TR201815375T4 - Bitkilerde ağır metal redüksiyonu. - Google Patents

Abstract

Bu buluş, ağır metal taşımasında yer alan ABC taşıyıcılarını kodlayan polinükleotitlere ve polipeptitlere yöneliktir. Mevcut buluş ayrıca, söz konusu polinükleotitlerin ya da polipeptitlerin bitkilerde ekspresyonunu modifiye etmeye yöneliktir. Özellikle, mevcut buluş hücre içi ağır metal taşımasında yer alan bir ya da daha fazla ABC taşıyıcısının ekspresyonunu ya da aktivitesini modüle etmek (örnek olarak, azaltmak ya da inhibe etmek) ile ilgilidir.

Description

Tarifname ayrica, bir bitki hücresi gibi bir hücreyi modifiye etmek için bir metot saglamakta olup, içerisinde bitki hücresinin genomu çinko parmak nükleaz aracili mutagenez ile modifiye edilmekte olup, bu (a) genimik nükleotit sekansi içerisinde modifikasyon için seçimli bir sekilde farkli bölgelere baglanan en az iki dogal olmayan çinko parmak proteinini tanima ve yapma; (b) her biri bir nükleaz ve bitki hücresi içerisindeki en az iki dogal olmayan çinko parmak proteininin birini içeren en az iki füzyon proteinini, bitki genomu içerisindeki genomik nükleotit sekansi içerisine özellikle genomik nükleotit sekansi içerisindeki bir hedef bölgede ya da yakininda bir çift iplikli kirilma olusacagi sekilde eksprese etme; ve istege bagli olarak (0) hücre içerisine çift iplikli kirilmanin yukari akis yönünde bir skeansa bir birinci homoloji bölgesi ve çift iplikli kirilmanin asagi akis yönünde bir ikinci homoloji bölgesi içeren bir nükleotit sekansini içeren bir polinükleotidi bu polinükleotidin genom içerisindeki DNA ile rekombine olacagi bir biçimde vermeyi içermektedir. Ayrica, füzyon proteinlerinin bir ya da daha fazlasini kodlayan nükleotit sekanslarini içeren bir ya da daha fazla ekspresyon yapisi içeren hücreler de tarif edilmistir.

Bir baska yaklasimda, tarifname ayrica mutant, dogal olmayan ya da transjenik ya da baska sekilde genetik olarak modifiye edilmis bitkilerin meganükleazlar - I-Crel gibi - kullanilarak üretilmesine yönelik metotlar saglar. Dogal olarak meydana gelen meganükleazlarin yani sira rekombinant meganükleazlar da tek bir bölgede ya da NtMRP geninin bozulmasina izin vermek için bir bitkinin genomik DNA 'sindaki nispeten az sayida alanda çift Zincirli bir kopmaya neden olmak için kullanilabilir. Meganükleaz, degistirilmis DNA tanima özelliklerine sahip tasarlanmis bir meganükleaz olabilir. Meganükleaz proteinleri, teknikte bilinen çesitli farkli mekanizmalarla Meganükleaz, degistirilmis DNA tanima özelliklerine sahip tasarlanmis bir meganükleaz olabilir.

Bu alinti, dogal olarak meydana gelen meganükleaz I-Crel 'den türetilen meganükleazlarin yapi temelli mühendisligi için metotlari tarif etmektedir. Bu mühendislik ürünü meganükleazlar, bitkilerin genomlarinda bulunan önceden belirlenmis 22 baz çiftli DNA sekanslarini tanimak ve kesmek için yapilabilir. Meganükleaz proteinleri, teknikte bilinen çesitli farkli mekanizmalarla Tarifnamenin yaklasimlari meganükleazlarin bir bitki hücresinde ya da bitkide NtMRP polinükleotidini inaktive etmesinde kullanimina olanak tanimaktadir. Yaklasimlar ayrica bir bitkide bir NtMRP polinükleotidinin bir meganükleaz kullanilarak inaktive edilmesi için bir yöntem saglamakta olup, bu yöntem: (a) bir NtMRP polinükleotidi içeren bir bitki hücresi saglanmasini; (b) söz konusu bitki hücresine bir meganükleaz ya da bir meganükleaz kodlayan bir yapi vermeyi; ve (c) meganükleazin NtMRP polinükleotitini büyük ölçüde etkisiz hale getirmesine olanak tanimayi içermektedir.

Meganükleazlar, bir NtMRP polinükleotitinin kodlama bölgeleri içindeki meganükleaz tanima bölgelerini ayirmak için kullanilabilir. Bu tür yarilma, homolog olmayan uç birlesmesiyle mutajenik DNA onarimini takiben meganükleaz algilama bölgesinde DNA 'nin delesyonuna neden olur. Gen kodlama dizisindeki bu tür mutasyonlar tipik olarak geni inaktive etmek için yeterlidir. Bu metot, bir meganukleaz ekspresyon kasetinin uygun bir transformasyon yöntemi kullanilarak bir bitki hücresine verilmesini içerir. En yüksek verim için, meganükleaz ekspresyon kasetinin seçilebilir bir isaretleyiciye baglanmasi ve bir seçim ajani varliginda basarili bir sekilde dönüstürülmüs hücrelerin seçilmesi arzu edilir. Bu yaklasim, meganükleaz ekspresyon kasetinin genoma entegrasyonu ile sonuçlanacaktir, bununla birlikte bitkinin düzenleyici onayi gerektirecekse bu arzu edilemez. Bu gibi durumlarda, meganükleaz ekspresyon kaseti (ve baglantili seçilebilir isaretleyici geni), geleneksel yetistirme teknikleri kullanilarak sonraki bitki nesillerinde ayrilabilir. Alternatif olarak, bitki hücreleri baslangiçta seçilebilir bir isaretleyici bulunmayan bir meganükleaz ekspresyon kaseti ile dönüstürülebilir ve bir seçim ajani içermeyen ortamlarda yetistirilebilir. Bu kosullar altinda, islenen hücrelerin bir kismi meganükleaz ekspresyon kasetini elde edecek ve meganükleaz ekspresyon kasetini genoma entegre etmeden geçici olarak tasarlanmis meganükleazi eksprese edecektir. Transformasyon verimliligini hesaba katmadigi için, bu son transformasyon prosedürü istenen genom modifikasyonunu elde etmek için daha fazla sayida islenen hücrenin taranmasini gerektirir.

Meganükleaz ekspresyon kasetinin verilmesini takiben bitki hücreleri, baslangiçta kullanilan belirli dönüstürme prosedürü için tipik olan kosullar altinda yetistirilir. Bu, 26 derece C 'nin altinda, siklikla karanlikta ortam üzerinde yetisen dönüstürülmüs hücreler anlamina gelebilir. Bu tür standart kosullar bitki hücresinin dönüsüm isleminden kurtulmasi için bir süre boyunca, tercihen 1-4 gün boyunca kullanilabilir. Bu ilk geri kazanim periyodunu takiben herhangi bir noktada meganükleaz tanima bölgesini ayirmak ve mutasyona ugratmak için islenmis meganükleazin aktivitesini uyarmak amaci ile yetistirme sicakligi yükseltilebilir.

Bazi uygulamalar için, NtMRP polinükleotitinin bir bitkinin genomundan kesin olarak çikartilmasi arzu edilebilir. Bu tür uygulamalar, her biri amaçlanan silme isleminin her iki tarafinda bir meganükleaz tanima bölgesini bölen bir çift tasarlanmis meganükleaz kullanilarak mümkündür.

Burada saglanmis olan rekombinant yapilar, NtMRP protein ekspresyon seviyelerini modüle etmek (örnek olarak azaltmak ya da inhibe etmek) amaciyla bitkileri ya da bitki hücrelerini dönüstürmek için kullanilabilir. Bir rekombinant polinükleotid yapisi, burada tarif edilmis oldugu üzere bir NtMRP polinükleotitini kodlayan bir polinükleotidi içerebilmekte olup, bu bitki ya da hücre içinde NtMRP polipeptidini eksprese etmeye uygun bir düzenleyici bölgeye çalisir sekilde baglanir. Dolayisiylai bir polinükleotid burada tarif edilmis oldugu üzere NtMRP polipeptidini kodlayan bir kodlama sekansini ya da bunun bir varyantini içerebilir.

Bir rekombinant polinükleotid tarafindan kodlanan NtMRP polipeptidi dogal bir NtMRP polipeptidi olabilir ya da hücreye heterolog olabilir. Bazi durumlarda, rekombinant yapi bir düzenleyici bölgeye islevsel olarak bagli bir NtMRP-modüle edici polipeptidin ekspresyonunu azaltan ya da inhibe eden bir polinükleotit içerir. Uygun düzenleyici bölgelerin örnekleri burada tarif edilmistir.

Burada tarif edilmis olanlar gibi rekombinant polinükleotid yapilari içeren vektörler de ayrica saglanir. Uygun vektör omurgalari, örnek olarak plazmidler, virüsler, yapay kromozomlar, BAC vektörleri, sinirlama olmaksizin, örnek olarak bakteriyofaj, bakulovirüsler ve retrovirüslerden türetilen plazmidleri ve viral vektörleri içerir. Sayisiz vektörler ve ekspresyons istemleri ticari olarak temin edilebilir.

Vektörler ayrica, örnek olarak replikasyon, iskelet baglanti bölgeleri (SAR) ya da isaretleyicilerin kökenlerini de içerebilir. Bir isaretleyici gen bir bitki hücresinde seçilebilir bir fenotip verebilir. Örnek olarak bir isaretleyici, bir antibiyotige (örnek olarak, kanamisin, G418, bleomisin ya da higromisin) ya da bir herbisite (örnek olarak, glifosat, klorsülfüron ya da fosfinotrisin) direnç gibi biyosit direnci saglayabilir. Ek olarak, bir ekspresyon vektörü ifade edilen polipeptidin manipülasyonunu ya da tespitini (örnek olarak saflastirma ya da lokalizasyonu) kolaylastirmak için tasarlanmis bir etiket sekansini içerebilir. Lusiferaz, .beta.-glukuronidaz (GUS), yesil flüorisimali protein (GFP), glutatiyon S-transferaz (GST), polihistidin, c-myc ya da hemaglutinin sekanslari gibi etiket sekanslari, tipik olarak kodlanmis polipeptit ile bir füzyon olarak ifade edilir.

Bu tür etiketler karboksil ya da amino terminali de dahil olmak üzere polipeptit içinde herhangi bir yere yerlestirilebilir. Çesitli yapilanmalar NtMRP gen ekspresyonunu susturmak ve bu sayede NtMRP tasiyicilarinin ilgili bitki dokulari içindeki ekspresyon seviyelerinin azaltilabildigi transjenik bitkiler üretmek için kullanilabien çesitli yöntemler vasitasiyla NtMRP gen ekspresyon seviyesini düsürmek üzere genetik olarak modifiye edilen transgenik bitkilere yöneliktir. Agir metal tasimanin, özellikle de kadmiyum tasimanin agir metal tasima oranlari ve agir metal dagitim sekilleri tarif edilmis olan metotlar ve bilesimlere göre üretilen transgenik bitkilerde degistirilebilir. Çesitli yapilanmalar, mutant bitkilere, dogal olarak meydana gelmeyen bitkilere ya da NtMRP gen ekspresyon seviyelerini modüle etmek (örnek olarak düsürmek ya da inhibe etmek) ve dolayisiyla bitkiler - tütün bitkileri gibi - üretmek için modifiye edilen transgenik bitkilere yönelik olup, içerisinde NtMRP 'nin ekspresyon seviyesi, ilgilenilen bitki dokulari içinde bir kontrol bitkisine göre azalir. Tarif edilmis olan bilesim ve metotlar Nicotiana familyasinin herhangi bir türüne uygulanabilmekte olup, bunlar N. rustica ve N. tabacum (örnek olarak, LA 821, LN acau/is, N. acuminata, N. acuminata var. multiflora, N, africana, N. alata, N. amplexicauli's, N. arentsii, N. attenuata, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bige/ovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. exce/sior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei', N. hybrid, N. ingu/ba, N. kawakami'i, N. knightiana, N. Iangsdorfûi, N. Iineari's, N. Iongif/ora, N. maritima, N. mega/osiphon, N. miersii, N. noctif/ora, N. nudicau/i's, N. obtusi'folia, N. occidentalis, N. ocoidenta/i's subsp. hesperis, N. otophora, N. panicu/ata, N. pauci'flora, N. petuni'oides, N. p/umbagini'foli'a, N. quadriva/vis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosu/ata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii', N. simulans, N. solani'folia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsi'flora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undu/ata, N. ve/utina, N. wigandioides ve N. x sanderae içerir.

Tütün çesitlerinin ve elit tütün çesitlerinin kullanimi da burada düsünülmektedir. Transgenik, dogal olarak bulunmayan ya da mutant bitki bu nedenle bir ya da daha fazla transgen ya da bir ya da daha fazla genetik mutasyon ya da bunlarin bir kombinasyonunu içeren bir tütün çesidi ya da elit tütün çesidi olabilir. Genetik mutasyon(lar) (örnek olarak, bir ya da daha fazla polimorfizm), bireysel tütün çesidi ya da tütün çesidinde dogal olarak bulunmayan mutasyonlar (örnek olarak, elit tütün kültür bitkisi) olabilir ya da mutasyon münferit tütün varyetesinde ya da tütün kültür bitkisinde (örnek olarak elit tütün kültür bitkisi) dogal olarak meydana gelmemek kaydiyla dogal olarak meydana gelebilen genetik mutasyon(lar) olabilir. Özellikle yararli Nicotiana tabacum çesitleri, Burley tipi, koyu tip, firinda kurutulmus tip ve Oryantal tip tütünleri içerir. Varyetelerin ya da kültür bitkilerinin sinirlandirici olmayan örnekleri: LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Dar Yaprak Madole, Dar Yaprak Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpâo Comum, HBO4P, Hioks Broadleaf, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB özellikle belirtilmemis olsalar bile, yukaridakilerin düsük dönüstürücü alt türleri de burada düsünülmüstür.

Bir baska yaklasimda burada tarif edilmis oldugu üzere mutasyona ugramis, dogal olarak meydana gelmeyen veya transjenik bir bitki temin edilmis olup, NtHMA tasiyicilarinin ekspresyonu da azaltilacak ve böylece bitkideki kadmiyum içerigini daha da azaltabilecek sekilde modifiye edilmistir. Bitkide kadmiyum içeriginin azaltilmasi için NtHMA tasiyicilarinin bir NtMRP polinükleotidi, bir NtMRP kimerik geni, bir NtMRP polinükleotit yapisi, bir NtMRP çift iplikli RNA, bir NtMRP konjugati ve/veya bir NtMRP ekspresyon vektörü içeren bir mutant, dogal olarak olusmayan veya transgenik bitki hücresi izole edilmis bir NtHMA polinükleotit, bir NtHMA kimerik geni, bir NtHMA polinükleotit yapisi, bir NtHMA çift iplikli RNA, bir NtHMA konjugati ve/veya bir NtHMA ekspresyon vektörü ile birlikte saglanmistir.

