CN101392024A - 水稻分蘖相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻分蘖相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的水稻分蘖相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQID №：3；2)将序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与水稻分蘖相关的蛋白质。本发明中的水稻分蘖相关蛋白及其编码基因对于合理配置水稻植株结构，进一步提高水稻产量具有重要的作用。
Description
本申请是申请号为200510059808.8、申请日为2005年3月31日、发明创造名称为“水稻分蘖相关蛋白及其编码基因与应用”的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种水稻分蘖相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，世界人口的一半以上以稻米为主要食物。随着全球人口的激增，耕地面积的逐年减少，如何进一步提高水稻产量来满足人类不断增长的需求已成为现代农业生产上的一项主要任务。
分蘖是影响水稻产量的一个重要农艺性状，水稻形成的分蘖数是决定每亩穗数的前提，而穗数又是构成产量的重要基础。影响水稻分蘖发生的栽培条件和生理机制已有广泛深入的研究，但关于水稻如何控制分蘖发生的分子生物学机制，目前尚不十分清楚。一般认为水稻的分蘖数目是受多基因控制的数量性状，并且很容易受到环境条件的影响。J.Q.Yan等研究报道已经发现了23个影响分蘖数目的数量性状位点(QTLs)，分布在除第9，第10号之外的其余10条染色体上。此外，主效基因的突变造成的有关水稻分蘖性状的突变体也分别被收集和研究，一类降低水稻分蘖数目的少分蘖突变体，分别被命名为rcn1，rcn2，rcn3，rcn4，rcn5(rcn，reduced culm number)，经典遗传学分析表明这类突变体是由单个隐性基因控制，并且rcn1，2，5被分别定位在水稻的第6，4，6号染色体上。寡分蘖突变体monoculm1由于其几乎丧失分蘖的能力而成为研究分蘖分子生物学机制很好的材料，MOC1是第一个被克隆的控制水稻分蘖的基因，它是番茄和拟南芥中控制侧枝发生的Lateral suppressor基因的同源基因，表达的蛋白属于GRAS家族的转录因子。水稻的另一类分蘖突变体，表现为单株分蘖数目的增加，但在这类多分蘖突变体中分蘖的增多却总是和植株的矮化协同出现，如8个非等位的矮化突变体d3，4，5，10，14，17，27，33都表现出很强的分蘖能力，矮化并且丛生，看起来象草。此外，在水稻的细秆多分蘖突变体fine culm1中，通过同源克隆FINE CULM1(FC1)被鉴定为TEOSINTE BRANCHED1(TB1)的同源基因OSTB1，该基因的蛋白产物为转录因子，其功能主要为抑制侧芽的活性。最近，Shinji通过对5个多分蘖矮秆突变体(d3，d10，d14，d17，d27)的研究发现这些分蘖相关的基因主要是控制分蘖芽的休眠来影响芽的生长活性；通过图位克隆鉴定出D3为拟南芥MAX2/0RE9的同源基因。至今尚未有报道发现仅分蘖数增多而株高未受影响的水稻多蘖突变体。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻分蘖相关蛋白及其编码基因。
本发明所提供的水稻分蘖相关蛋白，名称为HTD1，来源于水稻(Oryza sativavar)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
1)序列表中的SEQ ID №：3；
2)将序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与水稻分蘖相关的蛋白质。
序列表中的序列3由609个氨基酸残基组成。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。如将序列3的自氨基端第599位脯氨酸残基取代为亮氨基酸残基的与水稻分蘖相关的蛋白质；将序列3的自氨基端第599位脯氨酸残基取代为亮氨基酸残基且将序列3缺失自氨基端第37位-39位氨基酸残基而得到的由606个氨基酸残基组成的与水稻分蘖相关的蛋白质。
HTD1的编码基因也属于本发明的保护范围。
HTD1的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；
