CN101338340A - 一种检测山羊繁殖力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测山羊繁殖力的方法。是检测待测山羊基因组中的GnRHR基因的第757位核苷酸为G还是突变为A，确定山羊的基因型，然后通过基因型确定山羊繁殖力；如果山羊基因组中的GnRHR基因的第757位核苷酸为G时，其纯合体的基因型为AA；山羊基因组中的GnRHR基因的第757位核苷酸突变为A时，其纯合体的基因型为BB；它们的杂合体基因型为AB；BB基因型山羊的繁殖力高于AB基因型山羊和AA基因型山羊。本发明的方法利用遗传标记多态性确定山羊的繁殖力，可以迅速、简便的检测济宁青山羊的繁殖力，为山羊的育种提供了一个准确简便的检测其繁殖力的方法。
Description
技术领域
一种检测山羊繁殖力的方法。
背景技术
促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)是一种十肽，是下丘脑-垂体-性腺轴的关键神经内分泌调节因子，GnRH作用的发挥依赖于促性腺激素释放激素受体(gonadotropin releasing hormone receptor，GnRHR)的存在。GnRHR是位于促性腺细胞表面的一种高亲和G蛋白耦联受体，GnRH和GnRHR在促性腺细胞表面结合，促进垂体前叶合成和释放促卵泡激素(follicle-stimulatinghormone，FSH)和促黄体激素(luteinizing hormone，LH)。哺乳动物的排卵依赖于LH高峰，GnRH和GnRHR的分泌增加都会引起LH高峰。因此，GnRH基因和GnRHR基因在哺乳动物的繁殖调控中起着重要作用。
Yang-Feng等(1986)使用荧光原位杂交把人的GnRH-I基因定位到染色体8p21-p 11.2(Yang-Feng T L，Seeburg P H，Francke U.Human luteinizinghormone-releasing hormone gene(LHRH)is located on short arn of chromosome 8(region 8p11.2-p21).Somat Cell Mol Genet，1986，12(1)：95-100)，White等(1998)把人的GnRH-II基因定位到染色体20p13(White R B，Eisen J A，Kasten T L，Fernald R D.Second gene for gonadotropin-releasing hormone in humans.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(1)：305-309)。GnRH首先从哺乳动物中分离出来并被测序，现在已经从不同的动物中分离到16种不同形式的GnRH(Somoza G M，Miranda L A，Strobl-MazzulaP，Guligur L G.Gonadotropin-releasing hormone(GnRH)：from fish to mammalianbrains.Cell Mol Neurobiol，2002，22(5-6)：589-609)，所有这些变体不外乎是鸡的GnRH(cGnRH)和哺乳动物的GnRH(mGnRH)，从鸡分离出来的cGnRH-II是一种普遍存在的GnRH肽，从鱼到人都存在。Fernald等(1999)根据DNA序列和脑分区的系统发育研究，以不同的方式分类GnRH亚型(Fernald R D，White R B.Gonadotropin-hormone genes：phylogeny，structure，and functions.Front Neuroendocrinol，1999，20(3)：224-240)：mGnRH被定义为GnRH-I，cGnRH-II被定义为GnRH-II。以前认为灵长类脑中只含有mGnRH即现在被定义的GnRH-I，现在从成年的短尾猴和猕猴脑提取物中发现了两种形式的GnRH，类似于mGnRH和cGnRH。通过克隆人的GnRH基因，发现该基因包含4个外显子和3个内含子，存在很大的前体基因。人GnRH前体蛋白包括N端信号肽和C端Gly-Lys-Arg序列延伸(SherwoodNM，Lovejoy D A，Coe I R.Origin of mammalian gonadotropin-releasing hormones.Endocr Rev，1993，14(2)：241-254)。
Montgomery等(1995)通过研究把绵羊的GnRHR基因定位到6号染色体上(Montgomery G W，Penty J M，Lord E A，Brooks J，Mcneilly A S.Thegonadotrophin-releasing hormone receptor maps to sheep chromosome 6 outside of theregion ofthe FecB locus.Mammalian Genome，1995，6(6)：436-438)。Campion等(1996)获得了绵羊GnRHR基因完全的编码序列，绵羊GnRHR基因由3个外显子和2个内含子组成(Campion C E，Turzillo A M，Clay C M.The gene encoding the ovinegonadotropin-releasing hormone(GnRH)receptor：cloning and initial characterization.Gene，1996，170(2)：277-280)。Rohrer等(1999)将猪的GnRHR基因定位到染色体8q 1.1-q 1.2(Rohrer G A.Mapping four genes from human chromosome 4 to porcinechromosome 8further develonps the comparative map for an economically importantchromosome of the swine genome.Anim Genet，1999，30(1)：60-62)。Kakar等(1995)通过Southern杂交分析把人的GnRHR基因定位到染色体4q13，开放阅读框位于3个确定的外显子之间，全长18.9kb(Kakar S S，Neill J D.The humangonadotropin-releasing hormone receptor gene(GNRHR)maps to chromosome band4q13.Cytogenet Cell Genet，1995，70(3-4)：211-214)。
