CN111875685A - 一种水稻蛋白OsSWC4在调控水稻株型中的用途 - Google Patents

一种水稻蛋白OsSWC4在调控水稻株型中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种水稻蛋白OsSWC4在调控水稻株型中的用途。本发明还涉及调控水稻株型的方法，其包括使OsSWC4蛋白表达降低的步骤。OsSWC4蛋白表达降低能够降低水稻的株高和减少水稻的分蘖。

Description

一种水稻蛋白OsSWC4在调控水稻株型中的用途
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种水稻株高和分蘖相关蛋白 OsSWC4和其编码基因。
背景技术
大米(Oryza sativa L.)是一种主食，为世界一半人口提供粮食，大约 50％以上人类的主要营养来源是大米[1]。世界上95％的水稻产生和消耗在 亚洲，在亚洲饮食谱上占据40-80％的卡路里[2]。在1960年以来，人口的 快速增长和耕种面积的急剧减少使得人们对食物的需求越来越难以满足， 导致了全球化的食物危机，从而也开启了作物的绿色革命。
现代农业中，株高是决定粮食产量的重要性状[3]。水稻“绿色革命” 对提高水稻的产量潜力产生了积极的影响，以矮生品种选育为代表[4]。水 稻半矮秆基因sd-1在现代水稻育种中起到很重要的作用，半矮化植株能够 有效地防倒伏和增加氮肥利用率[5，6]。
分蘖也是影响水稻产量的一个重要农艺性状，分蘖数是决定穗数的 前提，是构成产量的重要基础。适量的有效分蘖更有利于水稻高产。因此 控制水稻株高和分蘖有基因研究有助于水稻品种的改良。
发明内容
本发明提供水稻分蘖和株高相关基因，名称为OsSwc4，来源于水稻(Oryzasativavar)，编码OsSWC4蛋白，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No： 2，核苷酸编码序列为SEQ ID No：1。该基因所表达的蛋白的表达降低能 够降低水稻的株高和减少水稻的分蘖。
在一个方面，本发明提供水稻蛋白或如SEQ ID NO：7所示的序列在 调控水稻株型中的用途，所述蛋白为OsSWC4蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
在一个实施方案中，所述OsSWC4蛋白的核苷酸编码序列如SEQ ID No：1所示。
在一个实施方案中，其中所述水稻株型为株高和/或分蘖。
在一个实施方案中，其中所述调控水稻株型为降低水稻的株高和/或 减小水稻的分蘖数目。
在一个实施方案中，所述水稻的品种是日本晴或9311，优选日本晴。
在另一个方面，本发明提供调控水稻株型的方法，其包括使OsSWC4 蛋白表达降低的步骤，其中所述OsSWC4蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No： 2。
在一个实施方案中，所述水稻的品种是日本晴或9311，优选日本晴。
在一个实施方案中，其中所述水稻株型为株高和/或分蘖。
在一个实施方案中，其中所述调控水稻株型为降低水稻的株高和/或 减小水稻的分蘖数目。
在一个实施方案中，其中使OsSWC4蛋白表达降低的步骤通过基因 敲除、基因敲减等方法来完成。
在一个实施方案中，其中所述基因敲除或基因敲减方法可以是本领 域已知的任何方法，例如RNA干扰的方法。
在一个实施方案中，其中RNA干扰的方法是使用如SEQ ID NO：7 所示的序列进行RNA干扰。
附图说明
图1显示OsSwc4基因RNA干扰示意图。
图2显示干扰植株中OsSwc4基因的表达水平。
图3显示OsSwc4的RNA干扰植株的表型观测(图3a)和株高、分蘖(图 3b)统计图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实 施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
实施例
下述实施例中提到的实验方法如无特别说明均为本领域公知的常规 方法。
实施例1：克隆OsSwc4基因
反转录
·Trizol法提取日本晴水稻(购自安徽省农科院)RNA；
·取约8ug的上述RNA于1.5ml EP管中，按如下体系用DNase I 37℃处理30min，除去DNA：
Figure BDA0002445815010000031
·向上述EP管中加170ul EDPC水，并加入等体积酚仿，充分震荡 混匀。4℃12000rpm离心10min；
·将上清(约200ul)转移至新的1.5mlEP管中，加入1/10体积的 3M NaAC和2.5倍体积预冷的无水乙醇和1.5ul的糖原，颠倒混 匀，-20℃放置30min以上；
·4℃12000rpm离心15min，弃上清，并用冰上预冷的70％乙醇洗 涤2次，去除残留乙醇；
·倒扣晾干，加入25ul DEPC水，2ul olig(dT)18，震荡溶解混匀， 短暂离心。65℃孵育5min，迅速置于冰上冷却，得到RNA与oligdT 混合液，使用诺唯赞公司的反转录试剂盒，按下表加入各组分；
Figure BDA0002445815010000032
Figure BDA0002445815010000041
·55℃水浴锅中孵育1h后，80℃热处理5min。
·补加160ulEDPC水溶解，-20℃保存。
得到日本晴水稻的cDNA。
PCR
从数据库(http：//rice.plantbiology.msu.edu/)中找出与拟南芥Swc4同 源的基因(LOC_Os03g25260，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基 酸序列如SEQ ID NO：2所示)，命名为OsSwc4，设计相应引物(正向引物： ATGGACGCGAAGGACATCCTCG(如SEQ ID NO：3所示)，反向引物： TCAATCAGATGCTTTCAACTTC(如SEQ ID NO：4所示))，扩增本实施例 得到的日本晴水稻的cDNA以获得OsSwc4基因的cDNA。
PCR的反应体系如下：
Figure BDA0002445815010000042
PCR的反应程序如下：98℃下预变性5min，98℃下变性15s，58℃ 下退火30s，72℃下延伸2min，反应35个循环，72℃下后延伸8min，4℃ 保持。
PCR结束后，用merga公司的DNA回收试剂盒回收并纯化扩增的 DNA片段，然后将纯化的DNA片段连接至载体pGEM-T中(Promega公 司)，转化E.coli DH5a感受态细胞，挑选阳性克隆提质粒，委托华大基因 测序，获得长度为1317bp的OsSwc4 cDNA片段，其具有如SEQID NO：1 所示的DNA序列。
实施例2：构建OsSwc4基因的干扰RNA载体