3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
4)与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的序列2由2017个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′端第28位至1857位碱基。
HTD1的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；
3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
4)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的序列1为HTD1的基因组序列，包含了2626个碱基，该基因含有7个外显子(序列1的5′端起：1-419，506-864，960-1088，1177-1308，1421-1693，1798-2198，2323-2626)，6个内含子(序列1的5′端起：420-505，865-959，1089-1176，1309-1420，1694-1797，2199-2322)。
所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
含有HTD1基因的表达载体，细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。
HTD1的基因表达为组成型表达。
扩增HTD1基因中任一片段的引物也在本发明的保护范围之内。
可利用所述水稻分蘖相关蛋白编码基因中的15个或15个以上连续碱基的寡核苷酸选育水稻品种。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的水稻分蘖相关蛋白编码基因HTD1导入植物细胞，可获得改变植物分枝的转基因细胞系及转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种一般性启动子、增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入可选择性标记(GUS基因、GFP和荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记基因(庆大霉素，卡那霉素等)。为了转基因植物释放的安全性，在构建植物表达载体时也可不携带任何标记基因，在苗期进行特定PCR分子标记筛选。含有本发明的HTD1的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。
本发明的水稻分蘖相关蛋白通过抑制腋芽的生长活性而达到控制分蘖的发生。因此，通过基因工程的方法能利用该水稻分蘖相关蛋白编码基因有效地调节和控制分蘖的发生，从而使水稻的分蘖发生理想化，即早期分蘖发生快，中后期不发生分蘖，既保证每亩的穗数，又杜绝无效分蘖，避免浪费营养物质，以最终达到光合物质的经济产量产出最大化。本发明中的水稻分蘖相关蛋白及其编码基因对于合理配置水稻植株结构，进一步提高水稻产量具有重要的作用。
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
附图说明
图1A为HTD1基因被初步定位于RM241和RM303标记之间
图1B为HTD1区间包含的BAC克隆群
图1C为HTD1基因被最后定位于BAC AL663000上两个CAPS标记C2和F2之间的30Kb的物理区间
图2为dCAPS标记分析htd1/OSCCD7的DNA序列单核苷酸点突变的特异性
图3为日本晴的htd1/OSCCD7基因的结构特征
图4为南京6的HTD1的southern分析
图5为T0代转基因植株的Hyg基因验证
图6为T0代转基因植株的dCAPS验证
图7为T0代转基因植株的表型恢复
图8为HTD1在不同组织内的表达分析
图9为HTD1：：GUS的转基因植株的GUS分析
具体实施方式
下述实施例中提到的实验方法如无特别说明均为常规方法。
T0表示由多蘖矮杆突变体新泰矮的愈伤组织得到的转基因植株，T1表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株。
实施例1、水稻分蘖相关蛋白及其编码基因的获得
1、水稻分蘖相关基因HTD1的遗传分析