目前发现哺乳动物存在两种GnRHR，即GnRHR-I和GnRHR-II。GnRHR-I在所有哺乳动物中存在，GnRHR-II首先在两栖动物中发现。最近研究证明绒猴、猕猴、绿猴等灵长类动物同时存在两种受体基因(Neill J D，Duck L W，Sellers J C.Agonadotropin-releasing hormone receptor specific for GnRH-II in primates.Biochem Biophys Res Commum，2001，282(4)：1012-1018)。小鼠GnRHR-I基因的cDNA编码327个氨基酸，人和绵羊的GnRHR-I基因的cDNA编码328个氨基酸，即在第二个细胞外环多了一个赖氨酸(Lys)残基(Kaiser U B，Conn P M，Chin W W.Studies of gonadotropin-releasing hormone action using gonadotropin-releasing hormonereceptor expressing pituitary cell lines.Endocr Rev，1997，18(1)：47-70)，哺乳动物GnRHR-I缺少C端胞质尾巴，有一个相对较短的额外细胞内环，这个区域和G蛋白的耦联有关(Fan N C，Jeung E B，Peng C，Olofsson JI，Krisinger J，Leung P C.Thehuman gonadotropin-releasing hormone(GnRH)receptor gene：cloning，genomicorganization and chromosomal assignment.Mol Cell Endocrinol，1994，103(1-2)：R1-R6)。Southern杂交证明人GnRHR-I由一种基因编码，含有3个外显子、2个内含子和7个跨膜结构域。Kakar(1997)通过比较人基因组文库中GnRHR-I序列，也证明人GnRHR-I基因由3个外显子和2个内含子组成，全长20kb：外显子1编码5′非翻译区序列和开放阅读框+1到+522核苷酸；外显子2编码+523到+742核苷酸；外显子3编码+743到+987开放阅读框和3′非翻译区，此外还发现该基因包括几个调控序列和调节因子，即AP-1位点、AP-2位点、Pit-1位点、孕酮反应元件、甲状腺反应元件和cAMP反应元件序列，该基因的5′侧翼区存在多个TATA和CAAT序列，多个转录起始位点的存在为组织的特异调控提供了可能(Kakar S S.Molecularstructure of the human gonadotropin-releasing hormone receptor gene.Eur JEndocrinol，1997，137(2)：183-192)。金鱼的GnRHR-II氨基酸序列与哺乳动物GnRHR-II的氨基酸序列有43％的同源性(Carolsfeld J，Powell J F，Park M，Fischer WH，Craig A G，Chang J P，Rivier J E，Sherwood N M.Primary structure and functionof three gonadotropin-releasing hormones，including a novel form，from and ancientteleost，herring.Endocrinology，2000，141(2)：505-512)，灵长类GnRHR-II的氨基酸序列和两栖类的GnRHR-II的氨基酸序列有60％的同源性。
GnRH基因不仅在下丘脑表达，也在脑的其它几个区和各种外周组织表达。GnRH肽最初是从牛和猪的脑中分离出来的，该肽在所有哺乳动物中是保守的，在生殖器官各部位的表达存在多样性(Aten R F，Polan M L，Bayless R，Behrman H R.Agonadotropin-releasing hormone(GnRH)-like protein in human ovaries：similarity to theGnRH-like ovarian protein of the rat.J Clin Endocrinol Metab，1987，64(6)：1288-1293)。Kang等(2003)通过对人卵巢细胞GnRH肽功能研究，发现该肽能够调节类固醇生成、刺激细胞增殖、诱发细胞程序性死亡(Kang S K，Choi K C，Yang H S，Leung P C.Potential role of gonadotrophin-releasing hormone(GnRH)-I andGnRH-II in the ovary and ovarian cancer.Endocr Relat Cancer，2003，10(2)：169-177)。虽然两种GnRH基因mRNA表达调控方式不同，但使用免疫细胞化学技术和分子生物技术证明小鼠和大鼠脑内存在的GnRH-II有类似GnRH-I的潜能，都能使垂体释放LH和FSH(Chen A，Yahalom D，Ben-Aroya N，Kaganovsky E，Okon E，Koch Y.A second isoform of gonadotropin-releasing hormone is present in thebrain of human and rodents.FEBS Lett，1998，435(2-3)：199-203)。原位杂交证明GnRH-II mRNA在中脑、海马和下丘脑弥散核表达，并在人的肾脏、骨髓、前列腺等脑外组织高水平表达。最近研究证明猕猴下丘脑两个分离细胞群能同时表达GnRH-I和GnRH-II(Latimer V，Rodrigues S M，Garyfallou V T，Kohama S G，White R B，FernaldR D，Urbanski H F.Two molecular forms of gonadotropin-releasing hormone(GnRH-Iand GnRH-II)are expressed by two separate populations of cells in the rhesus macaquehypothalamus.Mol Brain Res，2000，75(2)：287-292)。
