CN117230244A - 水稻镉吸收主效基因OsNramp5的SNP分子标记的应用以及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种水稻镉吸收主效基因OsNramp5的SNP分子标记的应用以及检测方法，水稻镉吸收主效基因OsNramp5的SNP分子标记在水稻育种中的应用，所述SNP分子标记位于水稻第7号染色体第8878412bp处，所述SNP分子标记的多态性为C/T。本申请的SNP分子标记的应用可以有效鉴定OsNramp5的基因型，具有操作简单、成本低廉、周期短等优点，应用于水稻分子标记辅助选择中，显著缩短低镉水稻育种的选育周期，具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本申请属于植物分子育种技术领域，尤其涉及一种水稻镉吸收主效基因OsNramp5的SNP分子标记的应用以及检测方法。
背景技术
稻米被镉污染，影响了粮食安全。培育低镉水稻品种则是最经济有效的应对手段。水稻OsNramp5基因编码的蛋白是水稻根部细胞参与二价阳离子的主要转运蛋白，主要吸收Mn2+，Cd2+，Fe2+，同时负责这些离子从根部向地上部的运输。
相关技术中，使用Indel分子标记检测，步骤繁琐且耗时长，对于大量检测具有局限性，而且对基因型辨别的精准度也不够。
因此，建立一种新的基于PCR技术的基因分型方法来快速、准确地鉴定水稻镉低吸收突变体基因OsNramp5的基因型将有助于提高水稻低镉育种的效率。
发明内容
本申请实施例提供一种水稻镉吸收主效基因OsNramp5的SNP分子标记的应用以及检测方法，旨在提供一种新的检测水稻低镉育种的分子标记位点。
第一方面，本申请提供一种水稻镉吸收主效基因OsNramp5的SNP分子标记在水稻育种中的应用，所述SNP分子标记位于水稻第7号染色体第8878412bp处，所述SNP分子标记的多态性为C/T。
可选地，所述SNP分子标记的多态性为T。
可选地，所述基因OsNramp5的编码区如SEQ ID NO.1所示。
可选地，所述SNP分子标记位于所述SEQ ID NO.1核苷酸序列自5’端起第132位，其碱基为C或T。
可选地，所述水稻育种中的应用为鉴定镉低积累水稻品种。
第二方面，本申请提供一种检测镉低积累水稻的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测水稻基因组DNA，以其为模板，利用引物组合进行KASP反应检测；所述KASP引物组合由两条特异性引物和一条通用引物组成，其核苷酸序列为：
1)两条特异性引物：
引物X：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGCCTGCATGGAAAAGGTTC-3’；
引物Y：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCCTGCATGGAAAAGGTTT-3’；
2)一条通用引物：
引物C：5’-ATCCAAGTAGGCTAAAGACACCAT-3’；
(2)检测扩增产物片段中所述基因OsNramp5的编码区序列自5’端起的第132位的碱基种类，若碱基种类为T，则待测水稻为镉低积累水稻，若碱基种类为C，则判定待测水稻不是镉低积累水稻。
可选地，所述两条特异性引物分别携带不同的荧光标记。
第三方面，本申请提供一种用于扩增水稻镉吸收主效基因OsNramp5的SNP分子标记的KASP引物组合，KASP引物组合用于检测中所述基因OsNramp5的编码区序列自5’端起第132位的碱基种类，KASP引物组合包括：
1)两条特异性引物：
引物X：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGCCTGCATGGAAAAGGTTC-3’；
引物Y：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCCTGCATGGAAAAGGTTT-3’；
2)一条通用引物：
引物C：5’-ATCCAAGTAGGCTAAAGACACCAT-3’。
第四方面，本申请提供一种含有第三方面所述KASP引物组合的试剂盒。
第五方面，本申请提供一种引物组合或含有该引物组合的试剂盒在辅助鉴定水稻籽粒镉吸收主效基因OsNramp5或鉴定镉低积累水稻品种中的应用，所述引物组合用于检测中所述基因OsNramp5的编码区序列自5’端起第132位的碱基种类，引物组合包括：
1)两条特异性引物：
引物X：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGCCTGCATGGAAAAGGTTC-3’；
引物Y：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCCTGCATGGAAAAGGTTT-3’；
2)一条通用引物：