多蘖矮杆突变体新泰矮(籼稻)从双矮突变体矮泰引-2和高秆籼稻品种南京6号的杂交组合中分离得到(Liang GH，P.，X.B.，Gu，M.H.，Ji，C.Q.(1995).″Theisolation and genetic identification of a semidwarf gene from an indicarice variety Aitaiyin 2.″Chinese J.RICE Sci.9：189-192)。在水稻已经抽穗植株定高后，分别测量南京6号、多蘖矮杆突变体新泰矮以及南京6号和多蘖矮杆突变体新泰矮的正交和反交F1代的株高和分蘖数，结果如表1所示，表明多蘖矮杆突变体新泰矮的株高显著低于野生型品种南京6号(82.64/140.52)，降幅为41.2％；而新泰矮的分蘖数却显著高于野生型品种南京6号(99.5/11.0)，升幅为8倍多；新泰矮与南京6号的正交和反交的F1代植株的株高和分蘖性状与南京6号表现相似，说明F1代植株的株高和分蘖性状均表现正常。在南京6号和新泰矮的正交和反交的F2代中，得到了492株正常表型个体和155株多蘖矮秆突变体，符合3:1的分离比例(X2＝0.322)。此外，新泰矮还分别与另外三个野生型水稻品种(IR24，日本晴和Lemont)进行了杂交，在各组合的F2代中植株中，正常：多蘖矮秆型的分离比例都符合3:1(表2)。这些结果表明，多蘖矮杆突变体新泰矮的多蘖和矮化性状是由细胞核内单个基因的隐性突变造成的。
表1.多蘖矮杆突变体新泰矮与南京6号及其F1的分蘖数和株高
表2.多蘖矮秆表现型在不同杂交组合F2代中的分离
2、水稻分蘖相关基因HTD1的精细定位
利用新泰矮/Lemont组合F2中643个多蘖矮秆类型植株将HTD1初步定位在第4染色体上两个微卫星标记RM241和RM303的区间(图1A)，具体方法为找出一系列和目的性状连锁的分子标记，应用Mapmaker分析软件对这些分子标记构建分子遗传图谱，将目的基因限定在一定的区间。为了进一步缩小目的基因的界定区间，通过利用另一个组合新泰矮/日本晴F2中的4600个多蘖矮秆类型植株分别筛选两个微卫星标记RM241和RM303，找出RM241和RM303和目的基因间发生交换的植株，通过设计新的分子标记，并将这些交换植株继续筛选新的分子标记，通过多次的染色体步行最终将HTD1定位在BAC AL663000上两个CAPS标记C2和F2之间的30Kb的物理区间(图1B和C)。图1C中，横线下的数字代表对应标记和HTD1的交换单株数。
在HTD1精细定位中根据日本晴和9311的基因组DNA的籼粳差异设计的CAPS引物及特定的限制内切酶如表3。
表3.本发明过程中所创制的CAPS标记和引物
3、HTD1候选基因的鉴定
通过图位克隆，HTD1基因被定位在30Kb的DNA区间内，而继续通过扩大定位群体进一步缩小目的基因所在区间已无必要。通过DNA测序的方法比对了多蘖矮杆突变体新泰矮和南京6的30Kb区间的DNA序列。结果发现在界定区间内的30KbDNA序列里，多蘖矮杆突变体新泰矮和南京6之间存在许多差异，其中包括碱基的插入、缺失、替换；同时参照比对多蘖矮杆突变体新泰矮与日本晴和9311已知的相应的DNA序列以发现特异的(也不同于日本晴和9311)碱基变化。为了找出30KbDNA序列内的ORFs，将此30Kb DNA序列侯选区域的基因组序列和KOME(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/Cdna/)(Kikuchi S et al.Collection，mapping，and annotation of over 28,000cDNA clones from japonica rice.science 2003301:376-379)中的cDNA数据进行blastn分析，以找出该侯选区域基因组序列的ORFs；由于KOME内的cDNA数据的非完全性，同时对侯选区域的基因组序列用GENSCAN软件(http:/genes.mit.edu/GENSCAN.html)预测可能的编码区(ORF)，结果发现该界定区间含有5个ORFs。DNA序列的比对和侯选区域基因组序列内ORFs的鉴定结果表明大多数的DNA碱基变化发生在基因间区间和基因内的内含子上；有些发生在基因的外显子上的DNA碱基变化造成同义突变；但多蘖突变体新泰矮中的OSCCD7的ORF序列(序列4)的1787(对应于序列2日本晴的cDNA序列的1823)处发生了胞嘧啶(cytosine)替换成胸腺嘧啶(thymine)(1787，C/T)，导致了该基因表达蛋白OSCCD7的596处的脯氨酸(prolin)(对应于序列3日本晴的OSCCD7的599处脯氨酸)变成了亮氨酸(leucine)(596P/L)。