GnRHR基因主要在垂体前叶促性腺细胞中表达，已经证明垂体同源框1(pituitary homeobox 1，Pitx-1)可以通过直接与DNA结合或与其它转录因子发生蛋白质-蛋白质相互作用，从而激活垂体特定基因表达。Pitx-1能激活GnRHR基因启动子，转录激活位点位于-308和-264之间，Pitx-1以低亲和力与该区域结合，该区域还包括一个AP-1位点，这对Pitx-1响应是必要的。Pitx-1和AP-1共同激活小鼠GnRHR基因启动子，Pitx-1同源域点突变会降低与DNA的亲和力，引起转录激活的减少(Jeong K H，Chin W W，Kaiser U B.Essential role ofthe homeodomain forpituitary homeobox 1activation of mouse gonadotropin-releasing hormone receptor geneexpression through interactions with c-Jun and DNA.Mol Cell Biol，2004，24(14)：6127-6139)。
最近已经发现人的GnRHR基因的组织特异性表达是通过在不同的细胞类型中使用不同的启动子进行调节的，位于核苷酸-1737和-1346的一个上游启动子为胎盘所特有，cAMP反应元件和GATA基元负责胎盘的GnRHR基因的特异性表达(ChengK W，Chow B K，Leung P C.Functional mapping of a placenta-specific up streampromoter for human gonadotropin-releasing hormone receptor gene.Endocrinology，2001，142(4)：1506-1516)。最近还发现了人卵巢颗粒细胞GnRHR基因存在新的上游启动子，即潜在的CCATT增强子结合蛋白和GATA基元，两者共同调节GnRHR基因的表达(Cheng C K，Yeung C M，Chow B K，Leung P C.Characterization of a newupstream GnRH receptor promoter in human ovarian granulosa-luteal cells.MolEndocrinol，2002，16(7)：1552-1564)。
为识别GnRHR基因表达的细胞和激素调节的分子机制，McCue等(1997)克隆了小鼠、牛的GnRHR基因，发现小鼠的GnRHR基因5′侧翼区1900bp对GnRH刺激有响应，荧光素酶直接在转基因小鼠的垂体、脑、性腺中表达(McCue J M，QuirkC C，Nelson S E，Bowen R A，Clay C M.Expression of a murine gonadotropin-releasinghormone receptor-luciferase fusion gene in transgenic mice is diminished byimmunoneutralization of gonadotropin releasing hormone.Endocrinology，1997，138(8)：3154-3160)。GnRHR基因在促性腺细胞衍生的αT3-1细胞系中的表达受一个三联体增强子的调节，该三联体包括激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)元件的一段共有序列、类固醇生成因子-1(steroidogenic factor-1，SF-1)的一个结合位点以及称为GnRHR激活序列(GnRHR-activating sequence，GRAS)的一个元件；GnRH对其受体基因的反应被蛋白激酶C在AP-1处调节，而激活素在GRAS处调节GnRHR基因的表达，到目前为止，在GnRHR基因中还没有识别出雌二醇反应元件(White BR，Duval D L，Mulvaney J M，Roberson M S，Clay C M.Homologous regulation of thegonadotropin-releasing hormone receptor gene is partially mediated by protein kinase Cactivation ofan activator protein-1 element.Mol Endocrinol，1999，13(4)：566-577)。
已经证明激活素可以通过和GnRH作用共同调节小鼠GnRHR基因的转录表达，GnRHR基因-387/-308区域对这种调节作用是必要的，这个区域包括两个重叠的顺式调控元件：GRAS和潜在的SMAD结合元件(SBE)。研究证明这些元件和转录因子共同激活小鼠GnRHR基因的表达(Errol R，Shuyun X，Jian X，Lisa B，Spiryda，Joong Shin Park，Kyeong-Hoon Jeong，Elizabeth A，Ursula B K.Direct binding of AP-1(Fos/Jun)proteins to a SMAD binding element facilitates both gonadotropin-releasinghormone(GnRH)-and activin-mediated transcriptional activation of the mouse GnRHreceptor gene.The Journal ofBiology Chemistry，2002，277(40)：37469-37478)。