CN106518993A

CN106518993A - 氨基酸转运基因OsAAP3在水稻选育中的应用

Info

Publication number: CN106518993A
Application number: CN201610937261.5A
Authority: CN
Inventors: 方中明; 吕凯; 黄玮婷; 吴博文
Original assignee: Wuhan Bioengineering Institute
Current assignee: Wuhan Bioengineering Institute
Priority date: 2016-10-25
Filing date: 2016-10-25
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2036-10-25
Also published as: CN106518993B

Abstract

本发明公开了氨基酸转运基因OsAAP3在水稻选育中的应用，属于植物基因工程领域。OsAAP3基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过构建水稻OsAAP3基因干扰植株、OsAAP3基因超表达植株，发现通过降低OsAAP3基因表达，可以使正常的水稻分蘖数和每株穗数增加，因此OsAAP3基因可用于水稻选育中以提高水稻产量。OsAAP3基因在阐述氨基酸运输影响植物生长及发育过程方面具有重要的应用价值。

Description

氨基酸转运基因OsAAP3在水稻选育中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及氨基酸转运基因OsAAP3在水稻选育中的应用。

背景技术

植物通过吸收土壤中的氨、硝酸根、氨基酸、可溶性肽等来获得氮素；氮的吸收和转运主要依靠铵根运输蛋白（AMT）、硝酸根运输蛋白（NRT）、氨基酸运输蛋白（AAT）、肽运输蛋白（PTR）等运输蛋白来完成（Williams L, Miller A. Transporters responsible forthe uptake and partitioning of nitrogenous solutes. Annu Rev Plant Biol andPlant Mol Biol, 2001, 52: 659-688.）。铵通过植物AMT吸收后再通过谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合酶（GOGAT）合成谷氨酰胺和谷氨酸，后者再进一步形成其它氨基酸（SonodaY, Ikeda A, Saiki S, et al. Feedback regulation of the ammonium transportergene family AMT1 by glutamine in rice. Plant Cell Physiol, 2003, 44: 1396-1402.）。植物可通过高亲和转运系统（HATS）的NRT2和低亲和转运系统（LATS）的NRT1吸收环境中的硝酸盐，由硝酸还原酶（NR）和亚硝酸还原酶（NiR）还原形成铵，再进一步形成氨基酸（Paungfoo-Lonhienne C, Lonhienne T G, Rentsch D, et al. Plants can useprotein as a nitrogen source without assistance from other organisms. PNAS,2008, 105: 4524-4529.）。

在高等植物中，AAT是一类跨膜蛋白，将氨基酸从胞外运至胞内，同时还在氨基酸远距离运输、病原反应和非生物胁迫等方面发挥着重要作用（Tegeder M. Transportersfor amino acids in plant cells: some functions and many unknowns. Curr OpinPlant Biol, 2012, 15: 1-7.）。AAT基因被分为两个超家族：APC（氨基酸、多胺和胆碱转运）超家族和AAAP（氨基酸/生长素透性酶）超家族。APC超家族分为三个亚家族：CATs（阳离子氨基酸转运蛋白）家族、ACTs（氨基酸/胆碱转运蛋白）家族和PHSs（多胺、H+协同转运蛋白）家族。AAAP超家族分为六个亚家族：AAPs（氨基酸透性酶）家族、LHTs（赖氨酸和组氨酸转运蛋白）家族、ProTs（脯氨酸转运蛋白）家族、GATs（γ-氨基酸丁酸，GABA）家族、AUXs（生长素转运蛋白）家族和ANTs（芳香族和中性氨基酸转运蛋白）家族（Fischer WN, Andre B,Rentsch D, et al. Amino acid transport in plants. Trends Plant Sci, 1998, 3:188-195.）。