根据该点DNA序列的差异，设计了dCAPS引物5-TCTCTTTGCTTCTTGACAGTATGC-3、5-CCAGAAACCATGGAATCCCCTT-3用以鉴定此点突变的特异性，分别以表4中的水稻品种基因组DNA为摸板，该对引物可扩增出150bp的PCR产物，野生型南京6的此PCR产物经styI(识别位点：CCWWGG)酶切后缩小到130bp；由于多蘖矮杆突变体新泰矮的碱基变化(1787，C/T)导致多蘖矮杆突变体新泰矮的PCR产物不能被styI酶切，仍保持150bp大小。结果表明所测试的19个野生型品种的PCR产物都能被styI酶切而变为130bp，只有多蘖矮杆突变体新泰矮的PCR产物不能被styI酶切(图2)，1-20为表4中的水稻品种号。这些结果说明与所测试的野生型品种比较，多蘖矮杆突变体新泰矮的该基因核苷酸的点突变是特异的，这也说明在野生型品种中该基因所表达的蛋白其596(籼稻)或599(粳稻)处的脯氨酸是固定不变的(表4)，该氨基酸在功能上是保守的。(cDNA克隆AK109771来自日本晴Nipponbare)。
cDNA克隆AK109771表达蛋白OSCCD7(序列3)的BLAST分析结果表明，OSCCD7是拟南芥MAX3/CCD7(Genbank，AC007659)的同源蛋白，已有研究证实拟南芥的MAX3是一个胡萝卜素裂解双氧酶，该酶与一个新的抑制植物侧枝发生的信号分子的合成有关。
表4.dCAPS分析验证OSCCD7表达蛋白596或599P/L突变的特异性
4、HTD1候选基因OSCCD7的分子特征
通过比较日本晴的OSCCD7的cDNA和其基因组DNA序列，发现OSCCD7共有7个外显子(序列1的5′端起：1-419，506-864，960-1088，1177-1308，1421-1693，1798-2198，2323-2626)，6个内含子(序列1的5′端起：420-505，865-959，1089-1176，1309-1420，1694-1797，2199-2322)；其基因组全长为2626bp(序列1)，cDNA全长为2017bp(序列2)，其开放阅读框架(ORF)为序列2自5′端第28至1857位共有1830碱基；该基因编码蛋白长度为609个氨基酸(图3，阴影框代表基因的外显子，黑线代表基因内的内含子)。突变体在最后的外显子上发生了单核苷酸的替代(1787C/T)导致单氨基酸的变化(596，P/L)；而在籼稻品种9311和多蘖矮杆突变体新泰矮以及南京6中，由于该基因第一个外显子上都缺失了9个核苷酸GCCGCCGCC(自序列1的5′端第136位-144位碱基，自序列2的5′端第136位-144位碱基)(翻译后缺失3个A，自序列3的氨基端第37位-39位氨基酸残基)而使其cDNA序列长度变为1821bp，这9个核苷酸的变化可能是籼粳水稻亚种间的差异；另外，根据籼稻品种9311和南京6并没有因为缺失这3个氨基酸而影响分蘖的发生说明突变体的多蘖矮化也不是由于该处氨基酸的缺失所致。
提取水稻品种南京6的基因组DNA经限制性内切酶EcoRI、EcoRV和DraI消化并转膜，以OSCCD7的cDNA(序列2)为探针进行southern，结果如图4所示，表明OSCCD7在水稻基因组中是以单拷贝形式存在。图4中，Marker为DL2000。
5、功能互补实验
为了进一步证实HTD1候选基因的功能，进行了OSCCD7在突变体内的功能互补实验。首先，对含有OSCCD7基因的BAC克隆AL663000进行酶谱分析，发现该BAC经EcoRI完全酶切后能分离出一含有该基因的合适的DNA片段，该片段包含了该基因起始密码子ATG上游的3679bp的DNA序列和该基因终止密码子TGA后572bp的DNA序列，共有6690bp大小。通过酶切、回收以及DNA片段的脱磷酸化后，将该基因片段用连接酶连到相同酶切和脱磷酸化后的双元载体pCAMBIA1301上，得到含有OSCCD7(序列1)的质粒pCAMBIA1301-OSCCD7，通过电击的方法将pCAMBIA1301-OSCCD7转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系LBA4404中。利用多蘖矮杆突变体新泰矮的成熟胚诱导愈伤组织进行农杆菌转化。结果得到4个独立的T0株系：T0-1，T0-2，T0-3和T0-4。