CN117187431A - 一种与茄子果实长度qtl紧密连锁的snp分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子遗传学技术领域，具体公开了一种与茄子果实长度QTL紧密连锁的SNP分子标记及其应用，本发明首先将果实长度QTL定位在6号染色体上的关联区间内，关联区间内筛选到一个SNP分子标记位于茄子6号染色体的第79951831位碱基处，所述第79951831位碱基具有T/A多态性，通过KASP技术能够对分离群体进行快速、便捷、高通量的基因分型。本发明具有减少育种工作量、缩短育种时间和提高育种效率的特点。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传学技术领域，具体涉及与茄子果实长度紧密连锁的SNP分子标记及其应用。
背景技术
茄子(Solanum melongena L.)是我国重要的蔬菜作物。果实长度是茄子重要的商品性状之一，我国消费者对茄子果实外观的喜好存在明显的地域差异性，同时茄子果实长度也是影响茄子单产的因素之一。因此，茄子果实长度是茄子育种的主要目标之一。
基于SNP分子标记的KASP(KompetitiveAllele Specific PCR)基因分型技术具有快速、高效、通量高、成本低等优点。选择与性状紧密连锁的SNP位点，基于这些标记设计KASP引物，应用于分子标记辅助育种，能够极大缩短育种周期，提高育种效率。
现有技术存在的问题：茄子果实长度是育种的重要目标之一，目前评价茄子果实长度的方法主要是等待茄子果实达到商品成熟度后进行测量，该方法时间长，并且容易受到环境条件和栽培管理方法的影响。利用分子标记能够在苗期快速的进行鉴定，然而目前缺乏关于茄子果实长度分子标记的研究。因此，发掘调控茄子果实长度基因，开发与调控果实长度基因紧密连锁的分子标记，不仅有利于解析果长形成的遗传机理和调控机制，还能加快茄子果实长度遗传改良。
发明内容
基于以上问题，本发明利用长果和短果茄子构建F2分离群体，通过BSA-Seq方法与G’统计值关联分析算法相结合，以Guiqie1参考基因组(CNGBdb：CNA0007245)为参考基因组，在茄子全基因组上检测到两个果实长度关联位点QTL1位于茄子3号染色体60.2～94.4Mb内，QTL2位于茄子6号染色体61.0～94.2Mb内(图1)。本发明针对QTL2位点开发与其紧密连锁的SNP分子标记，为茄子果实长度基因的精细定位和克隆奠定基础，为茄子果实长度的早期标记辅助选择提供依据。本发明中与茄子果长QTL位点紧密连锁的SNP标记，经试验检测，连锁性和可靠性均较高，这对于提高分子标记辅助选择的准确性和效率具有重要意义。本发明采用的技术方案如下：
1.一种与茄子果实长度QTL位点紧密连锁的SNP分子标记，该位点位于茄子6号染色体第79951831位碱基处，多态性位点为A/T，所述的SNP分子标记碱基A与长果连锁，SNP分子标记碱基T与短果连锁。多态性位点上下游各100个碱基的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.与茄子果实长度QTL位点紧密连锁的SNP分子标记的检测方法，步骤如下：
(1)上述的SNP分子标记，提取所述多态性位点上下游各100个碱基的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
(2)将步骤(1)得到的整体序列通过引物设计网站(http://www.snpway.com/)转化成KASP引物，所述KASP引物包括2条正向特异性引物以及1条反向通用引物，分别如SEQID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述的正向特异性引物分别带有FAM和HEX荧光探针接头序列；
(3)将步骤(2)得到的KASP引物经过定量PCR仪进行KASP基因分型检测，
所述的KASP基因分型检测，包括配制KASP反应体系，KASP反应程序扩增，最后检测荧光信号进行基因分型。所述KASP反应体系包括2条正向引物各0.075μl、反向引物0.2μl、KASP预混液2.5μl、DNA模板1μl和纯水1.15μl混合成5μl的反应体系；所述KASP反应程序为94℃15min；94℃20s，65℃(每循环-0.7℃)1min，10个循环；94℃20s，57℃1min，30个循环；所述的荧光信号检测是通过分析荧光信号强度完成基因分型。
3.与茄子果实长度QTL紧密连锁的SNP分子标记在茄子分子辅助育种中的应用，所述SNP分子标记位于茄子6号染色体的第79951831位碱基，所述第79951831位碱基为多态性位点T/A，所述第79951831位碱基前后各100个碱基的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的有益效果：本发明通过BSA-Seq与关联分析在6号染色体上检测到一个新的果实长度QTL，位于茄子6号染色体61.0～94.2Mb内，提供一种与茄子果实长度QTL紧密连锁的SNP分子标记。该分子标记能够准确、快速地鉴别出不同果实长度的茄子品种和个体，可用于茄子果实长度种质资源的预测和筛选，也可以用于分子辅助育种创制不同果实长度的茄子品种，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为茄子亲本表型图，A为亲本和F1的表型图，B为F2群体表型频数分布；
图2为茄子果实长度的BSA-Seq定位图，横坐标表示染色体，纵坐标表示G’关联算法的计算值；
图3为茄子果实长度的QTL检测图，横坐标表示SNP标记的遗传距离，纵坐标表示标记对应的LOD值；
