CN104004770A - 一种烟草镉转运基因NtHMA4及其克隆方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了烟草镉转运基因NtHMA4及其克隆方法与应用，烟草镉转运基因NtHMA4核苷酸序列如SEQID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQID：No.2所示。本发明还公开了烟草镉转运基因NtHMA4的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtHMA4基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtHMA4基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。通过调控烟草镉转运基因NtHMA4的表达，可降低镉从烟草根部转运到叶片的转运率，从而降低烟叶的铬含量，为生产绿色优质烟叶提供了基因资源。

Description

一种烟草镉转运 基因 NtHMA4 及其克隆方法与应用

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草镉转运基因NtHMA4及其克隆方法与应用。

背景技术

烟草（Nicotiana tabacum）是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物。烟草属大约有60多种。重金属镉是烟草生长的非必须元素，但容易被吸收，并且通过食物链对人体产生危害。镉随水灌溉和污泥进入土壤中，被土壤吸附的镉一般在0~15cm的表层土壤中积累。土壤中过量的镉，不仅能在烟草体内残留，而且也会对烟草的生长发育起明显的危害作用，破坏叶绿体结构，降低叶绿素含量，叶片发黄，光合过程的减弱，生长缓慢，植株矮小，根系受到抑制，生长受阻，产量下降。镉污染对烟草种子出苗、烟草光合特性、烟草体内矿质元素含量、烟草组织结构、烟草酶活性、烟草生长量和烟叶品质均有较大影响。

Cd²⁺的吸收主要是通过一些对Cd²⁺具有低亲和性的多底物金属离子转运蛋白或通道蛋白进入植物细胞内。例如，小麦的LCTI蛋白在酿酒酵母中表达能够介导Cd²⁺流入细胞内，并使酵母细胞对Cd²⁺高度敏感，这种Cd²⁺高度敏感性可能是由于LCTI蛋白对Cd²⁺吸收所造成的。另外，金属转运蛋白的Nramp家族也具有能够将Cd²⁺转运至植物细胞内的功能。酿酒酵母Nramp家族成员SMF1和SMF2蛋白不但能够转运Mn²⁺而且能够转运Cu²⁺、Co²⁺和Cd²⁺。目前研究表明，镉元素从地下部向地上部的转运是借助于膜转运蛋白进行的，例如P_1B型ATPase亚家族成员HMA。 HMA蛋白家族可以根据转运功能分为两类，即Cu/Ag转运泵和Zn/Cd/Co/Pb转运泵。AtHMA4拟南芥中克隆的第一个编码HMA的基因，该基因参与Zn²⁺的和Cd²⁺从根部向地上部的转运。过表达AtHMA4不仅提高植物对 Zn²⁺和Cd²⁺的耐性，而且增加上述金属从根向地上部的转移率。可见AtHMA4具有从根部向地上部转运的功能。

国际上一些知名烟草公司和研究机构正采用生物技术和基因工程技术对烟草品种进行改良，以提高烟草对镉的抗性，减少烟草对土壤镉的吸收和转运。我国也提出了无公害优质烟的开发计划，为烟草重金属危害的研究提供了新的契机。随着烟草镉污染研究的深入，必将使我国烟草镉污染控制迈上了新的台阶，为我国烟叶的健康和可持续发展奠定基础。因此，开发一种利用生物技术手段降低烟草镉转运率（叶片镉含量/根镉含量）的候选基因，通过基因操作减少烟叶镉含量是非常必要的。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种烟草镉转运基因NtHMA4；本发明的第二目的在于提供所述烟草镉转运基因NtHMA4的克隆方法；本发明的第三目的在于提供所述烟草镉转运基因NtHMA4的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草镉转运基因NtHMA4核苷酸序列为SEQ ID：No.1所示。

本发明的第二目的是这样实现的，所述烟草镉转运基因NtHMA4的克隆方法包括以下步骤：

A、确定NtHMA4基因序列；

B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；

C、根据NtHMA4基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；

D、回收和纯化PCR产物；

E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；

F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的烟草镉转运基因NtHMA4用于降低镉从烟草根部转运到烟叶的转运率。

本发明利用RACE技术从烟草中得到一个烟草镉转运基因NtHMA4，具体步骤为：以烟草基因组数据库（行业内部数据库）基因Ntom0672570为核心序列设计RACE引物，3′RACE基因特异引物为AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA，5′RACE基因特异引物为CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA。克隆基因末端RACE试剂盒为Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit，反应根据试剂盒说明书进行。3′端扩增到600bp左右的片段，5′端扩增到500bp左右的片段。回收后进行测序，并与核心序列拼接获得NtHMA4全长cDNA。利用农杆菌介导的遗传转化方法获得NtHMA4基因的过表达和RNAi植株，对NtHMA4进行功能验证，结果表明NtHMA4基因具有将镉从烟草根部转运到叶片的功能。NtHMA4基因的发现，为通过调控基因的表达，控制烟叶重金属镉含量，为生产绿色优质烟叶提供了基因资源。

