CN108374014B - 一种提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa及其克隆方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa及其克隆方法与应用。提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示。本发明还公开了提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtTPKa基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtTPKa基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物并与pTOPO载体连接；构建了含NtTPKa基因的RNAi表达载体。将RNAi载体通过农杆菌介导法转化烟草，制备转基因植株。获得的转基因植株钾含量比对照提高20%以上。说明烟草NtTPKa基因在培育高钾含量的烟草方面具有重大的应用前景。

Description

一种提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa及其克隆方法与应用
技术领域
本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa及其克隆方法与应用。
背景技术
钾是植物生长所必须的一种矿质营养元素之一，是植物体内含量最丰富的一价阳离子。植物吸收钾主要是通过根部进行的，吸收的形态是K+。植物吸收钾的方式分为两种：主动吸收和被动吸收。主动吸收需要消耗能量，但主动吸收的速率很高。在土壤溶液中K+浓度较高时，K+的吸收主要为被动吸收。在植物体内钾以K+的形态存在。根吸收的K+很容易被转运到地上部,在植物体内也很容易从一个部位转移到其它部位,并可以在植物体内被重复利用。在植物体内钾不足的情况下,钾被优先分配到生一长旺盛的幼嫩组织、器官中。
在植物中钾离子通道主要包括Shaker钾离子通道、TPK通道和Kir-like通道。TPK钾离子通道亚基具有4个跨膜结构域(TMS)和两个孔环结构，含有钾离子通道高度保守的特征序列（TxxTxGYG）的两个孔环结构（P-loop），TPK通道对K+具有高度的选择性。拟南芥TPK家族包含5个成员，TPK1-5。它们均有四个TMS和2个P-loop结构域。TPK1钾离子通道在昆虫细胞中过表达，显示外向型钾离子通道特征，并且对细胞质中钙离子浓度有很大的依赖性。TPK1、2、3、5在液泡中特异表达。对TPK1基因功能缺失突变体和过表达植株研究表明，其功能主要是将K+从液泡释放到细胞质，达到细胞内K+的动态平衡。TPKl钾离子通道还参与由ABA直接或者间接引起的气孔关闭时液泡中钾离子的释放。Cuin等发现在钾缺失或者盐胁迫时液泡会释放钾离子来维持细胞内的钾离子平衡以及维持细胞的膨压和膜电位。
钾被认为是烟草的品质元素，钾含量是评价烟叶品质优劣的重要指标之一。烟叶钾含量提高可以改善烟叶的组织结构，使烟叶结构细腻，而且还能提高烟叶外观色泽，使烟叶呈深橘黄色，香气足，吃味好，富有弹性和韧性，填充性增强。另外钾还可以增强烟叶糖类、色素类、芳香类物质的合成积累。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa；第二目的在于提供所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa的克隆方法；第三目的在于提供所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：
根据水稻AtTPK1基因的蛋白序列搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtTPKa序列，利用此序列设计基因克隆引物：
正向引物：NtTPKaF：ATGGATAAAGGTGATGTTGAAC
反向引物：NtTPKaR：TCAGATTTTCGATCGAGACGA
B、提取烟草叶组织RNA，反转录得到第一链cDNA；
C、以反转录得到的第一链cDNA作为模板，用引物NtTPKaF/NtTPKaR进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；
D、纯化产物与载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL saltsolution、1μL PCR®-BluntⅡ-TOPO（Invitrogen）混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测，筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。
本发明的第三目的是这样实现的，所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa用于获得叶片钾含量提高的转基因植株中的应用。
本发明利用同源克隆技术从烟草中得到一个烟草钾离子通道基因NtTPKa，具体步骤为：根据水稻AtTPK1基因的蛋白序列（GenBank 登录号 CAA65988），搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtTPKa序列。利用此序列设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtTPKa基因序列；通过gateway技术构建NtTPKa的RNAi载体；利用农杆菌介导的遗传转化方法获得NtTPKa基因的RNAi植株，对NtTPKa进行功能验证，结果表明NtTPKa基因具有提高烟草钾含量的功能。NtTPKa基因的发现，为通过调控基因的表达获得钾含量提高的烟草提供了基因资源。
附图说明
图1为利用引物对TPKa-KD-F/TPKa-KD-R扩增NtTPKa基因RNAi片段产物琼脂糖凝胶电泳图，扩增产物大小为305bp，M：DL2000，1：RNAi片段；
图2为RNAi片段连接载体TOPO后（pTOPO-NtTPKaRNAi），利用BamHI和XhoI进行酶切鉴定，切出305bp和3500bp左右两条片段，M：DL2000，1-3：酶切检测正确的质粒；
图3为TPKa RNAi片段连接入门克隆载体pENTR™2B后，利用BamHI和XhoI进行酶切鉴定，切出305bp和3800bp两条片段，M：DL2000，1-3：酶切检测正确的质粒；
图4为RNAi载体pK7GWIWG2-NtTPKa的PCR鉴定。A为引物T35SF1/P35SR1质粒PCR检测pK7GWIWG2-NtTPKa，M:DL2000，箭头所示为正确的质粒PCR产物；B为引物IntronF2/P35SR2质粒PCR检测pK7GWIWG2-NtTPKa，M:DL2000，箭头所示为正确的质粒PCR产物；
图5为NtTPKa RNAi植株T1代株系qPCR分析，TPK-KD-6，TPK-KD-19为转基因株系，VC为转空载体对照；