图4为本发明在茄子F2群体KASP基因分型结果，横坐标表示HEX荧光值，纵坐标表示FAM荧光值；
图5为茄子F2群体中标记基因型与表型的连锁图，图3中纵坐标表示植株数，横坐标表示果实长度，图例黑色表示亲本WT基因型，白色表示亲本NY基因型，斜杠表示F2杂合基因型。
具体实施方式
本发明下述实施例中使用方法，如无特殊说明，均为常规方法置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
实施例1
本实施例提供与茄子果实长度QTL紧密连锁的SNP分子标记，该标记位于6号染色体上的第79951831处，多态性为A/T。所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列第101位碱基处，存在多态性A/T，所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为GATTACATATAAATGCTTTTGAGATAACATTTTTTGTGTACTTATCGAAAACCCAAAATTACGTAGCCCAACTTGTTTTCCAAGAAAATATTTTCCATGCAAATTATTAGGGGTCAAATGAACGGTTTGGGTTGAAATTGGAGATATTAAAATATGTTGAAATAGAAATTGGGTTGGGTTATGACCCGCTTGACTTTACTT。
基于所述SNP分子标记开发的KASP引物，所述KASP引物由两条正向引物和一条反向引物组成；所述正向引物I的核苷酸序列如SEQ ID NO:2(5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAACCGTTCATTTGACCCCTAATAATTT-3’)所示；所述正向引物II的核苷酸序列如SEQ ID NO:3(5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAACCGTTCATTTGACCCCTAATAATTA-3’)所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4(5’-AGCCCAACTTGTTTTCCAAGAAAATATTTTC-3’)所示。
实施例2
本实施例提供茄子果实长度QTL紧密连锁的SNP分子标记筛选与检测方法，包括：
1、试验材料
以长条形高代自交系WT和短筒形高代自交系NY作为亲本，杂交后代F1自交得到F2分离群体，F2分离群体表型呈正态分布说明果实长度为数量性状(图1和图2)。
2、亲本与F2群体极端个体DNA混池的制备
分别取WT、NY和F2群体两种极端表型个体各25株的叶片，提取DNA等量混合，构建两个亲本池和两个极端池。委托北京贝瑞和康生物技术有限公司，对混池进行基因组重测序。测序流程为首先提取植物材料的基因组DNA，基因组DNA用酶随机打断成短的DNA片段后，进行平末端修复。然后在DNA片段两端连接dA尾，并连接测序接头。加上接头的DNA片段经过AMPure XP磁珠进行纯化，并选择300-400bp范围的片段进行PCR扩增。建好的文库经过纯化、库检，Hiseq X10 PE150上机测序。
3、关联分析确定果实长度位点
测序结果比对至茄子高质量参考基因组Guiqie1进行SNP检测和注释，通过R包QTLSeqr提供的G’算法计算SNP位点的G’值用于关联分析，选择关联阈值以上的区域作为与果实长度关联的区间，在第6号染色体上检测到果实长度相关的QTL位点，位于61.0～94.2Mb处，区间大小为33.1Mb。
4、检测并筛选与果实长度位点紧密连锁的SNP分子标记
挑选关联区间内峰值附近的SNP位点，分别提取上下游各100bp的碱基序列，根据引物设计原则，设计KASP标记引物。以两个亲本和F1单株的DNA为模板，利用武汉景肽公司提供的PARMS SNP试剂盒进行检测。具体KASP反应体系和反应程序参照试剂盒说明书，5μlKASP反应体系包括2条正向引物各0.075μl、反向引物0.2μl、KASP预混液2.5μl、DNA模板1μl和纯水1.15μl混合成5μl的反应体系，ABIQ6 plus荧光定量PCR仪上进行反应，使用384孔PCR板，KASP反应程序为94℃15min；94℃20s，65℃(每循环降低0.8℃)60s，10个循环；94℃20s，57℃60s，30个循环，37℃保持60s。选择能够区分出亲本和F1杂合个体的多态性SNP分子标记。
利用开发的标记对191个不同果实长度的F2单株进行检测，利用QTL IciMappingV4.2分析SNP标记对茄子果长的影响，检测到6号染色体上的第79951831处碱基的SNP标记对茄子果长的影响最大，与果长的连锁最紧密(图3)。
实施例3
本实施例提供与茄子果实长度QTL紧密连锁的SNP分子标记的应用，具体如下：
利用该SNP分子标记对191个不同果实长度的F2单株进行检测，通过分型结果可以甄别F2单株的果实长度，如果基因型为TT，则果实为短果，如果基因型为AA，则果实为长果。SNP标记，位于茄子6号染色体的第79951831位碱基处。正向引物F-1为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAACCGTTCATTTGACCCCTAATAATTT-3’；正向引物F-2为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAACCGTTCATTTGACCCCTAATAATTA-3’；反向引物R为5’-AGCCCAACTTGTTTTCCAAGAAAATATTTTC-3’。