引物C：5’-ATCCAAGTAGGCTAAAGACACCAT-3’。
本发明具有如下有益效果：
本申请的提供的SNP分子标记的应用可以有效鉴定OsNramp5的基因型，具有操作简单、成本低廉、周期短等优点，应用于水稻分子标记辅助选择中，显著缩短低镉水稻育种的选育周期，具有较高的应用价值。
本申请的检测方法利用SNP分子标记，并结合KASP检测技术，可快速、精准、高通量的检测水稻材料中OsNramp5基因是否缺失，解决传统分子标记辅助育种中的技术问题，加快辐8612-12在镉低积累新品种选育进程中的应用。
本申请提供的SNP分子标记的应用及其检测方法可在水稻苗期通过KASP引物组合进行OsNramp5的基因型检测，进而快速筛选出水稻材料是否具有镉低吸收特性，相较于传统的镉含量检测方法，节约了大量人力、物力成本。
附图说明
图1示出了华恢8612、辐8612-12及其华恢8612/辐8612-12杂交F1群体部分单株KASP标记基因分型结果；
图2华恢8612、辐8612-12及其华恢8612/辐8612-12杂交F1的籽粒镉含量。
具体实施方式
下面将详细描述本申请的各个方面的特征和示例性实施例，为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本申请进行进一步详细描述。应理解，此处所描述的具体实施例仅意在解释本申请，而不是限定本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以在不需要这些具体细节中的一些细节的情况下实施。下面对实施例的描述仅仅是为了通过示出本申请的示例来提供对本申请更好的理解。需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
镉(cadmium，Cd)是一种广泛存在于环境中的重金属元素，由于金属冶炼、工业活动及含镉肥料的使用，部分地区土壤中的镉含量严重超标。水稻作为重要的主粮作物，易受镉污染。稻米中镉含量超标会严重影响人体健康，长期摄入高镉稻米会诱发肾脏慢性中毒、骨质疏松、脊柱变形等多种疾病。
目前，已克隆参与水稻镉吸收、转运和积累的基因较多。水稻镉吸收相关基因OsNramp5编码的蛋白是水稻根部细胞参与二价阳离子的主要转运蛋白，主要吸收Mn2+，Cd2 +，Fe2+，同时负责这些离子从根部向地上部的运输，并影响离子在根部和叶片中的分布，对维持水稻体内的离子平衡具有重要作用。
基因敲除OsNramp5可使水稻丧失吸收Mn和Cd的能力，导致水稻的地上部分与地下部分中Mn和Cd含量显著低于野生型。
且水稻籽粒镉含量这个性状是由数量性状控制，表型值又不易准确测定，因此目前克隆的主效基因非常少，而真正针对主效基因设计的SNP标记也比较少。
关于水稻籽粒镉含量这一性状的SNP分子标记基本是根据QTL来设计的，因此这样的SNP标记在实际育种中价值可能较小。
经发明人研究发现，对水稻OsNramp5基因进行突变或抑制表达可显著减少根系对镉的吸收，降低秸秆和籽粒中镉的含量。因此根据此基因开发出的低镉SNP标记可能可以比较准确地预测水稻镉含量情况，在低镉水稻育种或是定向改良中实现其实际应用价值。
第一方面，本申请提供一种水稻镉吸收主效基因OsNramp5的SNP分子标记在水稻育种中的应用，所述SNP分子标记位于水稻第7号染色体第8878412bp处，所述SNP分子标记的多态性为C/T。
本申请开发的水稻镉吸收主效基因OsNramp5的SNP标记的应用，其所选择的SNP位点是独特的，而且此位点所代表的基因OsNramp5是水稻籽粒镉含量这一性状的主效基因，能比较准确的预测水稻籽粒镉含量；该SNP分子标记可用于水稻未结实之前预测水稻籽粒镉含量高低，可进行准确地筛选，大大改善了后期结实才能检测确定籽粒中镉含量的问题，显著促进水稻低镉含量品种的培育。
在一些实施例中，所述SNP分子标记的多态性为T。
在本申请实施例中，多态性为T的水稻植株相较于多态性为C的水稻植株具有更低的镉吸收特性。
在一些实施例中，所述基因OsNramp5的编码区如SEQ ID NO.1所示。
在一些实施例中，所述SNP分子标记位于所述SEQ ID NO.1核苷酸序列自5’端起第132位，其碱基为C或T。
在一些实施例中，所述水稻育种中的应用为鉴定镉低积累水稻品种。
第二方面，本申请提供一种检测镉低积累水稻的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测水稻基因组DNA，以其为模板，利用引物组合进行KASP反应检测；所述KASP引物组合由两条特异性引物和一条通用引物组成，其核苷酸序列为：
1)两条特异性引物：
引物X：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGCCTGCATGGAAAAGGTTC-3’；
引物Y：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCCTGCATGGAAAAGGTTT-3’；