雌二醇能在排卵前期增加垂体对GnRH的敏感性，对排卵前的LH高峰起重要作用(DawnL，Amy R，Christine C，Terry M，Debora L，Colin M.Responsiveness of the ovinegonadotropin-releasing hormone receptor gene to estradiol and gonadotropin-releasinghormone is not detectable in vitro but is revealed in transgenic mice.Endocrinology，2001，141(3)：1001-1010；Turzillo A M，Nolan T E，Nett T M.Regulation ofgonadotropin-releasing hormone(GnRH)receptor gene expression in sheep：interaction ofGnRH and estradiol.Endocrinology，1998，139(12)：4890-4894)。垂体前叶持续的GnRH会减少促性腺细胞GnRHR表达量，而持续的雌二醇会增加GnRHR表达量，主要原因是雌二醇通过细胞内受体起作用，而GnRH是通过细胞膜受体发挥作用，这些激素通过不同的机制来影响GnRHR基因的表达。
GnRHR能在垂体前叶促性腺细胞表达，GnRHR在转录水平的调控被认为是下丘脑-垂体-性腺轴的重要调控点(Kaiser U B，Jakubowiak A，Steinberger A，Chin WW.Regulation of rat pituitary gonadotropin-releasing hormone receptor mRNA level invivo and in vitro.Endocrinology，1993，133(2)：931-934)。为识别GnRHR基因的转录调控，Fan等(1995)分离出人GnRHR基因大约2.3kb的5′侧翼区，序列分析证明它是一个高度复杂的调节基因，通过DNA序列分析和引物扩增实验发现至少有5个转录起始位点和几个共同的TATA和CAAT框(Fan N C，Peng C，Krisinger J，Leung PC.The human gonadotropinreleasing hormone receptor gene：complete structure includingmultiple promoters，transcription initiation sites，and polyadenylation signals.Mol CellEndocrinol，1995，107(2)：R1-R8)。大鼠、小鼠、人和牛的GnRHR基因结构互不相同，存在明显不同的转录起始位点，包括多个调控元件，基因表达在不同的水平分步调节(Albarracin C T，Kaiser U B，Chin W W.Isolation and characterization of the5’flanking region of the mouse gonadotropin-releasing hormone receptor gene.Endocrinology，1994，135(6)：2300-2306)。小鼠GnRHR基因启动子受SF-1结合位点、AP-1结合位点和GRAS元件的调控(Duval D L，Nelson S E，Clay C M.The tripartitebasal enhancer of the gonadotropin-releasing hormone(GnRH)receptor gene promoterregulates cell-specific expression through a novel GnRH receptor activating sequence MolEndocrinol，1997，11(12)：1814-1821)。大鼠和人的GnRHR基因中含有cAMP反应元件(CRE)，但在小鼠GnRHR基因中没有发现。最近研究证明CRE有8bp共有回文序列(TGACGTCA)，CRE同源序列比较证明，5′回文序列一半是保守的，而3′基元是可变的(Sassone-Corsi P.Transcription factors responsive to cAMP.AnnuRev Cell Dev Biol，1995，11：355-377)。人和牛的GnRHR基因包含多个CAP位点，分别位于其超过650bp和800bp的5′非翻译区，而小鼠、大鼠基因5′非翻译区少于200bp。以上说明哺乳动物GnRHR基因是通过使用不同的5′侧翼区进行基因的表达调控的。
除了转录激活的正调控，GnRHR基因转录也被沉默元件和关联抑制蛋白负调控。研究证明垂体腺苷酸环化酶激活肽和位于-1676和-1648之间的沉默元件调节人类αT3-1细胞GnRHR基因启动子活动。人类GnRHR基因5′侧翼区缺失分析证明在-1017和-771之间存在较大的负调控元件(Kang S K，Cheng K W，Ngan E S，Chow BK，Choi K C，Leung P C.Differential expression of human gonadotropin-releasinghormone receptor gene in pituitary and ovarian cells.Mol Cell Endocrinol，2000，162(1-2)：157-166)。进一步的3′缺失研究证明八聚体转录因子-1(Octamer transcriptionfactor-1，Oct-1)能抑制GnRHR基因的转录，该八聚体调控序列(5′AAGCAAACT3′)抑制基因的启动子，该序列AAAC突变能完全去除GnRHR基因的沉默效应，该序列可能在GnRHR基因沉默中起到关键作用。而啮齿类动物GnRHR启动子八聚体序列(5′AAGCAAAGT3′)的突变不能使GnRHR基因沉默，这表明该序列的抑制作用存在进化保守性(Elly S W，Phido K W，Peter C K，Billy K C.Steroidogenic factor-1interacts with a gonadotrope-specific element within the first exon of the humangonadotropin-releasing hormone receptor gene to mediate gonadotrope-specificexpression.Endocrinology，1999，140(6)：2452-2462)。