采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术、通过抑制水稻中 OsSwc4基因的表达，验证该基因的功能。这个技术途径的主要机理：将 目标基因的部分片段以反向重复的形式与能够表达双链RNA(double strand RNA，dsRNA)的载体连接，通过遗传转化将该载体导入植物中。获 得的转化植株大量表达与目标基因部分片段同源的dsRNA。这些dsRNA 迅速形成短干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)。这些siRNA与目标 基因的转录子(mRNA)互补配对，在细胞内特殊酶的作用下使目标基因的 转录子降解，从而在mRNA水平上抑制目标基因的功能。研究者可以通 过转基因植株表型的改变，验证目标基因的功能。RNA干扰技术已被广 泛用于基因功能的验证。
本实施例以OsSwc4的CDS序列(SEQ ID NO：1)为模板，设计如下引 物进行PCR：
正向引物(SEQ ID NO：5)：5′- CGCGGATCCACTCATGCCGACCATCGAGGCTT-3′(含BamHI酶切位 点)，
反向引物(SEQ ID NO：6)：5′- CGCGTCGACCTCTAGCAATCAGAAGAGCACG-3′(SEQ IDNO.6含SalI 酶切位点)，
得到如SEQ ID NO：7所示RNA干扰所需片段，OsSWC4基因RNA 干扰示意图见图1。
把SEQ ID NO：7序列用BamHI和SalI酶切后连接到中间载体 PUC18RNAI(购自安徽省农科院)，得到中间载体PUC18RNAI-1测序正确 后，把PUC18RNAI-1用BamHI和SalI酶切得到RNAI片段，PUC18RNAI-1 用XhoI和BglII酶切后与上述片段连接接得到中间载体PUC18RNAI-2， 中间载体PUC18RNAI-2用PstI酶切得到的片段与通用转化载体PCAMBIA1390载体(购自安徽省农科院)(PstI酶切后)连接，得到终载体 PCAMBIA1390-OsSwc4-RNAI。
实施例3.繁育OsSwc4基因的干扰植株
委托安徽省农科院，采用农杆菌EHA105(购自安徽省农科院)介导的 水稻成熟胚愈伤浸染转化方法，将基因编辑载体终载体 PCAMBIA1390-OsSwc4-RNAI转入水稻成熟胚中，具体转化方法如下：(1) 水稻成熟胚愈伤组织的诱导：将成熟的日本晴种子(购自安徽省农科院)去 壳，然后用70-75％酒精表面消毒1-2min，然后用30％NaClO溶液浸泡 15min，并重复2次，然后用灭菌水清洗4-5次。然后将种子置于诱导培 养基上培养，26-28℃避光培养诱导愈伤组织用于转化。(2)水稻愈伤组织 与农杆菌的共培养：将含有上述实施例1中得到的终载体 PCAMBIA1390-OsSwc4-RNAI的EHA105菌株进行活化、富集、重悬，调 整OD600＝0.5-0.6。将愈伤组织收集于50ml无菌离心管中，倒入重悬好 的农杆菌悬浮液，浸染愈伤。浸泡15-30min后，倒掉悬浮液，将浸染过 的愈伤置于无菌滤纸上吸干多余的农杆菌菌液。然后将愈伤组织置于铺有 无菌滤纸的培养皿中，26℃避光培养2-3天。(3)抗性愈伤组织的筛选：共 培养完成后，将愈伤组织转移至含有50-100mg/ml的G418抗生素的筛选 培养基中，26-28℃条件下抗性筛选。(4)抗性愈伤组织的分化：将筛选培 养基中生长状态良好的愈伤组织置于分化培养基中，置于16小时光照/8 小时黑暗、环境温度在26-28℃之间的条件下，分化培养，直至分化长出 小苗。(5)分化小苗的生根：待分化小苗月2-5cm左右时，将小苗转移到生 根培养基中，进行生根培养。长出根系的小苗移栽于温室或转基因圃中进行生长。
利用以下特异性引物对日本晴转化植株和野生型日本晴植株的叶片 中的RNA进行逆转录和PCR扩增测序，鉴定阳性苗。扩增反应程序如下： 98℃下预变性5min，98℃下变性15s，58℃下退火15s，72℃下延伸30s， 反应35个循环，72℃下后延伸8min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳分 离和溴化乙锭染色，切割目的条带送通用送华大基因进行测序。用于鉴定 转染成功的阳性苗的PCR的特异性引物序列如下：
F：5-TGGTTGGTGTCCGTTAGACTCGTCGA-3(如SEQ ID NO：8 所示)
R：5-GTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGA-3(如SEQ ID NO：9 所示)
鉴定出两种阳性苗，其为转入重组载体 pCAMBIA1390-OsSwc4-RNAI的干扰植株，阳性植株的基因型分别命名为 Osswc4-I和Osswc4-II。
实施例4.PCR鉴定阳性苗中水稻基因OsSwc4表达水平的降低分别 提取实施例3得到的阳性苗和受体亲本水稻日本晴植株(对照组)叶片的 RNA，设定内参为Actin，利用内参引物 (AAGTACCCCATCGAGCATGGTATCG(如SEQ ID NO：10所示)和GAGCTGGTCTTGGCAGTCTCCATTT(如SEQ ID NO：11所示))以及 OsSwc4基因的特异性引物(AGGCACCAAGCACACCTAAG(如SEQ ID NO：12所示)和TTCCAGTGGTCTTCCGCTTG(如SEQ ID NO：13所示)) 进行荧光定量PCR反应来检测阳性植株OsSwc4基因的表达水平变化。结 果表明(图2)，转入重组载体pCAMBIA1390-OsSwc4-RNAI的干扰植株(即 阳性苗)中OsSwc4基因的表达水平均比对照组的表达水平明显降低，其中 Osswc4-I系的干扰植株降低至对照组的20％，Osswc4-II系的干扰植株降 低至对照组的46.6％。
实施例5.水稻株高和分蘖相关基因OsSwc4基因表达水平降低的转 基因植株的表型鉴定
将Osswc4-I系和Osswc4-II系的干扰苗和水稻日本晴植株种植在大 田中，观察整个生长周期内干扰植株和日本晴植株(简称WT)的表型差 异。观测结果(水稻抽穗期)如图3所示，与WT植株相比，Osswc4-I和II 系干扰植株均出现矮化和分蘖减少的表型，Osswc4-I系干扰植株比野生型 水稻日本晴植株矮化约33％，分蘖减少约66％，Osswc4-II系干扰植株比 野生型水稻日本晴植株矮化约21％，分蘖减少约54％。从而证明OsSwc4 基因参与控制水稻株高和分蘖。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行 了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已， 并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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Figure IDA0002445815060000011
Figure IDA0002445815060000021
Figure IDA0002445815060000031
Figure IDA0002445815060000041
Figure IDA0002445815060000051

