CN107557447A

CN107557447A - 一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记与应用

Info

Publication number: CN107557447A
Application number: CN201711048490.2A
Authority: CN
Inventors: 高玉龙; 李文正; 王丙武; 宋中邦; 李梅云; 焦芳婵; 吴玉萍; 李永平; 徐向丽
Original assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Current assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority date: 2017-10-31
Filing date: 2017-10-31
Publication date: 2018-01-09

Abstract

本发明公开了一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记与应用。与NtHMA4野生型位点检测相关的标记，其核苷酸序列如Seq No.1所示；与NtHMA4突变体位点检测相关的标记，其核苷酸序列如Seq No.2所示。应用，其特征在于所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记在利用突变体hma‑ 2h23改良烟草低镉特性回交转育过程中的应用。本发明的分子标记具有简单、快速的优势。该分子标记可以应用于利用突变体hma2‑2h23对烟草品种的低镉改良的回交过程中。

Description

一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记与应用。

背景技术

镉( Cd)、砷( As) 、铬( Cr) 和汞( Hg) 等是公认的对植物和人体危害比较大的重金属元素，其中镉对人体的伤害最大。烟草（Nicotiana tabacum）是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物，而且烟草是富镉作物，其对镉的富集系数达到10，所以近年来关于降低烟草中的镉含量也逐渐成为烟草减害研究的一个热点。

镉对人体的危害巨大，过量的镉进入人体内可能对血管造成损害；另外镉元素对肠道吸收铁具有抑制作用，还会干扰钴、铜、锌等微量元素的代谢过程，引起肺、肾、肝等人体脏器损害，最终可能导致致癌、致畸和致突变等作用。

拟南芥中AtHMA2、AtHMA4主要负责锌和镉从根部向地上部的转运。过量表达HMA4基因可提高植株对镉的忍耐力及吸收力，而HMA4基因突变后则能增强植物对镉的敏感性。RNAi干涉NtHMA4基因的表达后可以降低地上部镉的镉含量（Hermand等，2014，Metallomics，6（8）：1427-1440）。为了降低烟草镉含量，利用EMS诱导我国大面积种植烟草品种云烟87，并从中筛选到一个NtHMA4基因突变体，命名为hma4-4h12。镉其镉含量可以降低到野生型的40%左右。突变体hma4-4h12可以应用于烟草育种培育低镉含量的烟草品种。开发一种简单、方便、有效的区分突变体与野生型品种的分子标记，以实现对突变型的精准鉴定，对后续利用突变位点进行育种筛选具有重要价值。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记；第二目的在于提供所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，与NtHMA4野生型位点检测相关的标记，其核苷酸序列如Seq No.1所示；与NtHMA4突变体位点检测相关的标记，其核苷酸序列如Seq No.2所示。

本发的第二目的是这样实现的，所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记在利用突变体利用突变体hma4-4h12改良烟草低镉特性回交转育过程中的应用。

本发明与现有的技术具有如下优点和效果：

（1）开发了一种用于区分烟草镉转运基因NtHMA4突变体与野生型的分子标记，包括1对PCR扩增引物（HMA4-F5/ HMA4-R5）和1个限制性内切酶AIwNI。

（2）本发明的功能性标记通过常规PCR扩增和酶切反应，能够特异性地检测NtHMA4基因突变后的低镉突变体hma4-4h12，而不需要通过测序检测突变等位基因。本标记更加简单、快捷。该标记可以应用于利低镉突变体hma4-4h12培育低镉烟草材料的过程中，尤其是回交改良低镉特性时，每个回交世代都要选择杂合基因型，该标记可以准确选择目标基因型（杂合型）与轮回亲本回交。

附图说明

图1为烟草镉转运基因NtHMA4野生型序列与突变体hma4-4h12序列比对结果；

图2为PCR引物HMA4-F5/ HMA4-R5扩增产物电泳图，其中：M为100bp DNA Ladder，1-4：突变位点为突变纯合材料， 5-9：突变位点为杂合材料， 10-15：突变位点为野生型纯合材料；