Dunn等(2004)在母鸡群体中使用PCR-RFLP识别GnRHR基因型，报道母鸡群体中GnRHR限制酶等位基因的频率是0.54(Bpul 102I+)和0.46(Bpul 102I-)，发现GnRHR基因对双黄蛋数目(number of double-yolked eggs)具有显著的加性效应(P＜0.05)(Dunn I C，Miao Y W，Morris A，Romanov M N，Wilson P W，WaddingtonD.A study of association between genetic markers in candidate genes and reproductivetraits in one generation of a commercial broiler breeder hen population.Heredity，2004，92(2)：128-134)。
Jiang等(2001)在梅山×欧洲大白猪的F2代群体中发现GnRHR基因3’端UTR(非翻译区)1721位有C/G替代；1721位等位基因G在梅山猪中的频率为0.94，在欧洲大白猪中的频率为0.42。在梅山猪中最普遍的1721位的G等位基因与较高的黄体数显著相关(Jiang Z H，Gibson J P，Archibald A L，Haley C S.The porcinegonadotropin-releasing hormone receptor gene(GNRHR)：genomic organization，polymorphisms，and association with the number of corpora lutea.Genome，2001，44(1)：7-12)。
下丘脑促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)在调节哺乳动物生殖发育和机能中起着关键作用。GnRH通过与存在于垂体促性腺细胞膜上的促性腺激素释放激素受体(gonadotropin releasing hormone receptor，GnRHR)结合，能促进LH和FSH的合成与释放，促进性腺的生长、成熟和调控生物的繁殖力。GnRHR是G蛋白偶联的7个跨膜蛋白，缺乏胞内C末端结构域，同种的cDNA结构具有很强的保守性(Asa S L and Ezzat S.The pathogenesis ofpituitary tumours(J).Nature Reviews.Cancer，2002，2(11)：836～849)。目前已对编码小鼠、绵羊、牛和人GnRHR cDNA进行了克隆和特性描述，测序结果显示小鼠、绵羊、牛与人分别有97％、89％、87％的同源性。Ikemoto等(2004)认为GnRH与其受体的相互作用在生殖功能中起着关键性的作用(Ikemoto T，Enomoto M and Park M K.Identification andcharacterization of a reptilian GnRH receptor from the leopard gecko(J).Molecular andCellular Endocrinology，2004，214(1-2)：137～147)。Kim et al.(2003)研究表明在实验动物和人中抑制GnRH基因及其受体基因的表达将极大地抑制其生殖活动(Kim JH，Kim H J，Noh H S，Roh G S，Kang S S，Cho G J，Park S K，Lee B J and Choi W S.Suppression by ethanol ofmale reproductive activity(J).Brain Research，2003，989(1)：91～98)。GnRHR缺失或突变能引起人特发性促性腺激素分泌不足型性腺机能减退症(idiopathic hypogonadotropic hypogonadism，IHH)(Tamaya T.Normosmicidiopathic hypogonadotropic hypogonadism with GnRH receptor mutation(review)(J).Nippon Rinsho Japanese Journal ofClinical Medicine，2002，60(2)：319～324；Bo-Abbas Y，Acierno J S Jr，Shagoury J K，Crowley W F Jr and Seminara S B.Autosomalrecessive idiopathic hypogonadotropic hypogonadism：genetic analysis excludes mutationsin the gonadotropin-releasing hormone(GNRH)and GNRH receptor genes(J).Journal ofClinical Endocrinology and Metabolism，2003，88(6)：2730～2737)，同时GnRHR基因还可以与其它激素和生长因子如GDF9、FSH、LH协同作用(Hapgood J P，Sadie H，vanBiljon W and Ronacher K.Regulation of expression of mammaliangonadotrophin-releasing hormone receptor genes(J).Journal of Neuroendocrinology，2005，17(10)：619～638)。因此，GnRHR基因是繁殖性状的一个生理候选基因。
