CN111808180A

CN111808180A - 植物抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB3及其编码基因和应用

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Publication number: CN111808180A
Application number: CN202010577682.8A
Authority: CN
Inventors: 高世庆; 赵昌平; 刘永杰; 公杰; 赵保存; 张肖; 王永波; 张荃; 张风廷; 庞斌双; 张淑娟; 陈兆波; 陈现朝
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2019-12-08
Filing date: 2020-06-23
Publication date: 2020-10-23
Anticipated expiration: 2040-06-23
Also published as: CN111808180B

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及植物抗旱杂种优势相关蛋白TaNF‑YB3及其编码基因和应用。植物抗旱杂种优势相关蛋白TaNF‑YB3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的抗旱杂种优势相关蛋白及其编码基因对改良、增强小麦抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。

Description

植物抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB3及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及植物抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB3及其编码基因和应用。

背景技术

小麦是我国重要的粮食作物之一，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，每年因干旱、盐碱等逆境胁迫条件严重影响着小麦的产量和品质，制约着我国小麦粮食安全。利用基因工程技术从分子水平上深入研究植物与非生物逆境之间的关系，揭示植物对逆境胁迫信号传导及基因表达调控分子机理，克隆抗逆相关基因为培育作物抗逆新种质提供候选抗逆基因资源。

NF-Y转录因子家族(nuclear factor Y,NF-Y)作为转录因子家族中的一员，是近几年来新发现的一类转录因子家族，NF-Y转录因子不只存在于植物中，还广泛存在于酵母和哺乳动物等真核生物中。NF-Y转录因子由三个不同的亚基组成，分别是 NF-YA、NF-YB和NF-YC，除此之外，酵母等少数真菌中存在第四类亚基HAP4。 NF-Y转录因子在行使其功能时，NF-YA、NF-YB和NF-YC三个亚基之间会特异性结合形成异源三聚体，并与其它调控应答基因的启动子区域相互作用，从而调控下游靶基因的表达。酵母和哺乳动物中的NF-Y基因，一般每种亚基只由一个基因编码，但在植物中每个亚基很大程度上扩展由几个或更多基因编码。这样的家族扩增，在很大程度上提供了NF-YA/NF-YB/NF-YC更多的异源三聚体组合机会，并大量增加了核因子Y功能复杂的潜力。

NF-Y转录因子主要分为NF-YA、NF-YB、NF-YC三个亚基，每个亚基均含有自己独特的保守区域，这些保守区域是DNA特异性结合或者蛋白-蛋白结合所必需的。其中，NF-YA亚基中只含有一个保守结构域，在这个保守结构域中包含两个α螺旋结构域，这两个α螺旋结构域在功能上是相当保守的，这两个功能上保守的区域为A1和A2区域，A1区域位于保守结构域靠近氨基端的区域，由20个氨基酸组成，在功能上主要调控NF-YB/NF-YC异源二聚体相互作用；A2区域位于保守结构域靠近羧基端的区域，由21个氨基酸组成，在功能上主要与特异性DNA相互作用。

转录因子(Transcription factor,TF)又被称为序列特异性DNA结合因子，是一种通过与目的基因上游特异性DNA序列结合来调控其在特定时间、空间表达的一种蛋白质分子。NF-Y作为转录因子家族成员，其在植物胚胎发育、开花时间调控和逆境胁迫响应等诸多方面起重要作用。NF-Y转录因子在胚胎发育过程中的作用，如 AtNF-YA1基因功能突变体的雄性配子和胚胎发生缺陷表型，OsNF-YB1基因的沉默表达导致细胞周期过程中基因的差异表达，导致具有缺陷胚胎和胚乳的异常种子。 NF-Y转录因子在植物开花时间调控中的作用，如ZmNF-YA3基因可以与FT-like12 基因的启动子特异性结合促进早期开花；OsNF-YC2和OsNF-YC4蛋白可以调控水稻的光周期开花反应；AtNF-YC2基因在花诱导中起作用，AtNF-YC2过表达拟南芥植株与野生型相比有早期开花的表型。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB3。

本发明的再一目的是提供编码上述植物抗旱杂种优势相关蛋TaNF-YB3基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的转基因细胞系。

本发明的另一目的提供上述植物抗旱杂种优势相关基因TaNF-YB3的应用。

本发明的再一目的在于提供增强植物抗旱性的方法。

本发明的再一目的在于提供提高植物产量的方法。

根据本发明具体实施方式的抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB3，来源于小麦，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