2)一条通用引物：
引物C：5’-ATCCAAGTAGGCTAAAGACACCAT-3’；
(2)检测扩增产物片段的中所述基因OsNramp5的编码区序列自5’端起第132位的碱基种类，若碱基种类为T，则待测水稻为镉低积累水稻，若碱基种类为C，则判定待测水稻不是镉低积累水稻。
在本申请实施例中，引物X、引物Y、引物C的碱基序列如SEQ ID NO.2-4所示。
在一些实施例中，所述两条特异性引物分别携带不同的荧光标记。在本申请实施例中，两条特异性引物分别含有不同的荧光基团，例如，引物X含有荧光基团FAM，引物Y含有荧光基团HEX。
荧光基团HEX、荧光基团FAM是一种常用于生物标记和荧光染料的荧光标记基团。它通常用于分子生物学和细胞生物学研究中，以可视化或检测生物分子，如核酸和蛋白质。HEX是6-羟基己基酰胺(6-Hydroxyhexanoyl amide)，具有独特的荧光光谱特性，通常在绿色至黄色之间发射光。荧光基团FAM，全名为6-氢基吲哚[4,5-c]喹啉-2-酮(6-carboxyfluorescein)，具有独特的荧光光谱特性，通常在蓝绿色区域发射光。
第三方面，本申请提供一种用于扩增水稻镉吸收主效基因OsNramp5的SNP分子标记的KASP引物组合，KASP引物组合用于检测中所述基因OsNramp5的编码区序列自5’端起第132位的碱基种类，KASP引物组合包括：
1)两条特异性引物：
引物X：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGCCTGCATGGAAAAGGTTC-3’；
引物Y：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCCTGCATGGAAAAGGTTT-3’；
2)一条通用引物：
引物C：5’-ATCCAAGTAGGCTAAAGACACCAT-3’。
第四方面，本申请提供一种含有第三方面所述KASP引物组合的试剂盒。
第五方面，本申请提供一种引物组合或含有该引物组合的试剂盒在辅助鉴定水稻籽粒镉吸收主效基因OsNramp5或鉴定镉低积累水稻品种中的应用，所述引物组合用于检测中所述基因OsNramp5的编码区序列自5’端起第132位的碱基种类，引物组合包括：
1)两条特异性引物：
引物X：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGCCTGCATGGAAAAGGTTC-3’；
引物Y：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCCTGCATGGAAAAGGTTT-3’；
2)一条通用引物：
引物C：5’-ATCCAAGTAGGCTAAAGACACCAT-3’。
实施例
下述实施例更具体地描述了本申请公开的内容，这些实施例仅仅用于阐述性说明，因为在本申请公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。除非另有声明，以下实施例中所报道的所有份、百分比、和比值都是基于重量计，而且实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得，并且可直接使用而无需进一步处理，以及实施例中使用的仪器均可商购获得。
本申请实施例的生物材料：华恢8612、辐8612-12以及华恢8612/辐8612-12杂交组合F1来源于袁隆平农业高科技股份有限公司。本申请实施例用的试剂来源于长沙创辰生物科技有限公司和天根生化科技(北京)有限公司。
实施例1.SNP位点分析
基于镉低吸收水稻品种突变体辐8612-12在水稻7号染色体8878402-8878413位置缺失12bp，从而在8878402bp和8878412bp处的碱基为都为T，而华恢8612以及3000份水稻测序公共数据库资源在8878402bp和8878412bp处的碱基分别为G和C。挑选这2个SNP候选位点，利用Primer5软件对每个位点分别设计2组KASP引物对辐8612-12和华恢8612及华恢8612/辐8612-12杂交组合F1进行测试，期望挑选出基因分型效果好的SNP位点。
实施例2.KASP引物开发及验证
以8878402bp的多态性为G/T，8878412bp的多态性为C/T作为基因分型的SNP位点进行实验设计和验证。
以获得的SNP位点为靶点(分别在水稻7号染色体8878402bp和8878412bp处的碱基)，获取其在日本晴参考基因组上下游各200bp的序列，利用Primer5进行KASP引物设计，每个SNP位点分别设计了2组KASP引物组合，
8878402bp的多态性为G/T的KASP引物分别为：
组合1：
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5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACACCATGAATCCAGGACCAAC-3'，