图6为转基因烟草株系T1代植株中部烟叶钾含量，TPK-KD-6，TPK-KD-19为转基因株系，VC为转空载体对照，*表示在0.05水平上与对照差异显著，**表示在0.01水平上与对照差异显著。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1所示。
本发明所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa的克隆方法，包括以下步骤：
A、确定NtTPKa基因序列；
根据水稻AtTPK1基因的蛋白序列搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtTPKa序列，利用此序列设计基因克隆引物：
正向引物：NtTPKaF：ATGGATAAAGGTGATGTTGAAC
反向引物：NtTPKaR：TCAGATTTTCGATCGAGACGA
B、提取烟草叶组织RNA，反转录得到第一链cDNA；
C、以反转录得到的第一链cDNA作为模板，用引物NtTPKaF/NtTPKaR进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；
D、纯化产物与载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL saltsolution、1μL PCR®-BluntⅡ-TOPO（Invitrogen）混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测，筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。
C步骤中PCR扩增的反应体系是选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10μL，10mM dNTP 1μL，2U的Phusion®High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。
C步骤中PCR扩增的反应条件是在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，58℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；
本发明所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa的RNAi载体为pK7GWIW2-NtTPKa。
本发明所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa的应用为所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa用于获得叶片钾含量提高的转基因烟草中的应用。
用于获得叶片钾含量提高的转基因植株的方法包括以下步骤：
A、RNAi载体构建：
a、以PCR®-BluntII-TOPO载体为中间载体、pK7GW1WG2为表达载体骨架构建NtTPKa基因的RNAi 载体，构建引物为：
TPKa-KD-F：5’-GGATCCGGCATGGCTCTTGTTGGATT-3’
TPKa-KD-R：5’-CTCGAGGTCGAAAAGCTCTTATCGCCA-3’
TPKa-KD-F中GGTACC处为BamHI I酶切位点，TPKa-KD-R中CTCGAG处为Xho I酶切位点；
b、以含NtTPKa基因阳性克隆TOPO质粒DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体积为50μL，包括：200ng DNA，5×Phusion HF反应缓冲液10μL，10mM dNTP 1μL，2U的Phusion®High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的TPKa-KD-F引物、TPKa-KD-R引物各1μL，补水至50μL；PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，55℃，30秒，72℃，20秒，30个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化PCR产物；
c、回收目的片段产物与TOPO载体连接：通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下：4μL PCR纯化产物、1μL salt solution、1μL PCR®-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min，将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌，添加培养基震荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序；
d、入门载体pENTRTM2B-NtTPKaRNAi的构建：用上步测序对的TOPO质粒和pENTRTM2B空载体做酶切反应：BamH I/Xho I双酶切TOPO质粒和pENTRTM2B-ccdB得到目的基因片段和载体片段pENTRTM2B，切胶回收后进行连接，连接反应如下：连接反应总体积为10μL，含酶切目的片段的切胶回收产物4μL，pENTRTM2B（BamH I+Xho I双酶切）载体1μL，10×T4 buffer1μL，T4 Ligase 1μL，灭菌双蒸水3μL，混匀，室温反应2小时，转化大肠杆菌感受态细胞，添加培养基震荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，提取质粒进行PCR检测和酶切检测，以验证含目的基因片段的入门载体是否构建成功；
e、通过LR反应得到植物表达载体：挑选检测正确的入门载体与植物表达载体pK7GW1WG2(Destination clone)进行LR反应，具体反应如下：
反应体系：构建成功的入门载体(50-150ng)1-7μL，0.5μL Destination Vector，TE Buffer至总体积8μL；
1）上述体系混匀，冰浴2min，轻弹2次；
2）加入2μL LR CloneaseTMⅡ enzyme Mix，轻弹，混匀，离心，25℃水浴1h；
3）加入1μL Proteinase K轻弹，混匀，37℃水浴10min；
通过热激转化大肠杆菌，加入培养基震荡培养后涂布至含100mg/L壮观霉素的LB平板上过夜培养，挑菌提质粒后，以载体质粒DNA为模板，使用以下两对引物（T35SF1/P35SR1、IntronF2/P35SR2）进行PCR检测，
T35SF1：5’-AGGTCACTGGATTTTGGTTTTA-3’
P35SR1：5’-CTATCGTTCAAGATGCCTCTGC-3’
Intron-F2：5’-ATTGGTGGCTCAAATCATAGAA-3’
P35S-R2：5’-AGGACAGTAGAAAAGGAAGGTG-3’