据《中国羊品种志》记载(《中国羊品种志》编写组，1989)，在我国20个地方山羊品种中，大多数山羊品种繁殖力较低，而济宁青山羊繁殖力非常高；济宁青山羊平均产活羔数为2.94只，内蒙古绒山羊平均产活羔数为1.04只。波尔山羊平均产活羔数为2.10只(Malan S W.The improved Boer goat(J).Small Ruminant Research，2000，36(2)：165～170)，安哥拉山羊平均产活羔数为1.31只(Roberts A J and Reeves JJ.Kidding rates of Angora goats passively immunized against estrogens(J).Journal ofAnimal Science，1988，66(10)：2443～2447)。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测山羊繁殖力的方法。
本发明所提供的检测山羊繁殖力的方法，是检测待测山羊基因组中的GnRHR基因的第757位核苷酸为G还是突变为A，确定山羊的基因型，然后通过基因型确定山羊繁殖力；所述GnRHR基因的核苷酸序列为自GENBANK ACCESSION NUMBER为L42937的第1至1236位核苷酸；
所述确定山羊的基因型的方法为：如果山羊基因组中的GnRHR基因的第757位核苷酸为G时，其纯合体的基因型为AA；山羊基因组中的GnRHR基因的第757位核苷酸突变为A时，其纯合体的基因型为BB；它们的杂合体基因型为AB；
通过基因型确定山羊繁殖力的方法为：所述BB基因型山羊的繁殖力高于AB基因型山羊和AA基因型山羊。
所述方法中，所述检测山羊基因组中的GnRHR基因的第757位核苷酸为G还是突变为A的方法是利用PCR方法扩增待测山羊基因组中的核苷酸序列为自GENBANKACCESSION NUMBER为L42937的第657至843位核苷酸的片段，并将该扩增产物进行SSCP分析，若得到3条电泳条带，即为AB基因型，得到分别与所述AB基因型沿电泳方向第一条电泳带和第三条电泳带具有相同的迁移距离的两条电泳条带时，为AA基因型；得到分别与AB基因型沿电泳方向第二条电泳带和第三条电泳带具有相同的迁移距离的两条电泳条带时，为BB基因型。
所述方法中，所述PCR方法的扩增引物对为具有序列表中序列1所述序列的核苷酸和具有序列表中序列2所述序列的核苷酸。
所述方法中，所述山羊为济宁青山羊。
所述方法中，所述繁殖力为每胎产羔数。
本发明的方法，采用单链构象多态(single strand conformation polymorphism，SSCP)方法对在GnRHR基因进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)检测，以比较GnRHR基因在不同山羊品种中的多态性，并对具有SSCP多态性的DNA片段进行测序比较分析，寻找到与繁殖力(产羔数)相关的遗传标记，数据统计结果表明，该遗传标记多态性可确定山羊的繁殖力。本发明的方法即利用该遗传标记，建立SSCP检测山羊品种济宁青山羊、安哥拉、波尔和内蒙古绒山羊的基因型，并利用该基因型确定其繁殖力的有效方法，实验证明，该方法可以迅速、简便的检测济宁青山羊的繁殖力。本发明的方法为山羊的分子育种提供了一个准确简便的检测其繁殖力的方法。
附图说明
图1为GnRHR基因的8对引物(P1-P8)的PCR产物。
图2为引物P4对不同山羊品种扩增片段的SSCP分析。
具体实施方式
下述实施例中提到的实验方法，如无特别说明均为常规方法。
下述实施例中所用主要试剂Taq DNA聚合酶、dNTPs、pGEM-T Easy载体、DNA片段回收纯化试剂盒、质粒提取纯化试剂盒等均购自北京天根生物技术有限公司。
实施例1、检测山羊繁殖力的方法的建立及其效果验证
1、检测山羊繁殖力的方法的建立
1)模板材料准备
2005年产羔的具有产羔数记录的130只济宁青山羊母羊血样采自农业部济宁青山羊保种基地(山东省嘉祥县)；50只内蒙古绒山羊母羊血样采自内蒙古白绒山羊种羊场(内蒙古鄂尔多斯市鄂托克旗)；30只波尔山羊母羊血样采自安徽省畜禽品种改良站；40只安哥拉山羊母羊血样采自山西省晋城市沁水示范牧场(山西省沁水县郑庄镇)。其中，随机选择的130只济宁青山羊母羊是5只公羊的后代，其数目分别为24、25、26、27、28只。济宁青山羊胎次的划分是：实际第1胎(42只)、第2胎(43只)和第3胎(45只)分别作为3个胎次。产羔季节的划分是：产羔月份在3～5月的作为季节1(春季)(35只)，在6～8月的作为季节2(夏季)(30只)，在9～11月的作为季节3(秋季)(40只)，在12～2月的作为季节4(冬季)(25只)。
上述采血方法为颈静脉采血，所采血样均为10mL/只，用柠檬酸葡萄糖抗凝，-20℃冻存。
用酚氯仿抽提法提取基因组DNA，溶于TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH 8.0))，4℃保存作为模板。
2)引物设计
根据GenBank报道的绵羊GnRHR基因完全的编码序列(L42937、L43841、L43842)，用Oligo 6.0软件在外显子1至外显子3(外显子1为自GENBANK ACCESSION NUMBER为L42937的第1-1236位核苷酸序列，外显子2为自GENBANK ACCESSION NUMBER为L43841的第1-275位核苷酸序列，外显子3为自GENBANK ACCESSION NUMBER为L43842的第1-325位核苷酸序列)处设计8对引物，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。引物序列和扩增片段大小如下：
外显子1：
引物P1：F：5′-AATTTGAATGCATCTCAGTATTAGA-3′；R：5′-TCTGTTCAATACATGCAAAATGA-3′，扩增254bp的片段(自GENBANK accessionnumber为L42937的第23-276位核苷酸序列)。
引物P2：F：5′-ATGTATTGAACAGAACACTTAACAT-3′；R：5′-TTGTAATCCAACAGGGTGCTA-3′，扩增227bp的片段(自GENBANK accession number为L42937的第263-489位核苷酸序列)。
