CN107365775B - 一种烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2及其克隆方法与应用 - Google Patents

一种烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2及其克隆方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种烟草腋芽生长调控基因NtMAX3‑2及其克隆方法与应用，烟草腋芽生长调控基因NtMAX3‑2核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。本发明还公开了烟草腋芽生长调控基因NtMAX3‑2的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtMAX3‑2基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtMAX3‑2基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。通过调控烟草腋芽生长调控基因NtMAX3‑2的表达，可抑制打顶后烟草腋芽的形成，从而有望降低烟用抑芽剂使用，为生产绿色优质烟叶和降低人工成本提供基因资源。

Description

一种烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2及其克隆方法与应用
技术领域
本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2及其克隆方法与应用。
背景技术
烟草（Nicotianatabacum）是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物。打顶抹芽是优质烤烟种植过程中一项重要的生产技术措施。烟草在一定的生长时期必须打顶，而打顶后会萌生大量的侧芽。侧芽耗费营养，会降低烟叶的品质和产量，因此必须抹掉侧芽。人工抹芽耗费人力和物力，增加烟叶生产成本；打顶后施用化学药剂可抑制腋芽生长，降低烟叶生产劳动强度，但化学药剂需要成本，且会造成环境污染。以发现打顶后产生侧芽（腋芽）的相关基因为突破口，通过生物技术创建无侧芽、少侧芽或小侧芽的烟草，则有可能从根本上或大幅度解决上述问题，从而实现 烟草生长量、烟叶品质、环保等方面均有较大提升和改善。
MAX3是独脚金内酯合成途径基因。其在控制分枝生长中的功能已有报道，拟南芥MAX3基因突变后分枝增加。我们对烟草NtMAX3-2基因也进行了广泛理论研究和应用实践，发现过表达NtMAX3-2在烟草打顶后具有抑制侧芽（腋芽）形成的功能。通过植物基因工程技术控制烟草腋芽形成具有生产应用重要意义。
国际上一些知名烟草公司和研究机构正采用生物技术对烟草无腋芽、少腋芽品种进行研究，以提高烟草品质，减少对烟草打顶后化学药剂的施用，以降低烟叶生产劳动强度、化学药剂成本和环境污染。目前，我国也提出了无腋芽优质烟的开发计划，为烟草无腋芽、少腋芽品种研究提供了契机。随着烟草无腋芽、少腋芽品种研究的深入，必将使我国烟草腋芽控制迈上新台阶，为我国烟叶的健康和可持续发展奠定基础。因此，开发一种调控腋芽生长的候选基因，通过基因操作减少烟草腋芽是非常必要的。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2；第二目的在于提供所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：
A、确定NtMAX3-2基因序列；
（1）根据拟南芥MAX3基因（GenBank登录号(NM_130064.4)的蛋白质序列，搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtMAX3-2序列。利用此序列设计基因克隆引物：
正向引物：5’-GGTACCATGCAGGCCAAAGCTTGCCA-3’；
反向引物：5’-CTCGAGCTACCTTGAGTTTTTTGAG-3’；
B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；
C、根据NtMAX3-2基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ngcDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10μL，10mMdNTP 1μL，2U的Phusion® High-Fidelity DNAPolymerase，1μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。 PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，57℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化PCR产物；
D、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL salt solution、1μL PCR®-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。
本发明的第三目的是这样实现的，所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2在用于获得打顶后烟草产生腋芽的长度和重量显著降低的转基因植株中的应用。