Yapilanmalar ayrica mutant bitkiler, dogal olarak bulunmayan bitkiler, melez bitkiler ya da NtMRP ekspresyonunu ya da aktivitesini bir kontrol ile mukayese edildiginde daha düsük kadmiyum miktarlarinin elde edilebilecegi bir sekilde modüle etmek (örnek olarak azaltmak ya da inhibe etmek) için modifiye edilmis transjenik bitkiler üretmek için bilesimlere ve metotlara yöneliktir. Belirli yapilanmalarda elde edilen bitkiler, kontrol bitkilerine genel görünümde (örnek olarak fenotip) benzer ya da büyük ölçüde aynidir. Olgunluk derecesi, bitki basina yaprak sayisi, sap yüksekligi, yaprak ekleme açisi, yaprak boyutu (genislik ve uzunluk), noktalar arasi mesafesi ve yaprak ayasi-yapragin orta kismi orani gibi çesitli fenotipik özellikler alan gözlemleri ile degerlendirilebilir. Tercih edilen bir yapilanmada, bitkilerin yüksekligi ya da agirligi ya da yüksekligi ve agirligi, kontrol bitkileri ile büyük ölçüde aynidir. Bir baska tercih edilen yapilanmada, bitkilerin kurutulmus toplanmis yapraklarinda bir kontrol ile karsilastirildiginda önemli bir farklilik bulunmaz, bu da NtMRP transkriptlerinin modülasyonunun kuru biyokütle üzerinde istatistiksel olarak anlamli bir etkisi olmadigini gösterir.

Bir yaklasim mutant bitkinin, dogal olarak meydana gelmeyen bitkinin, melez bitkinin ya da transgenik bitkinin bir tohumudur. Tercihen tohum, bir tütün tohumudur. Bir baska yaklasim mutant bitkinin, dogal olarak meydana gelmeyen bitkinin, melez bitkinin ya da transgenik bitkinin bir poleni ya da ovülüdür. Ek olarak, mutasyona ugramis bir bitki, dogal olarak meydana gelmeyen bir bitki, bir melez bitki, ayrica bir erkek sterilite veren bir polinükleotit içeren bir transgenik bitki tarif edilmektedir.

Tarifname ayrica, mutant bitkinin, dogal olarak bulunmayan bitkinin, hibrit bitkinin ya da transjenik bitkinin ya da bunun bir kisminin, ebeveyinin bütün morfolojik ve fizyolojik özelliklerini eksprese edebilen bitkileri rejenere eden bir kisminin yenilenebilir hücrelerinin bir doku kültürünü saglar. Yenilenebilir hücreleri arasinda, yapraklar, polen, embriyolar, kotiledonlar, hipokotiller, kökler, kök uçlari, anterler, çiçekler ve bunlarin bir kismi, ovüller, sürgünler, saplar, saplar, özü ve kapsüller ya da kalluslar ya da bunlardan türetilen protoplastlar bulunur ancak bunlarla sinirli degildir.

Bazi yapilanmalarda, NtMRP polinükleotidinin ekspresyonunun modüle edildigi bir bitki (örnegin, azaltildigi ya da inhibe edildigi), özellikle yapraklarda, kadmiyum gibi, agir metal seviyelerinde azalmaya sahip olabilir. Kadmiyum seviyesi NtMRP polinükleotidinin ekspresyonunun modüle edilmedigi (örnek olarak, indirgenmedigi ya da inhibe edilmedigi) bir kontrol birimindeki da %200 - bir oranda azaltilabilir. Bazi yapilanmalarda, içerisinde NtMRP polinükleotidinin ekspresyonunun modüle edildigi bir bitki (örnek olarak, azaltildigi ya da inhibe edildigi), köklerde artan ya da azalan kadmiyum seviyelerine sahip olabilir. Bazi yapilanmalarda, NtMRP polinükleotidinin ekspresyonunun modüle edildigi (örnek olarak, azaltildigi ya da inhibe edildigi) bir bitki, köklerde artan kadmiyum seviyelerine ve yapraklarda azalan kadmiyum seviyelerine sahip olabilir. Bazi yapilanmalarda, içerisinde NtMRP polinükleotidinin ekspresyonunun modüle edildigi bir bitki (örnek olarak, azaltildigi ya da inhibe edildigi), hasat edilebilir biyokütlede azalan kadmiyum seviyelerine sahip olabilir.

Ekspresyon, örnek olarak, RT-PCR, Northern lekeleri, RNaz korumasi, primer uzantilari, Western lekeleri, protein jel elektroforezi, immüno-çökeltme, enzime bagli immünotestler, çip deneyleri ve kütle spektrometresi gibi yöntemler kullanilarak degerlendirilebilir. Bir polipeptidin doku tercihli ya da genis ölçüde eksprese eden bir baslaticinin kontrolü altinda eksprese edilmesi durumunda, ekspresyonun tüm bitkide ya da seçilmis bir dokuda degerlendirilebilecegi belirtilmelidir. Benzer sekilde, bir polipeptit örnek olarak, belirli bir zamanda, gelisimde ya da indüksiyon üzerine eksprese edilirse ekspresyon arzu edilen bir zaman periyodunda seçici olarak degerlendirilebilir.

Istenilen bir özelligi ya da fenotipi olan popülasyonun üyeleri için mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkilerin bir popülasyonu taranabilir ya da seçilebilir. Örnek olarak, tek bir transformasyon olayinin progenisi popülasyonu arzu edilen NtMRP polipeptidi ya da polinükleotid ekspresyon seviyesine sahip olan bitkiler için taranabilir. Ekspresyon seviyelerini tanimlamak için fiziksel ve biyokimyasal yöntemler kullanilabilir. Bunlar bir polinükleotidin saptanmasi için Southern analizi ya da PCR amplifikasyonu; Northern lekeleri, S1 RNaz korumasi, primer uzanti ya da RNA transkriptlerinin tespit edilmesi için RT-PCR amplifikasyonu; polipeptitlerin ve polinükleotitlerin enzimini ya da ribozim aktivitesini tespit etmek için enzimatik analizler; ve polipeptitleri saptamak için protein jel elektroforezi, Western lekeleri, immünopresipitasyon ve enzime bagli immün testleri içerir. Yerinde melezleme, enzim boyama ve immün boyama gibi baska teknikler de polipeptitlerin ya da polinükleotitlerin varligini ya da ekspresyonunu tespit etmek için kullanilabilir.

Modüle edilmis (örnek olarak, azaltilmis ya da inhibe edilmis) kadmiyum seviyesi gibi istenen bir özelligi olan bitkiler için bir bitki popülasyonu taranabilir. Seçim ya da tarama, bir ya da daha fazla nesilde ya da birden fazla cografi bölgede gerçeklestirilebilir. Bazi durumlarda, mutant, dogal olmayan ya da transgenik bitkiler, istenen bir fenotipi indükleyen kosullar altinda büyütülebilir ve seçilebilir ya da mutant, dogal olarak olusmayan ya da transgenik bir bitkide arzu edilen bir fenotipi üretmek için baska tür gerekli olabilir. Ek olarak, seçim ya da tarama, fenotipin bitki tarafindan sergilenmesi beklenen belirli bir gelisim asamasinda uygulanabilir.

Kadmiyum içeriginde, NtMRP polinükleotidinin ya da proteininin ekspresyonunun ya da aktivitesinin modüle edilmedigi (örnek olarak, azaltilmadigi ya da inhibe edilmedigi) bir kontrol bitkisine göre istatistiksel olarak anlamli bir farka sahip olan mutant, dogal olmayan ya da transgenik bitkileri seçmek için seçim ya da tarama yapilabilir.

Mutant, dogal olarak bulunmayan ya da transgenik bitki hücreleri ve bitkileri burada bir ya da daha fazla rekombinant polinükleotidler - örnek olarak izole edilmis polinükleotit, kimerik gen, polinükleotit yapi, çift iplikli RNA, konjugat ya da ifade vektörü gibi - tarif edilmektedir. Bir bitki ya da bitki hücresi, stabil olarak dönüstürülmek üzere rekombinant polinükleotidin genomuna entegre edilmesi sureti ile dönüstürülebilir. Stabil olarak dönüstürülmüs hücreler tipik olarak her bir hücre bölünmesi ile dahil edilen polinükleotidi muhafaza eder. Bir bitki ya da bitki hücresi rekombinant polinükleotidin genomuna entegre edilmeyecegi sekilde geçici olarak transforme edilebilir. Geçici olarak transforme edilen hücreler tipik olarak her bir hücre bölünmesi ile birlikte verilen rekombinant polinükleotitin tamamini ya da bir kismini kaybetmekte olup, böylelikle bir araya getirilen rekombinant polinükleotit yeterli sayida hücre bölünmesinden sonra yavru hücrelerde tespit edilemez.

Polinükleotitlerin monokotiledon ve dikotiledonlu bitkilere sokulmasi teknikleri teknikte bilinmektedir ve örnek olarak Agrobacterium aracili transformasyon, viral vektör aracili transformasyon, elektroporasyon ve partikül tabanca transformasyonunu içerir. Yabanci polinükleotidin bitki kromozomlarina entegrasyonu için Agrobacterium sistemi, bitki genetik mühendisligi için kapsamli bir sekilde arastirilmis, modifiye edilmis ve kullanilmistir. HYoIcu ya da antisens yönelimde düzenleyici sekanslara çalisir sekilde bagli olan söz konusu saflastirilmis proteine karsilik gelen polinükleotit sekanslari içeren çiplak rekombinant polinükleotit molekülleri geleneksel metotlar araciligi ile uygun T-DNA sekanslarina baglanir. Bunlar, polietilen glikol teknikleri ya da elektroporasyon teknikleri ile tütün asal hücrelerine dahil edilmekte olup, bunlarin her ikisi de standarttir. Alternatif olarak, söz konusu saflastirilmis proteini kodlayan rekombinant polinükleotit molekülleri içeren bu vektörler canli Agrobakteri hücrelerine dahil edilmekte olup, bu daha sonra polinükleotidi bitki hücrelerine aktarir. T-DNA vektör sekanslarina eslik etmeden çiplak polinükleotit ile dönüsüm, asal hücrelerinin polinükleotit içeren Iipozomlarla kaynamasi araciligi ile ya da elektroporasyon araciligi ile saglanabilir. T- DNA vektör dizileri ile refakat edilmeyen çiplak polinükleotit ayrica asal, yüksek hizli mikro mermiler araciligi ile hücreleri dönüstürmek için de kullanilabilir.

Bir hücre ya da kültürlenmis doku dönüsüm için alici doku olarak kullanilirsa, bitkiler, teknikte uzman kisiler tarafindan bilinen tekniklerle, istenirse, dönüstürülmüs kültürlerden yeniden üretilebilir.

Bir rekombinant yapiya dahil edilecek düzenleyici bölgelerin seçimi, bunlarla sinirli olmamak üzere, verimlilik, seçilebilirlik, indüklenebilirlik, arzu edilen ekspresyon seviyesi ve hücre ya da doku tercihli ekspresyonu içeren çesitli faktörlere baglidir. Düzenleyici bölgeleri kodlama sekansina göre uygun bir biçimde seçmek ya da konumlandirmak sureti ile bir kodlama sekansinin ekspresyonunu modüle etmek teknikte uzman bir kisi için siradan bir konudur. Bir polinükleotidin transkripsiyonu benzer bir sekilde modüle edilebilir. Bazi uygun düzenleyici bölgeler sadece ya da agirlikli olarak belirli hücre tiplerinde transkripsiyonu baslatir. Bitki genomik polinükleotidindeki düzenleyici bölgelerin tanimlanmasi ve karakterize edilmesi için metotlar teknikte bilinmektedir.

Uygun transkripsiyon baslaticilar farkli dokularda ya da hücre tiplerinde bulunan ya da farki gelisim asamalari sirasinda bulunan ya da farkli çevresel kosullara cevaben bulunan dokuya özgü faktörler tarafindan ayirt edilebilen dokuya özgü spesifik transkripsiyon baslaticilari (örnek olarak, köke özgü baslaticilar, filize özgü baslaticilar, odun dokusuna özgü baslaticilar) içerir.

Uygun baslaticilar spesifik indükleyiciler gerektirmeksizin birçok hücre tipinde aktive edilebilen konstitütif baslaticilari içerir. NtMRP RNAi polipeptit üretimini kontrol etmek için uygun baslaticilara iliskin örnekler karnibahar mozaik virüsü , SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, 833, nos veya ubikuitin- veya fazelion-baslaticilari içerir. Teknikte uzman kisiler çok sayida rekombinant transkripsiyon baslatici varyasyonu olusturabilirler.

Dokuya özgü baslaticilar bitki gelisimi sirasinda spesifik zamanlarda vejetatif dokular ya da üreme dokulari gibi belirli hücrelerde ya da dokularda aktif olan transkripsiyonel kontrol elemanlaridir. Dokuya özgü ekspresyon örnegin belirli dokulardaki polinükleotitlerin ekspresyonu tercih edildigi zaman avantajli olabilir. Gelisimsel kontrol altinda dokuya özgü transkripsiyon baslaticilara iliskin örnekler sadece (ya da birincil olarak sadece) vejetatif dokular, örnek olarak yapraklar ya da kökler gibi belirli dokularda ya da meyve, ovüller, tohumlar, polen, pistoller, çiçekler ya da herhangi bir embriyonik doku gibi üreme dokularinda trankripsiyonu baslatabilen transkripsiyon baslaticilarini içermektedir. Üreme dokusuna özgü transkripsiyon baslaticilar örnek olarak antere özgü, ovüle özgü, embriyoya özgü, endosperme özgü, zara özgü, tohuma ve tohum kabuguna özgü, polene özgü, petale özgü, sepale özgü ya da bunlarin kombinasyonlari olabilir.

Uygun yapraga özgü transkripsiyon baslaticilar piruvat, C4 bitkisinden (dari) ortofosfat dikinaz (PPDK) transkripsiyon baslatici, daridan cab-m1Ca+2 transkripsiyon baslatici, Arabidopsis thaliana myb ile iliskili gen baslatici (Atmyb5), ribuloz bifosfat karboksilaz (RBCS) baslaticilar (örnek olarak, yapraklarda ve isikta büyüyen fidelerde eksprese edilen domates RBCS 1, RBCSZ ve RBCSSA genleri, gelisen domates meyvesinde eksprese edilen RBCS1 ve RBCSZ ya da neredeyse tamamen yaprak ayasinda ve yaprak sap kökündeki mezofil hücrelerde yüksek seviyelerde eksprese edilen ribuloz bifosfat) içerir.

Uygun senesansa özgü baslaticilar meyve olgunlasmasi, senesans ve yapraklarin kesilmesi sirasinda aktif bir domates baslaticisi, bir sistein proteaz kodlayan genin bir dari baslaticisini içerir. Uygun antere özgü baslaticilar kullanilabilir. Teknikte uzman kisiler tarafindan bilinen uygun kök tercihli baslaticilar seçilebilir. Uygun tohum tercihli baslaticilar hem tohuma özgü baslaticilari (bu baslaticilar tohum depolama proteinlerinin baslaticilari gibi tohum gelisimi sirasinda aktiftir) hem de tohum filizleme baslaticilari (bu baslaticilar tohum filizlenmesi sirasinda aktiftir) içermektedir. Bu tür tohum tercihli baslaticilar Cim1 (sitokinin indüklü mesaj); da bilinir; nuclc ve ceIA (selüloz sintaz) içerir ancak bunlarla sinirli degildir. Gama-zein bir endospreme özgü transkripsiyon baslaticidir. GIob-1 bir embriyoya özgü transkripsiyon baslaticidir. Iki çenekliler için tohuma özgü baslaticilar fasulye .beta-faseolin, napin, - konglisinin, soya fasulyesi Iektin, krusiferin ve benzerlerini içerir ancak bunlarla sinirli degildir.