使用LA taq体系进行扩增，反应体系包括：200ng质粒DNA，10×LA反应缓冲液5μL，10mM dNTP 1μL，2U的LA taq DNA Polymerase，10μM正反向引物各1μL，补水至50μL，PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：94℃，5分钟；94℃，30秒，55℃，30秒，72℃，2分钟，35个循环；72℃延伸7分钟；检测重组质粒的正确性，理论上由T35SF1/P35SR1引物扩增的片段大小为1.7kb，由IntronF2/P35SR2引物扩增的片段大小为750bp，同时满足两个条件，则表明表达载体构建成功，进一步对构建正确的表达载体进行测序验证；
B、农杆菌转化：
从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞，放置冰上溶解后加入重组表达载体pK7GWIWG2-NtTPKa 4μL；液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟，再冰浴2分钟，向混合物中加入1mL LB液体培养基，28℃、220rpm培养3~4小时；培养物涂布于含有壮观霉素100mg/L和利福平25mg/L的LB固体培养基上，28℃倒置培养2~3天，可见含有目标载体的农杆菌克隆;
C、RNAi载体导入烟草、培养转基因植株：
a、挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有壮观霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2~3天；刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的MS培养基中，28℃，220rpm震荡培养，菌液浓度达到OD=0.5~0.8时进行侵染；
b、将烟草叶片置于500mL广口瓶中，加入适量75%乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入0.1%的HgCl2溶液，置摇床上室温振荡15~30分钟；弃溶液，用无菌水冲洗6遍；
c、将烟草叶片取出，用无菌吸水纸洗去表面液体，取无菌叶片用剪刀切成1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的无菌MS液体培养基悬浮菌液中，静置15~20min；取出烟草叶片，用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-BA（0.02mg/L）、NAA（2mg/L）的MS培养基中25℃暗培养两天；将烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，分化培养基为含有6-BA（0.5mg/L）、NAA（0.1mg/L）、卡那霉素(100mg/L)、头孢霉素(500mg/L)的MS培养基，每2~3周继代一次，切口处逐渐形成愈伤组织，最后分化出芽；
d、将长至3~5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，生根后的转基因植株由生根培养基中取出，用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中；
e、转基因植株经NPTII基因特异引物进行PCR验证，鉴定转基因阳性植株。
本发明所述的提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa的RNAi转基因烟草中钾含量比对照提高20%以上。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa的克隆
A、确定NtTPKa基因序列；
根据水稻AtTPK1基因的蛋白序列搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtTPKa序列，利用此序列设计基因克隆引物：
正向引物：NtTPKaF：ATGGATAAAGGTGATGTTGAAC
反向引物：NtTPKaR：TCAGATTTTCGATCGAGACGA
B、提取烟草叶组织RNA，反转录得到第一链cDNA；
C、以反转录得到的第一链cDNA作为模板，用引物NtTPKaF/NtTPKaR进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；
D、纯化产物与载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL saltsolution、1μL PCR®-BluntⅡ-TOPO（Invitrogen）混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测，筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。
C步骤中PCR扩增的反应体系是选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10μL，10mM dNTP 1μL，2U的Phusion®High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。
C步骤中PCR扩增的反应条件是在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，55℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；
实施例2
烟草钾转运体基因NtTPKa RNAi转基因植株的获得
A、RNAi载体构建：
a、以PCR®-BluntII-TOPO载体为中间载体、pK7GW1WG2为表达载体骨架构建NtTPKa基因的RNAi载体，构建引物为：
TPKa-KD-F：5’-GGATCCGGCATGGCTCTTGTTGGATT-3’
TPKa-KD-R：5’-CTCGAGGTCGAAAAGCTCTTATCGCCA-3’
TPKa-KD-F中GGTACC处为BamHI I酶切位点，TPKa-KD-R中CTCGAG处为Xho I酶切位点；
b、以含有NtTPKa的阳性克隆TOPO质粒DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体积为50μL，包括：200ng DNA，5×Phusion HF反应缓冲液10μL，10mM dNTP 1μL，2U的Phusion®High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的TPKa-KD-F引物、TPKa-KD-R引物各1μL，补水至50μL。PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，55℃，30秒，72℃，20秒，30个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化PCR产物；
c、回收目的片段产物与TOPO载体连接：通过试剂盒反应与TOPO载体连接。连接体系与过程如下：4μL PCR纯化产物、1μL salt solution、1μL PCR®-BluntⅡ-TOPO 混匀，25℃，水浴30min。将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌，添加培养基震荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序；
