CN102229661A - 调控水稻分蘖的一个dhhc型锌指蛋白基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个调控水稻分蘖的一个DHHC型锌指蛋白基因OsDHHC1及应用，属于植物基因工程领域。OsDHHC1基因具有正调控水稻分蘖从而构建理想株型的能力。通过基因工程技术提高OsDHHC1基因的表达量能够增加水稻分蘖的数量从而达到提高水稻产量的目的。因此，OsDHHC1的分离和鉴定对将来阐明水稻分蘖调控网络和分子机制具有一定的理论和现实意义，同时OsDHHC1基因在塑造理想水稻株型和培育高产优质的水稻品种两个方面有广泛的应用前景。

Description

调控水稻分蘖的一个DHHC型锌指蛋白基因及应用

技术领域

本发明涉及一种调控水稻分蘖的一个DHHC型锌指蛋白基因，同时，本发明还涉及所述基因的应用，属于植物基因工程领域。

背景技术

20世纪50年代后期，矮秆基因sd-1的发现和应用引发了作物生产的“绿色革命””，实现了水稻单产的第一次飞跃。70年代中期，  我国发现水稻野败型不育系并成功选育了三系配套的杂交水稻。使得我国的水稻单产水平实现了第二次飞跃。以理想株型塑造与杂种优势利用相结合的新株型水稻品种选育是进一步提高水稻单产的重要方法和有效途径(程式华等，中国水稻科学，19：280-284，2005)。水稻株型是发挥水稻高产性状基因的载体，而分蘖是创新水稻株型研究的关键因素之一。分蘖数目和分蘖角度是水稻分蘖的两个主要研究内容。水稻分蘖调控基因的分离和鉴定对于水稻分蘖调控分子机制的解析以及水稻理想株型塑造育种等具有重要的理论意义和应用价值。

水稻分蘖的形成过程可分为两个主要步骤，即分蘖芽的形成和分蘖芽的伸长。目前，在水稻中已经发现了许多与分蘖形成过程相关的基因，其中与分蘖芽的形成相关的基因有MOC1，LAX和SPA等；与分蘖芽的伸长相关的基因有D3，D10，THD1，OsTB1，OsNAC2等(Wang Y，Li J，Annu Rev Plant Biol，59：253-279，2008)。Li等(The Plant Journal，58：592-605，2009)通过研究小粒多分蘖突变体sp1分离出了SP1基因，发现该基因编码一个肽转运蛋白，主要调节稻穗的分枝和粒径的大小。近年研究发现，独脚金内酯是MAX途径产生的一种控制植物分枝的新的激素，是腋芽生长调控途径中位于生长素下游的负调节因子(Gomez-Roldan，et al.Nature，455：189-194，2008)。Lin等(The Plant Cell，21：1512-1525，2009)通过研究矮化多分蘖突变体d27分离出了D27基因，发现该基因编码一个Fe离子蛋白，参与独脚金内酯(strigolactones)的生物合成，从而调控水稻的分蘖。最近，Jiao等(NatureGenetics，42：541-545，2010)分离鉴定了一个理想株型IPA1，发现该基因编码OsSPL14蛋白，当对OsSPL14基因定点突变后，转化株系分蘖数减少，表现出明显的理想株型。

水稻分蘖角度是指植株主茎与分蘖之间的夹角，它是决定水稻株型的另一重要因素之一。外界环境是影响水稻分蘖角度大小的重要因素，尤其光照条件对水稻分蘖角度的形成影响较大。迄今为止，许多与分蘖角度相关的突变体被分离鉴定出来，如分蘖平卧生长的突变体la，分蘖直立生长的突变体er，株型分散矮化突变体d20等(Wang Y，Li J，Annu RevPlantBiol，59：253-279，2008)。李培金等(科学通报，48：2271-22741，2003)通过图位克隆分离了LAZY1基因，并发现该基因对植物生长激素的极性运输具有负调控作用。Yu等(The Plant Journal，52：891-898，2007)分离出一个控制水稻分蘖角度的新基因TAC1，发现TAC1 mRNA水平决定着分蘖角度的大小。Tan等(Nature Genetics，40：1360-13641，2008)克隆了控制野生稻匍匐生长习性的C2H2型锌指蛋白基因PROG1，  发现该基因主要在腋芽分裂组织表达。