Monokotlar için. tohuma özgü promoterler, bunlarla sinirli olmamak üzere, bir dari 15 kDa zein baslatici, bir 22 kDa zein baslatici, bir 27 kDa zein baslatici, bir g-zein baslatici. bir 27 kDa -zein baslatici (gzw64A baslatici gibi, bkz. Genbank Eklenme numarasi 878780), bir balmumu baslatici, bir çekilmis 1 baslatici, bir çekilmis 2 baslatici, bir globulin 1 baslatici (bkz. Genbank baslatici, Zm40 baslatici, eep1 ve eep2; Iec1, tioredoksin H baslatici; mlip15 baslatici, PCNA2 baslatici; ve çekilmis-2 promoteri içerir.

Indüklenebilir baslaticilara iliskin örnekler patojen atagina, anaerobik kosullara, yüksek sicakliga, isiga, kurakliga, soguga ya da yüksek tuz konsantrasyonuna cevap veren baslaticilari içerir. Patojen indüklenebilir baslaticilar bir patojen (örnek olarak, PR proteinleri, SAR proteinleri, beta-1,3-glukanaz, kitinaz) tarafindan enfeksiyonu takiben indüklenen patogenezle iliskili proteinlerden (PR proteinler) olanlari içerir.

Bitki baslaticilarina ek olarak diger uygun baslaticilar bakteriyel orijinden örnek olarak, oktopin sintaz baslatici, nopalin sintaz baslatici ve Ti plazmidlerden türetilen diger baslaticilardan türetilebilir ya da viral baslaticilardan (örnek olarak, karnabahar mozaik virüsünün (CaMV) 358 ve 198 RNA baslaticilari, tütün mozaik virüsünün konstitütif baslaticilari, karnabahar mozaik virüsünün (CaMV) 198 ve 358 baslaticilari ya da siraoa otu mozaik virüs 358 baslaticilari) türetilebilir.

Konjuge edilmis kisimlarin örnekleri, proteinler (örnek olarak, antikorlar), yag asidi zincirleri, seker kökleri, glikoproteinler, polimerler (örnek olarak, polietilen glikol) ya da bunlarin kombinasyonlari gibi makromoleküler bilesikleri içerir. Bir oligonükleotid, oligonükleotitin hücresel alimini arttiran bir parçaya konjuge edilebilir.

Kisimlarin sinirlayici olmayan örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, antikorlar, polipeptitler, bir kolesterol parçasi gibi lipit parçalari, kolik asit, bir tiyoeter, örnek olarak, HeksiI-s-tritiltiol, bir tiokolesterol, bir alifatik zincir, örnek olarak; dodesandiol ya da undesil kökleri, bir fosfolipid, örnek olarak di-heksadesiI-rac-gIiserol ya da trietilamonyum 1-di-o-heksadesil-rac-glisero-Sh- fosfonat, bir poliamin ya da bir polietilen glikol zinciri, bir adamantan asetik asit, bir palmitil parçasi, bir oktadesilamin ya da heksilamino-karbonil-oksikolesterol kismini içerir.

Kisim pozitif yüklü bir polimer olabilir - örnek olarak, yaklasik 1 ile 50 amino asit kökü ya da polietilen glikol (PEG) ya da polipropilen glikol gibi polialkilen oksit gibi pozitif yüklü bir peptit olabilir. Uygun olarak, bir polialkilen oksit gibi pozitif yüklü polimer, serbest birakabilir bir baglayici gibi bir baglayici vasitasiyla oligomere baglanabilir.

NtMRP ekspresyonu ölçüldügü zaman hücredeki NtMRP polipeptitini kodlayan mRNA miktarinin tespit edilmesi örnegin PCR ya da Northern blot vasitasiyla yapilabilir. Örnekteki NtMRP polipeptitin miktarindaki bir degisimin ölçüldügü zaman anti-NtMRP antikorlarinin kullanimi vasitasiyla NtMRP 'nin tespit edilmesi bilinen teknikler kullanilarak NtMRP polipeptitinin miktarinin belirlenmesi için kullanilabilir. Alternatif olarak biyolojik aktivite (örnek olarak kadmiyum gibi agir metal tasima) test ajani ile temastan önce ve sonra ölçülebilir.

Bir baska yapilanmada burada polipeptitler ile imünoreaktif olan antikorlar saglanmistir. NtMRP polipeptitleri, fragmanlari, varyantlari, füzyon polipeptitleri ve benzerleri burada açiklandigi gibi antikor immünoreaktifi üretmekte “immünojenler” olarak kullanilabilir. Bu tür antikorlar spesifik olarak polipeptitlere antikorun antijen baglanma alanlarinda baglanir. Spesifik olarak baglanma antikorlari NtMRP ailesi polipeptitlerini, homologlarini ve varyantlarini spesifik olarak ayirt eden ve bunlarla baglanan ancak diger moleküllerle baglanmayanlardir. Bir yapilanmada antikorlar burada belirtilmis olan bir NtMRP amino asit sekansina sahip olan polipeptitlere özgüdür ve diger polipeptitlerle çapraz etkilesime girmez.

Daha spesifik olarak polipeptitler, parça, varyantlar, füzyon polipeptitler ve benzerleri antikorlarin olusumunu meydana getiren antijenik belirleyiciler ya da epitoplar içerir. Bu antijenik belirleyiciler ya da epitoplar gerek lineer gerekse konformasyonel (kesintili) olabilir. Lineer epitoplar polipeptitin amino asitlerinin tek bir seçiminden olusurken konformasyonel veya kesintili epitoplar polipeptit katlanmasi üzerine yakin hale gelen polipeptitin farkli bölgelerinden amino asit kisimlarindan olusur. Epitoplar teknikte bilinen yöntemlerin herhangi biri araciligiyla tanimlanabilir. Ek olarak polipeptitlerden epitoplar analizlerde ve poliklonal sera ya da kültürlenen hibridomalardan süpernatantlar gibi maddelerden spesifik baglanma antikorlarini saflastirmak için arastirma ayiraçlari olarak kullanilabilir. Bu tür epitoplar ya da bunlarin varyantlari teknikte bilinen kati faz sentezi, kimyasal ya da enzimatik polipeptit klevaji gibi teknikler kullanilarak ya da rekombinant teknoloji kullanilarak üretilebilir.

Polipeptitlere yönelik hem poliklonal hem de monoklonal antikorlar geleneksel teknikler araciligiyla hazirlanabilir. Polipeptitlere özgü monoklonal antikorlar üreten hibridoma hücre hatlari ayrica burada tasarlanmistir. Bu tür hibridomalar geleneksel teknikler araciligiyla üretilebilir ve tanimlanabilir. Antikorlarin üretimi için çesitli konak hayvanlar bir NtMRP polipeptiti, parçasi, varyanti ya da bunlarin mutantlari ile enjeksiyon vasitasiyla immün hale getirilebilir. Bu tür konak hayvanlar tavsanlari, fareleri ve siçanlari içerir ancak bunlarla sinirli degildir. Çesitli adjuanlar immünolojik tepkiyi arttirmak için kullanilabilir. Konak türlere dayanarak bu tür yardimcilar Freund '3 (tam ve tam olmayan), alüminyum hidroksit gibi mineral jeller, yüzey aktif maddeler örnegin Iisolesitin, pluronik polioller, polianyonlar, peptitler, yag emülsiyonlari, anahtar deligi Iimpet hemosiyanin, dinitrofenol ve potansiyel olarak faydali insan adjuvanlari örnegin BCG (bacille Calmette-Guerin) ve Corynebacterium parvum içerir ancak bunlarla sinirli degildir. Monokonal antikorlar geleneksel teknikler araciligiyla geri kazanilabilir.

Bu tür monoklonal antikorlar IgG, IgM, IgE, IgA, IgD ve bunlarin herhangi bir alt sinifi dahil herhangi bir immünoglobulin sinifindan olabilir.

Antikorlar ayrica polipeptitlerin ya da fragmanlarinin gerek in vitro gerekse in vivo mevcudiyetini tespit etmek için kullanilabilir. Antikorlar ayrica immünoafinite kromatografi vasitasiyla polipeptitleri ya da fragmanlarini saflastirmakta kullanilabilir. Çesitli yapilanmalar, mutant, dogal olarak bulunmayan ya da transgenik bitkilerin yani sira, içerisinde biyokütle ve NtMRP polinükleotidinin ekspresyon seviyesinin, kadmiyum tasinmasini yaprak lamine içine düsürmek ya da engellemek için büyük ölçüde azaltildigi biyokütle ve tohumlar da saglanmaktadir. Yaprak tabakasi, puro, sigara ve dumansiz tütün ürünleri (yanici olmayan) gibi çesitli içilebilir ürünler gibi çesitli tüketilebilir ürünlere dahil edilebilir.

Bu içilebilir ürünler ve dumansiz ürünlerdeki % kadmiyum azaltimi mutant olmayan, dogal olmayan ya da transgenik olmayan muadillerden türetilen tüketilebilir ürünler ile kadmiyum içerigi, milyon basina yaklasik 0.01 ile yaklasik 0.05 parça (ppm), 0.01 ile yaklasik 0.01 ile yaklasik 5 ppm araliginda bir degerdir. Bazi yapilanmalarda, bu içilebilir maddelerin ve dumansiz ürünlerin kadmiyum içerigi yaklasik 0.001 ppm ya da daha az, yaklasik 0.01 ppm ya da daha az ya da yaklasik 0.05 ppm ya da daha az ya da yaklasik 0.49 ppm ya da daha az ya da yaklasik 0.5 ppm ya da daha azdir.

Bitkilerdeki kadmiyum birikim derecesi genotip ve büyüme ortaminin karmasikligina yorulan çesitli parametrelere dayanarak büyük ölçüde degisebilmektedir. Örnegin alanda büyüten tütün yapraklarindaki Cd konsantrasyonlari agro-iklim, toprak parametreleri ve bitki çesitleri gibi faktörlere dayanarak büyük ölçüde degisebilir. Bunun ötesinde bir tütün bitkisinin farkli kisimlari içindeki bagil kadmiyum dagilim sekilleri türlere, organ/dokuya ve büyüme kosullarina (baska bir deyisle, tarlada büyüme ya da hidroponik olarak büyüme) göre degisiklik gösterebilir. Ortalama olarak tarlada büyüyen tütün yapraklarinda ölçülen kadmiyum konsantrasyonlari (yapragin orta damari ve damarlari dahil) yaklasik olarak 0,5 ile 5 ppm (milyon basina parça ya da tütün yapraklarinin kuru agirliginin mikrogram/grami) araliginda olabilir. Ancak birçok yayinlanmis kadmiyum seviyesi tipik olarak tütün olgunlasma asamasini, tütün çesidini ya da analiz için toplanan özel yaprak kisimlarini (yani, yaprak sap pozisyonundan çikartilmis) tanimlamaz. Bazi varyetelerde alt yapraklar orta ve yukari yapraklardan daha fazla kadmiyum seviyesi biriktirebilmektedir. Hücre içi seviyede kadmiyum hücre duvari, sitoplazma, kloroplast, nükleus ve koful dahil bir bitki hücresinin çesitli hücre bilesenlerinde bulunabilir.

Bunun ötesinde tütün yapraklarinda ölçülen kadmiyum içerigi büyük ölçüde tütün bitkilerinin büyüdügü toprak ortamindaki kadmiyum seviyelerine dayanir. Kadmiyum-kontamine alanlarda büyüyen tütün yapraklari kontamine olmamis alanlarda büyüten genetik olarak özdes, yaklasik olarak 0,4 ile yaklasik olarak 8 ppm 'lik bir aralikta kadmiyum biriktirebilen karsitlarina nazaran yaklasik 35 ppm ya da daha fazla kadmiyum biriktirebilir. Kadmiyum-kontamine alanlarda büyüyen bitkilerin yapraklari içindeki kofullar çok yüksek kadmiyum konsantrasyonlari biriktirebilir. Belirli bir bitki türü için uygun olacak tarif edilmis bilesimleri uygulamak için metotlar teknikte uzman kisiler tarafindan bilinmektedir.

Bitkilerde agir metal içerigi, teknolojide bilinen çesitli metotlar kullanilarak ölçülebilir. Tercih edilen bir yöntem, endüktif olarak bagli plazma-kütle spektrofotometrisinin kullanimini içerir ("ICP-MS," Agilent 75OOA; Agilent Technologies, Palo Alto, CA).

Burada tarif edilmis olan mutant, dogal olarak olusmayan ya da transgenik bitkiler, örnek olarak tarimda baska kullanimlara sahip olabilir. Örnek olarak burada tarif edilen mutant, dogal olmayan ya da transgenik bitkiler, hayvan yemi ve insan gida ürünlerini yapmak için kullanilabilir.

Burada tarif edilmis olan bitkilerden elde edilen tohumlar, bir imalat ürününün olusturulmasi için teknikte bilinen araçlarla ambalajlama malzemesinde ambalajlanabilir ve paketlenebilir. Kagit ve bez gibi ambalaj malzemeleri teknikte iyi bilinmektedir. Bir tohum paketi, örnek olarak, ambalaj malzemesine tutturulmus bir etiket ya da çikartma, ambalaj malzemesi üzerine basilmis bir etiket ya da paketin içerisine yerlestirilen bir etiketin içindeki etiketin niteligini anlatan bir etikete sahip olabilir.

Bir mutant NtMRP aleli tasiyan bir bitki, yararli soylar, çesitler ve melezler olusturmak için bir bitki yetistirme programinda kullanilabilir. Özellikle, mutant NtMRP aleli, yukarida tarif edilmis oldugu üzere ticari açidan önemli çesitlere girmektedir. Bu nedenle, bir mutant bitkinin, dogal olarak meydana gelen bir bitkinin ya da burada tarif edildigi gibi bir transjenik bitkinin farkli bir genetik kimlik içeren bir bitki ile çaprazlanmasini içeren yetistirme bitkileri için metotlar saglanmaktadir. Metot ayrica, soy bitkinin baska bir bitki ile çaprazlanmasini ve istege bagli olarak, arzu edilen genetik özellikler ya da genetik arka plan ile bir soy elde edilene kadar geçisin tekrarlanmasini içerebilir. Bu tür islah metotlarinin hizmet ettigi bir amaç, baska çesitlere, yetistirme soylarina, melezlere ya da çesitlere, özellikle ticari menfaat sahiplerine arzu edilen bir genetik özellik kazandirmaktir. Bir baska amaç ise, tek bir bitki çesidi, soy, melezleri ya da kültür bitkilerinde farkli genlerin genetik modifikasyonlarinin istiflenmesini kolaylastirmaktir. Tür içinin yani sira türler arasi eslesmede düsünülmüstür. Bu kesismelerden dogan ve ayni zamanda yetistirme soylari diye anilan döl bitkileri, dogal olarak meydana gelmeyen bitkilerin örnekleridir.

DNA parmak izi, tek nükleotit polimorfizmi, mikrosatellit isaretleyicileri ya da benzer teknikler, burada tarif edilmis oldugu üzere NtMRP gen(ler)ini ya da mutant alellerini baska tütünlere transfer etmek ya da üretmek için bir isaretleyici destekli seçim (MAS) yetistirme programinda kullanilabilir. Örnek olarak, bir yetistirici agronomik olarak arzu edilen bir genotipe sahip bir mutant aleli içeren bir genotipin melezlemesinden ayrilan popülasyonlar olusturabilir. F2 ya da geri çapraz nesillerdeki bitkiler, burada listelenen tekniklerden biri kullanilarak bir NtMRP genomik sekans(lar)indan ya da bunun bir fragman(lar)indan gelistirilmis bir isaretleyici kullanilarak taranabilir. Mutant alele sahip oldugu belirlenen bitkiler, taranacak ikinci bir popülasyon yaratmak için geri çaprazlanabilir ya da kendi kendine tozlasabilir. Beklenen kalitim modeline ya da kullanilan MAS teknolojisine bagli olarak, seçilen bitkilerin tanimlanmasina yardimci olmak için her bir geri çaprazlama döngüsünden önce seçilen bitkilerin kendi kendine tozlasmasi gerekli olabilir. Tekrarlayan ebeveynin istenen fenotipi geri kazanilincaya kadar geriye dogru çaprazlama ya da baska bir islah prosedürü tekrar edilebilir.