d、入门载体pENTRTM2B-NtTPKaRNAi的构建：用上步测序对的TOPO质粒和pENTRTM2B空载体做酶切反应：BamH I/Xho I双酶切TOPO质粒和pENTRTM2B-ccdB得到目的基因片段和载体片段pENTRTM2B，切胶回收后进行连接。连接反应如下：连接反应总体积为10μL，含酶切目的片段的切胶回收产物4μL，pENTRTM2B（BamH I+Xho I双酶切）载体1μL，10×T4 buffer1μL，T4 Ligase 1μL，灭菌双蒸水3μL，混匀，室温反应2小时，转化大肠杆菌感受态细胞，添加培养基震荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，提取质粒进行PCR检测和酶切检测，以验证含目的基因片段的入门载体是否构建成功。
e、通过LR反应得到植物表达载体：挑选检测正确的入门载体与植物表达载体pK7GW1WG2(Destination clone)进行LR反应，具体反应如下：
反应体系：构建成功的入门载体(50-150ng)1-7μL，0.5μL Destination Vector，TE Buffer至总体积8μL；
1）上述体系混匀，冰浴2min，轻弹2次；
2）加入2μL LR CloneaseTMⅡ enzyme Mix，轻弹，混匀，离心，25℃水浴1h；
3）加入1μL Proteinase K轻弹，混匀，37℃水浴10min；
通过热激转化大肠杆菌，加入培养基震荡培养后涂布至含100mg/L壮观霉素的LB平板上过夜培养，挑菌提质粒后，以载体质粒DNA为模板，使用以下两对引物（T35SF1/P35SR1、IntronF2/P35SR2）进行PCR检测，
T35SF1：5’-AGGTCACTGGATTTTGGTTTTA-3’
P35SR1：5’-CTATCGTTCAAGATGCCTCTGC-3’
Intron-F2：5’-ATTGGTGGCTCAAATCATAGAA-3’
P35S-R2：5’-AGGACAGTAGAAAAGGAAGGTG-3’
使用LA taq体系进行扩增，反应体系包括：200ng质粒DNA，10×LA反应缓冲液5μL，10mM dNTP 1μL，2U的LA taq DNA Polymerase，10μM正反向引物各1μL，补水至50μL，PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：94℃，5分钟；94℃，30秒，55℃，30秒，72℃，2分钟，35个循环；72℃延伸7分钟；检测重组质粒的正确性，理论上由T35SF1/P35SR1引物扩增的片段大小为1.7kb，由IntronF2/P35SR2引物扩增的片段大小为750bp，同时满足两个条件，则表明表达载体构建成功，进一步对构建正确的表达载体进行测序验证；
B、农杆菌转化：
从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞，放置冰上溶解后加入重组表达载体pK7GWIWG2-NtTPKa 4μL；液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟，再冰浴2分钟，向混合物中加入1mL LB液体培养基，28℃、220rpm培养3~4小时；培养物涂布于含有壮观霉素100mg/L和利福平25mg/L的LB固体培养基上，28℃倒置培养2~3天，可见含有目标载体的农杆菌克隆;
C、RNAi载体导入烟草、培养转基因植株：
a、挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有壮观霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2~3天；刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的MS培养基中，28℃，220rpm震荡培养，菌液浓度达到OD=0.5~0.8时进行侵染；
b、将烟草叶片置于500mL广口瓶中，加入适量75%乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入0.1%的HgCl2溶液，置摇床上室温振荡15~30分钟；弃溶液，用无菌水冲洗6遍；
c、将烟草叶片取出，用无菌吸水纸洗去表面液体，取无菌叶片用剪刀切成1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的无菌MS液体培养基悬浮菌液中，静置15~20min；取出烟草叶片，用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-BA（0.02mg/L）、NAA（2mg/L）的MS培养基中25℃暗培养两天；将烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，分化培养基为含有6-BA（0.5mg/L）、NAA（0.1mg/L）、卡那霉素（100mg/L）、头孢霉素（500mg/L）的MS培养基，每2~3周继代一次，切口处逐渐形成愈伤组织，最后分化出芽；
d、将长至3~5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，生根后的转基因植株由生根培养基中取出，用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中；
e、转基因植株经NPTII基因特异引物（NPTII-F:TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA，NPTII-R:AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG)进行PCR验证，鉴定转基因阳性植株。
实施例3
烟草NtTPKa RNAi转基因株系钾含量检测
温室盆栽种植目标基因表达显著降低的转基因株系TPK-KD-6，TPK-KD-19及转空载体对照VC的T1代（图5）。每株按5g纯氮使用烟草专用复合肥（氮:磷:钾=10:10:15），分5次施入。现蕾期取中部叶（9-12位叶），杀青后检测钾含量，结果见图6，转基因株系钾含量比对照提高20%以上。表明通过抑制NtTPKa基因的表达可以获得烟叶钾含量提高的烟草。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省烟草农业科学研究院
<120> 一种提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa及其克隆方法与应用
<130> 2018
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1062
<212> DNA
<213> 基因NtTPKa的核苷酸序列
<400> 1
atggataaag gtgatgttga acaacctcta ctacgaagcc atgtaaattc tttgattcgt 60