锌指蛋白在调控RNA的结合、转录、细胞凋亡、蛋白质相互作用的生命过程中发挥重要作用。根据Cys和His与锌离子结合的位点和数量，有C2H2，，C2C2，，C2HC，C2C2C2C2，C2HCC2C2和DHHC等不同类型的锌指结构域。其中DHHC型锌指蛋白是锌指蛋白大家族中较小的一类，具有DHHC(Asp-His-His-Cys)富含半胱氨酸高度保守的锌指结构域，多数家族成员具有蛋白质酰基转移酶(protein acyltransferase，PAT)活性。目前，DHHC型锌指蛋白的研究主要集中于酵母和哺乳动物(Jessica，et al.Cell Biology，170：1091-1099，2005)，而在植物中的研究较少。Hemsley等(The Plant Cell，17：2554-2563，2005)从tip1突变体中分离和克隆了一个DHHC型锌指蛋白基因TIP1，发现锌指蛋白TIP1有PAT活性，参与调节植物细胞的生长。当该基因缺失时则会造成根尖的根毛发育不良。最近，本发明人通过研究拟南芥多分枝突变体scc10-D分离和鉴定了一个新的DHHC型锌指蛋白基因AtDHHC1(GenBank accession no.At5g04270)，初步发现该基因对腋芽的生长起正调控作用，同时也揭示了DHHC型锌指蛋白的一种全新功能(Xiang，et al.African Journal of Biotechnology，45：7759-7766，2010)。由此可见，DHHC型锌指蛋白在植物的生长发育及株型调控中起着非常重要的作用。但是该家族其它成员的功能仍不清楚，特别是水稻中DHHC型锌指蛋白对株型调控的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻分蘖蛋白及其编码基因。

本发明所提供的水稻分蘖蛋白，名称为OsDHHC1，来源于水稻(Oryza sativavar L.)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID No：4和SEQ ID No：5；

2)将序列表中SEQ ID No：4和SEQ ID No：5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与水稻分蘖相关的蛋白质。

序列表中的序列4由223个氨基酸残基组成。

序列表中的序列5由272个氨基酸残基组成。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。如将序列4自氨基端第76位半光氨酸残基取代为丙氨酸残基的与水稻分蘖相关的蛋白质；将序列4自氨基端第76位半光氨酸残基取代为丙氨酸残基且将序列4缺失自氨基端第73位-76位氨基酸残基而得到的由223个氨基酸残基组成的与水稻分蘖相关的蛋白质；将序列5的自氨基端第125位半光氨酸残基取代为丙氨酸残基的与水稻分蘖相关的蛋白质；将序列5的自氨基端第125位半光氨酸残基取代为丙氨酸残基且将序列5缺失自氨基端第121位-125位氨基酸残基而得到的由272个氨基酸残基组成的与水稻分蘖相关的蛋白质。

本发明还提供OsDHHC1和Os02g0819100的编码基因。

OsDHHC1和Os02g0819100的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID No：2或SEQ ID No：3的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID No：4或No：5蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID No：2或SEQ ID No：3限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中的序列1由1293个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5’端第66位至884位碱基。

OsDHHC1的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID No：4或No：5蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中的序列1为OsDHHC1的基因组序列，包含了1293个碱基，该基因含有2个外显子(序列1的5’端起：67-189，336-884)，1个内含子(序列1的5’端起：190-335)。

所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SS)，0.1×SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

本发明还提供含有OsDHHC1和Os02g0819100基因的表达载体，以及含有所述载体的细胞系或宿主菌。OsDHHC1的基因表达为非组成型表达。

扩增OsDHHC1和Os02g0819100基因中任意片段的引物也在本发明的保护范围之内。可利用所述水稻分蘖相关蛋白编码基因中的15个或15个以上连续碱基的寡核苷酸选育水稻品种。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的水稻分蘖相关蛋白编码基因OsDHHC1和Os02g0819100导入植物细胞，可获得改变植物分枝的转基因细胞系及转基因植株。

本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种一般性启动子、增强启动子或诱导型启动子。

为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入可选择性标记(GUS基因、GFP、YFP、AsRed和荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记基因(潮霉素、庆大霉素、卡那霉素、氨苄青霉素、博莱霉素等)。为了转基因植物释放的安全性，在构建植物表达载体时也可不携带任何标记基因，在苗期进行特定PCR分子标记筛选。

含有本发明的OsDHHC1和Os02g0819100的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等。

本发明的水稻分蘖基因及其蛋白正调节分蘖芽的伸长，在水稻理想株型塑和高产育种中具有很高的应用价值。本发明人将该基因超强表达于水稻后，发现其转化株系的分蘖数和有效穗数显著增加，产量也显著提高。因此，本发明的水稻分蘖基因可以通过基因工程的方法用于增加水稻分蘖数和有效穗数，从而达到水稻增产的目的。同时，还可以利用该水稻分蘖基因来调节分蘖的发生，从而使水稻的分蘖发生理想化，即早期分蘖发生快，中后期不发生分蘖，既保证每亩的穗数，又杜绝无效分蘖，避免浪费营养物质，以最终达到光合物质的经济产量产出最大化。另外，该水稻分蘖基因及其蛋白的分离和鉴定，可以作为一种重要的分子标记用于水稻分子辅助选择育种，加速水稻高产和理想株型塑造育种的进程。