附图说明

图1为利用引物对NtHMA4F/NtHMA4R扩增NtHMA4基因结果，扩增产物4377bp；

图2为pBI121-NtHMA4载体PCR鉴定，所用引物对为NtHMA4F/NtHMA4R，扩增产物为4377bp；

图3为 pBI121-NtHMA4载体测序验证，灰色部分为过表达载体中部分基因序列斜体部分为载体序列；

图4为 NtHMA4基因RNAi载体片段PCR扩增结果，所用引物对为HMARNAiF/HMARNAiR，扩增产物为369bp；

图5为RNAi 载体pBI121-pQLi-NtHMA4的酶切验证，XbalI和SacI双酶切后可以将1500bp左右的反向重复单元切下；

图6 为NtHMA4RNAi烟草植株镉转移率，Vector Control为转空载体对照，其余为转基因植株；

图7为NtHMA4过表达烟草植株镉转移率，Vector Control为转空载体对照，其余为转基因植株。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的烟草镉转运基因NtHMA4核苷酸序列为SEQ ID：No.1所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID：No.2所示。

所述的烟草镉转运基因NtHMA4来源于绒毛状烟草。

本发明所述所述的烟草镉转运基因NtHMA4的克隆方法，包括以下步骤：

A、确定NtHMA4基因序列；

B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；

C、根据NtHMA4基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；

D、回收和纯化PCR产物；

E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；

F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。

所述的步骤A包括如下步骤：（1）利用同源基因拟南芥At HMA4序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA4的EST序列（NCBI号：FG135138.1）；

（2）利用FG135138.1比对烟草基因组数据库（行业内部数据库），获得一个基因序列（Ntom0672570），根据此序列设计RACE引物，克隆基因末端RACE试剂盒为Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit，反应根据试剂盒说明书进行。3′端扩增到500~700bp的片段，5′端扩增到400~600bp的片段。回收后进行测序；（3）测序结果与核心序列拼接获得NtHMA4全长cDNA。其序列如SEQ ID NO.1 所示。其中，步骤（2）所述的RACE引物为：

3′RACE基因特异引物：5′-AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA-3′；

5′RACE基因特异引物：5′-CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA-3′。

所述步骤C的特异性引物为：

正向引物：NtHMA4F：5′- CTTCCTTAGAGTAGAGTGTAGA -3′；

反向引物：NtHMA4R：5′- CTACTCTATGACAATTTCTGATAA -3′。

本发明所述的烟草镉转运基因NtHMA4的应用，其特征在于所述的烟草镉转运基因NtHMA4用于制备降低烟叶镉含量的转基因烟草中的应用。

所述烟草镉转运基因NtHMA4的应用，主要通过调控该基因的表达，降低镉从烟草根部转运到烟叶的转运率，从而降低烟叶中重金属镉的含量。降低镉从烟草根部转运到烟叶的转运率的方法包括如下步骤：

A、构建RNAi载体；

B、农杆菌转化；

C、RNAi载体导入烟草；

D、培养转基因植株。

本发明的工作原理为利用RACE技术从烟草中得到一个烟草镉转运基因NtHMA4序列，具体步骤为：以烟草基因组数据库（行业内部数据库）基因Ntom0672570为核心序列设计RACE引物，3′RACE基因特异引物为AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA，5′RACE基因特异引物为CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA。克隆基因末端RACE试剂盒为Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit，反应根据试剂盒说明书进行。3′端扩增到600bp左右的片段，5′端扩增到500bp左右的片段。回收后进行测序，并与核心序列拼接获得NtHMA4全长cDNA。再对基因NtHMA4进行克隆，构建重组载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法获得NtHMA4基因的过表达和RNAi植株，对NtHMA4进行功能验证，结果表明NtHMA4基因具有将镉从烟草根部转运到叶片的功能。理论上，可通过调控NtHMA4基因的表达，控制烟叶重金属镉含量，为生产绿色优质烟叶提供了基因资源。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

1、NtHMA4基因的克隆，为降低烟叶镉含量分子育种提供新的基因资源，该基因资源的开发利用有利于生产低镉含量烟草和实现绿色优质烟叶的开发。

2、通过农杆菌介导的遗传转化方法获得该基因过表达和抑制表达的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的NtHMA4基因具有将镉从烟草根部转运到叶片的功能。

实施例1 ——NtHMA4基因的分离克隆

利用同源基因拟南芥At HMA4序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA4的EST序列得到烟草NtHMA4的EST序列（NCBI号：FG135138.1）；利用FG135138.1比对烟草基因组数据库（行业内部数据库），获得一个基因序列（Ntom0672570）；以此序列为核心序列通过RACE获得基因全长，具体步骤为：以烟草基因组数据库（行业内部数据库）基因Ntom0672570为核心序列设计RACE引物，3′RACE基因特异引物为AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA，5′RACE基因特异引物为CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA。克隆基因末端RACE试剂盒为Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit，反应根据试剂盒说明书进行。3′端扩增到600bp左右的片段，5′端扩增到500bp左右的片段。回收后进行测序，并与核心序列拼接获得NtHMA4全长cDNA。根据全长cDNA序列设计PCR引物克隆基因全长。

对目的产物测序，得到新基因NtHMA4，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其中131～4342 bp为该基因的编码区，包含4212bp的开放阅读框；编码1404个氨基酸，如序列表SEQIDNO.2所示。