水稻基因组中共找到85个AAT家族成员（Zhao H, Ma H, Yu L, et al. Genome-wide survey and expression analysis of amino acid transporter gene family inrice (Oryza sativa L.). PLoS ONE, 2012, 7: e49210.）。研究发现OsAAT5、OsAAT7、OsAAT24、OsAAT49和OsAAT60的T-DNA插入突变体的稻米产量及植物体干重均下降，证明AAT对水稻的氮素积累及碳氮分配有着重要作用（Lu Y, Song Z, Lu K, et al. Molecularcharacterization, expression and functional analysis of the amino acidtransporter gene family (OsAATs) in rice. Acta physiol Plant, 2012, 34: 1943-1962.）。研究发现超量表达OsAAP6会增加水稻籽粒中储藏性蛋白和氨基酸含量，从而改善稻米营养和风味（Peng B, Kong H, Li Y, et al. OsAAP6 functions as an importantregulator of grain protein content and nutritional quality in rice. NatCommun, 2014, 5: doi:10.1038.）。氨基酸转运蛋白对水稻等各种植物体的氨基酸吸收、转运和储藏具有重要的作用。目前关于水稻AAP家族成员研究的报道很少，水稻氨基酸转运家族OsAAP3基因的蛋白可以运输赖氨酸和精氨酸等多种氨基酸（Taylor M R, ReindersA, Ward J M. Transport function of rice amino acid permeases (AAPs)[J]. Plantand Cell Physiology, 2015, 56(7): 1355-1363.），但对水稻的生长发育目前未有任何研究。本发明发现OsAAP3基因对水稻分蘖有极其重要的作用，可应用于植物株型改良从而使水稻增产。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供氨基酸转运基因OsAAP3在水稻选育中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以水稻的氨基酸转运基因OsAAP3为对象，从水稻中花11中克隆了OsAAP3的cDNA序列。通过RNAi技术构建OsAAP3基因干涉表达载体，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将干扰表达载体导入正常粳稻品种中花11中，得到OsAAP3基因表达量下降的干扰植株，干扰植株的分蘖数与对照野生型中花11相比显著提高。同时构建了OsAAP3基因超表达载体，将超表达载体导入中花11中，得到OsAAP3基因超表达植株，其分蘖数与中花11相比显著降低。这些结果表明，通过降低OsAAP3基因表达，可以使正常的水稻分蘖数增加，从而提高穗数和水稻产量。OsAAP3基因在阐述氨基酸运输影响植物生长及发育过程方面具有重要的应用价值。

基于本发明发现的OsAAP3基因的功能，其可用于水稻选育中。所述的水稻选育为提高水稻分蘖数，从而提高穗数和水稻产量。具体可通过RNAi技术降低OsAAP3基因的表达或用CRISPR等基因编辑技术敲除OsAAP3基因，使水稻分蘖数和每株穗数增加，达到提高水稻产量的目的。所述的OsAAP3基因编码的OsAAP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的OsAAP3基因的cDNA序列优选如SEQ ID NO.2所示。

应该理解为，在不影响OsAAP3蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本领域技术人员可对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。因此，OsAAP3蛋白还包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的优点和效果：

（1）本发明克隆的OsAAP3基因干扰表达后使水稻分蘖能力增强，说明OsAAP3基因对提高水稻分蘖数较明显，因此，通过基因工程技术降低OsAAP3基因的表达能够提高植物产量。这不仅有助于通过正常施氮条件下培育高产水稻，还可以通过结合基因编辑技术和分子育种进行植物的品种改良。

（2）OsAAP3基因的成功克隆，进一步证实了氨基酸转运家族在氮吸收过程中的重要作用，对阐明氨基酸转运家族的生物学功能有重要的意义，另外对进一步了解植物氮代谢途径，提高氮吸收效率有极大的推动作用。

（3）尽管目前已克隆到了一些提高植物产量的基因，但对植物增产的分子机制仍不清楚。而本发明克隆的OsAAP3基因能够提高水稻的分蘖数，对确定植物增产的关键因素有极大的推动作用。

附图说明

图1是对照中花11、OsAAP3基因超表达植株3个株系和OsAAP3基因干扰植株3个株系的整株表型图。

图2是对照中花11、OsAAP3基因超表达植株3个株系和OsAAP3基因干扰植株3个株系分蘖数的统计柱状图，数据采用SPSS软件进行变量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别小写字母（a、b、c）表示差异显著。