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5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACACCATGAATCCAGGACCAAA-3'；
组合2：
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5'-GCATGGCATTCATTGCTCAT-3'，
8612N5-132-143-wFAM11:
5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACACCATGAATCCAGGACGAAC-3'，
8612N5-132-143-mHEX12:
5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACACCATGAATCCAGGACGAAA-3'；
8878412bp的多态性为C/T的KASP引物分别为：
组合3：
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5'-ATCCAAGTAGGCTAAAGACACCAT-3'，
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5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGCCTGCATGGAAAAGGTTC-3'，
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组合4：
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5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCCTGCATGGAAAAGTTTT-3'。
引物委托上海生工生物有限公司合成。
分别对这些KASP引物进行PCR扩增测试引物的基因分型效果。步骤如下：
(1)DNA的提取。提取华恢8612、辐8612-12以及华恢8612/辐8612-12杂交组合F1的基因组DNA作为模板，利用设计的4组KASP引物组合进行检测。
(2)PCR扩增体系。PCR扩增反应体系以10μl计为：2×Flu-ASPCR Mix forKASP 5μl，10μM的Fam和Hex引物各0.15μl，10μM的Com引物0.3μl，50-100ng/ul的DNA模板2μl，其余为超纯水，共10μl。
(3)PCR扩增条件。PCR反应程序包括：94℃预变性3min；循环(94℃变性20秒，65℃～57℃退火及延伸40S)10次，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；循环(94℃变性20秒，57℃退火及延伸40S)28次。然后利用Bio-Rad公司的CFX96 Touch实时荧光定量PCR系统对反应后的体系进行扫描和基因分型，具体程序为：37℃1min，Plate Read，End。
(4)基因型分析。
经过结果检验分析，最终挑选最优标记组合3(SEQ ID NO:2-4)：
8612N5-132-143-wFAM2/8612N5-132-143-mHEX2/8612N5-132-143-COM2作为OsNramp5鉴定的优选引物。8612N5-132-143-wFAM2引物序列如SEQ ID NO:2所示，8612N5-132-143-mHEX2引物序列如SEQ ID NO:3所示，8612N5-132-143-COM2引物序列如SEQ IDNO:4所示。
如图1所示，利用该KASP引物检测，辐8612-12检测到HEX荧光信号，基因型为T型；野生型华恢8612检测到FAM荧光信号，基因型为C型；华恢8612/辐8612-12杂交组合F1的荧光信号则位于辐8612-12的HEX荧光信号与野生型华恢8612的FAM荧光信号中间，并且有明显的界线可以区分，其基因型为C/T杂合型。因此本发明提供的KASP引物组能有效区分8878412bp处的C/T不同等位基因型。
实施例3水稻镉吸收主效基因OsNramp5的SNP分子标记的应用
为了验证当8878412bp处的基因型为T的水稻材料属于镉低吸收类型，将种植于镉污染田(土壤有效镉含量0.317mg/kg)的辐8612-12，华恢8612以及华恢8612/辐8612-12杂交组合F1进行籽粒镉含量检测。如图2所示，辐8612-12籽粒镉含量平均为0.009mg/kg，而华恢8612和华恢8612/辐8612-12杂交组合F1的籽粒镉含量平均分别为0.098mg/kg和
0.103mg/kg。辐8612-12籽粒镉含量显著低于华恢8612和华恢8612/辐