本发明利用同源克隆技术从烟草中得到一个烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2，具体步骤为：根据拟南芥MAX3基因（GenBank登录号(NM_130064.4)的蛋白质序列，搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtMAX3-2序列。利用此序列信息设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtMAX3-2基因序列；利用农杆菌介导的遗传转化方法获得NtMAX3-2基因的过表达（OE）植株，对NtMAX3-2进行功能鉴定，结果表明NtMAX3-2基因具有抑制烟草腋芽形成的功能。NtMAX3-2基因的发现，为通过调控基因的表达抑制打顶后烟草腋芽的形成提供了基因资源。
附图说明
图1为中间载体pTOPO-NTMAX3-2的构建；
其中：A为利用引物对NtMAX3-2F/NtMAX3-2R扩增NtMAX3-2基因结果，M: DL2,000DNA Marker，1～2:PCR扩增产物；B为pTOPO-NTMAX3-2质粒PCR电泳检测，M: DL2,000 DNAMarker，1、4～5:PCR扩增产物；C为Kpn I＋Xho I双酶切检测pTOPO-NTMAX3-2质粒，M: DL2,000，1～3:酶切产物；
图2为入门克隆pENTR™2B-NTMAX3-2的构建；
其中：A为pENTR™2B-NTMAX3-2质粒PCR电泳检测, M: DL2,000 DNA Marker，1～5:PCR扩增产物；B为Kpn I＋Xho I双酶切检测pENTR™2B-NTMAX3-2质粒，M:DL2,000，3～5:酶切产物；
图3为植物表达载体pK2-NTMAX3-2的构建，pK2-NTMAX3-2质粒PCR电泳检测，M:DL2,000 DNA Marker，1～2:PCR扩增产物；
图4为菌落PCR检测pK2-NTMAX3-2的农杆菌转化效果；
图5为NtMAX3-2T1代过表达株系基因表达水平分析；
图6为NtMAX3-2T1代过表达株系腋芽重量分析；
图7为NtMAX3-2T1代过表达株系腋芽长度分析；
图8为NtMAX3-2T2代过表达株系腋芽重量分析。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的克隆方法，包括以下步骤：
A、确定NtMAX3-2基因序列；
（1）根据拟南芥MAX3基因（GenBank登录号(NM_130064.4)的蛋白质序列，搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtMAX3-2序列。利用此序列设计基因克隆引物：
正向引物：5’-GGTACCATGCAGGCCAAAGCTTGCCA-3’；
反向引物：5’-CTCGAGCTACCTTGAGTTTTTTGAG-3’；
B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；
C、根据NtMAX3-2基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ngcDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10μL，10mMdNTP 1μL，2U的Phusion® High-Fidelity DNAPolymerase，1μM的正反向引物各1μL，补水至50μL。 PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，57℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化PCR产物；
D、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL salt solution、1μL PCR®-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L 卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测。筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。
C步骤中所述的特异性引物为：
正向引物：5’-GGTACCATGCAGGCCAAAGCTTGCCA-3’；
反向引物：5’-CTCGAGCTACCTTGAGTTTTTTGAG-3’。
D步骤中所述的培养基配方及制备方法是称取胰蛋白胨8~12g，酵母提取物5g，NaCl 10g溶解于1L蒸馏水中，121℃灭菌25min得到。
本发明所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的应用为所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2在用于获得打顶后烟草产生腋芽的长度和重量显著降低的转基因植株中的应用。
所述获得的NtMAX3-2过表达的转基因烟草的方法包括以下步骤：
A、中间载体pTOPO-NTMAX3-2的构建
（1）以云烟87根的cDNA为模板，利用NtMAX3-2基因特异引物进行扩增，得到大小约为2kb的基因片段；
（2）将回收的NtMAX3-2基因片段进行TOPO克隆，连接到PCR®-BluntⅡ-TOPO（3.5kb）载体后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，提取质粒进行PCR检测，扩增产物大小约为2kb，和预期相符，说明pTOPO-NTMAX3-2构建成功；
（3）由于基因上下游引物分别带有Kpn I、Xho I的识别位点，因此选择这两个酶对部分质粒样品进行双酶切检测，酶切结果产生两条片段，大小分别为3.5kb和2kb左右，说明目的片段已插入pTOPO载体；