引物P3：F：5′-GATTACAAGCCCACAAAACAAGT-3′；R：5′-TGATACAGCTTCAAGACTCGTGTT-3′，扩增191bp的片段(自GENBANK accessionnumber为L42937的第482-672位核苷酸序列)。
引物P4：F：5′-TCTTGAAGCTGTATCAGCCATA-3′；R：5′-GTGTTGAAAATTGTGGAGAGTAGA-3′，扩增187bp的片段(自GENBANK accessionnumber为L42937的第657-843位核苷酸序列)。
引物P5：F：5′-CCGAGTGACTGTTACTTTCTTCCT-3′；R：5′-TCCAGTGGCATAACAATCAGAGT-3′，扩增183bp的片段(自GENBANK accessionnumber为L42937的第793-975位核苷酸序列)。
引物P6：F：5′-GGAGACTCTGATTGTTATGCCACT-3′；R：5′-GGTTTACCTGTGGTCCAGCAAA-3′，扩增263bp的片段(自GENBANK accessionnumber为L42937的第949-1211位核苷酸序列)。
外显子2：
引物P7：F：5′-CCTACAGTTATACATCTTTGGGA-3′；R：5′-TGAGAAATACATACTGTGGGGAT-3′，扩增241bp的片段(自GENBANK accessionnumber为L43841的第26-266位核苷酸序列)。
外显子3：
引物P8：F：5′-CTGTTTAAAAGAACTACAACTGAAT-3′；R：5′-AACAATTACAGAGAGAAATATCCA-3′，扩增261bp的片段(自GENBANK accessionnumber为L43842的第21-281位核苷酸序列)。
以步骤1得到的从不同品种山羊实验材料提取的基因组基因为模板，分别用上述引物进行PCR扩增。
PCR扩增反应体系为25μL，包括：5μmol/L上下游引物各1.0μL；10×PCR缓冲液2.5μL；200μmol/L dNTPs 2.5μL；Taq DNA聚合酶1.0U；50ng/μL DNA模板3.0μL；20mmol/L Mg2+1.5μL，其余用超纯水补齐。
8对引物的PCR扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s(8对引物退火温度不同，为54～60℃(P1为58℃，P2为56℃，P3为60℃，P4为54℃，P5为54℃，P6为57℃，P7为60℃，P8为58℃)，72℃延伸30s，共32个循环；最后72℃延伸7min；4℃保存。
将所设计的8对引物对4个山羊品种的基因组进行扩增得到的PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明扩增片段与目的片段大小一致且特异性好(图1)，可直接进行SSCP分析。图1中泳道1-8分别为引物P1-P8扩增得到的片段的电泳图；图1中泳道M为SD002marker(自上而下的条带大小依次为100、200、300、400、500和600bp)
3)SSCP分析
分别对步骤1)得到的8对引物在4个山羊品种中扩增的PCR产物分别进行SSCP分析，具体方法如下所述：取1.5μL PCR产物置于PCR管中，加6μL上样缓冲液(98％甲酰胺、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯氰、10mmol/L EDTA(pH8.0)、10％甘油)，离心混匀，98℃变性10min，迅速插入冰中，放置5min，使之保持变性状态。变性后PCR产物在10～12％非变性聚丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺(29～49∶1)凝胶中常温电泳过夜，电泳结束后，银染显带。用AlphaImagerTM 2200and 1220Documentation and Analysis Systems(Alpha Innotech Corporation，San Leandro，CA，USA)拍照和分析。
结果发现引物P4扩增片段有3种基因型，命名为AA、AB和BB(图2)，即扩增产物非变性聚丙烯酰胺电泳得到三条带的，为AB基因型(图2中泳道1，2，5)；扩增产物非变性聚丙烯酰胺电泳得到分别与AB基因型沿电泳方向第一条电泳带和第三条电泳带具有相同的迁移距离的两条电泳条带的，为AA基因型(图2中泳道3，4，8)；扩增产物非变性聚丙烯酰胺电泳得到与AB基因型沿电泳方向第二条电泳带和第三条电泳带具有相同的迁移距离的两条电泳条带的，为BB基因型(图2中泳道6，7)。其余7对引物的扩增片段均没有检测到多态。图2中，泳道3，4，8为AA基因型；泳道1，2，5为AB基因型；泳道6，7为BB基因型。
对SSCP分析后不同基因型纯合个体的PCR产物用DNA片段快速纯化回收试剂盒纯化，回收后的DNA片段用pGEM-T Easy载体连接，并转化大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α菌株，酶切鉴定后在ABI 3730测序仪上测序。测序反应由上海英骏生物技术有限公司完成。
结果发现AA型与GenBank L42937序列一致，BB型与AA型相比有1个碱基突变(+757G→A)，但没有引起氨基酸变化。即当自GenBank Accession Number为L42937的第757位核苷酸为G时，定义为A等位基因，当源自GenBank Accession Number为L42937的第757位核苷酸为A时，定义为B等位基因，这两个等位基因可组成三种基因型：纯合体AA、BB，杂合体AB。
上述结果表明，引物P4(F：5′-TCTTGAAGCTGTATCAGCCATA-3′；R：5′-GTGTTGAAAATTGTGGAGAGTAGA-3′)扩增得到的187bp的片段(自GENBANKaccession number为L42937的第657-843位核苷酸序列)具有多态性，共有AA、AB和BB三种基因型。其中AA基因型的扩增得到的核苷酸序列如序列表中序列3所示，BB基因型的扩增得到的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