图3是对照中花11、OsAAP3基因超表达植株3个株系和OsAAP3基因干扰植株3个株系表达量的统计柱状图，数据采用SPSS软件进行变量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别星号（*）表示与对照相比具有差异显著。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术（参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约）完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1 OsAAP3基因干扰植株的构建

提取水稻中花11的RNA，并将其反转录成cDNA，利用引物对：

F1：5'-GGTACCAAGGACGTGGAGATGGCG-3'（Kpn I），

R1：5'-GGATCCATCGCCAGTGCGGTAGCAGTC-3'（BamH I）；

F2：5'-ACTAGTAAGGACGTGGAGATGGCG-3'（Spe I），

R2：5'-GAGCTCATCGCCAGTGCGGTAGCAGTC-3'（Sac I）；

各自PCR扩增出OsAAP3基因的cDNA片段，通过上述相应的限制性内切酶酶切后连入pTCK303载体，构建出OsAAP3基因的干扰表达载体OsAAP3-pTCK303。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将干扰表达载体导入正常粳稻品种中花11中。

将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，种于大田中，待苗长大后，提取基因组DNA通过PCR对转基因植株进行检测，检测引物对为：

F3：5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3'，

R3：5'-TCGTTATGTTTATCGGCACTTT-3'。

若扩增出517bp的片段，则说明转基因植株为阳性植株。阳性植株单株收种并种植，直至T2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到OsAAP3基因干扰植株。OsAAP3基因干扰植株的分蘖数远多于对照中花11植株，差异显著，如图1、2中所示。

取OsAAP3基因干扰植株叶片，提取RNA并将其反转录成cDNA，通过实时荧光定量PCR检测OsAAP3基因在干扰植株的表达量，结果显示（图3）干扰植株中OsAAP3基因的表达量比对照中花11降低，将对照的表达量定为1的话，干扰植株三个株系的表达量平均值依次为0.36、0.52、0.56。实时荧光定量PCR所用引物对：

F4：5'-GCGGAGAACAAGACGATGAA-3'，

R4：5'-ATGGGCTGGCAGAACACC-3'。

实施例2 OsAAP3基因超表达植株的构建

提取水稻中花11的RNA，并将其反转录成cDNA，利用引物对：

F5：5'-AGATCTATGGCGAAGGACGTGGAGATGGCG-3'（Bgl II），

R5：5'-CTTAAGTCACGACTTGGTCTTGAAGGGGACGTA-3'（Afl II）；

通过PCR扩增OsAAP3基因的cDNA后，通过Bgl II和Afl II酶切后连入pCAMBIA-1301载体（pCAMBIA-1301载体购自Cambia公司），构建出OsAAP3基因的超表达载体OsAAP3-p1301。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常水稻品种中花11中。

F3：5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3'，

R3：5'-TCGTTATGTTTATCGGCACTTT-3'；

若扩增出517bp的片段，则说明转基因植株为阳性植株。阳性植株单株收种并种植，直至T2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到OsAAP3基因超表达植株。OsAAP3基因超表达植株的分蘖数远少于对照中花11植株，差异显著，如图1、2中所示。

取OsAAP3基因超表达植株叶片，提取RNA并将其反转录成cDNA，通过实时荧光定量PCR检测OsAAP3基因在超表达植株的表达量，操作同实施例1，结果显示（图3）超表达植株中OsAAP3基因的表达量远远高于对照中花11，将对照的表达量定为1的话，超表达植株三个株系的表达量平均值依次为101.13、82.33、135.77。

上述结果表明，OsAAP3基因可以通过表达量的降低，提高水稻的分蘖数和每株穗数，最终提高水稻产量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉生物工程学院

<120> 氨基酸转运基因OsAAP3在水稻选育中的应用

<130> 1

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 487

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 1

Met Ala Lys Asp Val Glu Met Ala Val Arg Asn Gly Asp Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Tyr Tyr Ala Thr His Pro His Gly Gly Ala Gly Gly Glu