为了使蛋白TaNF-YB3便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

根据本发明的具体实施方式的TaNF-YB3编码基因，其具有如SEQ ID NO.2所示cDNA序列：

本发明还提供含有TaNF-YB3基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌。

可用现有的植物表达载体构建含有TaNF-YB3基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用TaNF-YB3构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因 (GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明还提供增强植物耐旱性的方法，以及提高植物产量的方法。上述方法包括在植物中过表达TaNF-YB3基因的步骤。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的 TaNF-YB3基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强、产量提高的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：拟南芥、小麦、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明的有益效果：

本发明以抗旱耐盐性较强的京麦8杂交种为实验材料，得到了抗逆相关的 TaNF-YB3蛋白及其编码基因，并将其导入小麦中，显著提高了转基因小麦的抗旱性及产量。本发明的抗旱相关蛋白及其编码基因对改良、增强小麦抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。

附图说明

图1显示179杂交小麦及其父母本幼苗期耐旱性检测结果，其中，A.旱处理前； B.干旱处理20d；C.干旱处理20d+水恢复10d；D.干旱处理20d+水恢复20d。179：二系杂交小麦品种；04Y花27：杂交小麦179的父本；BS1745：杂交小麦179的母本

图2显示179杂交小麦及其父母本干旱胁迫存活率统计结果，179：二系杂交小麦品种；04Y花27：杂交小麦179的父本；BS1745：杂交小麦179的母本；

图3显示胁迫条件下TaNF-YB3基因的表达模式分析(n＝3)，179：二系杂交小麦品种；04Y花27：杂交小麦179的父本；BS1745：杂交小麦179的母本；

图4显示TaNF-YB3转基因小麦筛盒抗旱产量鉴定结果，其中，WT为野生型小麦京冬18；HT1、HT2、HT3为不同转基因小麦株系。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1京麦179杂交小麦及其父母本抗旱表型鉴定

以京麦179及其父本04Y花27、母本BS1745为试验材料。

小麦在正常环境下生长至15d后，对179杂交小麦及其父母本植株地上部分长度进行测量，179的平均株高为12.45cm，母本(BS1745)平均株高为12.65cm，父本(04Y花27)平均株高为12.77cm，父母本地上部分的长度略高于179杂交小麦，如图1中A所示。

停止浇水20d后发现，179杂交小麦及其父母本植株叶片均有卷曲现象，与179 杂交小麦相比，其父母本的叶片卷曲更加严重；胁迫后179杂交小麦植株茎部仍保持挺立，而其父本和母本茎部却已经出现枯萎，如图1中B所示。

水恢复10d后，父母本叶片更加枯萎变黄，而179杂交品系植株部分叶片逐渐恢复坚挺变绿，如图1中C所示；水恢复20d后，父母本植株地上部分完全枯黄甚至死亡，179杂交品系植株叶片完全恢复、茎干坚挺，如图1中D所示。以上现象说明杂交小麦品种179与父本和母本相比，其耐旱性能提高。

本发明观察并统计了水恢复20d后179及其亲本存活的小麦数量，179杂交小麦和其父母本的抗旱实验结果表明，179杂交小麦在干旱条件下，苗期的抗干旱能力明显优于其父母本，存活率明显高于母本BS1745和父本04Y花27，结果如图2 所示。

实施例2克隆TaNF-YB3基因的cDNA

对生长10天左右的京麦8幼苗进行干旱处理5小时，用Trizol提取总RNA。应用5’RACE试剂盒(GIBCOBRL,CAT.NO.18374-058)和3’RACE试剂盒(GIBCOBRL, CAT.NO.18373-019)获得TaNF-YB3基因的全长序列447bp。

用Trizol提取小麦幼苗的总RNA，用superscript II(invitrogen)反转录酶反转录获得到cDNA。根据TaNF-YB3基因编码区序列设计引物P1和P2。以反转录得到的cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增。引物P1和P2的序列如下：

P1：5’-ATGTCGGAGGCGGTGG-3’，

P2：5’-TCAGAGTTCCCCAACACC-3’。

对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到约为500bp左右的条带，与预期结果相符。

用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy(Promega)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。