B、植物过表达载体的构建
a、入门克隆pENTR™2B-NTMAX3-2的构建
（1）Kpn I +Xho I酶切pTOPO-NTMAX3-2和pENTR™2B-ccdB得到目的基因片段NTMAX3-2和载体片段pENTR™2B，胶回收后进行连接、转化感受态细胞DH5a；
（2）以pENTR™2B-NTMAX3-2为模板，PCR扩增检测重组质粒的正确性；
（3）Kpn I +Xho I双酶切pENTR™2B-NTMAX3-2，片段大小理论上为2.5kb的载体片段和2kb左右的NtMAX3-2目的片段，从图2中可以看出酶切结果和预期一致，表明目的基因已插入载体片段；
b、通过LR反应得到植物表达载体
（1）入门克隆pENTR™2B-NTMAX3-2（Entry clone）和pK2GW7(Destination clone)LR反应后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，得到植物表达载体pK2-NTMAX3-2，以pK2-NTMAX3-2为模板，上游引物为5’-ATGCAGGCCAAAGCTTGCCA-3’,下游引物为5’-CTACCTTGAGTTTTTTGAG-3’，进行PCR扩增，检测重组质粒的正确性；从图3中可以看出质粒PCR检测结果和预期一致，表明目的基因已插入载体片段。
C、烟草的遗传转化
采用冻融法转化质粒pK2-NTMAX3-2进入农杆菌C58C1感受态细胞，涂布在含壮观霉素和利福平的LB平板上28℃生长两天后，进行菌落PCR检测，检测结果呈阳性，表明重组质粒pK2-NTMAX3-2已转入农杆菌；
D、过表达（OE）载体导入烟草、培养转基因植株：
a、挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有壮观霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2~3天；刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的MS培养基中，28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD=0.5~0.8时6,000rpm离心5分钟富集菌体，弃上清，再用20mL液体MS培养基重悬菌体，得到含目标载体的农杆菌悬浮菌液；
b、将烟草叶片置于500mL广口瓶中，加入适量75%乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入0.1%的HgCl2溶液，置摇床上室温振荡15~30分钟；弃HgCl2溶液，用无菌水冲洗6遍；
c、将烟草叶片取出，用无菌吸水纸吸去表面液体，使用剪刀将无菌叶片切成约1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的无菌MS液体培养基悬浮菌液中，静置15~20min；取出烟草叶片，使用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-BA （0.02mg/L）、NAA（2mg/L）的MS培养基中25℃暗培养（暗培养培养基为MS1, 配方为MS+0.02mg/L 6-BA +2mg/L NAA）两天；随后，把烟草叶片转入分化培养基（分化培养基为MS4,配方为：MS+0.5mg/L 6-BA + 0.1mg/L NAA）中，切口接触培养基，于温室条件下分化培养；分化培养基为含有6-BA （0.5mg/L）、NAA （0.1mg/L）、卡那霉素（100mg/L）、头孢霉素（500mg/L）的MS培养基，每2~3周继代培养1次，切口处逐渐长出愈伤组织，最终分化出芽；
d、将长至3~5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，取出生根后的转基因植株用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中；
e、转基因植株经NPTII基因特异引物PCR验证扩增，鉴定转基因阳性植株。
D步骤b中所述的0.1%的HgCl2溶液配制方法为称取升汞0.1克，用酒精溶解，再加水定容至100毫升。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1——NtMAX3-2基因的分离克隆
根据拟南芥MAX3基因（GenBank登录号(NM_130064.4)的蛋白质序列，搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtMAX3-2序列。根据该序列设计克隆基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtMAX3-2基因序列；其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码651个氨基酸，如序列表SEQIDNO.2所示。
提取云烟87根部RNA，抽提使用Trizol试剂盒（Invitrogen,按该试剂盒提供的说明书操作）。
取2μg RNA进行反转录，利用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（TAKARA）试剂盒进行基因组DNA去除并反转录（按试剂盒操作手册操作）。
将反转录得到的第一链cDNA作为模板，用于PCR扩增NtMAX3-2基因全长，并设计特性行引物如下：
正向引物：NtMAX3-2F：5’-GGTACCATGCAGGCCAAAGCTTGCCA-3’；
反向引物：NtMAX3-2R：5’-CTCGAGCTACCTTGAGTTTTTTGAG-3’。