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为水稻和拟南芥的DHHC型锌指蛋白的聚类分析。

图2为AtDHHC1和Os02g0819100的氨基酸序列对比。

图3为Os02g0819100和OsDHHC1的基因序列对比。

图4为Os02g0819100和OsDHHC1的氨基酸序列对比。

图5为OsDHHC1的基因结构分析。

图6为OsDHHC1在不同组织内的表达分析。

图7为T₀代OsDHHC1转基因水稻中的Hpt基因检测。

图8 OsDHHC1过表达植株的表型鉴定及分子检测，其中，A.OsDHHC1转基因株系的代表植株；B.OsDHHC1在野生型和过表达植株中的表达分析；C.野生型和OsDHHC1过表达植株的分蘖数统计。

具体实施方式

下述实施例中提到的实验方法如无特别说明均为常规方法。

1.OsDHHC1基因的克隆

最近，我们研究组通过研究拟南芥多分枝突变体scc10-D分离和鉴定了一个新的DHHC型锌指蛋白基因AtDHHC1(GenBank accession no.At5g04270)，初步发现该基因对腋芽的生长起正调控作用(Xiang，et al.African Journal of Biotechnology，45：7759-7766，2010)。于是我们利用同源对比的方式将AtDHHC1的氨基酸序列在NCBI的水稻数据库中进行blast搜索，共找到了27个DHHC型锌指蛋白序列；同时也将AtDHHC1的序列在NCBI的拟南芥数据库中进行blast搜索，共找到28个DHHC型锌指蛋白序列。然后用分子遗传进化分析软件MEGA4.0.2对水稻和拟南芥DHHC型锌指蛋白序列进行分析并构建了分子进化树(图1)。从树形图中可以看出，AtDHHC1与Os02g0819100的序列相似性最高，处在同一个小分支上，其氨基酸序列相似性高达53％(图2)。由此可见在水稻中与拟南芥AtDHHC1基因相似性最高的是Os02g0819100。我们已知AtDHHC1基因在拟南芥中能调控分枝，于是推测Os02g0819100基因在水稻中也能调控分蘖。

用引物设计软件Primer Premier 5设计了特异的引物：

OsDHHC1Q-F：5’-ATGGCGCGGAGGAGGGGAA-3’

OsDHHC1Q-R：5’-TCAGTTGTTTGTGATCTGGAACTCAGTGCC-3’

以水稻品种日本晴的cDNA为模板进行PCR扩增Os02g0819100基因的CDS序列。结果在电泳检测时发现有2条扩增产物带，一条长约700bp，另一条长约800bp。约700bp的扩增带非常亮，而约800bp的扩增带比较弱。为了确定哪个片段是本发明所扩增的目的基因，将2条带胶回收后亚克隆到pGEM-T vector，并送上海生工生物工程有限公司测序。测序结果显示，约800bp片段的序列与NCBI水稻数据库中由电子克隆得到的Os02g0819100基因序列完全相同；约700bp片段的序列与Os02g0819100基因序列相比少了113-250位点之间的148bp片段，其他部位的序列完全一致(图3)。该基因在GenBank中没有收录，它有完整的开放阅读框(ORF)，编码序列能够通读，与Os02g0819100编码蛋白相比少了38-86位点之间的49个氨基酸(图4)。该研究结果表明，Os02g0819100基因有2种不同的剪接方式：一种较短序列的剪接方式在GenBank中没有登记，而且是该基因的主要剪接方式，命名为OsDHHC1；在GenBank中登记的剪接方式仍命名为Os02g0819100。由于GenBank中登记的Os02g0819100序列仅为水稻基因组测序完成后进行序列分析所得的序列，并且功能未知，而本发明中所提供的OsDHHC1和Os02g0819100经过后续研究发现该2种剪接方式均调控水稻分蘖。

2.OsDHHC1基因的分子特征

通过比较日本晴的Os02g0819100的cDNA及其基因组DNA序列，发现OsDHHC1共有2个外显子(序列3的5’端起：1-112，251-819)，1个内含子(序列1的5’端起：113-249)；其基因组全长为1293bp(见SEQ ID No：1)，cDNA全长为672bp(见SEQ IDNo：2)，其开放阅读框架为序列2自5’端第1至672位点共有672个碱基；该基因编码蛋白长度为223个氨基酸(图5B)。