tttagtgata taaactcttt caagagaagg cgaacacaat cgagcagcag tactggtaat 120
atcagtcata taccacagaa aaataatgag gaactgtttc attcctctga gttcattgca 180
acagagagat ttagactcag gtctgtgctc ttgtttttgt ctgtctatat aggaatcgga 240
gcgatttgct tcttcataat cagggatcaa atcgaaggaa aaaagactaa tggaattctt 300
gatgcaatat acttgtgtat tgttacaatg actactgttg gatatggtga tcttgtacct 360
aaaagcatct tagctaagct actcgcgtgt attttcgtct tcacgggcat ggctcttgtt 420
ggatttgttc taagtaaagc agcagatagt tttcttgaga ggcagcaaat cttgtttctc 480
aaagccataa acatgaggaa aaattatagc aattcaaatg aggtgttaca agaggttgaa 540
acgaacatcg aaaagtacaa gtttttaagt gcattggcac ttcttgtgat gtttactata 600
cttggaacaa tttttttaaa tcaagttgag gatctgagtt tatttgatgc tttttattgt 660
gtttgtgcta ccattactac tctgggatat ggcgataaga gcttttcgac aaaatggggg 720
cgtttgttcg cgtctttctg gatactgttg agcacgattt gtttgggtca gttgttttac 780
tcccttgctg aattatacac agaacaaagg cgaaaatcta tgttcagatg ggttctaact 840
cgagagttga caaattcaga cctgcaggca gcagatcttg atcatgacag tgaagtcagt 900
gctgcagaat ttattgtcta taaacttaaa gagttgggga agataactga ggaagatatc 960
tctgtagtaa tggagagctt caaaatgctt gatgttgatc attctggcac attgactgaa 1020
aaagatattg cattattaca ctcgtctcga tcgaaaatct ga 1062
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> NtTPKaF
<400> 2
atggataaag gtgatgttga ac 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> NtTPKaR
<400> 3
tcagattttc gatcgagacg a 21
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> TPKa-KD-F
<400> 4
ggatccggca tggctcttgt tggatt 26
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> TPKa-KD-R
<400> 5
ctcgaggtcg aaaagctctt atcgcca 27
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> T35SF1
<400> 6
aggtcactgg attttggttt ta 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> P35SR1
<400> 7
ctatcgttca agatgcctct gc 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Intron-F2
<400> 8
attggtggct caaatcatag aa 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> P35S-R2
<400> 9
aggacagtag aaaaggaagg tg 22

Claims (4)

1.一种提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa的应用，所述提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其特征在于，所述提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa用于获得叶片钾含量提高的转基因烟草。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，提高烟草叶片钾含量的基因NtTPKa的克隆方法包括以下步骤：
A、确定NtTPKa基因序列；
根据水稻AtTPK1基因的蛋白序列搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtTPKa序列，利用此序列设计基因克隆引物：
正向引物：NtTPKaF：ATGGATAAAGGTGATGTTGAAC；
反向引物：NtTPKaR：TCAGATTTTCGATCGAGACGA；
B、提取烟草叶组织RNA，反转录得到第一链cDNA；
C、以反转录得到的第一链cDNA作为模板，用引物NtTPKaF/NtTPKaR进行PCR扩增，回收和纯化PCR产物；
D、纯化产物与载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL salt solution、1μLPCR®-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连接好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测，筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，C步骤中PCR扩增的反应体系是选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10μL，10mM dNTP 1μL，2U的Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，C步骤中PCR扩增的反应条件是在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，58℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟。
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