20 25 30

Asp Val Asp Asp Asp Gly Lys Gln Arg Arg Thr Gly Asn Val Trp Thr

35 40 45

Ala Ser Ala His Ile Ile Thr Ala Val Ile Gly Ser Gly Val Leu Ser

50 55 60

Leu Ala Trp Ala Thr Ala Gln Leu Gly Trp Val Val Gly Pro Val Thr

65 70 75 80

Leu Met Leu Phe Ala Leu Ile Thr Tyr Tyr Thr Ser Gly Leu Leu Ala

85 90 95

Asp Cys Tyr Arg Thr Gly Asp Pro Val Ser Gly Lys Arg Asn Tyr Thr

100 105 110

Tyr Met Asp Ala Val Ala Ala Tyr Leu Gly Gly Trp Gln Val Trp Ser

115 120 125

Cys Gly Val Phe Gln Tyr Val Asn Leu Val Gly Thr Ala Ile Gly Tyr

130 135 140

Thr Ile Thr Ala Ser Ile Ser Ala Ala Ala Val His Lys Ala Asn Cys

145 150 155 160

Tyr His Lys Asn Gly His Asp Ala Asp Cys Gly Val Tyr Asp Thr Thr

165 170 175

Tyr Met Ile Val Phe Gly Val Val Gln Ile Phe Phe Ser Met Leu Pro

180 185 190

Asn Phe Ser Asp Leu Ser Trp Leu Ser Ile Leu Ala Ala Val Met Ser

195 200 205

Phe Ser Tyr Ser Thr Ile Ala Val Gly Leu Ser Leu Ala Arg Thr Ile

210 215 220

Ser Gly Ala Thr Gly Lys Thr Thr Leu Thr Gly Val Glu Val Gly Val

225 230 235 240

Asp Val Thr Ser Ala Gln Lys Ile Trp Leu Ala Phe Gln Ala Leu Gly

245 250 255

Asp Ile Ala Phe Ala Tyr Ser Tyr Ser Met Ile Leu Ile Glu Ile Gln

260 265 270

Asp Thr Val Lys Ser Pro Pro Ala Glu Asn Lys Thr Met Lys Lys Ala

275 280 285

Thr Leu Leu Gly Val Ser Thr Thr Thr Ala Phe Tyr Met Leu Cys Gly

290 295 300

Cys Leu Gly Tyr Ala Ala Phe Gly Asn Ala Ala Pro Gly Asn Met Leu

305 310 315 320

Thr Gly Phe Gly Phe Tyr Glu Pro Tyr Trp Leu Ile Asp Phe Ala Asn

325 330 335

Val Cys Ile Val Val His Leu Val Gly Ala Tyr Gln Val Phe Cys Gln

340 345 350

Pro Ile Phe Ala Ala Val Glu Thr Phe Ala Ala Arg Arg Trp Pro Gly

355 360 365

Ser Glu Phe Ile Thr Arg Glu Arg Pro Val Val Ala Gly Arg Ser Phe

370 375 380

Ser Val Asn Met Phe Arg Leu Thr Trp Arg Thr Ala Phe Val Val Val

385 390 395 400

Ser Thr Val Leu Ala Ile Val Met Pro Phe Phe Asn Asp Ile Leu Gly

405 410 415

Phe Leu Gly Ala Val Gly Phe Trp Pro Leu Thr Val Tyr Tyr Pro Val

420 425 430

Glu Met Tyr Ile Arg Gln Arg Arg Ile Gln Arg Tyr Thr Ser Arg Trp

435 440 445

Val Ala Leu Gln Thr Leu Ser Leu Leu Cys Phe Leu Val Ser Leu Ala

450 455 460

Ser Ala Val Ala Ser Ile Glu Gly Val Ser Glu Ser Leu Lys His Tyr

465 470 475 480

Val Pro Phe Lys Thr Lys Ser

485

<210> 2

<211> 1464

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atggcgaagg acgtggagat ggcggtgcgg aacggagacg gcggcggcgg cggcggctac 60