图3为 PCR产物经AIwNI酶切后电泳图，其中M：100bp DNA Ladder，1-4：突变位点为突变纯合材料， 5-9：突变位点为杂合材料， 10-15：突变位点为野生型纯合材料；

图4为样品测序结果，方框所示为突变碱基位点，上为样品1：突变位点为碱基T，显示单峰，突变体纯合；中为样品5：突变位点为碱基T和C混合，显示双峰，杂合突变；下为样品10：突变位点为碱基C，显示单峰，野生型纯合。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记，与NtHMA4野生型位点检测相关的标记，其核苷酸序列如Seq No.1所示；与NtHMA4突变体位点检测相关的标记，其核苷酸序列如Seq No.2所示。

NtHMA4突变体为hma4-4h12突变体。

本发明所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记的引物对，所述的引物对为：

上游引物：HMA4-F5：TAGAGTGTAGAGGAAAAATAGAAAGAAGAG；

下游引物：HMA4-R5：TCATGAATAACAATGACAGTCTCT。

本发明所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记的应用为所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记在利用突变体利用突变体hma4-4h12改良烟草低镉特性回交转育过程中的应用。

本发明所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记的鉴定方法，包括以下步骤：

（1）利用PCR引物HMA4-F5 / HMA4-R5对烟草基因组进行PCR扩增；

（2） PCR产物经纯化后利用AIwNI酶切，如果PCR产物能被AIwNI酶切，则为野生型；如果PCR产物不能被AIwNI酶切，则为突变体。

步骤（1）所述的PCR扩增利用ExTaq进行（Takara），25µL体系，PCR体系包括以下成分：

ExTaq 0.125µL

10x ExTaq Buffer(Mg2+ free) 2.5µL

MgCl₂ 2µL

dNTP(2.5mM) 2µL

基因组DNA 0.5µL

上游引物HMA4-F5（10µM） 0.5µL

下游引物HMA4-R5（10µM） 0.5µL

灭菌超纯水 16.875 µL。

步骤（1）所述的PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃90s，35个循环； 72℃ 7min。

本发明所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记，与NtHMA4野生型位点检测相关的核苷酸序列如下所示（Seq No.1）：

TAGAGTGTAGAGGAAAAATAGAAAGAAGAGAATGGTGGAAAGTGAGAAAATGAATGACACAAAGAATCTGAGCAAGAGCTATTTTGATGTTTTGGGAATTTGCTGTACTTCAGAAGTTGTTCTTGTTGAAAAAATTCTCAAGAATCTTGAAGGGGTTAAAGAGGTTTCAGTAATTGTCACAACAAAGACTGTCATTGTTATTCATGA

与NtHMA2突变体位点检测相关的核苷酸序列如下所示（Seq No.2）：

TAGAGTGTAGAGGAAAAATAGAAAGAAGAGAATGGTGGAAAGTGAGAAAATGAATGACACAAAGAATCTGAGCAAGAGCTATTTTGATGTTTTGGGAATTTGCTGTACTTCAGAAGTTGTTCTTGTTGAAAAAATTCTCAAGAATCTTGAAGGGGTTAAAGAGGTTTCAGTAATTGTCACAATAAAGACTGTCATTGTTATTCATGA

所述的镉转运基因突变体为hma4-4h12。

本发明还公开了一种用于鉴别上述烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变型的分子标记引物，具体为：

上游引物：HMA4-F5：TAGAGTGTAGAGGAAAAATAGAAAGAAGAG（Seq No.3），

下游引物：HMA4-R5：TCATGAATAACAATGACAGTCTCT（Seq No.4）；

所述的用于鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记在烟草育种辅助选择中的应用。

应用上述引物鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的方法，其特征包括以下步骤：

（1）利用上游引物（HMA4-F5）和下游引物（HMA4-R5）对待鉴定材料DNA进行扩增。

（2）扩增产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后利用AIwNI酶切，并进行电泳分析，如果PCR产物能被AIwNI酶切，酶切产物为21bp和186bp两条片段（琼脂糖凝胶电泳只能看到186bp的片段），则为野生型NtHMA4；如果PCR产物不能被AIwNI酶切，依然为207bp，则为纯合突变体hma4-4h12；如果酶切产物为21bp、186bp和207bp三条片段（琼脂糖凝胶电泳只能看到186bp和207bp两条带），则为野生型和突变体的杂合体。