PCR反应体系为50μL，包括：200ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10μL，10mMdNTP 1μL，2U的Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase，10μM的上述引物各1μL，补水至50μL。PCR反应在Mastercycler® pro（Eppendorf，德国）扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，57℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟。
产物经1%（g/mL）的琼脂糖凝胶电泳分离，扩增结果产生一条单一PCR条带，见图1。用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN，德国）回收扩增条带，提取步骤参照试剂盒使用说明。回收纯化的DNA与TOPO载体（Invitrogen ZERO BluntII-TOPO -PCR Cloning kit）连接，按说明书操作。连接产物利用热激法转化大肠杆菌DH5a，在含有100mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个克隆测序（大连宝生物工程有限公司）。
测序结果表明该基因核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，通过测序、比对确定是本发明需要的目的基因，申请人将该基因命名为NtMAX3-2。NtMAX3-2基因包括1956bp的开放阅读框；编码651个氨基酸。
实施例2——过表达（OE）载体构建
a、中间载体pTOPO-NTMAX3-2的构建
（1）以云烟87cDNA为模板，利用NtMAX3-2基因特异引物进行扩增，得到大小约为2kb的基因片段(图1A)。
（2）将回收的NtMAX3-2基因片段进行TOPO克隆，连接到PCR®-Blunt II-TOPO（3.5kb）载体后转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒进行PCR检测（图1B）扩增产物大小约为2kb，和理论预期相符，说明pTOPO-NTMAX3-2构建成功。
（3）由于基因上下游引物分别带有Kpn I、Xho I的识别位点，因此选择这两个酶对部分质粒样品进行双酶切检测，酶切结果产生两条片段，大小分别为3.5kb和2kb左右，这和图1C结果一致，说明目的片段已插入pTOPO载体。
b、入门克隆pENTR™2B-NTMAX3-2的构建
（1）Kpn I +Xho I酶切pTOPO-NTMAX3-2和pENTR™2B-ccdB得到目的基因片段NTMAX3-2和载体片段pENTR™2B，胶回收后进行连接、转化感受态细胞DH5a。
（2）以pENTR™2B-NTMAX3-2为模板，PCR扩增检测重组质粒的正确性。
（3）Kpn I +Xho I双酶切pENTR™2B-NTMAX3-2（图2），片段大小理论上为2.5kb的载体片段和2kb左右的NtMAX3-2目的片段，从图中可以看出酶切结果和预期一致，表明目的基因已插入载体片段。
c、通过LR反应得到植物表达载体
入门克隆pENTR™2B-NTMAX3-2（Entry clone）和pK2GW7(Destination clone) LR反应后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，得到植物表达载体pK2-NTMAX3-2。以pK2-NTMAX3-2为模板，上游引物为5’-ATGCAGGCCAAAGCTTGCCA-3’,下游引物为5’-CTACCTTGAGTTTTTTGAG-3’进行PCR扩增，检测重组质粒的正确性（图3）。从图中可以看出质粒PCR检测结果和预期一致，表明目的基因已插入载体片段。
实施例3 ——烟草的遗传转化
（1）表达载体转化农杆菌
从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞，放置冰上溶解后加入重组表达载体PK2G7- NTMAX3-2 4μL；液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟，再冰浴2分钟，向混合物中加入1mL LB液体培养基，28℃、220rpm培养3~4小时；培养物涂布于含有壮观霉素100mg/L和利福平25mg/L的LB固体培养基上，28℃倒置培养2~3天，可见含有目的载体的农杆菌克隆；
（2）烟草转化
a、挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有壮观霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2~3天；刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的MS培养基中，28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD=0.5~0.8时6,000rpm离心5分钟富集菌体，弃上清，再用20mL液体MS培养基重悬菌体，得到含目标载体的农杆菌悬浮菌液；
b、将烟草叶片置于500mL广口瓶中，加入适量75%乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入0.1%的HgCl2溶液，置摇床上室温振荡15~30分钟；弃HgCl2溶液，用无菌水冲洗6遍；