Tarifnameye göre, bir yetistirme programinda basarili çaprazlar, verimli olan F1 bitkilerini vermektedir. Seçilen F1 bitkileri, ebeveynlerden biri ile çaprazlanabilir ve ilk geri çapraz nesil bitkileri, varyant NtMRP gen ekspresyonu (örnek olarak, NtMRP geninin sifir versiyonu) için tekrar taranan bir popülasyon üretmek için kendi kendine tozlasir. Geriye dogru çaprazlama, kendi kendine tozlasma ve tarama islemi, örnek olarak son tarama, tekrarlayan ebeveyn ile verimli ve makul ölçüde benzer bir bitki üretene kadar en az 4 kez tekrarlanir. Bu bitki, eger istenirse, kendi kendine tozlastinlir ve sonra bitki, varyant NtMRP gen ekspresyonu sergiledigini teyit etmek üzere sonradan taranir. Bazi yapilanmalarda, F2 neslindeki bir bitki popülasyonu varyant NtMRP gen ekspresyonu için taranir, standart yöntemlere göre örnek olarak, burada tarif edilmis olan NtMRP ekspresyonu için NtMRP bilgisine dayanan primerler ile bir PCR yöntemi kullanilarak bir NtMRP geninin yokluguna bagli olarak NNtMRP eksprese etmeyen bir bitki belirlenir.

Melez çesitler, bir birinci çesitteki disi ebeveyn bitkilerinin (diger bir deyisle tohum ebeveynleri) kendi kendine tozlasmasini önleyerek, disi ebeveyn bitkilerini döllemek için ikinci bir çesit erkek ebeveyn bitkilerinden polene izin vererek ve disi bitkiler üzerinde F1 melez tohumlarinin olusmasini saglayarak üretilebilir. Çiçeklerin erken evrelerinde çiçeklerin yumusatilmasiyla disi bitkilerin kendi kendine tozlasmasi önlenebilir. Alternatif olarak, disi ebeveyn bitkilerinde bir erkek sterilite formu kullanilarak polen olusumu önlenebilir. Örnek olarak, erkek sterilitesi sitoplazmik erkek sterilite (CMS) ya da bir transgenik erkek sterilite ile üretilebilmekte olup içerisinde bir transgen mikrosporogenez ve/veya polen olusumunu ya da kendiliginden uyumsuzlugu inhibe eder. CMS içeren disi ebeveyn bitkiler özellikle yararlidir. Disi ebeveyn bitkilerinin CMS oldugu yapilanmalarda, erkek fertil bitkilerden polen toplanir ve CMS disi ebeveyn bitkilerinin stigmalarina elle uygulanir ve sonuçta elde edilen F1 tohumu hasat edilir.

Burada tarif edilen varyeteler ve soylar tek çapraz F1 melezleri olusturmak için kullanilabilir. Bu tip yapilanmalarda, ebeveyn varyetelerinin bitkileri erkek ebeveyn bitkilerden disi ebeveyn bitkilere dogal çapraz tozlasmayi kolaylastirmak amaci ile esas olarak homojen birlesen popülasyonlar olarak yetistirilebilir. Disi ebeveyn bitkileri üzerinde olusturulan F1 tohumu, geleneksel yollarla seçici olarak hasat edilir. Ayrica iki ana bitki türü toplu olarak yetistirilebilir ve kendi kendine tozlasma sonucu erkek ebeveyn üzerine olusturulan disi ebeveyn ve tohum üzerinde olusan F1 melez tohumunun bir karisimi hasat edilebilir. Alternatif olarak, tek çaprazli bir F1 melezinin disi bir ebeveyn olarak kullanildigi ve farkli bir erkek ebeveyn ile çaprazlandigi üç yönlü çaprazlar gerçeklestirilebilir. Baska bir alternatif olarak, iki çapraz bagin F1 dölünün kendileri çapraz oldugu çift çapraz melezler olusturulabilir.

Istenilen bir özelligi ya da fenotipi olan popülasyonun üyeleri için mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkilerin bir popülasyonu taranabilir ya da seçilebilir. Örnek olarak, tek bir transformasyon olayinin progenisi popülasyonu arzu edilen NtMRP polipeptidi ya da polinükleotid ekspresyon seviyesine sahip olan bitkiler için taranabilir. Ekspresyon seviyelerini tanimlamak için fiziksel ve biyokimyasal yöntemler kullanilabilir. Bunlar bir polinükleotidin saptanmasi için Southern analizi ya da PCR amplifikasyonu; Northern lekeleri, S1 RNaz korumasi, primer uzanti ya da RNA transkriptlerinin tespit edilmesi için RT-PCR amplifikasyonu; polipeptitlerin ve polinükleotitlerin enzimini ya da ribozim aktivitesini tespit etmek için enzimatik analizler; ve polipeptitleri saptamak için protein jel elektroforezi, Western lekeleri, immünopresipitasyon ve enzime bagli immün testleri içerir. Yerinde melezleme, enzim boyama ve immün boyama gibi baska teknikler de polipeptitlerin ya da polinükleotitlerin varligini ya da ekspresyonunu tespit etmek için kullanilabilir.

Mutant, dogal olarak bulunmayan ya da transgenik bitki hücreleri ve bitkileri burada tarif edilmis olup, bunlar bir ya da daha fazla izole edilmis NtMRP polinükleotidi gibi bir ya da daha fazla rekombinant polinükleotit, bir ya da daha fazla polinükleotit yapi, bir ya da daha fazla çift iplikçikli RNA, bir ya da daha fazla konjugat ya da bir ya da daha fazla vektör/ekspresyon vektörü içerir.

NtMRP 'nin ekspresyonu, örnek olarak, RT-PCR, Northern lekeleri, RNaz korumasi, primer uzantilari, Western lekeleri, protein jel elektroforezi, immüno-çökeltme, enzime bagli immünotestler, çip deneyleri ve kütle spektrometresi gibi yöntemler kullanilarak degerlendirilebilir. Bir polipeptidin doku tercihli ya da genis ölçüde eksprese eden bir baslaticinin kontrolü altinda eksprese edilmesi durumunda, ekspresyonun tüm bitkide ya da seçilmis bir dokuda degerlendirilebilecegi belirtilmelidir. Benzer sekilde, bir polipeptit örnek olarak, belirli bir zamanda, gelisimde ya da indüksiyon üzerine eksprese edilirse ekspresyon arzu edilen bir zaman periyodunda seçici olarak degerlendirilebilir.

Sinirlama olmaksizin, burada tarif edilmis olan bitkiler NtMRP 'nin ekspresyon ya da aktivitesinin modüle edilmesinden (örnek olarak azaltilmasi ya da inhibe edilmesi) önce ya da sonra baska amaçlar için modifiye edilebilir. Asagidaki genetik modifikasyonlarin biri ya da daha fazlasi, mutant, dogal olarak olusmayan ya da transgenik bitkilerde mevcut olabilir. Bir yapilanmada agir metal alimi ya da agir metal tasimasina dahil olan bir ya da daha fazla gen modifiye edilmis olup bu da modifikasyon(lar) olmaksizin kontrol bitkilerinden ya da parçalarindan daha düsük bir agir metal içerigine sahip olan bitkilerle ya da bitki kisimlariyla (yapraklar gibi) sonuçlanir.

Sinirlayici olmayan örnekler, katyon difüzyon kolaylastiricilari (CDF) ailesine, Zrt-, lrt-benzeri proteinlerin ailesine (ZIP), katyon degistiricilerin (CAX) ailesine, bakir tasiyicilarin ailesine üzere), dogal dirençle iliskili makrofaj proteinlerinin (NRAMP) homologlari ailesi ve kadmiyum gibi agir metallerin tasinmasinda yer alan ATP-baglayici kaset (ABC) tasiyicilari ailesinin bir baska elemanina ait olan genleri içerir. Burada kullanildigi haliyle agir metal terimi, geçis metallerini içerir. Bir baska yapilanmada, azotlu metabolik ara maddelerin dönüstürülmesine katilan bir ya da daha fazla gen bitkilerle ya da bitkilerin kisimlariyla (yapraklar gibi) sonuçlanacak sekilde modifiye edilmis olup, bunlar isitildiginda, kontrol bitkilerinden ya da bunlarin kisimlarindan daha düsük seviyelerde en az bir tütün spesifik nitrozamin (örnek olarak; Kontrol bitkilerine veya bunlarin parçalarina kiyasla 4-(metilnitrozamino)-1-(3-piridil)-1 bütanon, N-nitrosonornikotin, N-nitrozoanatabin ve N-nitrozoanabasin) üretir. Degistirilebilen genlerin Diger modifikasyonlarin örnekleri herbisid toleransi, örnek olarak glifosati içermekte olup, bu birçok genis spektrumlu herbisidin aktif bir içerigidir. Glifosat dirençli transgenik bitkiler, aroA geninin (Salmonella typhimurium ve E.coli'den bir glifosat EPSP sintetaz) aktarilmasiyla gelistirilmistir. Sülfonilüre dirençli bitkiler, Arabidopsis 'ten mutant ALS (asetolaktat sentetaz) geninin dönüstürülmesiyle üretilmistir. Mutant Amaranthus hibridusundan fotosistem II 'nin 08 proteini atrazine dirençli transgenik bitkiler üretmek amaci ile bitkilere aktarilmistir; ve bromoksinile dirençli transgenik bitkiler, bxn geninin bakteri Klebsiella pneumoniae 'den ilave edilmesi ile üretilmistir. Bir baska örnek modifikasyon, böceklere dirençli bitkilerde ortaya çikar.

Bacii/us thuringiensis (Bt) toksinleri, B-direnç/i hasere/erin ortaya çikisinin geciktiri/mesinin etkili bir yolunu saglayabi/ir, burada yakin zamanda brokoli içinde gösterildigi gibi, piramit/i crylAc ve cry1C Bt genleri, her iki tek proteine dirençli elmas sirt/i güve/eri kontrol eder ve dirençli böceklerin evrim/ni önemli ölçüde geciktirir. Bir baska örnek modifikasyon, patojen/erin (örnek olarak virüsler, bakteriler, mantarlar) neden oldugu hastaliklara dirençli olan bitkilerde ortaya çikar. Hem bir Bt füzyon genini hem de bir kit/naz genini (sari sap deligine direnç ve kilif toleransi) eksprese eden bitkiler/e Xa21 genini (bakteri yanikligina karsi direnç) eksprese eden bitkiler yapi/andiri/mistir. Bir baska örnek modifikasyon, erkek steri/ite gibi degistirilmis reprodüktif kabiliyet ile sonuç/ahir. Diger bir örnek modifikasyon, abiyotik strese (örnek olarak, kuraklik, sicaklik, tuzluluk) tolerans/i olan bitkilerde ortaya çikar ve tolerans/i transjenik bitkiler, Arabidopsis'ten asil glisero/ fosfat enziminin aktarilmasiyla üretilmistir; Mannito/ ve sorbitol sentezinde rol oynayan mannitoi dehidrojenaz ve sorbitol dehidrogenaz kodlayan genler, kuraklik direncini artirir. Bir baska örnek modifikasyon, insan/arda ku//anim için uygun immünojenik özelliklere sahip proteinler Üreten bitkilerde ortaya çikar. Örnek olarak, N- glikaninda esas olarak alfa-1,3-bag/antili fukoz tortu/ari, beta-1,2-bagii ksiioz tortu/ari ya da her ikisinden de yoksun proteinler Üretebiien bitkiler kullanilabilir. Diger örnek modifikasyon/ar, gelistirilmis depolama protein/eri ve yag/ari, gelismis fotosentetik etkinlige sahip bitkiler, uzati/mis raf ömrü olan bitkiler, gelistirilmis karbonhidrat içerigi olan bitkiler ve mantar/ara dirençli bitkiler; aikaloidierin biyosentezinde yer alan bir enzimi kodlayan bitkiler ile sonuç/anabilir. Içerisinde S-adenosi/-L-metionin (SAM) ve/veya sistatiyonin gama-sintaz (CGS) ekspresyonunun modÜ/e edildigi transgenik bitkiler de düsünülmektedir.

Sinirlama olmaksizin, burada tarif edilmis olan bitkiler ayrica modifiye edilebilir. Bu gibi modifikasyonlarin örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamakla birlikte, sunlar yer alir: (a) Bitki öldürücü kimyasallari tolere edebilen bitkiler. Örnek olarak, glifosat, birçok genis spektrumlu bitki öldürücünün aktif bir içerik maddesidir. Glifosat dirençli transgenik bitkiler, aroA geninin (Salmonella typhimurium ve E.coli'den bir glifosat EPSP sintetaz) aktarilmasiyla gelistirilmistir; Sülfonilüre dirençli bitkiler, Arabidopsis 'ten mutant ALS (asetolaktat sentetaz) geninin dönüstürülmesiyle üretilmistir; Mutant Amaranthus hibridusundan fotosistem II 'nin 08 proteini, atrazine dirençli transgenik bitkiler üretmek için bitkilere aktarilmistir; ve bromoksinile dirençli transgenik bitkiler, bxn geninin bakteri Klebsiella pneumoniae'den katilmasiyla üretilmistir; (b) Böceklere dayanikli bitkiler. Bacillus thuringiensi's (Bt) toksinleri, B-dirençli hasere/erin ortaya çikisinin geciktirilmesinin etkili bir yolunu saglayabi'lir, burada yakin zamanda brokoli içinde gösterildigi gibi, piramitli cry1Ac ve cry1C Bt genleri, her iki tek proteine dirençli elmas sirt/i güveleri' kontrol eder ve dirençli böceklerin evrimini önemli ölçüde geciktirir. (c) Virüse dayanikli bitkiler. Tütün Mozaik Virüsü bitkileri, viral kaplama protein/eri eklenerek üretilmistir. Diger viral dirençli transgenik bitkiler patates virüsüne dirençli patates bitkileri, RSV dirençli pirinç ve YMV dirençli siyah gram ve yesil grami içermektedir; (d) Bakterilere dayanikli bitkiler. Hem bir Bt füzyon genini hem de bir ki'tinaz genini (sari sap deligine direnç ve kilif toleransi) eksprese eden bitkilerle Xa21 genini (bakteri yanikligina karsi direnç) eksprese eden bitkiler yapi/andirilmistir; (e) Strese dayanikli transgenik bitkiler: Soguk ve tolerans/i transgenik bitkiler, Arabidopsis 'ten asil gliserol fosfat enziminin transfer edilmesiyle üretilmistir; Mann/to! ve sorbi'tol sentezinde rol oynayan mannitol dehidrogenaz ve sorbitol dehidrogenaz kod/ayan genler, kuraklik direncini artirir; (0 Insanlarda kullanim için uygun immünojenik özelliklere sahip proteinler Üreten bitkiler. Örnek olarak, N-glikaninda esas olarak alfa-1,3-baglantili fukoz kökleri, beta-1,2-bagli ksiloz kökleri ya da her ikisinden yoksun protein/eri üretebilen bitkiler kullanilabilir; ve (g) Transgeni'k bitkilerin diger örnekleri, gelistirilmis depolama protein/eri ve yaglari, iyilestirilmis fotosentetik etkinlige sahip bitkiler, uzun süreli kendi yasami olan bitkiler, gelismis karbonhidrat içerigi olan bitkiler ve mantar/ara dirençli bitkiler; alkiloitlerin biyosentezinde yer alan bir enzimi kod/ayan bitkiler; bakteriyel organik Civa detoksifikasyon yolu (merkürik redüktaz, merA) ve organomerküriyal liyaz, merB için genler, Arabidopsis'te çapraz/ama ile birlestirildi ve her iki geni sentez/eyen bitkiler, vahsi tipli bitkilere kiyasla 50 kat daha yüksek meti/civa konsantrasyonu üzerinde büyüyebildi.