8612-12杂交组合F1的籽粒镉含量。因此，利用KASP引物检测8878412bp处的基因型可以判断水稻材料是否具有镉低积累的特性。具体为，当8878412bp处的基因型为T，则该水稻材料具有镉低积累的特性。利用该KASP标记可以实现对镉吸收相关基因OsNramp5的基因型的高效、快速、准确的鉴定，通过分子标记辅助选择，加快低镉水稻新品种的选育。
还需要说明的是，本申请中提及的示例性实施例，基于一系列的步骤或者装置描述一些方法或系统。但是，本申请不局限于上述步骤的顺序，也就是说，可以按照实施例中提及的顺序执行步骤，也可以不同于实施例中的顺序，或者若干步骤同时执行。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，所属领域的技术人员可以清楚地了解到，为了描述的方便和简洁，上述描述的系统、模块和单元的具体工作过程，可以参考前述方法实施例中的对应过程，在此不再赘述。应理解，本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种水稻镉吸收主效基因OsNramp5的SNP分子标记在水稻育种或水稻种质资源改良中的应用，所述SNP分子标记位于水稻第7号染色体第8878412bp处，所述SNP分子标记的多态性为C/T。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SNP分子标记的多态性为T。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因OsNramp5的编码区如SEQ IDNO.1所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述SNP分子标记位于所述SEQ ID NO.1核苷酸序列自5’端起第132位，其碱基为C或T。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻育种中的应用为鉴定镉低积累水稻品种。
6.一种检测镉低积累水稻的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测水稻基因组DNA，以其为模板，利用引物组合进行KASP反应检测；所述KASP引物组合由两条特异性引物和一条通用引物组成，其核苷酸序列为：
1)两条特异性引物：
引物X：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGCCTGCA
TGGAAAAGGTTC-3’；
引物Y：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCCTGCA
TGGAAAAGGTTT-3’；
2)一条通用引物：
引物C：5’-ATCCAAGTAGGCTAAAGACACCAT-3’；
(2)检测扩增产物片段中所述基因OsNramp5的编码区序列自5’端起第132位的碱基种类，若碱基种类为T，则待测水稻为镉低积累水稻，若碱基种类为C，则判定待测水稻不是镉低积累水稻。
7.根据权利6所述的方法，其特征在于，所述两条特异性引物分别携带不同的荧光标记。
8.用于扩增水稻镉吸收主效基因OsNramp5的SNP分子标记的KASP引物组合，其特征在于，KASP引物组合用于检测中所述基因OsNramp5的编码区序列自5’端起第132位的碱基种类，KASP引物组合包括：
1)两条特异性引物：
引物X：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGCCTGCA TGGAAAAGGTTC-3’；
引物Y：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCCTGCA TGGAAAAGGTTT-3’；
2)一条通用引物：
引物C：5’-ATCCAAGTAGGCTAAAGACACCAT-3’。
9.含有权利要求8所述KASP引物组合的试剂盒。
10.一种引物组合或含有该引物组合的试剂盒在辅助鉴定水稻籽粒镉吸收主效基因OsNramp5或鉴定镉低积累水稻品种中的应用，所述引物组合用于检测中所述基因OsNramp5的编码区序列自5’端起第132位的碱基种类，引物组合包括：
1)两条特异性引物：
引物X：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGCCTGCA TGGAAAAGGTTC-3’；
引物Y：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCCTGCA TGGAAAAGGTTT-3’；
2)一条通用引物：
引物C：5’-ATCCAAGTAGGCTAAAGACACCAT-3’。
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