c、将烟草叶片取出，用无菌吸水纸吸去表面液体，使用剪刀将无菌叶片切成约1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的无菌MS液体培养基悬浮菌液中，静置15~20min；取出烟草叶片，使用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-BA （0.02mg/L）、NAA（2mg/L）的MS培养基中25℃暗培养两天；随后，把烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，于温室条件下分化培养；分化培养基为含有6-BA （0.5mg/L）、NAA （0.1mg/L）、卡那霉素（100mg/L）、头孢霉素（500mg/L）的MS培养基，每2~3周继代培养1次，切口处逐渐长出愈伤组织，最终分化出芽；
d、将长至3~5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，取出生根后的转基因植株用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中；
e、转基因植株经NPTII基因特异引物PCR验证扩增，鉴定转基因阳性植株。
实施例4 ——转基因植株分析
T1代转基因株系提取总RNA，利用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit反转录试剂盒合成cDNA作为模板进行实时荧光定量PCR分析，获得过表达（OE）株系进行表型分析（图5）。T1代和T2代转基因株系实验结果表明，NtMAX3-2基因过表达株系第1茎节处腋芽长度、重量与对照相比显著下降，（图6、图7、图8），表明NtMAX3-2基因抑制腋芽形成。
SEQUENCE LISTING
<110>云南省烟草农业科学研究院
<120>一种烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2及其克隆方法与应用
<130> 2017
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1956
<212> DNA
<213>NtMAX3-2的核苷酸序列
<400> 1
atgcaggcca aagcttgcca taatattatt cctccaaaac ttctgccacc agcaaagttg 60
ccgtccacgg cgagccacat aacattgcca agccacgtac cacgagccat aacaataact 120
acatcaccaa ctcatgaagt ttatacacca gtaccagaaa ttgatgatac aattactgcc 180
ttttgggatt atcaattcct ttttgtgtcc caacgttcag aagccactga acccatcacc 240
cttcgggtcg ttgagggcgc cataccgacc gattttccct cggggaagta ttatctcacc 300
gggccgggcc ttttcgccga tgatcatggg tccacagtgc accctttaga tggccatggt 360
tacctaagga catttgaaat agatggtggt tcaggtcagg ttaagttcat ggctaggtac 420
attgagacgg aggctcaggc cgaggaacgg gacccagtga ccgggaaatg gcggttcact 480
caccggggcc cgttttcggt cctgaaaggt gggaagatgg ttggtaacac taaggttatg 540
aagaatgtgg ctaatactag tgtgttacaa tggggtggta ggttgttttg cttgtgggaa 600
ggtggtgatc cttatgagat tgattctaag actttgaaga ctgttgggaa atttgagctc 660
atcaacaaca actgcaaatc attagcagaa caaaaaaaac taattaatgg tgattttttg 720
gatgttgcag ctcaaatctt gaaacccata ttatatgggg tatttaagat gcctccaaag 780
agattgttgt cccattacaa gattgatgct cgtagaaaca gacttttgat cgcgtcatgc 840
aacgcagagg atatgttact ccctcggagt aattttacat tttacgaatt tgattccaac 900
ttccagctgc tgcaaagcca ggaattcgac ataccagacc acttaatgat ccatgattgg 960
gcttttacag atactcacta catattgttt ggaaatcgta tcaagctgga tattcctggg 1020
tcaatgacag cagtatgtgg attgtcgcca atgatatctg cattatcagt aaatccaagc 1080
aaagcaacat ctcccattta tttgctgccc agattttctg atcacaatca aaccaataat 1140
attgtacaga gagactggag aaaacctata gaagcaccta cacaaatgtg ggtgttacat 1200
gttggaaatg cctttgaaga aaaagatgag aatggaaatg taaatataca aattcaggct 1260
tctggttgct cttatcaatg gttcaatttc cagaaaatgt ttggctacga ttggcaaagt 1320
ggcaaacttg atccttcaat gatgaatgta gaagaaggag aagaaaagct actgccgcac 1380