提取烟草根部RNA，抽提使用Trizol试剂盒（Invitrogen,按该试剂盒提供的说明书操作）。

取2μg RNA进行反转录，利用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（TAKARA）试剂盒进行基因组DNA去除并反转录（按试剂盒操作手册操作）。

将反转录得到的第一链cDNA作为模板，用于PCR扩增NtHMA4基因全长，并设计特性行引物如下：

正向引物：NtHMA4F：5′- CTTCCTTAGAGTAGAGTGTAGA -3′；

反向引物：NtHMA4R：5′- CTACTCTATGACAATTTCTGATAA -3′

PCR反应体系为50μL，包括：200ng cDNA，1×Phusion HF反应缓冲液，10mM dNTP，2U的Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase，上述引物各1μM。PCR反应在Mastercycler® pro（Eppendorf，德国）扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，10秒，60℃，20秒，72℃，2分钟，40个循环；72℃延伸7分钟。

产物经1%（g/mL）的琼脂糖凝胶电泳分离，扩增结果产生一条单一PCR条带，见图1。用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN，德国）回收扩增条带，提取步骤参照试剂盒使用说明。回收纯化的DNA与TOPO载体（Invitrogen ZERO Blunt TOPO RCR Cloning kit）连接，按说明书操作。连接产物利用热激法转化大肠杆菌DH5，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个克隆测序（大连宝生物工程有限公司）。测序结果表明NtHMA4基因的全长为4377bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，通过测序、比对确定是本发明需要的目的基因，申请人将该基因命名为NtHMA4。NtHMA4基因包括4335bp的开放阅读框；编码1445个氨基酸。推导的NtHMA4基因的氨基酸序列与拟南芥AtHMA4具有53%的相似性。

实施例2 ——植物转化载体构建

（1）过表达载体构建。根据pBI121载体序列酶切位点，利用Primer Premier5.0软件设计出构建NtHMA4基因过表达的引物对，其序列如下所示：

正向引物：5′- GGGTGGATCCCTTCCTTAGAGTAGAGTGTAGA -3′；

反向引物：5′- TAATGAGCTCCTACTCTATGACAATTTCTGATAA -3′。

下划线所示为酶切位点。

以NtHMA4基因阳性克隆DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系激扩增程序同实例1。双酶切体系：反应总体积为40μL，含PCR纯化后的产物10μL， 10×NEB Buffer1.1 4μL，BamHI和SacI各2μL，灭菌双蒸水22μL。37℃酶切过夜后纯化。pBI121载体的双酶切体系：反应总体积为40μL，含纯化的pBI121质粒DNA 10μL，10×NEB Buffer1.1 4μL，BamHI和SacI各2μL，灭菌双蒸水22μL。37℃酶切过夜后纯化。

连接反应体系中NtHMA4基因与pBI121载体的摩尔比为5:1，反应总体积为10μL，其中：10×连接Buffer 1μL，T4 DNA连接酶1μL，NtHMA4基因双酶切片段6μL，pBI121载体双酶切片段2μL。16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌菌种DH5α。

在含有卡那霉素（50mg/L）的LB固体培养基上筛选阳性克隆，抽提质粒后进行PCR（图2）及酶切鉴定（图3），即pBI121-NtHMA4载体测序验证，AGTTCATTTCATTTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGA GGATCCCTTCCTTAGAGTAGAGTGTAGAGGAAAAATAGAAAGAAGAGAMATGGTGGAAAGTGAGAAAATGAATGACACAAAGAATCTGAGCAAGAGCTATTTTGATGTTTTGGGAATTTGCTGTA，其中下划线部分为过表达载体中部分基因序列斜体部分为载体序列。构建的载体命名为pBI121-NtHMA4。

（2）抑制表达（RNAi）载体构建

以pQLi载体为中间载体，pBI121为表达载体构建NtHMA4基因的RNAi 载体，构建引物为：

HMARNAiF：CATTCTAGAGAGCTCGGATCCGAATCAAGCAAGATTAGAAGCA

HMARNAiR：TCAACTAGT GATATCCTCGAGAGTGATGACATAGCAGCAGT

HMARNAiF中下划线分别为XbaI，SacI，BamHI酶切位点；HMARNAiR中下划线分别为SpeI，EcoRV酶切位点。

以NtHMA4基因阳性克隆DNA为模板进行PCR扩增（结果见图4）。PCR扩增体系激扩增程序同实例1。NtHMA4基因RNAi正向片段与pQLi载体连接：利用BamHI和EcoRV分别双酶切纯化的PCR产物和pQLi载体，反应体系同过表达载体的构建。酶切后回进行回收纯化并进行连接。连接反应体系中RNAi正向片段和pQLi的摩尔比为5:1，反应程序同过表达载体构建部分。连接产物转化大肠杆菌菌种DH5α后提取质粒进行酶切鉴定。NtHMA4基因RNAi反向片段与连接有正向片段的pQLi载体连接：SacI和SpeI分别双酶切RNAi反向片段与连接有正向片段的pQLi载体，酶切后回收纯化并进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α细胞，转化子抽提后进行酶切验证。构建的中间载体命名为pQLi-HMA4。