以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的TaNF-YB3基因的开放阅读框(ORF)为SEQ ID No.2的自5’末端第1至447位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。将含序列SEQ ID No.2所示TaNF-YB3基因的重组载体命名为pTE-TaNF-YB3。

将TaNF-YB3基因的序列进行比对，在小麦中未发现同源蛋白基因，证明 TaNF-YB3基因是一个新的基因。

进一步用引物P1和P2在小麦基因组中进行扩增，结果显示该基因的基因组序列大小与cDNA长度大小一致，不含有内含子序列。

实施例3 TaNF-YB3基因的表达模式分析

本发明分别对179杂交小麦及其父、母本进行15％PEG、250mM NaCl、40℃高温处理及200μM ABA处理四种胁迫处理。

如图3所示，四种胁迫处理后的179杂交小麦中TaNF-YB3基因在15％PEG处理6h时表达量最高，为0h的6.22倍；在250mM NaCl胁迫3h后TaNF-YB3基因表达量最高，为0h的1.42倍；经40℃高温处理6h时TaNF-YB3基因表达量最高，为0h的5.46倍；经200μM ABA处理时，TaNF-YB3基因在处理3h时表达量最高，为0h的1.61倍。

四种胁迫处理后，父本04Y花27中TaNF-YB3基因在15％PEG处理1h时表达量最高，为0h的3.48倍；TaNF-YB3基因在250mM NaCl胁迫24h表达量最高，为0h的1.81倍；TaNF-YB3基因经40℃高温处理1h表达量最高，为0h的2.36倍；经200μM ABA处理时，TaNF-YB3基因在处理1h时表达量最高，为0h的2.62 倍。

四种胁迫处理后，母本BS1745中TaNF-YB3基因在15％PEG处理6h时表达量最高，为0h的3.72倍；TaNF-YB3基因在250mM NaCl胁迫24h表达量最高，为0 h的2.90倍；TaNF-YB3基因经40℃高温处理6h时表达量最高，为0h的2.53倍；经200μM ABA处理时，TaNF-YB3基因在处理24h时达到表达量的最高峰，为0h 的7.16倍。

以上结果表明，179杂交小麦中TaNF-YB3基因受到PEG和高温的强诱导表达，在PEG和高温胁迫下，179杂交小麦中TaNF-YB3基因的表达量要明显高于父本和母本中TaNF-YB3基因的表达量，说明TaNF-YB3基因参与179杂交小麦的抗旱杂种优势调控网络应答。

实施例4用TaNF-YB3基因增强小麦的抗旱性

1重组表达载体的构建

1)35S-TaNF-YB3重组表达载体的构建

以小麦的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有SmaI和SpeI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后SmaI和SpeI双酶切PCR产物回收，将酶切产物正向插入载体pBI121的CaMV 35S启动子之后的SmaI和SpeI酶切位点之间，得到重组载体p35S::TaNF-YB3。

引物序列如下：

TaNF-YB3[SmaI]5’-TCCCCCGGGGATGTCGGAGGCGGTGG-3’，

TaNF-YB3[SpeI]5’-GGACTAGTTCAGAGTTCCCCAACACC-3’。

2转基因小麦获得和功能鉴定

1)转基因小麦的获得

将上述构建的重组表达载体p35S::TaNF-YB3分别用冻融法转化根癌农杆菌EHA105，再用p35S::TaNF-YB3的根癌农杆菌EHA105转化小麦，用含100mg/L卡那霉素的MS培养基进行筛选，得到阳性转基因植株。将筛选得到的阳性转基因植株用PCR做进一步鉴定筛选，PCR所用的一对引物为P3和P4。

P3(上游引物):5’-CCGATCGCCAACATCGGGC-3’，

P4(下游引物):5’-CACAAGCAGCACATGCGTA-3’。

对35S::TaNF-YB3转基因小麦进行PCR鉴定，阳性转基因植株经PCR扩增可获得300bp左右条带，结果获得转35S::TaNF-YB3小麦18株，如图4中上图所示。

同时将pBI121空载体导入小麦，方法同上，作为对照，获得8个株系的转空载体小麦(筛选获得的转基因小麦用T2代表示)。

2)转基因小麦耐旱性鉴定

对TaNF-YB3转基因株系HT1、HT2、HT3转基因株系材料进行小区产量鉴定，其中，京冬18为受体对照，结果如图4中下图及表2所示。

表2 TaNF-YB3转基因小麦产量统计分析

株系名称	旱地小区(Kg)	折亩产(Kg)	较CK±％	穗粒数(个)	千粒重(g)
						HT1	3.90	433.55	5.12	34	34.24
HT2	3.94	437.99	6.20	35	35.68
						HT3	3.97	441.33	7.01	36	34.98
京冬18	3.71	412.43	-	32	33.05