具体方法为：提取上述191个F2单株叶片的DNA，将SNP分子标记对应的引物用于检测。根据分型结果，FAM荧光对应碱基A，HEX荧光对应碱基T，基因型AA为WT亲本基因型，基因型TT为NY亲本基因型，基因型T/A为杂合型，以纯水作为阴性对照(图4)。将191个单株的基因分型结果与表型数据进行对应(图5)，可以看出NY基因型对应的果实长度较短，WT基因型对应的果实长度较长，杂合基因型介于两者之间，这一结果与实际相符，说明本发明SNP分子标记能够区分果实长度。
a.PCR反应在ABIQ6 plus荧光定量PCR仪上进行，使用384孔PCR板，具体反应体系5μL：其中1μL DNA(60ngμL-1)，2.5μl KASP Master mix(2×)，0.21μL引物混合物(由浓度为10μmoL-1F_FAM、F_HEX和R按照1:1:1的体积比混合得到)，ddH2O补足至5μL。
b.PCR循环反应程序：1.预变性：94℃变性15min；2.变性：94℃变性20s，65℃退火60s，共10个循环(从第2个循环开始，每个循环降低0.8℃)；3.变性：94℃变性20s，57℃退火60s，共30个循环；4.37℃降温保持60s，并且采集FAM和HEX荧光数据，利用，ABIQ6 plus荧光定量PCR仪自带程序进行基因分型。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
Claims (6)
1.与茄子果实长度QTL紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于所述SNP分子标记位于茄子6号染色体的第79951831位碱基，所述第79951831位碱基为多态性位点T/A，所述第79951831位碱基前后各100个碱基的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述与茄子果实长度QTL紧密连锁的SNP分子标记在茄子分子辅助育种中的应用，其特征在于所述SNP分子标记位于茄子6号染色体的第79951831位碱基，所述第79951831位碱基为多态性位点T/A，所述第79951831位碱基前后各100个碱基的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述与茄子果实长度QTL紧密连锁的SNP分子标记在茄子分子辅助育种中的应用，其特征在于所述SNP分子标记在长果亲本为碱基A，短果亲本为碱基T。
4.根据权利要求2所述与茄子果实长度QTL紧密连锁的SNP分子标记在茄子分子辅助育种中的应用，其特征在于SNP分子标记通过如下引物鉴定：正向特异性引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，反向通用引物如SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求2和4中任何一项所述与茄子果实长度QTL紧密连锁的SNP分子标记在茄子分子辅助育种中的应用，其特征在于所述的SNP分子标记通过引物对茄子植株DNA进行扩增并读取扩增产物的荧光信号，如果检测到HEX荧光，则植株为短果，如果检测到FAM荧光，则植株为长果。
6.茄子果实长度QTL紧密连锁的SNP分子标记筛选与检测方法，包括：
(1)试验材料
以长条形高代自交系WT和短筒形高代自交系NY作为亲本，杂交后代F1自交得到F2分离群体，F2分离群体表型呈正态分布说明果实长度为数量性状；
(2)亲本与F2群体极端个体DNA混池的制备
分别取WT、NY和F2群体两种极端表型个体各25株的叶片，提取DNA等量混合，构建两个亲本池和两个极端池，委托北京贝瑞和康生物技术有限公司，对混池进行基因组重测序，测序流程为首先提取植物材料的基因组DNA，基因组DNA用酶随机打断成短的DNA片段后，进行平末端修复，然后在DNA片段两端连接dA尾，并连接测序接头，加上接头的DNA片段经过AMPure XP磁珠进行纯化，并选择300-400bp范围的片段进行PCR扩增，建好的文库经过纯化、库检，Hiseq X10 PE150上机测序；
(3)关联分析确定果实长度位点
测序结果比对至茄子高质量参考基因组Guiqie1进行SNP检测和注释，通过R包QTLSeqr提供的G’算法计算SNP位点的G’值用于关联分析，选择关联阈值以上的区域作为与果实长度关联的区间，在第6号染色体上检测到果实长度相关的QTL位点，位于61.0～94.2Mb处，区间大小为33.1Mb；
(4)检测并筛选与果实长度位点紧密连锁的SNP分子标记
挑选关联区间内峰值附近的SNP位点，分别提取上下游各100bp的碱基序列，根据引物设计原则，设计KASP标记引物，以两个亲本和F1单株的DNA为模板，利用武汉景肽公司提供的PARMS SNP试剂盒进行检测，具体KASP反应体系和反应程序参照试剂盒说明书，5μlKASP反应体系包括2条正向引物各0.075μl、反向引物0.2μl、KASP预混液2.5μl、DNA模板1μl和纯水1.15μl混合成5μl的反应体系，ABIQ6 plus荧光定量PCR仪上进行反应，使用384孔PCR板，KASP反应程序为94℃15min；94℃20s，65℃(每循环降低0.8℃)60s，10个循环；94℃20s，57℃60s，30个循环，37℃保持60s，选择能够区分出亲本和F1杂合个体的多态性SNP分子标记。
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| PB01 | Publication | ||
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