利用XbaI和SacI分别双酶切pBI121和pQLi-HMA4载体，回收pBI121大片段和pQLi-HMA4载体酶切后1000bp左右的片段，进行连接。连接后转化大肠杆菌DH5α，抽提质粒进行酶切验证（图5），程序同上。构建的载体命名为pBI121-pQLi-NtHMA4。

实施例3 ——烟草的遗传转化

（1）表达载体转化农杆菌

利用冻融法（参照萨姆布鲁克，拉塞尔著，黄培堂等译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002 年）将重组载体pBI121-NtHMA4和pBI121-pQLi-NtHMA4转入农杆菌军中GV3101。

从-80℃冰箱中取出3管农杆菌感受态细胞，冰上溶解，分别加入重组表达载体pBI121-NtHMA4、pBI121-pQLi-NtHMA4和pBI121空载体。

将以上混合物放入液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟。

相混合物中加入1mL LB培养基，28℃，220rpm培养3～4小时。

培养物涂布于含有卡那霉素（50mg/L）和利福平（25mg/L）的LB固体培养基上，28℃倒置培养2～3天。可见含有目的载体的克隆。

（2）烟草转化

挑取含有目标载体的农杆菌在含有卡那霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2～3天。

刮取划线菌斑接菌于含有卡那霉素和利福平的MS培养基中，28℃，220rpm震荡培养，菌液浓度达到OD=0.5～0.8时进行侵染。

将菌体收集到离心管中，6,000rpm离心分钟富集菌体，弃上清，再用约20ml液体MS培养基重悬菌体。

将叶片置于500mL广口瓶中，加入适量70％乙醇，漂洗1min。；倒掉乙醇，加入0.1％HgCl₂溶液（称取升汞0.1克，用少许酒精溶解，再加水至100毫升），置摇床上室温振荡15～30分钟； 倒掉溶液，用无菌水冲洗6遍；将叶片取出，用灭菌吸水纸洗去表面液体，取无菌叶片用剪刀切成1cm×1cm的小片，将切成小片的植物叶片放入无菌MS液体培养基悬浮的菌液中，静置15～20min。

取出材料，用无菌滤纸吸去多余菌液，于共培养培养基中（MS+6-BA 1.0mg/L + NAA 0.1mg/L ），25℃暗培养两天。

把材料转入分化培养基中（MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 200mg/L + Carb（羧苄青霉素钠）500mg/L），切口接触培养基，于温室中分化培养，每2-3周将其转移到新的培养基中。切口处逐渐长出愈伤组织，最后分化出芽。

将长至3～5cm的芽切下，转入生根培养基（MS）诱导生根。

生根后的转基因植株由生根培养基中取出，用自来水净培养基，移植于灭菌的营养土中。

转基因植株经NPTII基因特异引物PCR验证扩增，鉴定转基因阳性植株。

实施例4 ——转基因植株镉吸收试验

转基因植株移栽到一次性花盆后，置于育苗池中，育苗池内10cm左右含的水（含4ppm氯化镉）。

生长30天后，取转基因植株叶片和根，60℃烘干，测定镉含量，计算转基因植株镉转移率（叶片镉含量/根镉含量），结果见图6、图7。RNAi植株NtHMA RNAi-6、NtHMA RNAi-41、NtHMA RNAi-43镉转移率比空载体对照Vector Control降低50%以上。NtHMA4过表达植株NtHMA4OE-2、NtHMA4OE-9、NtHMA4OE-22镉转移率比空载体对照Vector Control提高2倍以上。上述结果表明，NtHMA4基因负责烟草镉从根部向叶片的运输。通过对该基因的遗传操作，可以降低烟草叶片镉含量。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种烟草镉转运基因NtHMA4及其克隆方法与应用

<130> 2014

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4737

<212> DNA

<213> NtHMA4 核苷酸序列

<400> 1

gaaaattctc tgcatgtttt tataagagaa actaatcacc tctttccaaa acaaaagtat 60

atccaattta tctcagagcc aaaagtccct ttttcattta ttatcttctc ctcttcctta 120

gagtagagtg tagaggaaaa atagaaagaa gagaatggtg gaaagtgaga aaatgaatga 180

cacaaagaat ctgagcaaga gctattttga tgttttggga atttgctgta cttcagaagt 240

tgttcttgtt gaaaaaattc tcaagaatct tgaaggggtt aaagaggttt cagtaattgt 300

cacaacaaag actgtcattg ttattcatga ttctctcctc atttctcagc aacaaattgt 360

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ccaaaagaaa tggccaagtc catttgcaat tggcagtgga atattgcttg gactctcatt 480

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tcttgtttta atagcagtga cgggatcaat tgttttacac gattattggg aagctggtac 660

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tgctgctatg tcatcactgg tcaatatagt ccctccaaca gcagttttag ctgaaagtgg 780

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tgacaagtgt gctaaatatt atacaccagc aattgtggct atatcagctt ctttggcaat 1140

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gttggtgagt gcatgtccgt gtgcacttgt gctatctaca ccagttgcca tgtgttgtgc 1260

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atcaaattcc gttgagccaa agcctgatag agttgagcag tttcaaaatt ttcctggtga 1560