对该T0株系利用潮霉素基因的引物(P1：5’-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3’，P2：5’-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3’)PCR扩增潮霉素基因，利用dCAPS引物5-TCTCTTTGCTTCTTGACAGTATGC-3和5-CCAGAAACCATGGAATCCCCTT-3进行HTD1/OSCCD7内特异的单核苷酸替代(1787C/T)区域的PCR扩增和限制内切酶StyI的酶切分子鉴定，结果如图5和图6所示，图5表明T0株系中扩增得到大小为852bp的潮霉素基因，图6表明dCAPS引物在转基因植株(2-5)基因组内扩增的产物经StyI酶切后出现150bp和130bp两条DNA带，而作为对照植株的突变体(1)的dCAPS扩增产物不能被StyI酶切仍然为150bp大小；潮霉素基因的PCR扩增和HTD1/OSCCD7基因内特异的单核苷酸替代的分子鉴定证实了外源基因OSCCD7确实已整合到转基因植株中。图5中，1为对照，水，2-7为T0株系，8为阳性对照，pCAMBIA1301-OSCCD7，M为DL2000。图6中，1为突变体对照，2-5为T0株系，M为DL2000。
对T0转基因植株进行形态观察，结果表明T0转基因植株的分蘖数恢复正常，株高也恢复正常(图7，CK为多蘖矮杆突变体新泰矮)。在3个T0株系的各自T1代中都分别有突变体和野生型植株的分离，其分离情况如表5。这些结果证实了OSCCD7就是HTD1。
表5.转基因植株T1代分离情况
实施例2、HTD1的表达分析
为了研究HTD1在水稻中的表达模式，分别提取了水稻的叶、茎秆、穗和根等不同组织的RNA，以HTD1的cDNA(序列2)为探针进行Northern杂交，结果如图8所示，表明HTD1在以上这些组织内都有表达，但地上部分组织内表达较强，根内表达较弱。另外，在用含有HTD1和GUS融合蛋白编码基因HTD1：：GUS的载体转化水稻得到的转基因植株中，GUS的组织化学染色结果表明HTD1：：GUS基因的水稻植株的叶中脉，叶鞘，茎节，穗和根组织中GUS都有表达，其中各组织也进一步证实了HTD1基因表达模式的Northern结果；同时，GUS的组织化学染色结果也揭示HTD1基因可能仅在植株的维管束内表达(图9)。
序列表
<160> 4
<210> 1
<211> 2626
<212> DNA
<213> 水稻属水稻(Oryza sativa)
<400> 1
<210> 2
<211> 2017
<212> cDNA
<213> 水稻属水稻(Oryza sativa)
<400> 2
<210> 3
<211> 609
<212> PRT
<213> 水稻属水稻(Oryza sativa)
<400> 3
<210> 4
<211> 1821
<212> DNA
<213> (Oryza sativa)
<400> 4
Claims (8)
1、水稻分蘖相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
1)序列表中的SEQ ID №：3；
2)将序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与水稻分蘖相关的蛋白质。
2、权利要求1所述的水稻分蘖相关蛋白的编码基因。
3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述水稻分蘖相关蛋白的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；
3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
4)与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述水稻分蘖相关蛋白的基因组基因，具有下述核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；
3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
4)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
5、含有权利要求2、3或4所述水稻分蘖相关蛋白编码基因的表达载体，细胞系和宿主菌。
6、扩增权利要求2、3或4所述水稻分蘖相关蛋白编码基因中任一片段的引物。
7、权利要求2、3或4所述水稻分蘖相关蛋白编码基因在培育水稻品种中的应用。
8、权利要求2、3或4所述水稻分蘖相关蛋白编码基因中的15个或15个以上连续碱基的寡核苷酸在选育水稻品种中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20111005 Termination date: 20140331 |