结果表明，在控制浇水情况下，对照京冬18叶片早衰发黄，而转基因株系的叶片持绿性较好。产量比较发现，转基因株系HT1、HT2、HT3比对照京冬18产量增加，其中HT2比对照增产6.2％，千粒重增加显著；HT3比对照增产7.01％，穗粒数增加显著。上述结果表明，TaNF-YB3过表达增强了转基因小麦的抗旱性，产量也比对照有一定幅度的增产。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 植物抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB3及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 148

<212> PRT

<213> 小麦(Triticum aestivuml.)

<400> 1

Met Ser Glu Ala Val Gly Thr Pro Glu Ser Gly Gly Ala Lys Glu Gln

1 5 10 15

Glu Arg Phe Leu Pro Ile Ala Asn Ile Gly Arg Ile Met Arg Arg Gly

20 25 30

Val Pro Glu Asn Gly Lys Ile Ala Lys Asp Ala Lys Glu Ser Ile Gln

35 40 45

Glu Cys Val Ser Glu Phe Ile Ser Phe Ile Thr Ser Glu Ala Ser Asp

50 55 60

Lys Cys Met Lys Glu Lys Arg Lys Thr Ile Asn Gly Asp Asp Leu Ile

65 70 75 80

Trp Ser Met Gly Thr Leu Gly Phe Glu Asp Tyr Val Glu Pro Leu Lys

85 90 95

Leu Tyr Leu Lys Leu Tyr Arg Glu Val Ile Phe Ile His Ser Phe Val

100 105 110

Pro Leu Phe Leu Cys Cys Leu Cys Tyr Ala Cys Ala Ala Cys Glu Arg

115 120 125

Asn Ser Glu Phe Gly Val Arg Arg Arg Phe Gly Gly Tyr Ser Ile Gly

130 135 140

Val Gly Glu Leu

145

<210> 2

<211> 447

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivuml.)

<400> 2

atgtcggagg cggtgggcac gccggagagc ggcggggcga aggagcagga gcggttcctg 60

ccgatcgcca acatcgggcg catcatgcgg cgcggcgtgc cggagaacgg caagatcgcc 120

aaggacgcca aggagtccat ccaggagtgc gtctccgagt tcatcagctt catcaccagc 180

gaggccagcg acaagtgcat gaaggagaag cgcaagacca tcaacggcga cgacctgatc 240

tggtccatgg gcacgctcgg cttcgaggac tacgtcgagc ccctcaagct ctacctcaag 300

ctctaccggg aggtgatatt cattcattca ttcgttcccc tcttcttgtg ctgcttgtgc 360

tacgcatgtg ctgcttgtga gaggaattct gaatttggtg tgagaagaag gtttggtggg 420

tacagtattg gtgttgggga actctga 447

Claims

1.植物抗旱杂种优势相关蛋白TaNF-YB3，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.植物抗旱杂种优势相关基因TaNF-YB3，其特征在于，编码权利要求1所述的植物抗旱耐盐相关蛋白TaNF-YB3。

3.根据权利要求2所述的植物抗旱杂种优势相关基因TaNF-YB3，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2。

4.包含权利要求2所述植物抗旱杂种优势相关基因TaNF-YB3的重组载体。

5.包含权利要求2所述植物抗旱杂种优势相关基因TaNF-YB3的重组菌株。

6.权利要求2所述的植物抗旱杂种优势相关基因TaNF-YB3用于增强植物抗旱性的应用。

7.权利要求2所述的植物抗旱杂种优势相关基因TaNF-YB3用于提高植物产量的应用。

8.增强植物抗旱性的方法，其特征在于，所述方法包括在植物中过表达权利要求2所述的植物抗旱杂种优势相关基因TaNF-YB3的步骤。

9.根据权利要求8所述的增强植物抗旱性的方法，其特征在于，所述植物包括拟南芥、小麦、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草和/或苜宿。

10.提高植物产量的方法，其特征在于，所述方法包括在植物中过表达权利要求2所述的植物抗旱杂种优势相关基因TaNF-YB3的步骤。