Bir ya da daha fazla bu tür özellik, baska bir tütün çesidinden elde edilen mutant, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik tütün bitkilerine girebilir ya da dogrudan ona dönüstürülebilir. Özellik(ler)in, mutasyona ugramis, dogal olarak meydana gelmeyen ya da transjenik bitkilere dahil edilmesi, örnek olarak, soya yetistirme, geri çaprazlama, iki kat haploid islahi ve benzeri gibi bu alanda bilinen herhangi bir bitki islahi yöntemi ile elde edilebilir (bkz.

Cultivar Development. Crop Species. W.H. Fehr (ed), MacMiIIan Publishing C0., New York, NY 761 pp.). Yukarida tarif edilen moleküler biyoloji-bazli teknikler, özellikle RFLP ve mikrosatelit isaretleyicileri, yinelenen ebeveyn ile en yüksek genetik özdeslige sahip olan progenleri tanimlamak için bu gibi geri çaprazlamalarda kullanilabilir. Bu, yinelenen ebeveyn ile en azindan %90, tercihen en az %95, daha tercihen en az %99 genetik özdeslige sahip, ancak daha tercihen genetik olarak yinelenen ebeveyn ile özdes olan ve ayrica donör ebeveynden gelen özellik(ler)i içeren bir varyetenin üretimini hizlandirmaya izin verir. Genetik kimligin bu sekilde belirlenmesi, teknolojide bilinen moleküler isaretleyiciler temelinde olabilir.

Son geri çaprazlama nesli, transfer edilen polinükleotit(ler) için saf üreme soyunu vermek için kendiliginden olabilir. Elde edilen bitkiler genel olarak, aktarilan özellikler (örnek olarak bir ya da daha fazla tek genli özellik) yani sira, mutasyona ugramis, dogal olarak bulunmayan ya da transjenik bitkilerin morfolojik ve fizyolojik özelliklerine de sahiptir. Tam geri çaprazlama protokolü, uygun bir test protokolünü belirlemek için degistirilen özellige bagli olacaktir. Her ne kadar transfer edilen özellik dominant bir alel oldugunda geri çaprazlama yöntemleri basitlestirilmis olsa da, resesif bir alel de transfer edilebilir. Bu örnekte, arzu edilen özelligin basarili bir sekilde transfer edilip edilmedigini belirlemek için dölün bir testinin yapilmasi gerekli olabilir. Çesitli düzenlemeler, mutant bitkiler, dogal olarak ortaya çikmayan bitkiler ya da transgenik bitkilerin yani sira NtMRP polinükleotidinin ekspresyon seviyesinin indirgenmis oldugu biyokütle saglar, böylece bunlarda daha düsük miktarlarda kadmiyum birikir.

Bu tür bitkilerin, özellikle de tütün bitkilerinin ve daha özel olarak yaprak Iamina ve tütün bitkilerinin ortasinin parçalari, aerosol olusturucu malzemeler, aerosol olusturan cihazlar, tütün ürünleri, sigara olarak içilebilen nesneler, dumansiz ürünler ve tütün ürünleri dahil olmak üzere ancak bunlarla sinirli olmamak kaydiyla çesitli tüketim ürünlerinin içerisine dahil edilebilir ya da bunlarin yapiminda kullanilabilir. Aerosol olusturucu malzemelerin örnekleri tütün bilesimleri, tütünler, tütün ekstresi, kesilmis tütün, kesilmis dolgu, kürlenmis tütün, genisletilmis tütün, pestil tütün, yapisi yeniden kazandirilmis tütün ve pipo tütünlerini içerir ancak bunlarla sinirli degildir.

Sigara içim ürünleri ve sigara olarak içilebilir ürünler aerosol olusturma cihazlarinin tipleridir.

Sigara içme ürünleri ya da sigara olarak içilebilir ürünler sigaralari, sigarillolari ve purolari içerir, ancak bunlarla sinirli degildir. Dumansiz ürünlerin örnekleri çigneme tütünleri ve enfiye içerir.

Belirli aerosol Olusturucu cihazlarda, yanma yerine, bir tütün bilesimi ya da baska bir aerosol Olusturucu malzeme, bir aerosol üretmek üzere bir ya da daha fazla elektrikli isitma elemani tarafindan isitilmaktadir. Isitmali sigara içim ürününün bir baska tipinde bir aerosol, isinin bir tutusturulabilir ya da kimyasal isi kaynagindan fiziksel olarak ayri bir aerosol olusturan malzemeye aktarimi ile üretilmekte olup, bu malzeme isi kaynaginin içerisinde, etrafinda ya da asagi akim yönünde bulunabilir. Dumansiz tütün ürünleri ve çesitli tütün içeren aerosol olusturan malzemeler herhangi bir formda tütün içerebilmekte olup, bunlar pullar, filmler, köpükler veya boncuk gibi herhangi bir formatta diger içerige ilave edilen, içerisine karistirilan, bununla çevrelenen ya da baska türlü bir araya getirilen kuru parçaciklar, granüller, seritler, tozlar ya da bir bulamaci içermektedir. Burada kullanilmis oldugu üzere, "duman" terimi, sigaralar gibi tütün ürünleri ile üretilen ya da bir aerosol Olusturucu malzemenin yakilmasiyla üretilen bir aerosol türünü tarif etmek için kullanilir.

Bir yapilanmada, ayrica burada tarif edilmis olan mutant, transgenik ve dogal olarak meydana gelmeyen tütün bitkilerinden kürlenmis malzeme saglanmistir. Yesil tütün yapraklarinin kürlenmesi islemleri, teknikte uzman kisilerce bilinir ve bunlarla sinirli olmamak üzere, hava ile kürleme, atesleme, firinda kürleme ve günesle sertlestirme içerir. Yesil tütün yapraklarini kürleme islemi, hasat edilen tütün türüne baglidir. Örnek olarak, Virginia flue (parlak) tütün, tipik olarak firinda kürlenir, Burley ve bazi koyu suslar genellikle hava ile sertlestirilir ve pipo tütünü, çigneme tütünü ve enfiye genellikle atesle sertlestirilir.

Bir baska yapilanmada, mutant tütün bitkilerinden, transgenik tütün bitkilerinden ya da burada tarif edilmis olan dogal olarak meydana gelmeyen tütün bitkilerinden yapilan yapraklar, tercihen de kürlenmis yapraklar içeren tütün içeren aerosol olusturan malzemeler tarif edilmistir. Burada tarif edilmis olan tütün mamulleri ayrica modifiye edilmemis tütün de içerebilen bir harmanlanmis tütün mamulü olabilir.

Mutant, dogal olarak olusmayan ya da transjenik bitkiler, örnek olarak tarimda baska kullanimlara sahip olabilir. Örnek olarak burada tarif edilen mutant, dogal olmayan ya da transgenik bitkiler, hayvan yemi ve insan gida ürünlerini yapmak için kullanilabilir.

Tarifname ayrica mutant bitkinin, dogal olarak meydana gelmeyen bitkinin ya da burada tarif edilen transgenik bitkinin yetistirilmesini ve ekili bitkilerden tohumlarin toplanmasini içeren tohumlarin üretilmesine yönelik metotlar da saglamaktadir. Burada tarif edilmis olan bitkilerden elde edilen tohumlar, bir imalat ürününün olusturulmasi için teknikte bilinen araçlarla ambalajlama malzemesinde ambalajlanabilir ve paketlenebilir. Kagit ve bez gibi ambalaj malzemeleri teknikte iyi bilinmektedir. Bir tohum paketi, örnek olarak, ambalaj malzemesine tutturulmus bir etiket ya da çikartma, ambalaj malzemesi üzerine basilmis bir etiket ya da paketin içerisine yerlestirilen bir etiketin içindeki etiketin niteligini anlatan bir etikete sahip olabilir.

Tanimlama, seçme ya da yetistirme için bitkileri genotiplerine ayirma için bilesimler, yöntemler ve kitler, tarifname ile kapsanmaktadir ve bir polinükleotid numunesinde bir NtMRP polinükleotidinin varligini saptamak için bir araç içerebilir. Buna göre, NtMRP polinükleotidinin en azindan bir bölümünü ve istege bagli olarak bir ya da daha fazla prob ve istege bagli olarak amplifikasyon ya da saptamanin gerçeklestirilmesi için bir ya da daha fazla reaktifin yükseltilmesi için daha fazla primerin birini içeren bir kompozisyon tarif edilmistir.

Buna göre, NtMRP polinükleotitine karsilik gelen yaklasik 10 ya da daha fazla bitisik polinükleotid içeren gen spesifik oligonükleotit primerleri ya da problari tarif edilmistir. Bahsi geçen primerler ya da problar, NtMRP polinükleotitine melezlenen (örnek olarak spesifik olarak da bunlardan meydana gelebilir. Bazi yapilanmalarda, primerler ya da problar yaklasik 10 ile 50 bitisik nükleotit, yaklasik 10 ile 40 bitisik nükleotit, yaklasik 10 ile 30 bitisik nükleotit ya da yaklasik 15 ile 30 bitisik nükleotit içerebilmekte ya da bunlardan meydana gelebilmekte olup, bunlar gen tanimlamasinin sekansa bagli metotlarinda (örnek olarak, Southern melezlemesi) ya da izolasyonda (örnek olarak, bakteriyel kolonilerin ya da bakteriyofaj plaklarinin yerinde melezlemesi) ya da gen tespitinde (örnek olarak, polinükleotit yükseltmesi ya da saptamasinda bir ya da daha fazla amplifikasyon primeri olarak) kullanilabilir. Bu bir ya da daha fazla spesifik primer ya da prob, NtMRP polinükleotidinin bir parçasini ya da tamamini büyütmek ya da tespit etmek üzere dizayn edilebilir ve kullanilabilir. Spesifik örnekleme yoluyla, iki primer NtMRP polinükleotidini kodlayan bir polinükleotit fragmanini - örnek olarak DNA ya da RNA gibi - çogaltmak için bir polimeraz zincir reaksiyon protokolünde kullanilabilir. Polimeraz zincir reaksiyonu, NtMRP polinükleotit sekansindan türetilmis bir primer ve NtMRP polinükleotit sekansinin yukarisindaki ya da asagisindaki bir sekansa melezlenen bir ikinci primer kullanilarak da gerçeklestirilebilir - örnegin bir NtMRP transkripsiyon baslatici sekansi, mRNA öncüsünün 3' ucu ya da bir vektörden türetilen bir sekans. Polinükleotidlerin in vitro amplifikasyonu için kullanisli termal ve izotermal tekniklerin örnekleri, teknikte iyi bilinmektedir.

Numune, bir bitki, bir bitki hücresi ya da bitki malzemesi ya da bitkiden, bitki hücresinden ya da burada tarif edilen bitkisel malzemeden yapilmis ya da türetilmis bir üründen elde edilebilir ya da türetilebilir.

Böylece, baska bir yaklasimda, bir numunede bir NtMRP polinükleotitinin saptanmasi için bir metot saglanmis olup, bu metot: (a) bir polinükleotit içeren ya da içermesinden süphelenilen bir numunenin saglanmasi; (b) NtMRP polinükleotidinin en azindan bir kismini spesifik olarak tespit etmek için söz konusu numuneyi daha fazla primer ya da bir ya da daha fazla prob ile temas ettirme; ve (o) bir amplifikasyon ürününün varligini belirleme adimlarini içermekte olup, içerisinde bir amplifikasyon ürününün varligi, numunedeki NtMRP polinükleotitinin varliginin göstergesidir. Bir baska yaklasimda, NtMRP polinükleotidinin en azindan bir bölümünü spesifik olarak saptamak için daha fazla primerin ya da probun kullanilmasi da saglanmistir. NtMRP polinükleotidinin en azindan bir kismini saptamak için olan kitler de saglanmis olup, bunlar NtMRP polinükleotidinin en azindan bir kismini spesifik olarak saptamak için daha fazla primer ya da probdan birini içerir. Kit polinükleotid amplifikasyonu için reaktifler - örnek olarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) - ya da polinükleotit probu melezleme tespit teknolojisi için - örnek olarak Southern Blots, Northern Blots, yerinde melezleme ya da mikro sekans gibi - reaktifler içerebilir. Kit, Western Blots, ELISA, SELDI kütle spektrometrisi ya da test seritleri gibi antikor baglama tespit teknolojisi için reaktifler içerebilir. Kit, DNA sekanslama için reaktifler içerebilir. Kit, kadmiyum gibi agir metallerin belirlenmesi için reaktifler ve/veya talimatlar içerebilir. Bazi yapilanmalarda, bir kit tarif edilen metotlardan biri ya da daha fazlasi için talimatlar içerebilir. Tarif edilen kitler, özellikle ortak dominant puanlama ile genetik kimlik belirleme, filogenetik çalismalar, genotipleme, haplotipleme, pedigri analizi ya da bitki islahi için yararli olabilir.

Mevcut tarifname ayrica bir bitkinin, bir NtMRP polinükleotitini içeren bir bitki hücresinin ya da bitki malzemesinin genotipinin belirlenmesine yönelik bir metot da saglar. Genotipleme, bir kromozom çiftinin homologlarini ayirt etmenin bir yolunu saglar ve bitki popülasyonundaki segregantlari ayirmak için kullanilabilir. Moleküler isaretleme metotlari, filogenetik çalismalar için, bitki çesitleri arasindaki genetik iliskileri karakterize etmek için, çaprazlamalari ya da somatik melezleri tanimlama için, monogenik özellikleri etkileyen kromozomal bölümleri lokalize etmek için ve niceliksel kalitim arastirmasi için kullanilabilir. Spesifik genotipleme yöntemi, amplifikasyon parçasi uzunluk polimorfizmlerini (AFLP'Ier) içeren herhangi bir sayida moleküler isaretleyici analitik teknigi kullanabilir. AFLP 'ler, nükleotid sekansi degiskenliginin neden oldugu amplifikasyon parçalari arasindaki alelik farklarin ürünüdür. Böylece, NtMRP 'nin yani sira AFLP analizi gibi teknikler kullanilarak bu genlere ya da polinükleotidlere genetik olarak baglanmis kromozomal sekanslarin ayrilmasini takip etmek için bir araç tarif edilmektedir.