步骤（1）中所述的PCR扩增利用ExTaq进行（Takara）， 25µL体系。PCR体系包括以下成分：

ExTaq 0.125µL

10x ExTaq Buffer(Mg2+ free) 2.5µL

MgCl₂ 2µL

dNTP(2.5mM) 2µL

基因组DNA 0.5µL

上游引物HMA4-F5（10µM） 0.5µL

下游引物HMA4-R5（10µM） 0.5µL

灭菌超纯水 16.875 µL

PCR扩增反应程序优选为： 94℃预变性5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s，35个循环； 72℃ 7min。扩增的目的条带大小为207bp。

下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

实施例1

一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体hma4-4h12的分子标记的建立。

引物设计

突变体hma4-4h12是通过EMS诱变获得的，其突变方式为152位核苷酸（CDS）由C变为T，导致第51位氨基酸由苏氨酸（Thr）突变为异亮氨酸（Ile）。利用dCAPS Finder 2.0在线设计软件（http：//helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html），根据突变序列和野生型序列设计引物，引物序列如下：

上游引物：HMA4-F5：TAGAGTGTAGAGGAAAAATAGAAAGAAGAG（Seq No.3），

下游引物：HMA4-R5：TCATGAATAACAATGACAGTCTCT（Seq No.4）；

上述引物扩增突变型和野生型产物都是207bp，野生型PCR产物可以被限制性内切酶AIwNI切成21bp和186bp两条片段，而突变型PCR产物不可以被AIwNI酶切。

实施例2

利用上述分子标记分析利用突变体hma4-4h12回交改良云烟87低镉特性的BC₃F₂群体中的15个材料的基因型。

（1）烟草叶片基因组DNA提取

利用DNeasy Plant Mini Kit （QIAGEN，德国）试剂盒提取烟草叶片DNA。具体步骤如下：将样品液氮研磨，并用1.5ml离心管收取；加入400ul的AP1溶液，4ul的RNA酶混匀；把样品放入65℃水浴锅水浴10min，期间摇匀3次；往样品中加入130ul P3溶液，冰浴5mim；高速离心，13200rpm，5min；取上层液倒入紫色过滤柱，13200rpm，2min离心；将滤液转入新的1.5mL离心管并加入675ul的AW1溶液混匀;把混匀样品溶液分2次转入淡黄色过滤柱并进行10000rpm，1min离心，弃除滤液；把淡黄色过滤柱放入新的2ml离心管中并加入500ul的AW2溶液，进行10000rpm，1min离心，弃滤液 (此步骤重复两次)；再把弃除滤液的淡黄色过滤柱进行空转（10000rpm，1min），将空转好的淡黄色过滤柱放入新的1.5ml离心管中加入50ulAE溶液后静置5min，放入离心机进行10000rpm，1min离心，去除淡黄色过滤柱，放入4℃冰箱保存。

（2）利用鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记分析15个BC₃F₂回交世代材料NtHMA4基因型。

利用PCR引物（HMA4-F5/ HMA4-R5）进行扩增，利用ExTaq（Takara）进行，总体积25µL，包括以下成分：ExTaq 0.125µL，10x ExTaq Buffer(Mg2+ free) 2.5µL，MgCl₂，2µL，dNTP(2.5mM) 2µL，基因组DNA 0.5µL，上游引物HMA4-F5（10µM） 0.5µL，下游引物HMA4-R5（10µM） 0.5µL，灭菌超纯水 16.875 µL。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s，35个循环； 72℃ 7min。吸取5µL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增的目的条带大小为207bp。

扩增产物利用PCR产物纯化试剂盒（QIAGEN）进行纯化，具体步骤：①在PCR 产物里加5倍体积的PB溶液，混匀。②将上述溶液转移至紫色过滤柱，12000 rmp离心30s。③弃滤液，往过滤柱里加750 µL PE，12000 rmp离心30s。④弃滤液，过滤柱12000rpm转离心1min。⑤将过滤柱转移至新的1.5mL离心管，在过滤柱里加20µL buffer PE，12000 rmp，离心1min收集PCR纯化产物，贮存于4℃。