3.OsDHHC1的表达分析

用已经克隆出短片段的引物OsDHHC1Q-F和OsDHHC1Q-R考察水稻成年植株不同组织部位的OsDHHC1基因表达水平，结果发现在根、茎和穗中都只能扩增出约700bp的片段，但是在叶片中既能扩增出约700bp的片段又能扩增出约800bp的片段(图6)。为了进一步确认该800bp片段是否为该基因的另一种剪接方式，我们将该条带通过胶回收后将其克隆到pGEM-T vector，然后送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果显示该片段序列与NCBI水稻数据库里的Os02g0819100基因序列完全相同。该结果说明，OsDHHC1均能在水稻各组织器官中稳定表达，尤其在穗中表达量最高，相反Os02g0819100仅在叶片表达，或在其它组织器官表达量很低，以致无法检测到。

4.OsDHHC1基因的功能验证

(1)过量表达载体的构建：

为了验证OsDHHC1基因的功能，将OsDHHC1的CDS序列亚克隆到具有相同酶切位点的双元表达载体pCAMBIA1301上，得到重组质粒pCAMBIA1301-OsDHHC1。然后再将该重组质粒通过电激方法转入农杆菌(Agrobacterium)菌株EHA105中。

(2)愈伤组织的诱导：

将野生型中花11(WT)的成熟种子脱壳灭菌，接种到愈伤组织诱导培养基中，培养10天。

(3)转化和筛选：

用含有重组质粒pCAMBIA1301-OsDHHC1的农杆菌菌株浸染水稻愈伤组织，在黑暗处28℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素和450mg/L羧苄青霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织，然后于含35mg/L潮霉素的分化培养基上进行分化培养以获得转基因植株。再生植株经炼苗1周后移栽到大田中，并通过PCR检测潮霉素抗性基因Hpt，确定T₀代转基因阳性植株(图7)。本实施例中，共获得了23个独立阳性转化株系(T₀)。

(4)表型鉴定：

单株收取T₀代种子，在水中浸种2天后，移入37℃培养间催芽3天，然后将露白的种子播在装有滤纸的培养皿中，用100 mg/L的潮霉素筛选1周。一周后统计各转化株系潮霉素抗性苗和敏感性苗的分离比，根据孟德尔遗传规律确定其T-DNA插入拷贝数。然后将抗性苗移栽至苗床上育秧，于4叶期移栽入大田。同时，还可以通过常规分子检测以获得T₁代转基因植株。然后于整个生长发育期考察各转基因植株的农艺性状，结果发现在23个OsDHHC1超强表达株系(OeOsDHHC1)(T₁)中，共有15个株系的分蘖数和有效穗数比野生型明显增加(图8A-C，表1)，而且其产量也增加了10-30％(图8D和E，表1)。该结果说明，OsDHHC1能够促进水稻的分蘖，从而达到增加有效穗数和产量的目的，在水稻理想株型塑和高产育种中具有很高的应用价值。

表1.部分OsDHHC1超强表达株系的农艺性状统计

株系	有效穗数a	单穗种子数a	单株产量(g)a	每亩产量(Kg)b
					WT(中花11)	14.6±2.8	111.2±32	38.9±3.3	466.6±43
OeOsDHHC1-1	18±5.7	165.7±40.8	52.5±5.2	539.9±66
					OeOsDHHC1-2	21.3±5.7	1 39.5±48.7	43.3±4.2	509.8±48
OeOsDHHC1-3	23±3.4	165.6±45.3	52.5±6.3	535.6±72

a.数据(Mean±SE)由栽培于同一个小区的50个单株统计而来。

b.数据(Mean±SE)由50个单株栽培面积的产量折算成的亩产量，分别由3个独立小区统计而来。

Claims (8)

1.一种水稻分蘖相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID No：4或SEQ ID No：5；

2)将序列表中SEQ ID No：4或SEQ ID No：5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且仍然具有水稻分蘖相关蛋白活性。

2.一种权利要求1所述的水稻分蘖相关蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述水稻分蘖相关蛋白的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID No：2或SEQ ID No：3的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID No：4或SEQ ID No：5蛋白质序列的多核苷酸。

4.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述水稻分蘖蛋白的基因组基因，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID No：4或SEQ ID No：5蛋白质序列的多核苷酸。

5.一种含有权利要求2至4任一项所述的水稻分蘖蛋白编码基因的表达载体。

6.一种含有权利要求5所述表达载体的细胞系或宿主菌。

7.一种培育转基因植物的方法，其特征在于：利用权利要求5所述的表达载体导入植物细胞，培育出增加分蘖数和有效穗数的转基因植物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述植物是水稻。

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