Bulus, istemlerde açiklanan bulusun kapsamini sinirlama amaci tasimayan asagidaki örneklerde daha ayrintili olarak açiklanacaktir. ÖRNEKLER Asagidaki örnekler bir sinirlama olarak degil, örnek olarak verilmistir. Aksi belirtilmedikçe, geleneksel teknikler ve moleküler biyoloji, bitki biyolojisi, biyoinformatik ve bitki islahi yöntemleri kullanilir. Örnek 1: NtMRP3 DNA 'sinin genomik sekansinin tanimlanmasi Tütün BAC kütüphanesi. Bir bakteriyel Yapay Kromozom (BAC) kütüphanesi asagidaki gibi hazirlanir: Çekirdekler, Hicks Broad Leaf 'in Nicotiana tabacum varyetesinin serada yetistirilen bitkilerinin yapraklarindan izole edilir. Yüksek moleküler agirlikli DNA, standart protokollere göre çekirdeklerden izole edilir ve BamHl ve Hindlll ile kismi olarak sindirilir ve BAC vektörü plNDIG05 'in BamHl veya Hindlll bölgelerinde klonlanir. Tütün genomunun yaklasik 9.7 katini kaplayan 135 mega baz çiftinin ortalama insert uzunlugunda 320.000 'den fazla klon elde edilir.

Tütün genom sekansi düzenegi. Rastgele seçilmis çok sayida BAC klonu, ortalama 550 baz çifti uzunlugundaki 1.780.000 'den fazla ham sekans üreten Sanger yöntemi kullanilarak sekanslamaya tabi tutulur. Metil filtreleme, Escherichia koli 'nin bir Mcr + türü kullanilarak dönüsüm için uygulanir ve yalnizca hipometile DNA izole eder. Tüm sekanslar, 200,000 den toplayicisi kullanilarak birlestirilir. Contig boyutlari 120 ile 15.300 baz arasi arasinda olup, ortalama 1.100 baz çifti uzunluga sahiptir.

NtMRP3 DNA 'sinin genomik sekansi, NtMRP3 DNA 'si içeren genomun bir kismini içeren bir BAC dizilimi ile tanimlanir. Sekans, Sekil 6 'da belirtilmistir. Örnek 2: NtMRP3 RNAi Ekspresyon Vektörleri ile Tütün Çesitlerinin Transformasyonu Tütün tohumlari sterilize edilir ve 5 ml/L bitki koruyucu karisim (PPM) ile takviye edilmis MS bazal ortamini içeren bir petri kabinda çimlendirilir. Filizler yaklasik olarak 7 ile 10 günlük filizlenme sonrasinda çesitli NtMRP3 RNAi ekspresyon vektörleri ile transformasyon için seçilir.

Tek bir Agrobacteri'um tumefaciens LBA4404 kolonisi 50 mg l“1 kanamisin (kanamisin mono sülfat) içeren bir sivi ortami içinde inoküle edilir ve iki tarafli çalkalama ile 28°C'de 48 saat yogunluga kadar süspansiyon haline getirildi. 7-10 günlük filiz eksplantlari 5 dakika boyunca bir bakteriyel süspansiyon içine daldirilir ve steril filtre kagitlari Üzerinde blotlandi. Elli eksplant REG agar ortamin ( takviye edilen MS bazal ortam) 100 mm X 20 mm petri kaplarinin 40 ml ,lik sivi bölüntüleri üzerine yerlestirildi. Eksplantlar 25 °C 'de Agrobacterium ile birikte kültive edildi. 3 günlük birlikte kültivasyon ardindan eksplantlar yikandi ve transformantlari seçmek için RCPK ortamina ( tasindi. Eksplantlar her 2 haftada bir alt kültürlendi. Seçici kosullar altinda 8-12 hafta büyümenin ardindan NtMRP3 RNAi ekspresyon yapilarini kendi genomlari içine entegre eden transformantlari temsil eden kurtulan bitkiler bir köklestirme ortamina (100 mg I-1 Kanamisin ile takviye edilen MS bazal ortami) tasindi. Köklenmis bitkiler ayrica büyümeyi tesvik etmek için kaplara tasindi. Örnek 3: Tütün bitkilerinde NtMRP3 polinükleotit ekspresyonu NtMRP3 polinükleotitinin ekspresyonunu belirlemek için, toplam hücresel RNA, bitkilerin çesitli kisimlarindan izole edilir. Toplam RNA, TRI® Reaktifi (Sigma-Aldrich, St. Louis, M0) kullanilarak izole edilir. DNA katiskilarini uzaklastirmak için saflastirilan RNA RNAz- bulunmayan DNAz ile isleme tabi tutuldu (TURBO DNA-free, Ambion, Austin TX). Birinci CDNA sarmalini sentezlemek için yaklasik olarak toplam 10 ug toplam RNA Yüksek Kapasiteli CDNA Arsiv Kiti (Applied Biosystems, Foster City, CA) kullanilarak transkribe edildi. Örneklerdeki NtMRP3 transkriptlerinin seviyesini ölçmek için kantitatif 2 adimli bir RT-PCR Taqman MGB probuna dayali kimyaya göre gerçeklestirildi. RT karisimi 4 uM dNTP karisimi, 1X rastgele primer, 1X RT Tamponu, 10 g CDNA, 50U Çoklu yazicili Ters transkriptaz (Applied Biosystems), 2U Superaz-In RNaz Inhibitörü (Ambion), ve nükleazsiz su içerir. PCR karisimi 1X Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), 400 nM ileri primer, 400 nM ters primer, 250 nM Taqman MGB prob, 2 ng cDNA ve nükleazsiz su içerdi. RT-PCR bir ABI 7500 Real-Time System (Applied Biosystems, Foster City, CA) kullanilarak ve amplifikasyon kosullari altinda gerçeklestirildi: 2 dakika boyunca 50 °C; 10 dakika boyunca 95 °C; 15 saniye boyunca 95 °C 'lik 40 döngü; ve 1 dakika boyunca 60 °C. Örnek 4: Tütün bitkilerinde NtMRP3 polinükleotit ekspresyonunun susturulmasi Tütün Genom Girisimi (TGI) ek açiklamalari kullanilarak varsayilan bir NtMRP3 transkriptini kodlayan bir birinci kismi sekans bulunur. Bu özel sekanstan, bir RNAi yaklasimi kullanilarak tütün içindeki NtMRP3 polinükleotit ekspresyonunu susturmak için primerler olusturulur. Karsilik gelen NtMRP3 RNAi sekansi (RT-PCR) ile cDNA 'dan güçlendirilir ve daha sonra üretici (Invitrogen) tarafindan detayli olarak açiklandigi üzere bir giris vektörü vasitasiyla pB7GWIWGZ (ll) Gateway vektörüne sokulur. Bu vektör bitkinin tüm dokularinda transgeninin konstitütif ekspresyonu için (karnabahar mozaik virüsü (CaMV 358 transkripsiyon baslatici) bir transkripsiyon baslatici ve agar plakalari (30 mg/ml) üzerinde Basta ile bitki öldürücü kimyasal seçimi için bar geni içerir. Yapi daha sonra klasik bir yaprak disk prosedürü kullanilarak Agrobacterium tumefasciens yoluyla Burley tütünü KY14 'ün genomuna yerlestirilir. CaIIi 'den, münferit soylar Basta üzerinde yeniden üretilir ve seçilir. RNAI susturucu dizgiler daha sonra RT-PCR ile izlenir ve tohum üretimi için büyütülür. T1 tohumlari toplanir, Basta içeren agar plakalari üzerinde yeniden büyütülür ve seçilim için dirençli bitkiler, tarlada ekimden önce yüzen tepsilerde yetistirilir.

Yaklasik olarak 500 mg tütün tartilir ve mikrodalgada hizlandirilmis reaksiyon sistemi 5 sindirim sistemi (CEM corporation, Mathews, NC) vasitasiyla 10 ml konsantre HN03 içinde sindirilir.

Agir metal konsantrasyonlari indüktif olarak birlestirilmis plazma-kütle spektrofotometresi kullanilarak analiz edildi ("ICP-MS." Agilent 7500A; Agilent Technologies, Palo Alto. CA).

Transgenik olmayan tütün kontrol olarak Polonya sertifikali Virjinya tütün yapraklari, CTA-VTL-2 Örnek 5: NtMRP4 DNA 'sinin genomik sekansinin tanimlanmasi NtMRP4 DNA 'sinin genomik sekansi, NtMRP4 DNA 'si içeren genomun bir kismini içeren bir BAC dizilimi ile tanimlanir. Sekans, Sekil 1 'da belirtilmistir. Örnek 6: NtMRP4 RNAi Ekspresyon Vektörleri ile Tütün Çesitlerinin Transformasyonu Tütün tohumlari sterilize edilir ve 5 mI/L bitki koruyucu karisim (PPM) ile takviye edilmis MS bazal ortamini içeren bir petri kabinda çimlendirilir. Filizler yaklasik olarak 7 ile 10 günlük filizlenme sonrasinda çesitli NtMRP4 RNAI ekspresyon vektörleri ile transformasyon için seçilir.

Tek bir Agrobacterium tumefaciens LBA4404 kolonisi 50 mg I'1 kanamisin (kanamisin mono sülfat) içeren bir sivi ortami içinde inoküle edilir ve iki tarafli çalkalama ile 28°C'de 48 saat boyunca inkübe edildi ( yogunluga kadar süspansiyon haline getirildi. 7-10 günlük filiz eksplantlari 5 dakika boyunca bir bakteriyel süspansiyon içine daldirilir ve steril filtre kagitlari üzerinde blotlandi. Elli eksplant REG agar ortamin ( takviye edilen MS bazal ortam) 100 mm X 20 mm petri kaplarinin 40 ml 'lik sivi bölüntüleri üzerine yerlestirildi. Eksplantlar 25 °C 'de Agrobacterium ile birikte kültive edildi. 3 günlük birlikte kültivasyon ardindan eksplantlar yikandi ve transformantlari seçmek için RCPK ortamina ( tasindi. Eksplantlar her 2 haftada bir alt kültürlendi. Seçici kosullar altinda 8-12 hafta büyümenin ardindan NtMRP4 RNAi ekspresyon yapilarini kendi genomlari içine entegre eden transformantlari temsil eden kurtulan bitkiler bir köklestirme ortamina (100 mg I -1 Kanamisin ile takviye edilen MS bazal ortami) tasindi. Köklenmis bitkiler ayrica büyümeyi tesvik etmek için kaplara tasindi. Örnek 7: Tütün bitkilerinde NtMRP4 polinükleotit ekspresyonu NtMRP4 polinükleotitinin ekspresyonunu belirlemek için, toplam hücresel RNA, bitkilerin çesitli kisimlarindan izole edilir. Toplam RNA, TRI® Reaktifi (Sigma-Aldrich, St. Louis, M0) kullanilarak izole edilir. DNA katiskilarini uzaklastirmak için saflastirilan RNA RNAz- bulunmayan DNAz ile isleme tabi tutuldu (TURBO DNA-free, Ambion, Austin TX). Birinci cDNA sarmalini sentezlemek için yaklasik olarak toplam 10 ug toplam RNA Yüksek Kapasiteli cDNA Arsiv Kiti (Applied Biosystems, Foster City, CA) kullanilarak transkribe edildi. Örneklerdeki NtMRP4 transkriptlerinin seviyesini ölçmek için kantitatif 2 adimli bir RT-PCR Taqman MGB probuna dayali kimyaya göre gerçeklestirildi. RT karisimi 4 uM dNTP karisimi, 1X rastgele primer, 1X RT Tamponu, 10 g cDNA, 50U Çoklu yazicili Ters transkriptaz (Applied Biosystems), 2U Superaz-In RNaz Inhibitörü (Ambion), ve nükleazsiz su içerir. PCR karisimi 1X Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), 400 nM ileri primer, 400 nM ters primer, 250 nM Taqman MGB prob, 2 ng cDNA ve nükleazsiz su içerdi. RT-PCR bir ABI 7500 Real-Time System (Applied Biosystems, Foster City, CA) kullanilarak ve amplifikasyon kosullari altinda gerçeklestirildi: 2 dakika boyunca 50 °C; 10 dakika boyunca 95 °C; 15 saniye boyunca 95 °C 'lik 40 döngü; ve 1 dakika boyunca 60 °C.

NtMRP4 polinükleotit, petallardan, stamenden, pistilden, sepallerden, kapsülden, damarlardan, yapraklardan ve köklerden cDNA kullanilarak RT-PCR ile belirlenmis oldugu üzere tütün dokulari içerisinde eksprese edilir.

Tütün bitkileri hidroponik bir solüsyonda yetistirildiginde, NtMRP4 polinükleotidinin ekspresyonu, N. tabacum'un hem kök hem de yaprakli bitkiciklerinde kadmium tarafindan hafifçe yukari regüle edilir (TN90, bkz. Sekil 2). Bununla birlikte, NtMRP4 polinükleotidinin N. rustica yapraginda da indüklendigi bulunmasina ragmen, N. tabacum ile karsilastirildiginda N. rustica'nin (asagi regülasyon) köklerinde zit veriler gözlenir, böylece NtMRP4 polinükleotitinin N. rustica kök ve kadmiyum toleransinda kadmiyum birikiminde bir rol oynayabilecegi düsünülür. Örnek 8: Tütün bitkilerinde NtMRP4 polinükleotit ekspresyonunun susturulmasi Tütün Genom Girisimi (TGI) ek açiklamalari kullanilarak varsayilan bir NtMRP4 transkriptini (gösterilmemistir) kodlayan bir birinci kismi sekans (CHO_SL022xb24f1.ab1) bulunur. Bu özel sekanstan, bir RNAI yaklasimi kullanilarak tütün içindeki NtMRP4 polinükleotit ekspresyonunu susturmak için primerler olusturulur (SEKIL1). Karsilik gelen MRP4 RNAI dizisi (RT-PCR) ile CDNA 'dan amplifiye edilir ve daha sonra üretici (Invitrogen) tarafindan detayli olarak açiklandigi üzere bir giris vektörü vasitasiyla pB7GWIWG2 (II) Gateway vektörüne sokulur. Bu vektör bitkinin tüm dokularinda transgeninin konstitütif ekspresyonu için (karnabahar mozaik virüsü (CaMV 358 transkripsiyon baslatici) bir transkripsiyon baslatici ve agar plakalari (30 mg/ml) üzerinde Basta ile bitki öldürücü kimyasal seçimi için bar geni içerir. Yapi daha sonra klasik bir yaprak disk prosedürü kullanilarak Agrobacterium tumefasciens yoluyla Burley tütünü KY14 'ün genomuna yerlestirilir. Calli 'den, münferit soylar Basta üzerinde yeniden üretilir ve seçilir. RNAI susturucu dizgiler daha sonra RT-PCR ile izlenir ve tohum üretimi için büyütülür. SEKIL 3, NtMRP4 susturmanin hatlar 1 ve 2 de dahil olmak üzere transgenik çizgilerde etkili oldugunu göstermektedir. T1 tohumlari toplanir, Basta içeren agar plakalari üzerinde yeniden büyütülür ve seçilim için dirençli bitkiler. tarlada ekimden önce yüzen tepsilerde yetistirilir.

Yaklasik olarak 500 mg tütün tartilir ve mikrodalgada hizlandirilmis reaksiyon sistemi 5 sindirim sistemi (CEM corporation, Mathews, NC) vasitasiyla 10 ml konsantre HN03 içinde sindirilir. Agir metal konsantrasyonlari indüktif olarak birlestirilmis plazma-kütle spektrofotometresi kullanilarak analiz edildi ("ICP-MS," Agilent 7500A; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Transgenik olmayan tütün kontrol olarak Polonya sertifikali Virjinya tütün yapraklari, CTA-VTL-2 'den olusan bir örnek karsilastirilabilir kosullar altinda hazirlanir.