ttagttcagg tatccataag cttggataca aatgggaatt gcacaagaag ttcagtaaat 1440
gacctaaaca ctcagtggaa taaagctgca gatttccctg ccatgaatcc agactattct 1500
ggcaagaaaa atgaatatgt ttatgcagca acttcttctg gttctcgcca agcactgcca 1560
cattttccct ttgacacagt tgtgaaacta aatactgctg ataaatcagt ccgtaagtgg 1620
tcagctggta gaaggagatt cattggcgaa cctgttttta tcccaagagg aattacagaa 1680
gatgatggat accttcttgt ggttgaatat gcagtgtcag cacaaaggtg ctatcttgta 1740
attttggatg cacaaataat tggagagaag aatgaagtgg ttgcaagact tgaagtccca 1800
agacatttga atttcccact tggttttcat ggcttttggg ctcctagcaa cactggccaa 1860
gggaatttac caaattttga atccaaatgc aaagattctt ggtcaatgct ggaggataac 1920
atggttaatc ttgggaactc aaaaaactca aggtag 1956
<210> 2
<211> 651
<212> PRT
<213>NtMAX3-2编码的氨基酸序列
<400> 2
Met Gln Ala Lys Ala Cys His Asn Ile Ile Pro Pro Lys Leu Leu Pro
1 5 10 15
Pro Ala Lys Leu Pro Ser Thr Ala Ser His Ile Thr Leu Pro Ser His
20 25 30
Val Pro Arg Ala Ile Thr Ile Thr Thr Ser Pro Thr His Glu Val Tyr
35 40 45
Thr Pro Val Pro Glu Ile Asp Asp Thr Ile Thr Ala Phe Trp Asp Tyr
50 55 60
Gln Phe Leu Phe Val Ser Gln Arg Ser Glu Ala Thr Glu Pro Ile Thr
65 70 75 80
Leu Arg Val Val Glu Gly Ala Ile Pro Thr Asp Phe Pro Ser Gly Lys
85 90 95
Tyr Tyr Leu Thr Gly Pro Gly Leu Phe Ala Asp Asp His Gly Ser Thr
100 105 110
Val His Pro Leu Asp Gly His Gly Tyr Leu Arg Thr Phe Glu Ile Asp
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gln Val Lys Phe Met Ala Arg Tyr Ile Glu Thr Glu
130 135 140
Ala Gln Ala Glu Glu Arg Asp Pro Val Thr Gly Lys Trp Arg Phe Thr
145 150 155 160
His Arg Gly Pro Phe Ser Val Leu Lys Gly Gly Lys Met Val Gly Asn
165 170 175
Thr Lys Val Met Lys Asn Val Ala Asn Thr Ser Val Leu Gln Trp Gly
180 185 190
Gly Arg Leu Phe Cys Leu Trp Glu Gly Gly Asp Pro Tyr Glu Ile Asp
195 200 205
Ser Lys Thr Leu Lys Thr Val Gly Lys Phe Glu Leu Ile Asn Asn Asn
210 215 220
Cys Lys Ser Leu Ala Glu Gln Lys Lys Leu Ile Asn Gly Asp Phe Leu
225 230 235 240
Asp Val Ala Ala Gln Ile Leu Lys Pro Ile Leu Tyr Gly Val Phe Lys
245 250 255
Met Pro Pro Lys Arg Leu Leu Ser His Tyr Lys Ile Asp Ala Arg Arg
260 265 270
Asn Arg Leu Leu Ile Ala Ser Cys Asn Ala Glu Asp Met Leu Leu Pro
275 280 285
Arg Ser Asn Phe Thr Phe Tyr Glu Phe Asp Ser Asn Phe Gln Leu Leu
290 295 300
Gln Ser Gln Glu Phe Asp Ile Pro Asp His Leu Met Ile His Asp Trp
305 310 315 320
Ala Phe Thr Asp Thr His Tyr Ile Leu Phe Gly Asn Arg Ile Lys Leu
325 330 335
Asp Ile Pro Gly Ser Met Thr Ala Val Cys Gly Leu Ser Pro Met Ile
340 345 350
Ser Ala Leu Ser Val Asn Pro Ser Lys Ala Thr Ser Pro Ile Tyr Leu
355 360 365