Claims (11)

1.水稻蛋白或如SEQ ID NO：7所示的序列在调控水稻株型中的用途，所述蛋白为OsSWC4蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
2.权利要求1所述的用途，其中所述OsSWC4蛋白的核苷酸编码序列如SEQ ID No：1所示。
3.权利要求1或2所述的用途，其中所述水稻株型为株高和/或分蘖。
4.权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述调控水稻株型为降低水稻的株高和/或减小水稻的分蘖数目。
5.权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述水稻的品种是日本晴或9311，优选日本晴。
6.调控水稻株型的方法，其包括使OsSWC4蛋白表达降低的步骤，其中所述OsSWC4蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：2，其中所述水稻的品种例如是日本晴或9311，优选日本晴。
7.权利要求6所述的方法，其中所述水稻株型为株高和/或分蘖。
8.权利要求6或7所述的方法，其中所述调控水稻株型为降低水稻的株高和/或减小水稻的分蘖数目。
9.权利要求6-8中任一项所述的方法，其中使OsSWC4蛋白表达降低的步骤通过基因敲除或基因敲减的方法来完成。
10.权利要求9所述的方法，其中所述基因敲除或基因敲减方法是RNA干扰的方法。
11.权利要求10所述的方法，其中RNA干扰的方法是使用如SEQ IDNO：7所示的序列进行RNA干扰。
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