SEKIL 4, iki ardisik yilda iki ardisik alan deneyinin ardindan test edilen iki NtMRP4 RNAI çizgisinde (çizgi 1 ve 2) %20 'ye yakin bir yaprak kadmiyum azaltmasini göstermektedir. Her bir durumda, deney birimleri, bloklar halinde rastgele hale getirilmis toplanmis 4 bitkiden (wt, satir 1 ve 2 ve ikinci yil Tarla deneyinde vektör kontrol bitkileri) dört bagimsiz replikattan olusur. Ek olarak, mekansal egilimleri kontrol etmek için bloklara kontrol örnekleri eklenir. NtMRP4 RNAi çizgilerinin analizi, kadmiyumun ortalama seviyesinin azaltilmasinda güçlü ve istatistiksel olarak anlamli bir etki göstermektedir. Örnek 9: NtMRP4 polinükleotit ekspresyonunun susturuldugu tütün bitkilerinden elde edilen bitkilerde boy ve kilo analizi.

Susturulmus NtMRP4 hatlarinin yüksekligi ve agirligi, kontrol bitkilerine kiyasla biraz etkilenir.

Bununla birlikte, NtMRP4 RNAi bitkileri ve vahsi tip ya da vektör kontrol bitkileri arasinda kurutulmus toplanan yapraklarda önemli bir farklilik bulunmaz, bu da NtMRP4 transkriptlerinin bozunmasinin kuru biyokütle üzerinde istatistiksel olarak anlamli bir etkisi olmadigini gösterir.

Bu veriler, ayni tütün arka planinda (KY14) asiri eksprese eden AtMRP4'ün (NtMRP4 polinükleotidine benzer) yapraklarda (transjenik çizgilere bagli olarak) %10-30 daha fazla kadmiyum birikimine yol açtigini gösteren baska bir tarla deneyi ile dogrulanmistir. NtMRP4 proteinini kodlayan mRNA'nin indirgenmesinin tütün yapragindaki kadmiyum seviyesini önemli ölçüde azalttigi açiktir. Örnek 10: NtMRP4 'te EMS ile indüklenen mutantlarin tanimlanmasi Bir DNA kütüphanesi, etil metansülfonat (EMS) 'ya maruz birakilmis ve tek tek bitkilerin NtMRP4 geninin ilgili kisminin sekanslanmasi ile NtMRP4 polinükleotitinin ekson 1 ve ekson 2 'deki mutantlar için taranan Nicotiana tabacum bitkilerinden yapilir.

Ekson 1 için NtMRP4Ekson1FW (5'-CATCTCCTTACGAAGGATACTACC-3 ') ve NtMRP4Ekson1REV (5'-GCTGCAAGCTCTCCTTTTCTAA-3 ') sekanslama için kullanilir ve ekson 2 için NtMRP4Ekson2FW (5'-GTGCAATCTGGCAAATATAGTGAG-3 ') ve NtMRP4Ekson2REV (5'-AAAATGACATAGGAGCATGCAGTA-3 ') sekanslama için kullanilir.

NtMRP4 polinükleotidinin eszon 1 ve eszon 2 için bulunan tüm mutantlarin bir genel görünümü Tablo 1 'de sunulmustur. Orijinal kodon (kodon ori) ve mutasyona ugramis kodon (kodon mut), ayrica orijinal amino asit (AS ori) ve amino asit ikamesi (AS mut) ya da stop kodonu belirtilmistir. Örnek 11: Çinko parmak nükleaz hedef bölgelerinin seçimi için arama protokolü Bu örnek, genin ekspresyonunu modifiye etmek için araçlar gelistirmek üzere belirli bir genom veri tabanina kiyasla verilen gen dizisi içindeki benzersiz hedef bölgelerin meydana gelmesi için NtMRP4 geninin nasil aranacagini gösterir. Asagida açiklananlar da dahil olmak üzere tarifnamenin metotlari tarafindan tanimlanan hedef bölgeler sekans motifleri ve bölgelerin ya da motiflerin herhangi birinin tütün gibi bir bitkide karsilik gelen gen sekansini modifiye etmek için kullanimi tarifname içerisine alinmistir.

Arama algoritmasi. Örnek olarak Örnek 1'in tütün genom sekansi düzenegi gibi bir DNA veriitabani içerisinde bir son ek dizisi kullanan herhangi bir mesafe tutucu boyutu tarafindan ayrilan iki adet sabit uzunlukta alt dizgi DNA motifinin ortaya çikisi için bir girdi sorgusu (hedef) nükleotit sekansinin taranmasina olanak taniyan bir bilgisayar programi gelistirilmistir. Sonek dizisi olusturma ve arama, herhangi bir girdi dizesini dogrudan Burrows-Wheeler dönüstürülmüs dizeye dönüstüren açik kaynak Iibdivsufsort library-2.0.0 (http://code.google.com/p/Iibdivsufsortl) kullanir. Program, tam girdi (hedef) nükleotid dizisini tarar ve seçilen DNA veritabaninda seçilen sayida süreden daha az olan tüm alt dizgi kombinasyonlarini döndürür.

Bir sorgu dizisinin çinko parmak nükleaz araci/i mutagenezi için hedef alanin seçimi.

Bir çinko parmak DNA baglanma alani, bir üç baz çifti uzunlukta nükleotit sekansini tanir. Bir çinko parmak nükleazi, bir, iki, üç, dört, bes, alti ya da daha fazla çinko parmak DNA baglama alanini ve bir Tip IIS kisitlama enziminin spesifik olmayan nükleazini içeren bir çinko parmak proteini içerir. Çinko parmak nükleazlari, bir hedef sekansa iki iplikçikli bir kirilmanin sokulmasi için kullanilabilir. Çift iplikçikli bir kirilmayi yerlestirmek için, biri hedef sekansin arti (üst) dizgisine baglanan ve digeri ayni hedef sekansin bir eksi (alt) dizgisine baglanan bir çift çinko parmak nükleazin O, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ya da daha fazla nükleotitle ayrilmasi gereklidir. Iki sabit uzunlukta allt dizgi DNA motifinin her biri için 3 'lük çogul kullanilarak, program belirli bir aralayici uzunlugu ile ayrilan iki çinko parmak proteini hedef bölgesini tanimlamak için kullanilabilir.

Program girdi/eri.' 1. Hedef sorgu DNA sekansi Aranacak DNA veritabani Ilk alt dizgi DNA motifinin sabit boyutu Ara parçanin sabit boyutu Ikinci alt dizgi DNA motifinin sabit boyutu Program girisi 2 'nin seçilen DNA veri tabanindaki program girisi 4 ile ayrilan program girisleri 3 ve 5 kombinasyonunun esik sayisi Program çiktisi.' 1. Her bir sekans için, DNA veri tabaninda sekansin maksimum sayisi, maksimum program girisi 6 esigi ile kaç kez gerçeklestigine dair nükleotit sekanslarinin bir listesi. Örnek 12: Tütün içindeki NtMRP3 ve NtMRP4 transkriptlerinin ekspresyon profili Tütün EksonDizisinin gelistirilmesi ve analizi. Örnek 1 'de tarif edilmis oldugu üzere elde edilen BAC klonlarini kullanarak, 272,342 ekson tütün EST verilerinin ve BAC dizilemesinden elde edilen metil filtreli sekanslarin birlestirilmesi ve karsilastirilmasiyla tanimlanir. Bu eksonlarin her biri için dört 25-mer oligonükleotit tasarlanmis ve bir Tütün EksonDizisi olusturmak için kullanilmistir. EksonDizisi standart protokoller kullanilarak Affymetrix (Santa Clara, ABD) tarafindan yapilir.

Tütün içindeki NtMRP3 ve NtMRP4 'Ün ekspresyon profili. RNA, Cd + (Cd kontamine) ve Cd- (Cd yoksun) topraklarda yetistirilen Nicotiana türlerinden izole edilir ve standart melezleme protokolleri ve analitik araçlar kullanilarak analiz edilir. Ekspresyon profili, Cd birikimi ile ilgili gen kümelerini tanimlamak ve topragin Cd 'sinin NtMRP3 ve NtMRP4 transkriptlerinin varyasyonu üzerindeki etkisini belirlemek için gerçeklestirilir. Kullanilan NtMRP3 ve NtMRP4 problari, 3'UTR bölgesinde oldugu gibi birinci ve sonuncu eksonlarda da bulunur. Tablo 2 'de gösterilmis olan sonuçlar, Cd ile kirlenmis bir toprakta yetistirilen N. tabacum bitkilerinin yapraklarinin ayni toprakta yetistirilen N. rustica bitkilerinden daha fazla Cd biriktirdigini göstermektedir. N. tabacum bitkilerinin kökleri, N. rustica bitkilerinin köklerinden daha az Cd biriktirir. Ilginç bir sekilde, hem NtMRP3 hem de NtMRP4 Cd tarafindan düzenlenmez, ancak iki Nicotiana türünün de ekspresyonlari farklidir, bu da her iki genin Nicotiana erisimlerinde Cd alimi, translokasyon ve birikimi farkli sekilde kullandiklarini gösterir (veriler log olarak 2 biyolojik replikanin oitalamasina karsilik gelir). Kontroller olarak, üç yönetici genin (UBP12, ekson 1 ve 2), d-tubulin ve ribozomal protein 816 'nin ekspresyonu gösterilmektedir.