Leu Pro Arg Phe Ser Asp His Asn Gln Thr Asn Asn Ile Val Gln Arg
370 375 380
Asp Trp Arg Lys Pro Ile Glu Ala Pro Thr Gln Met Trp Val Leu His
385 390 395 400
Val Gly Asn Ala Phe Glu Glu Lys Asp Glu Asn Gly Asn Val Asn Ile
405 410 415
Gln Ile Gln Ala Ser Gly Cys Ser Tyr Gln Trp Phe Asn Phe Gln Lys
420 425 430
Met Phe Gly Tyr Asp Trp Gln Ser Gly Lys Leu Asp Pro Ser Met Met
435 440 445
Asn Val Glu Glu Gly Glu Glu Lys Leu Leu Pro His Leu Val Gln Val
450 455 460
Ser Ile Ser Leu Asp Thr Asn Gly Asn Cys Thr Arg Ser Ser Val Asn
465 470 475 480
Asp Leu Asn Thr Gln Trp Asn Lys Ala Ala Asp Phe Pro Ala Met Asn
485 490 495
Pro Asp Tyr Ser Gly Lys Lys Asn Glu Tyr Val Tyr Ala Ala Thr Ser
500 505 510
Ser Gly Ser Arg Gln Ala Leu Pro His Phe Pro Phe Asp Thr Val Val
515 520 525
Lys Leu Asn Thr Ala Asp Lys Ser Val Arg Lys Trp Ser Ala Gly Arg
530 535 540
Arg Arg Phe Ile Gly Glu Pro Val Phe Ile Pro Arg Gly Ile Thr Glu
545 550 555 560
Asp Asp Gly Tyr Leu Leu Val Val Glu Tyr Ala Val Ser Ala Gln Arg
565 570 575
Cys Tyr Leu Val Ile Leu Asp Ala Gln Ile Ile Gly Glu Lys Asn Glu
580 585 590
Val Val Ala Arg Leu Glu Val Pro Arg His Leu Asn Phe Pro Leu Gly
595 600 605
Phe His Gly Phe Trp Ala Pro Ser Asn Thr Gly Gln Gly Asn Leu Pro
610 615 620
Asn Phe Glu Ser Lys Cys Lys Asp Ser Trp Ser Met Leu Glu Asp Asn
625 630 635 640
Met Val Asn Leu Gly Asn Ser Lys Asn Ser Arg
645 650
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213>正向引物
<400> 3
ggtaccatgc aggccaaagc ttgcca 26
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213>反向引物
<400> 4
ctcgagctac cttgagtttt ttgag 25

Claims (6)

1.一种烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的应用，其特征在于所述的烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2在用于获得打顶后烟草产生腋芽的长度和重量显著降低的转基因植株中的应用；所述NtMAX3-2过表达转基因烟草的方法包括以下步骤：
A、中间载体pTOPO-NTMAX3-2的构建
（1）以云烟87根的cDNA为模板，利用NtMAX3-2基因特异引物进行扩增，得到大小约为2kb的基因片段；
（2）将回收的NtMAX3-2基因片段进行TOPO克隆，连接到PCR®-BluntⅡ-TOPO载体后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，提取质粒进行PCR检测，扩增产物大小约为2kb，和预期相符，说明pTOPO-NTMAX3-2构建成功；
（3）由于基因上下游引物分别带有KpnI、XhoI的识别位点，因此选择这两个酶对部分质粒样品进行双酶切检测，酶切结果产生两条片段，大小分别为3.5kb和2kb左右，说明目的片段已插入pTOPO载体；
B、植物过表达载体的构建
a、入门克隆pENTR™2B-NTMAX3-2的构建
（1）KpnI +XhoI酶切pTOPO-NTMAX3-2和pENTR™2B-ccdB得到目的基因片段NtMAX3-2和载体片段pENTR™2B，胶回收后进行连接、转化感受态细胞DH5a；
（2）以pENTR™2B-NTMAX3-2为模板，PCR扩增检测重组质粒的正确性；
（3）KpnI +XhoI双酶切pENTR™2B-NTMAX3-2，片段大小理论上为2.5kb的载体片段和2kb左右的NtMAX3-2目的片段，酶切结果和预期一致，表明目的基因已插入载体片段；
b、通过LR反应得到植物表达载体
（1）入门克隆pENTR™2B-NTMAX3-2 Entry clone 和pK2GW7 Destination clone LR反应后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，得到植物表达载体pK2-NTMAX3-2，以pK2-NTMAX3-2为模板，上游引物为5’-ATGCAGGCCAAAGCTTGCCA-3’,下游引物为5’-CTACCTTGAGTTTTTTGAG-3’，进行PCR扩增，检测重组质粒的正确性；