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aagagctgga tgtactacag taccagaaat agagggtgat agtttccaag gaaagtctgt 1680

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aattggtgta aaagaagcca tgagagagct gaagcagatg ggtatcaaaa ccgcgatgct 1800

tactggtgat tgttatgcag ctgccaacca tgtgcaggat cagttaggtg gagctatgga 1860

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tatactaatg acaaatgaca tcggaagaat accaaaagct gcacgtcttg ctagaagagt 2100

tcgaaggaag attgttgaga atatgattat atcagtcgtt acaaaggccg ccatagttgc 2160

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cttgctagtg atcttgaaca gcatgctact tctacgagta ggcacacaca gacatgggaa 2280

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ttgcaagtcg gaaaatgctc cgcagctgtg ttgctctgat attgagtcac aaaagaaatg 2400

tacgagtcaa tcatgctcgt ccgaggtgtg tgttccaaga tgtcaacctg tctcctcggg 2460

atcaaagtca tgtggaaata atcagtgccc agactccgtt gaaaatagtg gttttcattc 2520

tcatccccgt cctcaatgct gctcgtcgaa gatggcttct aaagcatgcc aatctgcagt 2580

ttcagaatca aagtcatgtg gaaataatca gtgcccagac tccgttgaaa atagtggttt 2640

tcattctcat ccccgccctc aatgctgctc gtctaagatg gcttctaaag catgccaatc 2700

tgcagtttca gaatcaaagt catgtggaaa taatcagtgc ccagactccg ttgaaaatag 2760

tggttttcat tctcatcccc gtcctcaatg ctgctcgttg aagatggctt ctaaagcatg 2820

ccaatctgca gtttcagaat caaagtcatg tggaaataat cagtgcccag actccgttga 2880

aaatagtggt tttcattctc atccccgtcc tcaatgctgc tcgtcgaaga tggctgctaa 2940

agcatgccaa tctgcagttt cagaatcaaa gtcatgtgga aataacaatt gctcggagtc 3000

catttacaag agtagttgtc attctttaac aagttctcta gtatgttctt ccaagatgtc 3060

tgctccacaa tgtcattctg ccacttcaag ctccaaatca tgtggaagta ccaagtgctc 3120

caacttcagt gacaaaaaat gttgccaata tgacaaaatt cctcaaacgt gctctaccaa 3180

gaagtctgct ccaggatgtc aatctgcagt ttctgggtct aaatcatgtg gagatagcaa 3240

gtgttcagac tcgaaagaca atagtagcca tccttcacat cccgatcatc aaatatgcac 3300

gtctaagttg tgtgctccac aaagccaatc tgcaacttca agctccagga catgtggaaa 3360

tatgaagtgc tcggacacca atagcaagaa ttcttgttat tcacatacca actctgaatc 3420

atgctcttca aagatgtctg gtccagcatg caaaactgct aattcaggtt caaggttatg 3480

cggaaataag aagtgcctag actctgcaaa cgagaacagt tttcattcac ttactaatcc 3540

actctgtgag gaaaagcttt tggagaagga aagcttggat ttagcccgaa aagataggga 3600

atcaaatcat gatcttagtc atggttgctc tgacgaggaa catgatcatc taaatttaga 3660

caaggcacat gacagttgtg ccttacaaga atgttgttat tctgttcaag gcaataaaac 3720

tgatgtatca gaaactggaa tccaggaagc tgctcattgt gacagcatca atcaaacatg 3780

ccaaactgca atttcaggat caatgacatg cggaaataat aagagtctgg actctctaag 3840

catccatggt tgtcattcac atgatagtcc actccacaag gagagcaact tggagcagaa 3900

aagcttggat gttgctggag aaggtataaa atcacctcat gctgtcggtc aaggctgttc 3960