3)GnRHR基因型检测及其与繁殖力关系的统计分析
按照步骤2)的方法用P4引物对济宁青山羊、安哥拉山羊、波尔山羊和内蒙古绒山羊进行了GnRHR基因型检测，并计算了不同山羊品种的基因型频率和等位基因频率，统计结果如表1所示。
表1.4个山羊品种中GnRHR基因的等位基因频率和基因型频率
注：括号内的数字是个体数。
配合下列模型进行最小二乘方差分析，比较济宁青山羊产羔数在基因型之间的差异(对引物P4的基因型进行分析)：
yijklm＝μ+Si+KSj+Pk+G1+eijklm
济宁青山羊2005年产羔的具有产羔数记录的130只济宁青山羊母羊，为5头公羊的后代，其数目分别为24、25、26、27、28只，胎次的划分是：实际第1胎(n＝42)、第2胎(n＝43)和第3胎(n＝45)分别作为3个胎次。产羔季节的划分是：产羔月份在3～5月的作为季节1(春季)(n＝35)，在6～8月的作为季节2(夏季)(n＝30)，在9～11月的作为季节3(秋季)(n＝40)，在12～2月的作为季节4(冬季)(n＝25)。
所以，上述模型中：yijklm为产羔数的记录值；μ为群体均值；Si为第i头公羊的固定效应，i＝1，2，3，4，5；KSj为第j个产羔季节的固定效应，j＝1，2，3，4；Pk为第k个胎次的固定效应，k＝1，2，3；G1为第1种基因型的固定效应，1＝1，2，3；eijklm为随机残差效应。用SAS(V8.12)的GLM(General Linear Model)过程完成。
方差分析结果表明公羊、产羔季节、胎次和GnRHR基因型对济宁青山羊产羔数都有显著影响(分别为P＝0.032＜0.05、P＝0.048＜0.05、P＝0.045＜0.05和P＝0.046＜0.05)。GnRHR基因引物P4不同基因型的济宁青山羊产羔数的最小二乘均值及标准误见表2。
表2.GnRHR基因引物P4扩增产物不同基因型济宁青山羊产羔数的最小二乘均值及标准误
具有不同字母肩标的平均值间差异显著(P＜0.05)。
由表2可知，BB型济宁青山羊平均产羔数分别比AB型和AA型多0.69只(P＜0.05)和0.82只(P＜0.05)，显著多于AB型和AA型济宁青山羊，AB型和AA型济宁青山羊平均产羔数差异不显著(P＞0.05)。该结果表明，可利用该上述P4基因型多态性检测济宁青山羊繁殖力。
序列表
<160>4
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
tcttgaagct gtatcagcca ta 22
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
gtgttgaaaa ttgtggagag taga 24
<210>3
<211>187
<212>DNA
<213>山羊属(Capra hircus)
<400>3
tcttgaagct gtatcagcca taaaggatgg caaacggtga ctctcctgat cagaatgaaa 60
accactgttc agcgatcaac agcagcatcc tactaacacc gggcagcctc cccaccctga 120
ccctatctgg aaagatccga gtgactgtta ctttcttcct ttttctactc tccacaattt 180
tcaacac 187
<210>4
<211>187
<212>DNA
<213>山羊属(Capra hircus)
<400>4
tcttgaagct gtatcagcca taaaggatgg caaacggtga ctctcctgat cagaatgaaa 60
accactgttc agcgatcaac agcagcatcc tactaacacc aggcagcctc cccaccctga 120
ccctatctgg aaagatccga gtgactgtta ctttcttcct ttttctactc tccacaattt 180
tcaacac 187
Claims (5)
1、一种检测山羊繁殖力的方法，是检测待测山羊基因组中的GnRHR基因的第757位核苷酸为G还是突变为A，确定山羊的基因型，然后通过基因型确定山羊繁殖力；所述GnRHR基因的核苷酸序列为自GENBANK ACCESSION NUMBER为L42937的第1至1236位核苷酸；
所述确定山羊的基因型的方法为：如果山羊基因组中的GnRHR基因的第757位核苷酸为G时，其纯合体的基因型为AA；山羊基因组中的GnRHR基因的第757位核苷酸突变为A时，其纯合体的基因型为BB；它们的杂合体基因型为AB；
通过基因型确定山羊繁殖力的方法为：所述BB基因型山羊的繁殖力高于AB基因型山羊和AA基因型山羊。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测山羊基因组中的GnRHR基因的第757位核苷酸为G还是突变为A的方法是利用PCR方法扩增待测山羊基因组中的核苷酸序列为自GENBANK ACCESSION NUMBER为L42937的第657至843位核苷酸的片段，并将该扩增产物进行单链构象多态法检测，若得到3条电泳条带，即为AB基因型，得到分别与所述AB基因型沿电泳方向第一条电泳带和第三条电泳带具有相同迁移距离的两条电泳条带的，为AA基因型；得到分别与AB基因型沿电泳方向第二条电泳带和第三条电泳带具有相同迁移距离的两条电泳条带的，为BB基因型。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR方法的扩增引物对为具有序列表中序列1所述序列的核苷酸和具有序列表中序列2所述序列的核苷酸。
4、根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于：所述山羊为济宁青山羊。
5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述繁殖力为每胎产羔数。
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