C、烟草的遗传转化
采用冻融法转化质粒pK2-NTMAX3-2进入农杆菌C58C1感受态细胞，涂布在含壮观霉素和利福平的LB平板上28℃生长两天后，进行菌落PCR检测，检测结果呈阳性，表明重组质粒pK2-NTMAX3-2已转入农杆菌；
D、过表达载体导入烟草、培养转基因植株：
a、挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有壮观霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2~3天；刮取划线菌斑接菌于含有壮观霉素和利福平的MS培养基中，28℃，220rpm振荡培养，菌液浓度达到OD=0.5~0.8时6,000rpm离心5分钟富集菌体，弃上清，再用20mL液体MS培养基重悬菌体，得到含目标载体的农杆菌悬浮菌液；
b、将烟草叶片置于500mL广口瓶中，加入适量75%乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入0.1%的HgCl2溶液，置摇床上室温振荡15~30分钟；弃HgCl2溶液，用无菌水冲洗6遍；
c、将烟草叶片取出，用无菌吸水纸吸去表面液体，使用剪刀将无菌叶片切成约1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的无菌MS液体培养基悬浮菌液中，静置15~20min；取出烟草叶片，使用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有0.02mg/L 6-BA、2mg/L NAA的MS培养基中25℃暗培养两天；随后，把烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，于温室条件下分化培养；分化培养基为含有0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、100mg/L卡那霉素、500mg/L头孢霉素的MS培养基，每2~3周继代培养1次，切口处逐渐长出愈伤组织，最终分化出芽；
d、将长至3~5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，取出生根后的转基因植株用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中；
e、转基因植株经NPTII基因特异引物PCR验证扩增，鉴定转基因阳性植株。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述烟草腋芽生长调控基因NtMAX3-2的克隆方法包括以下步骤：
A、确定NtMAX3-2基因序列；
（1）根据拟南芥MAX3基因GenBank登录号NM_130064.4的蛋白质序列，搜索NCBI数据库得到烟草中同源基因NtMAX3-2序列，利用此序列设计基因克隆引物：
正向引物：5’-GGTACCATGCAGGCCAAAGCTTGCCA-3’；
反向引物：5’-CTCGAGCTACCTTGAGTTTTTTGAG-3’；
B、提取烟草根组织RNA，反转录得到第一链cDNA；
C、根据NtMAX3-2基因序列设计合成特异性引物，以反转录得到的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，选用Phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μL，包括：200ngcDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10μL，10mMdNTP 1μL，2U的Phusion® High-Fidelity DNAPolymerase，1μM的正反向引物各1μL，补水至50μL,PCR反应在Mastercycler® pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，57℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化PCR产物；
D、纯化产物与载体连接，通过试剂盒反应与TOPO载体连接，连接体系与过程如下：4μL纯化产物、1μL salt solution、1μL PCR®-BluntⅡ-TOPO混匀，25℃，水浴30min；将连好的载体通过热激转化大肠杆菌DH5a，加液体培养基振荡培养后涂布至含100mg/L卡那霉素的LB平板上过夜培养，挑取菌落进行菌液培养，质粒提取和PCR检测，筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于C步骤中所述的特异性引物为：
正向引物：5’-GGTACCATGCAGGCCAAAGCTTGCCA-3’；
反向引物：5’-CTCGAGCTACCTTGAGTTTTTTGAG-3’。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于D步骤中所述的培养基配方及制备方法是称取胰蛋白胨8~12g，酵母提取物5g，NaCl 10g溶解于1L蒸馏水中，121中灭菌25min得到。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于D步骤b中所述的0.1%的HgCl2溶液配制方法为称取升汞0.1克，用酒精溶解，再加水定容至100毫升。
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