ggacaaggag cacaatcact cgcatccaga aaaggcgtat gacagttgtg caacagacga 4020

ttgttgtttt tcagttcaag tccatggcat tgacgacgta tcaagaagtg aaattcaaga 4080

aactgctcat tgtgacagca caaaacagag cacggtcatc cccagcagct gcgaacatga 4140

accaaaagat caggtaaatc actgtggatc tcactctaaa agtattccaa ctgatgaaga 4200

actagccaag ctggttagaa gatgctgcaa atacaaacca tgccacgatg tccgctctgg 4260

ctgcaggaag catgctgcag aatgtggtcc aaccgttcga tcaaccatca atatcttacg 4320

ggacaaccat catcatcatc tagactgcag tggtcgtaag gtttgttcgc tgttggagaa 4380

gagacacatt ggtggatgct gtgacagctt cagaaaagaa tgttgtgcca agaacaatca 4440

ccttggagca agttttggag gaggtttatc agaaattgtc atagagtaga tgcaatctga 4500

agtgtacata tgttgtgaac ttcctaccta ttttatcttc aagaagttaa gctgctaatc 4560

tgaacatagc tattgcaatg gcttgtatat ttatcctaaa aatggcttgt gtttttattg 4620

agttttcaca aagttgaaca catcaatgta atttgcgtga aaaagtcagc tcacatcgaa 4680

ggccaactgt gcttatttat atgcacagtt aactccgtta aaaaaaaaaa aaaaaaa 4737

<210> 2

<211> 1444

<212> PRT

<213> NtHMA4 氨基酸序列

<400> 2

Met Val Glu Ser Glu Lys Met Asn Asp Thr Lys Asn Leu Ser Lys Ser

1 5 10 15

Tyr Phe Asp Val Leu Gly Ile Cys Cys Thr Ser Glu Val Val Leu Val

20 25 30

Glu Lys Ile Leu Lys Asn Leu Glu Gly Val Lys Glu Val Ser Val Ile

35 40 45

Val Thr Thr Lys Thr Val Ile Val Ile His Asp Ser Leu Leu Ile Ser

50 55 60

Gln Gln Gln Ile Val Lys Ala Leu Asn Gln Ala Arg Leu Glu Ala Ser

65 70 75 80

Ile Arg Val Lys Gly Glu Lys Asn Tyr Gln Lys Lys Trp Pro Ser Pro

85 90 95

Phe Ala Ile Gly Ser Gly Ile Leu Leu Gly Leu Ser Phe Leu Lys Tyr

100 105 110

Phe Phe Ala Pro Phe Gln Trp Leu Ala Leu Ala Ala Val Ala Val Gly

115 120 125

Ile Pro Pro Ile Ile Phe Arg Gly Val Ala Ala Val Arg Asn Leu Thr

130 135 140

Leu Asp Ile Asn Ile Leu Val Leu Ile Ala Val Thr Gly Ser Ile Val

145 150 155 160

Leu His Asp Tyr Trp Glu Ala Gly Thr Ile Val Phe Leu Phe Thr Ile

165 170 175

Ala Glu Trp Leu Glu Ser Arg Ala Ser His Lys Ala Thr Ala Ala Met

180 185 190

Ser Ser Leu Val Asn Ile Val Pro Pro Thr Ala Val Leu Ala Glu Ser

195 200 205

Gly Glu Val Val Asn Val Asp Glu Val Lys Leu Asn Ser Ile Leu Ala

210 215 220

Val Lys Ala Gly Glu Thr Ile Pro Ile Asp Gly Val Val Met Glu Gly

225 230 235 240

Glu Cys Asp Val Asp Glu Lys Thr Leu Thr Gly Glu Ser Phe Pro Val

245 250 255

Ser Lys Gln Ile Asp Ser Thr Val Trp Ala Gly Thr Thr Asn Leu Asn

260 265 270

Gly Tyr Ile Ser Val Lys Thr Thr Ala Leu Ala Glu Asp Cys Ala Val

275 280 285

Ala Arg Met Ala Gln Leu Val Glu Asp Ala Gln Asn Lys Lys Ser Lys

290 295 300

Thr Gln Arg Tyr Ile Asp Lys Cys Ala Lys Tyr Tyr Thr Pro Ala Ile

305 310 315 320

Val Ala Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Val Pro Thr Ala Leu Arg Val

