取，年龄4-7岁)配种组成单一家系。在本研究17个绵羊家系中，性别和初生等级被分别记录。采用视频图像分析方法(文献如下HopkinsDL,SafariE,ThompsonJM,SmithCR.VideoimageanalysisintheAustralianmeatindustry–precisionandaccuracyofpredictingleanmeatyieldinlambcarcass[J].MeatScience,2004,67:269-274)评估总肉产量(腿部、腰部和肩部肉产量之和)。
应用一般线性混合效应模型(GLMM)评估特定等位基因存在/缺失对生产性状的影响。针对目标性状，等位基因存在缺失分别定义为1和0，考虑等位基因效应，性别效应及出生等级(单羔和多羔)为固定因素，家系效应为随机因素，配合下列模型进行最小二乘方差分析，
Yijkng＝μ+Mi+Gj+Wg+Ck+Xn+eijkng
其中：Yijkng为性状；μ为群体平均值；Mi为基因型，等位基因效应；Gj为出生等级效应；Wg为性别效应；Ck为家系效应；Xn为二级或二级以上互作效应；eijkng为随机残差效应。
分析结果采用“平均数+标准误”，P<0.05为显著水平，P<0.1表示有影响趋势，P>0.15表示无影响。
根据上述分析鉴定结果，绵羊肉用性能评估等级分别为等位基因A为优质(高产肉性能)，等位基因B和C对总产肉量有影响趋势(P<0.1)，为良好，等位基因B存在时具有较高的总产肉量(51.207±0.179Kg)，而等位基因C总产肉量较低(51.027±0.165Kg)，所以评估等位基因B同样可参考作为绵羊肉用性能基因标记。等位基因D合格，等位基因E建议淘汰。
本申请人对绵羊特异主效基因FABP4进行检测，共发现5种等位基因(A、B、C、D和E)，分析了5种等位基因对绵羊产肉性能指标的影响，确定绵羊高产肉性能特异等位基因：将等位基因A和B作为绵羊肉用性能基因标记，建立绵羊肉用性能特异主效基因等位基因的标记辅助选择技术。应用本实用新型试剂盒能够快速的完成绵羊肉用性能的检测，从而判断是否留做种用。
本实用新型的绵羊肉用性能特异主效基因等位基因检测试剂盒将检测过程中所使用的多种试剂存放在一起，使用方便。
附图说明
附图用来提供对本实用新型的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本实用新型的实施例一起用于解释本实用新型，并不构成对本实用新型的限制。在附图中：
图1为绵羊肉用性能特异主效基因等位基因SSCP带型图；
图2为绵羊肉用性能特异主效基因等位基因检测试剂盒结构图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本实用新型，但并不限定本实用新型。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
本实用新型所述的绵羊肉用性能特异主效基因等位基因检测试剂盒的具体结构参见图2，其中，10：盒盖；11：盒体；12：衬垫，衬垫上设有9个容器孔。各个孔内分别装有以下物质：
1：5ml20mMNaOH试剂；2孔：5ml1倍TE溶液；3孔：2ml
PCR混合试剂(buffer、去离子水、MgCl2溶液、dNTP、5倍Q溶液、Taq聚合酶)；4孔：0.5ml特异性上下游引物混合溶液，0.5ml等位基因标准DNA样本；5孔：5ml银染液；6孔：10ml40％的丙烯酰胺溶液；7孔：0.5ml变性上样缓冲液；8孔：2mlTEMED溶液和2ml10％的过硫酸铵溶液；9孔：特殊DNA承载滤纸。
等位基因标准DNA样本包括等量的FABP4*A标准DNA样本、FABP4*B标准DNA样本、FABP4*C标准DNA样本、FABP4*D标准DNA样本和FABP4*E标准DNA样本。所述FABP4*A标准DNA样本的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.1，所述FABP4*B标准DNA样本的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.2，所述FABP4*C标准DNA样本的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.3，所述FABP4*D标准DNA样本的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.4，所述FABP4*E标准DNA样本的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.5。
现就绵羊肉用性能分子选种技术为例，对本实用新型试剂盒的操作方法进行进一步详细地说明。
一、试验材料
本实用新型绵羊样品220份采自新西兰罗姆尼羊群体，采用NaOH两步法提取绵羊基因组DNA。
二、试验方法
1、基因组DNA的提取
本实用新型采用NaOH法提取DNA。FTA卡打孔(直径1.2mm)取样，200微升20mMNaOH浸泡血样小点30分钟，吸净变色液体加入200微升1倍TE室温放置5分钟，吸净残液待血样小点干燥后进行PCR扩增。
2、引物设计和PCR扩增
上游引物Up:TGTGGGCTTTGCTACCAG；
下游引物Dn：ACTTAGATGAAGGTGCTCTG。
PCR反应体系为：
PCR反应条件为：预变性95℃5分钟，变性94℃30秒，退火温度60℃30秒，延伸温度72℃45秒，最后延伸温度72℃10分钟。得到的350bp大小的PCR产物，可直接进行SSCP。
3.SSCP检测及结果判定
为保证检测样本DNA等位基因判读的准确性，等位基因标准DNA与待测样本DNA同时进行SSCP电泳，参照等位基因标准DNA样本判定检测样本等位基因类型。
待测样本DNA的SSCP电泳如下：将PCR产物20微升与60微升SSCP上样缓冲液(98％去离子甲酰胺、10mMEDTA、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯青FF)混合，加热器105℃变性5分钟后，立即冰上冷却10分钟，14％非变性聚丙烯酰胺凝胶在室温7.5℃、冷循环4.2℃、390V电压下电泳19小时，银染后，观察带型。
如SSCP带型与图1中A相符则为高产肉性能绵羊品种，SSCP带型与图1中B相符产肉性能良好的绵羊品种。SSCP带型与图1中C或D相符为合格，SSCP带型与图1中E相符建议淘汰。
最后应说明的是：以上所述仅为本实用新型的优选实施例而已，并不用于限制本实用新型，尽管参照前述实施例对本实用新型进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。
Claims (1)
1.绵羊肉用性能特异主效基因等位基因检测试剂盒，包括盒体（11）、盒盖（10）和衬垫（12），在衬垫（12）上设有9个容器孔，其特征在于：所述容器孔分3列放置，每列之间设有挡板或凹槽；左列上部设有容器孔（9），容器孔（9）为长方体形，左列下部横向并排设有两个容器孔，分别为容器孔（1）和容器孔（2）；中间列设有竖向的两个容器孔，分别为容器孔（3）和容器孔（4），所述容器孔（4）的直径大于所述容器孔（3）的直径；右列设有竖向的四个容器孔，分别为容器孔（5）、容器孔（6）、容器孔（7）和容器孔（8）。
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|---|---|---|---|---|
| CN109554489A (zh) * | 2019-01-25 | 2019-04-02 | 甘肃农业大学 | 一种与绵羊饲料转化率相关的分子标记及其应用 |
| CN109694916A (zh) * | 2019-01-08 | 2019-04-30 | 甘肃农业大学 | 一种与绵羊饲料转化率相关的分子标记及其应用 |
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