利用AIwNI（NEB）酶切，酶切检测体系为20µL，包括灭菌超纯水：7.25µL，AIwNI :0.25µL，CutsmartTM:2.5µL， PCR纯化产物：10µL。37℃酶切2h。酶切产物经3%琼脂糖凝胶电泳检测（图3），如果PCR产物能被AIwNI酶切，酶切产物为21bp和186bp两条片段（琼脂糖凝胶电泳只能看到186bp的片段），则为野生型NtHMA4（样品1-4）；如果PCR产物不能被AIwNI酶切，依然为207bp，则为纯合突变体hma4-4h12（样品10-15）；如果酶切产物为21bp、186bp和207bp三条片段（琼脂糖凝胶电泳只能看到186bp和207bp两条带），则为野生型和突变体的杂合体（样品5-9）。酶切结果（图3）与测序结果（图4）一致，该标记可以代替以往的测序方法，对NtHMA2突变体进行准确鉴别。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记与应用

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 207

<212> DNA

<213> NtHMA4野生型位点检测相关的核苷酸序列

<400> 1

tagagtgtag aggaaaaata gaaagaagag aatggtggaa agtgagaaaa tgaatgacac 60

aaagaatctg agcaagagct attttgatgt tttgggaatt tgctgtactt cagaagttgt 120

tcttgttgaa aaaattctca agaatcttga aggggttaaa gaggtttcag taattgtcac 180

aacaaagact gtcattgtta ttcatga 207

<210> 2

<211> 207

<212> DNA

<213> NtHMA2突变体位点检测相关的核苷酸序列

<400> 2

tagagtgtag aggaaaaata gaaagaagag aatggtggaa agtgagaaaa tgaatgacac 60

aaagaatctg agcaagagct attttgatgt tttgggaatt tgctgtactt cagaagttgt 120

tcttgttgaa aaaattctca agaatcttga aggggttaaa gaggtttcag taattgtcac 180

aataaagact gtcattgtta ttcatga 207

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> HMA4-F5

<400> 3

tagagtgtag aggaaaaata gaaagaagag 30

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> HMA4-R5

<400> 4

tcatgaataa caatgacagt ctct 24

Claims

1.一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记，其特征在于与NtHMA4野生型位点检测相关的标记，其核苷酸序列如Seq No.1所示；与NtHMA4突变体位点检测相关的标记，其核苷酸序列如Seq No.2所示。

2.根据权利要求1所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记，其特征在于NtHMA4突变体为hma4-4h12突变体。

3.一种权利要求1或2所述鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记的引物对，其特征在于所述的引物对为：

上游引物：HMA4-F5：TAGAGTGTAGAGGAAAAATAGAAAGAAGAG；

下游引物：HMA4-R5：TCATGAATAACAATGACAGTCTCT。

4.一种权利要求1或2所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记的应用，其特征在于所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记在利用突变体利用突变体hma4-4h12改良烟草低镉特性回交转育过程中的应用。

5.一种权利要求1或2所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记的鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）利用PCR引物HMA4-F5 / HMA4-R5对烟草基因组进行PCR扩增；

6.根据权利要求5所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记的鉴定方法，其特征在于步骤（1）所述的PCR扩增利用ExTaq进行（Takara），25µL体系，PCR体系包括以下成分：

ExTaq 0.125µL

10x ExTaq Buffer(Mg2+ free) 2.5µL

MgCl₂ 2µL

dNTP(2.5mM) 2µL

基因组DNA 0.5µL

上游引物HMA4-F5（10µM） 0.5µL

下游引物HMA4-R5（10µM） 0.5µL

灭菌超纯水 16.875 µL。

7.根据权利要求5所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记的鉴定方法，其特征在于步骤（1）所述的PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃ 30s，55℃30s，72℃ 90s，35个循环； 72℃ 7min。