325 330 335

His Asn Arg Asn Glu Trp Tyr Arg Leu Ala Leu Val Thr Leu Val Ser

340 345 350

Ala Cys Pro Cys Ala Leu Val Leu Ser Thr Pro Val Ala Met Cys Cys

355 360 365

Ala Leu Ser Lys Ala Ala Thr Ser Gly Leu Leu Phe Lys Gly Ala Glu

370 375 380

Tyr Leu Glu Thr Leu Ala Lys Ile Lys Ile Met Ala Phe Asp Lys Thr

385 390 395 400

Gly Thr Ile Thr Arg Gly Glu Phe Met Val Thr Glu Phe Lys Ser Leu

405 410 415

Val Asp Gly Leu Gly Leu Asn Thr Leu Leu Tyr Trp Val Ser Ser Ile

420 425 430

Glu Ser Lys Ser Gly His Pro Met Ala Ala Ala Leu Val Asp Tyr Ala

435 440 445

Gln Ser Asn Ser Val Glu Pro Lys Pro Asp Arg Val Glu Gln Phe Gln

450 455 460

Asn Phe Pro Gly Glu Gly Ile Phe Gly Arg Ile Asp Gly Met Glu Ile

465 470 475 480

Tyr Val Gly Asn Arg Lys Ile Ser Ser Arg Ala Gly Cys Thr Thr Val

485 490 495

Pro Glu Ile Glu Gly Asp Ser Phe Gln Gly Lys Ser Val Gly Tyr Ile

500 505 510

Phe Leu Gly Ser Ser Pro Ala Gly Ile Phe Gly Leu Ser Asp Val Cys

515 520 525

Arg Ile Gly Val Lys Glu Ala Met Arg Glu Leu Lys Gln Met Gly Ile

530 535 540

Lys Thr Ala Met Leu Thr Gly Asp Cys Tyr Ala Ala Ala Asn His Val

545 550 555 560

Gln Asp Gln Leu Gly Gly Ala Met Asp Glu Phe Gln Ala Glu Leu Leu

565 570 575

Pro Glu Asp Lys Ala Thr Ile Ile Lys Gly Phe Gln Lys Glu Ala Pro

580 585 590

Thr Ala Met Ile Gly Asp Gly Leu Asn Asp Ala Pro Ala Leu Ala Thr

595 600 605

Ala Asp Ile Gly Ile Ser Met Gly Ile Ser Gly Ser Ala Leu Ala Lys

610 615 620

Glu Thr Gly His Val Ile Leu Met Thr Asn Asp Ile Gly Arg Ile Pro

625 630 635 640

Lys Ala Ala Arg Leu Ala Arg Arg Val Arg Arg Lys Ile Val Glu Asn

645 650 655

Met Ile Ile Ser Val Val Thr Lys Ala Ala Ile Val Ala Leu Ala Ile

660 665 670

Ala Gly Tyr Pro Leu Val Trp Ala Ala Val Leu Ala Asp Thr Gly Thr

675 680 685

Cys Leu Leu Val Ile Leu Asn Ser Met Leu Leu Leu Arg Val Gly Thr

690 695 700

His Arg His Gly Lys Lys Cys Cys Arg Ser Ala Thr Pro Ser His Ala

705 710 715 720

Pro Asn His Lys Asp Lys Ala Ser Cys Cys Lys Ser Glu Asn Ala Pro

725 730 735

Gln Leu Cys Cys Ser Asp Ile Glu Ser Gln Lys Lys Cys Thr Ser Gln

740 745 750

Ser Cys Ser Ser Glu Val Cys Val Pro Arg Cys Gln Pro Val Ser Ser

755 760 765

Gly Ser Lys Ser Cys Gly Asn Asn Gln Cys Pro Asp Ser Val Glu Asn

770 775 780

Ser Gly Phe His Ser His Pro Arg Pro Gln Cys Cys Ser Ser Lys Met

785 790 795 800

Ala Ser Lys Ala Cys Gln Ser Ala Val Ser Glu Ser Lys Ser Cys Gly

805 810 815

Asn Asn Gln Cys Pro Asp Ser Val Glu Asn Ser Gly Phe His Ser His

820 825 830

Pro Arg Pro Gln Cys Cys Ser Ser Lys Met Ala Ser Lys Ala Cys Gln

835 840 845

Ser Ala Val Ser Glu Ser Lys Ser Cys Gly Asn Asn Gln Cys Pro Asp

850 855 860

Ser Val Glu Asn Ser Gly Phe His Ser His Pro Arg Pro Gln Cys Cys

865 870 875 880

Ser Leu Lys Met Ala Ser Lys Ala Cys Gln Ser Ala Val Ser Glu Ser

885 890 895

Lys Ser Cys Gly Asn Asn Gln Cys Pro Asp Ser Val Glu Asn Ser Gly

900 905 910

Phe His Ser His Pro Arg Pro Gln Cys Cys Ser Ser Lys Met Ala Ala

915 920 925

Lys Ala Cys Gln Ser Ala Val Ser Glu Ser Lys Ser Cys Gly Asn Asn

930 935 940

Asn Cys Ser Glu Ser Ile Tyr Lys Ser Ser Cys His Ser Leu Thr Ser

945 950 955 960

Ser Leu Val Cys Ser Ser Lys Met Ser Ala Pro Gln Cys His Ser Ala

965 970 975

Thr Ser Ser Ser Lys Ser Cys Gly Ser Thr Lys Cys Ser Asn Phe Ser

980 985 990

Asp Lys Lys Cys Cys Gln Tyr Asp Lys Ile Pro Gln Thr Cys Ser Thr

995 1000 1005

Lys Lys Ser Ala Pro Gly Cys Gln Ser Ala Val Ser Gly Ser Lys

1010 1015 1020

Ser Cys Gly Asp Ser Lys Cys Ser Asp Ser Lys Asp Asn Ser Ser

1025 1030 1035

His Pro Ser His Pro Asp His Gln Ile Cys Thr Ser Lys Leu Cys

1040 1045 1050

Ala Pro Gln Ser Gln Ser Ala Thr Ser Ser Ser Arg Thr Cys Gly

1055 1060 1065

Asn Met Lys Cys Ser Asp Thr Asn Ser Lys Asn Ser Cys Tyr Ser

1070 1075 1080

His Thr Asn Ser Glu Ser Cys Ser Ser Lys Met Ser Gly Pro Ala

1085 1090 1095

Cys Lys Thr Ala Asn Ser Gly Ser Arg Leu Cys Gly Asn Lys Lys

1100 1105 1110

Cys Leu Asp Ser Ala Asn Glu Asn Ser Phe His Ser Leu Thr Asn

1115 1120 1125

Pro Leu Cys Glu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Glu Ser Leu Asp Leu