tacgccaccc acccgcacgg cggcgccggc ggcgaggacg tcgacgacga cggcaagcag 120

cggcgaaccg gtaacgtatg gacggcgagc gcgcacatca tcacggcggt gatcggctcc 180

ggcgtgctct ctctcgcatg ggcaacggcg cagctcggct gggtggtcgg gccggtgact 240

ctgatgctct tcgccctcat cacgtactac acctctgggc tcctcgccga ctgctaccgc 300

actggcgatc cggtcagcgg caagcgcaac tacacctaca tggatgccgt tgcggcctac 360

ttaggtggct ggcaagtctg gtcctgtggt gttttccaat atgtcaacct ggttgggaca 420

gcaattgggt acacaatcac agcatccatc agcgcagcgg ctgtgcacaa ggccaactgc 480

taccacaaga acggccacga tgccgattgc ggtgtctacg acaccacgta catgatcgtc 540

tttggagtcg tccagatctt cttctccatg ctgcccaact tcagtgacct ctcatggctt 600

tccatcctcg ccgcggtcat gtcattctca tactcgacca ttgccgttgg cctctcgctt 660

gcgcgaacaa tatcaggtgc tactggtaag actactctga ctggcgttga ggttggagtt 720

gacgtcactt cagcccagaa gatctggctc gcgttccaag cgctcggtga catcgcgttc 780

gcctactcct actccatgat ccttatagaa attcaggaca cggtgaagtc tccaccggcg 840

gagaacaaga cgatgaagaa ggcaacgctg ctgggggtgt cgaccacgac ggcgttctac 900

atgctgtgcg ggtgcctggg gtacgcggcg ttcgggaacg cggcgccggg gaacatgctc 960

accgggttcg gcttctacga gccctactgg ctgatcgact tcgccaacgt ctgcatcgtg 1020

gtccacctgg tcggcgccta ccaggtgttc tgccagccca tcttcgccgc cgtcgagacg 1080

ttcgccgcca ggcggtggcc gggctcggag ttcatcaccc gggagcgccc cgtcgtggcc 1140

ggcaggtcgt tcagcgtcaa catgttcagg ctgacgtggc ggacggcgtt cgtggtcgtc 1200

agcacggtgc tcgccatcgt gatgcccttc ttcaacgaca tcctgggctt cctcggcgcc 1260

gtcgggttct ggccgctgac ggtgtactac ccggtggaga tgtacatccg gcagcggcgg 1320

atacagcggt acacgtccag gtgggtggcg ctgcagacgc tcagcctcct ctgcttcctc 1380

gtctcgctcg cctccgccgt cgcctccatc gagggcgtca gcgagtcgct caagcactac 1440

gtccccttca agaccaagtc gtga 1464

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F1

<400> 3

ggtaccaagg acgtggagat ggcg 24

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R1

<400> 4

ggatccatcg ccagtgcggt agcagtc 27

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F2

<400> 5

actagtaagg acgtggagat ggcg 24

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R2

<400> 6

gagctcatcg ccagtgcggt agcagtc 27

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F3

<400> 7

gatgttggcg acctcgtatt 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R3

<400> 8

tcgttatgtt tatcggcact tt 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F4

<400> 9

gcggagaaca agacgatgaa 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R4

<400> 10

atgggctggc agaacacc 18

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F5

<400> 11

agatctatgg cgaaggacgt ggagatggcg 30

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R5

<400> 12

cttaagtcac gacttggtct tgaaggggac gta 33

Claims

1.OsAAP3基因在水稻选育中的应用，其特征在于：所述的水稻选育为提高水稻分蘖数。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：通过降低OsAAP3基因的表达或敲除OsAAP3基因使水稻分蘖数增加。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的OsAAP3基因编码的OsAAP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或OsAAP3蛋白为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的OsAAP3基因的cDNA序列如SEQ IDNO.2所示。