1130 1135 1140

Ala Arg Lys Asp Arg Glu Ser Asn His Asp Leu Ser His Gly Cys

1145 1150 1155

Ser Asp Glu Glu His Asp His Leu Asn Leu Asp Lys Ala His Asp

1160 1165 1170

Ser Cys Ala Leu Gln Glu Cys Cys Tyr Ser Val Gln Gly Asn Lys

1175 1180 1185

Thr Asp Val Ser Glu Thr Gly Ile Gln Glu Ala Ala His Cys Asp

1190 1195 1200

Ser Ile Asn Gln Thr Cys Gln Thr Ala Ile Ser Gly Ser Met Thr

1205 1210 1215

Cys Gly Asn Asn Lys Ser Leu Asp Ser Leu Ser Ile His Gly Cys

1220 1225 1230

His Ser His Asp Ser Pro Leu His Lys Glu Ser Asn Leu Glu Gln

1235 1240 1245

Lys Ser Leu Asp Val Ala Gly Glu Gly Ile Lys Ser Pro His Ala

1250 1255 1260

Val Gly Gln Gly Cys Ser Asp Lys Glu His Asn His Ser His Pro

1265 1270 1275

Glu Lys Ala Tyr Asp Ser Cys Ala Thr Asp Asp Cys Cys Phe Ser

1280 1285 1290

Val Gln Val His Gly Ile Asp Asp Val Ser Arg Ser Glu Ile Gln

1295 1300 1305

Glu Thr Ala His Cys Asp Ser Thr Lys Gln Ser Thr Val Ile Pro

1310 1315 1320

Ser Ser Cys Glu His Glu Pro Lys Asp Gln Val Asn His Cys Gly

1325 1330 1335

Ser His Ser Lys Ser Ile Pro Thr Asp Glu Glu Leu Ala Lys Leu

1340 1345 1350

Val Arg Arg Cys Cys Lys Tyr Lys Pro Cys His Asp Val Arg Ser

1355 1360 1365

Gly Cys Arg Lys His Ala Ala Glu Cys Gly Pro Thr Val Arg Ser

1370 1375 1380

Thr Ile Asn Ile Leu Arg Asp Asn His His His His Leu Asp Cys

1385 1390 1395

Ser Gly Arg Lys Val Cys Ser Leu Leu Glu Lys Arg His Ile Gly

1400 1405 1410

Gly Cys Cys Asp Ser Phe Arg Lys Glu Cys Cys Ala Lys Asn Asn

1415 1420 1425

His Leu Gly Ala Ser Phe Gly Gly Gly Leu Ser Glu Ile Val Ile

1430 1435 1440

Glu

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> HMAGSPF1

<400> 3

agaaactgct cattgtgaca gcaca 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> HMAGSPR2

<400> 4

caactgcaac agctgcaagt gcta 24

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> NtHMA4F

<400> 5

cttccttaga gtagagtgta ga 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> NtHMA4R

<400> 6

ctactctatg acaatttctg ataa 24

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> HMARNAiF

<400> 7

cattctagag agctcggatc cgaatcaagc aagattagaa gca 43

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> HMARNAiR

<400> 8

tcaactagtg atatcctcga gagtgatgac atagcagcag t 41

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> Forward primer

<400> 9

gggtggatcc cttccttaga gtagagtgta ga 32

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> Reverse primer

<400> 10

taatgagctc ctactctatg acaatttctg ataa 34

Claims (9)

1.一种烟草镉转运基因NtHMA4，其特征在于所述的烟草镉转运基因NtHMA4核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示。

2.根据权利要求1所述的烟草镉转运基因NtHMA4，其特征在于所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。

3.一种权利要求1所述的烟草镉转运基因NtHMA4的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：

A、确定NtHMA4基因序列；

B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；

C、根据NtHMA4基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；

D、回收和纯化PCR产物；

E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；

F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。

4.根据权利要求3所述的烟草镉转运基因NtHMA4的克隆方法，其特征在于所述的步骤A包括如下步骤：

（1）利用同源基因拟南芥At HMA4序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA4的EST序列；

（2）利用FG135138.1比对烟草基因组数据库，获得一个基因序列（Ntom0672570），根据此序列设计RACE引物，克隆基因末端RACE试剂盒为Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit，反应根据试剂盒说明书进行，3′端扩增到500~700bp左右的片段，5′端扩增到400~600bp左右的片段，回收后进行测序；

（3）测序结果与核心序列拼接获得NtHMA4全长cDNA，其序列如SEQ ID NO.1 所示；

（4）利用特异性引物进行PCR反应，对目的产物测序，得到NtHMA4基因序列。

5.根据权利要求4所述的烟草镉转运基因NtHMA4的克隆方法，其特征在于步骤（2）所述的RACE特异性引物为：

3′RACE基因特异引物：5′-AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA-3′；

5′RACE基因特异引物：5′-CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA-3′。

6.根据权利要求3所述的烟草镉转运基因NtHMA4的克隆方法，其特征在于步骤C所述的特异性引物为：

正向引物：NtHMA4F：5′- CTTCCTTAGAGTAGAGTGTAGA -3′；

反向引物：NtHMA4R：5′- CTACTCTATGACAATTTCTGATAA -3′。

7.一种权利要求1所述的烟草镉转运基因NtHMA4的应用，其特征在于用于降低镉从烟草根部转运到烟叶的转运率。

8.根据权利要求7所述的烟草镉转运基因NtHMA4的应用，其特征在于所述的降低镉从烟草根部转运到烟叶的转运率的方法包括如下步骤：

A、构建RNAi载体；

B、农杆菌转化；

C、RNAi载体导入烟草；

D、培养转基因植株。

9.根据权利要求8所述的烟草镉转运基因NtHMA4的应用，其特征在于步骤A中所述的RNAi载体为pBI121-pQLi-NtHMA4。