Codon AS Codon AS Amplikon f sek r sek ori ori mut Mut NtMRP4-1 gaagctggaatg attttaaagag gau asp aau asn NtMRP4-1 atgcttatt gatcgacact cga arg uga stop NtMRP4-1 aggttgtcatg tcagctagac ugc cys ugu cys NtMRP4-1 tgctcagcta acaggctcatg aga arg aaa Iys NtMRP4-1 acaggctcatg tgttggacag ggu gly gau asp NtMRP4-1 caggctcatg tgttggacag ggu gly gau asp NtMRP4-1 tgttggaca attgtaaattat cag gln caa gln NtMRP4-1 ccgtagatgct agcagctttc cag gln uag stop NtMRP4-1 gcagctgtcc atatgatgcta gau asp aau asn NtMRP4-1 gctacagcta attccatttg cau his uau tyr NtMRP4-1 attccatttg ctcatgccatt ugg trp uga stop NtMRP4-1 tgccattgcaa tttctgtggc guu val auu Ile NtMRP4-1 ctttagccatc tttatactta cuu Ieu uuu phe NtMRP4-1 ttcaactgtt taacactagc gua val aua ile NtMRP4-'l tggacttgca cagtgatggta gca ala aca thr NtMRP4-1 aggoaacaaat agatgotta gag glu aag Iys NtMRP4-1 ttataaagtt caggcatggg uuc phe uuu phe NtMRP4-1 ttataaagtt caggcatggga uuc phe uuu cys NtMRP4-1 attgaatcttt cgcgagtccga uuc phe uuu phe NtMRP4-1 aatctttccgc agtccgagt gag glu aag Iys NtMRP4-1 agtacggatg ttgtccaagtt ugg trp uga stop NtMRP4-1 agttcttgtact aatagctggt uca ser uua Ieu NtMRP4-1 cattgtcttgt gagcactcct ugg trp uag stop NtMRP4-1 ttgtcttgtg agcactcctc ugg trp uga stop NtMRP4-1 tggagcactc tcttctagt ccu pro cuu Ieu NtMRP4-1 tcttctagttg tacgctcactt gcu ala guu val NtMRP4-1 atcccgcttg cgcaggaaca gcg ala acg thr NtMRP4-1 atcccgcttg cgcaggaaca gug val aug met NtMRP4-1 gaaccgatca ggctttccct agg arg aag Iys NtMRP4-1 catgatctca tttcacaagca cuu leu uuu cys NtMRP4-1 atctcttgata attggacaaat aga arg aaa Iys NtMRP4-2 tattagaagct gaatggatttt gga gly aga arg NtMRP4-2 ttcaccgcga atctctcttc aca thr aua ile NtMRP4-2 aaacaaccaaa agagcaatgc gag gly aag Iys NtMRP4-2 ccttgaagaat aaaatcttctc uca ser uua Ieu NtMRP4-2 agaatcaaaat ttctcgaagat ucu ser uuu phe NtMRP4-2 tatctaaggaa aaaacggaga gaa glu aaa Iys NtMRP4-2 tcaacagtota atctga aca thr aua ile NtMRP4-2 atctgatagg gggattctaaa ggg gly agg arg NtMRP4-2 acttataaag aagaagaaag gaa glu aaa Iys NtMRP4-2 aacttataaag aagaagaaag gaa glu aaa Iys NtMRP4-2 aaggaagaa aaagagaaactg gaa glu aaa Iys NtMRP4-2 gctatatatta tgaagcttttg acu thr auu ile NtMRP4-2 gctatatatta tgaagcttttg acu thr auu ile NtMRP4-2 gaagcttttg atggtgggg gga gly gaa glu NtMRP4-2 ttggatggtg ggcgtagtgct ugg trp uga stop NtMRP4-2 ttgtggcaaa ttctctaatg agu ser aau asn NtMRP4-2 gttctctaat gcaagtga aug leu aua Ieu NtMRP4-2 gcaaagttct taatggcaag cua leu uua Ieu NtMRP4-2 tattggctg catatgaaac gca ala aca thr NtMRP4-2 caacaaatga atgcttaatt gag glu gaa glu NtMRP4-2 cttcagcrgay gtgccatgtcct cgu arg ugu cys NtMRP4-2 tgtccttcaat cttctctgtt ccu pro ucu ser NtMRP4-2 ggcatgggaa aacattttaa gaa glu aaa Iys Kök N. rustika Kök TN90 Yaprak N. rustika Yaprak TN90 SEKANSLAR (gölge eksonlarin konumunu isaret eder) SEK ID NO:1 (5 've 3' UTR ile NtMRP4'ün DNA sekansi) ggtgagtttgattcatactncaatctagtttttagctttgcttaaaagCthttcttgcc atagagaaaatctcctgatggggatggttCtttttctcttttgcattaatgatcagaatt catcattgttaaatggtactccctcaataacttCttgatttaaaaaaaaaactgtcctct cattcataatcatcatctcctttatcatattaccctaaaccgttgctaaagctccttttt tctctccacactttcacatgtttccgtttcctgtagatttctcctttctctttcctcggt tctttttccaactcataatcttcatgtgatttcaatttttgtttgtttttattccatcct ttcagcgtatgcagattcaggggatataaagacataaaggatgaatcttttatggtataa catggatatgaggaacagtatgtcttcagaatctcgtctagcatcactctcctgttctgc ctctccatgtccacaaaggacLcctctatctcccattgatgtgctgcttttgctCacttt cattgtattcgcagtacaaaagtCgtactcaaagctgaggtccaatgagcactccacttc tagcattgataagcctccaactgcacacaacaggacttctgttagaaccaatccitggtt taagctgtctctgattttgtcagctactttagccttatcttctatagttttatgcacttt tatttcccacccaccgtccctgcgcgcçttCCggattgcaaactttgtagtcatgagttc gttctttggttgtgggatcacaaggcttgtgtcacttaaggaaattgatcccaacttaag cattaaaggttcgaccggagttgccgtaattagtgattctgaatctcacttaagtgatga aaccaatggLtatgaactcctggataaatccagtgtgagtggctttgcttcagcttctct aatatcgaaagccttttggaCCtggacgaaccctttactgcaaaaaggttacaagtcacc tctcaagattgatgaagctccttcaccttccccactgcatagagcagagaaaatgtctca acttttcgaaagaaatLggcctaaacctgaagaaatatcaaagcatcctgtccgaacaac attgctgcgttgcttttggaaggaagttatttttactgccattcttgcagtaattagggt atgtgtcatgtatgtagggccaacactcatacaaagatttgttgattacacagcaggaaa gaggacatccecttatgaaggatactaccctataggaactccectaataqccaaacttgt ggaagttctaacctctcatcagttcaactttaactcccaaaagcttggcatgcttattcg agcgacacttctcacttccttgtataagaaggggCtaaggctgtcatgctcagctagaca tacgatgctacagctacactccaCttggctcacgccattgcaagcctccgtggccttagg catcctttatacttacctcggtgctLcaactgttgtaacgctagctggacttgcagcagt gatggcatttgtggtgtttggaaccaaaagaaacaacaggtttcaattLuacatcatgaa gaaccgtgattctagaatgaaagcgacaaatgagaLgcttaattatatgcgcgttataaa gttccaggcatgggaagaacattitaacaaaagaattgaatchLccgcgdutccgagta tggatggttgtccaagtccttgtactcaatcgctgggaatatcattgtcttgtggagcac tcctcttctagtggctacactcacttttggaagtgcaatcstgttgggaatcccgcttgg tgcagggacagCQtLcachcaacatctctcctcaagatgttgcaggaaccgatcagggc tttccctcaatccatgatctcactttcacaagcaatgatatctcttgatagattggacaa atataLgatgagtaaggagttagtggataaagctgtggaaagactagaaggttgtggggg tacaattgccatgcaggtgaaagatggagctttttgctgggatgatgaaaacagtaaaga agaattgaaaaatgtaaactttgagactagaaaaggagagcttgcagcagtagtggggac dgttggggcggggaagtcttccctccctgcatctgtacttggtgagatgcacaagttgtc gggtcaggtatggctctcatccttctgtttgcttgattaatacaaactttgctgccaatc tgtagagtggaggtattatatgcagaacaattgcaatcaagcaattacctgtgagatacc atCCCgCtttcatattagtggaccggtacaczctcacuggtgtatcgtctgatctccacc aaagcagaggttttactggccgacagagtcaaaccactgtgcttcactcctcttactcca attactctggataacagcccLadatgcaagcaaaatcaactgtgttttcagtctcgagct guccaatcagttcacgacgtcctcagcttgtccaagctggtgcctcaccggaatcatgtg ggttaatagttccttaaacgtagtaattatttqctaactLdctttaccaaccccttqtcc aaceggtcacaaiitgtggttcaactgcctatgttgcacaaacatcgtggattcagaatg gcacgatacaagaaaataccccgtttggtatgccaatgaacagagacagacacaaggaag aaataggagaacgtggcatcadcctcagtggcggtcagaagcngcgaatccagcctgcaa gaqctgtttaccaqgaccqtgatatttatcttctagatgatgcactcagtgcaqttgatg aatcatggattttgaatggctactttccccagtgaaqacacaCatcacttcctgggagga agacgtgaaagcçgcaaqctacctactccaaaaagcataatccaaaaqacntttdnidag tttggaaggcttaatccaccatttgttatctgctgtctacttgtccttattaaaattctt ttgcctzggtgtccctacattttcagccatccccattccgaagctcatatttgttttctc qacctcttcaqaacttgtLgacgtggdaacadccaaagagagcaatgcctcccttgaaga atcaaaatcttctcgaagattatccaaggaagaaaacggagatgataaacctcaacagtc LacaLchataggggggatcctaaacttaLdadggaagaagadagagaductggaaaagt cagtcctcgcgtgtacaagctatacattactgaagcttctggatggtggggtgtagtgct ttgatgtcttcctcccgttctttanaazctcactttggccatgtttatcacactgctcg gcatcatcatcatcacatgccaatattcttggcctaccgtactacttttgattcctcLgg Z!cttgtcigaactcaaattLgaatcctttgtLtugdggcaattagtctgzcctgagcat cgaactaggagatiagcattcttctgcaaggagccctgaatgcttgaaaagttaaacaqa tatatgacatgtgCtaLLLgggagctdcgdaaaaqatuaggactattatgtagactacaa aaaccgagtgaattccantctgcgaanggatttccacaacadLggatccadtgaatggtt gggctLLcgactggudECgatgggaagcttactcctttgcgttcccgcaath:catgat da!gunahgag:dtgaggaaatagaatatccgtLgagcatttacgtctttctatCaaaaa tagatcaaatttaagtgttgtgcctataaagaattgtatqgtgagattgadtutagiggt caagccgtgggaatgttgagcttgaaaacgtgcaggtaataattctaactaattctgtgg ttgctatttgctagcatccgcacaaaaggaaaactataaaaagttcatagtaaggaagag agggtagctgtattaacaagcctacagattctttaatttcaaatatgttacgttgaatct ctatattgtttgtcctaccggtcaacaggtCagatatcgtccgaacactcctccagtgcc taaaggagttactctcagcattagagggggagagaagataggtgttgttggtcgtacagg gggtggaaaatcaacattaattcaagtCttctttcgtttggcggagcctgcagctggaag aataatcattgatgacgtagatatatccagacttgggcttcatgatcttagatctcgctt cgggatcattccccaagagccagtcctctttgaaggaactgtgagaagcaacattgaccc cattggacaatattcagatgatgaaatttggaaggtaatctaacttgctgactgaaataa tttacaaaaatctcaaaatatagtacagagttagccaaacatgtcttctgagtgctgaga tctttttggattataaattctgtaagagcaacatactatttgttagtgagaagaaaagca tatactccagcgttttgttatctcccagaatgtctctaacatgaaatcgCQCacattgca gagccccgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaaacccgaaaaacttgattc accaggtaaattttcctcctctacgtcatccttgtggttctttgcggaattatgcaacca actttctatgtgtttcaaatatatatactgataactgaatactgtcattggtaaatcata gttgtcgataacggagacaactggagtgtcggacagaggcagcttctttgctcgggaaga cagacagatgcagtgattcagaaaatcatccgcgaggactttgcggcctgtaccataatc agcattgcccacagaataccaacagtcatggactgtgatagagttcttgttatagatgca ggtgctgatttctctcctCttactttgtacctcattttgaaCctggtaaatgattattta tctgtatgtgatggtttccaaccaatcatagtcagtacctctatgaagaaattgcctaat gctagccaagcagtagtaaatgcatgaagtcattagcctacctgtCttggaCCttgtgag tctcatacttcaaactggaagcttatgctatactatctgacccctcgtttgtatagattg ctttcttttcctttttctcggatttatcttatacataagcggacagagtaaaagaatgta aacatgcgtaatttgacctattatagcagattatttgtcttattttccaggtcgctgatt ccacttattaggagtagttacacgtacttatcttttaagtgaaataatagtgtaaagttt cttttggcactgtcggtgtaaagaagttaaactcctttctttaaccccggcacttcttat tcatgcaggaatagcaaaagagtttgacaaaccatctcgttcgctcgaaaggccttcact tcctggggctctggttcaagaatatgccaaccgatcctctgagctctaaccacactatct tggctctcatgccttttgccgtaaattgcagctatcttggaggataggtgaaacaggaaa aatacctatccaaatgtcacatagattcccaaatagtgttatctcctactaagctatcca gtagatCtttggaaatgtaacaatactgggattaacaattgtaatCgatgaatctattaa tcaaacacaatgattattctgttatagacgtagtccgtgcaatgttatatagactgatttc SEK ID No:2 (5 've 3' UTR 'Siz NtMRP4'ün DNA dizisi) atggatatgaggaacagtatgtcttcagaatcttgtttagcatcactttcttgttctgc ctccacatttcaatcgtcagaggattcagcagttgctaaatggttaagattcattttccc ctctccatgtccacaaaggactcttctatcttccactgatgtgctgcttttgcttacttc cattgcatttgcagtacaaaagttgtactcaaagtcgaggtccaacgagcactctacttc tagcattgataagcctctaattgcacacaacaggacccctgcnagaaccaatctLtggtt taagctgtctctgatttcgtcagctattttagcctcatcttctatagttCtatgcatttc ggttattgtgggaaattcccagtcgccttggaaagtcatagatggaCCQtattggttgtc tcaggcgattacacaCQCtgtaatcaCCatactaaCagttcatgagaaaagatctcacgc tatttcccatccactgtccctgcgcgcgttttggatCgcaaactctgtagttaCQagttc gtcCCLLggtcgtgggatcacaaggcctgtgtcacttaaggaaatcgatcctaatttaag aaccaatggttatgaactcctggataaacccagtgtgagtggctttgcttcagcttctcc aatatcgaaagccttttggatttggatgaaccctttactgcaaaaaggttacaagtcacc tctcaagattgatgaagccccttcacttcccccaCtgcatagagcagagaaaatgtctca acttttcgaaagaaattggcctaaacctgaagaaatatcaaagcatcctgtccgaacaac attgctgcgtthCtttggaaggaagttahttttaccgccattcttgcagtaattagggt atgtgttatgtatgtagggccaacactcatacaaagatttgttgattacacagcaggaaa gaggacatctccttatgaaggatactaccttataggaactctcctaatagccaaacttgc ggaagttctaaccccccatcagttcaactctaactcccaaaagcttggcatgcttattcg agcgacacttctcacttctttgtataagaaggggttaaggttgtcatgctcagctagaca ggctcatggtgttggacagattgtaaattatatggccgtcgatgctcagcaQCCQtccga tatgatgctacagctacaCCccatttggctcatgccattgcaagtctctgtggccttagg catccttCataCCCacctcggtgcttcaactgttgtaacgctagctggacttgcagcagt gatggtatttgtggtgtttggaactaaaagaaacaacaggtttcaattcaacatcatgaa gaatcgtgattccagaatgaaagcgacaaatgagatgcttaattatatgcgcgctataaa tggatggttgtccaagrtctthaCCCaatcgccgggaatatcattgtctcgtggagcac tcctccLccagtggccacactcactcttggaagtgcaatcttgttgggaatcccgcttgg tgcagggacagtgttcactgcaacatctctcttcaagatgttgcaggaaccgaccagggc tttccctcaatccatgatctcactttcacaagcaaigatatccctcgatagatcggacaa tacaaccgctangcaggtgaaagatggagccttttgctgggatgatgaaaacagcaauga aqautLgaaaaatgtaaactttgagdttagaaaaggagagcttgcagcagtagtggggac agttggggcggggaagtcttccctccttgcatctgtacttggtgagatgcacaagttgtc gggtcaggtatggctctcatccttctgtLtgtttgaLtaatacaaactttqctqccaatt accttttgccccttgtLgctaCCCcttttCCQtggtataaaaaattaatgtaggctaatg aaagcagaggttttactggccgacagagtcaaactactgtgcttcactccttttactcca attagctgattagtcactctacaattccagagcatacctacattttctgcttggttgtct gaccaaccagttcatgacgccctcagcttgtccaagctggtgcctcaccggaactatgtg ggaccttcgtacttaatcaactagttcaccttcttcttaaaaaLattgaatgntttgutt ggtcaatagttccttaaacgtagtaattatttgctaacttacttiaccaaccccttgtcc aacaggtcacaatttgtggrtcanctqccratgttgcacaaacaicgrggaticagaatg aaataggagaacgtggcatcaacctcagtggtggtcagaagcagcgaatccagcttgcaa ctcacactggctctgauatcttcuaggttugaagtccacaatgtcatgtgtcattgaaga aatcatqgatLLLgaatggctactcnccccagtgaagacacatdccutLtccigggagga agatgtgaaagtggcaagctatttactccaaaaagtataatctaaaagacttttactaag tttggaaggciLaatccutcuttcgttatctgctgcctacttgcctttactaaaatLCLL aaagataaaaccattttgcttgtcacacaccaagttgacttcttgcataatgctgacctg caaatataatgagatactagaagCCggaatggatcctaaagagctagtagccgcacatga atcaaaatcttcccgaagattatctaaggaagaaaacggagatgataaatctcaacagtc cagtcctcgtgtgtacaagctatatactactgaagctttcggdcggtggggcgtagtgct atatgaaacttcagcggatcgtgccatgtccttcaatccttctctgtttattgggatata tcctazqtcattcttcgacacaacaccttccggaagaattctgagtcgggtaaatttctg aggacaagtttttcctcttgcatgtaaathaaactttgctgcctagatgattaaataac gcatcdtcatcaccacatgccaacattcctgqcccaccqcictaCCtttgattcctctgg ttgcaactctgaCCGatctagatttggggaaggCttgttgttagttgatgactagatacL aaagaaaaagtccugggcagatagacataatgtgccaaagtaathaattgqagcacaga tatatgacatgtgttacttgggaQCCacgaaaaagataaggactattatgtagactacaa ttgaaataacaggtaattcatttctggtttacagggatattatcttgcaacatctcgtga attgactcggcttgactcaattacaaaagcacctgttattcaccatttccctgaaagcat ctcaggtgttatgactatacgttgccntaggaagcaggagatgttttgtaacgagaatgt aaaccgagtgaactccaatctgcgaatggatctccacaacaacggatccaatgaatggtt gggccttcgactggaattgatgggaagcttacttctttgtgtttccgcaatgttcatgat tgtcttacctagcagcatcatcaagccaggtataacaccgtccaatgctcacttatggga attataaatcctagtacttgataatCCCtctgtactttagatctacctgctctactgaaa aatgaaatgagtatgaggaaatagaatatccgttgagcatttatgtctttctattaaaaa tttgcattccatcttcttgttccaagtcaaaatcttgaacaactatatctagagaatttt ccttcttgtgaagtaatgcatatatacatcaagagaagtcagagtCgctgaatgaaatag tagatcaaacttaagtgtcgtgcctataaagaattgtatggtgagattgaatatagtggt catattattctctcaatcttagtgattaaagtattccatacaaacagacaagcatttagt cgtgcattcattggcactacaaaattatcaaccaagagtaataccctttcagctttcctc tgtatatgtgtgttctatcctggagctgaagataactaatattcttttttatttctacag aaaatgctggtttgtcaccatcatatggcctgtctctcaatagtgtcctattctggccca tctttgtgagttgccttgtggaaaataaaatggtttctgtcgaaagactaaaacagttcc cagaaataccatcagaagcagagtggagaaagatggattttctcccaccttcaagttggc caagccgtgggaatgitgagcttgaaaacgtgcaggtaacaattctaactaaCCCtgtgg ttgctatttgctagcatttgcacaaaaggaaaactataaaaagttcacagtaaggaagag agggtagccgtattaacaagcctacagaccctttaatttcaaatatgttacgtcgaatct ctatattgtttgttctactgQCCaacaggttagatatcgnccgaacactcctctagtgct taaaggagttactctcagcattagagggggagagaagataggtgttgttggtcgtacagg gggtggaaaatcaacattaattcaagttttccttcgtttggtggagcctgcagctggaag aataatcattgatgacgtagatatatccagactcgggcttcatgatcttagatctcgctt cgggatcattccccaagagccagtcctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgaccc cattggacaatattcagatgatgaaatttggaaggtaacctaacttgctgactgaaataa tttacaaaaacctcaaaatatagtacagagttagccaaacatgtcttctgagtgctgaga tctttttggatcaCaaactctgtaagagcaacacactatttgttagtgagaagaaaagca tatactccagtgttttgctatctcccagaatgtctctaacatgaaatcgtgtacattgca gagcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaaacccgaaaaacttgattc accaggtaaattctcctcctctacgtcatccttgtggtcctttgcggaattacgcaacca actttttatgtgtttcaaaCatatatactgataactgaatactgtcattggtaaatcata gtcgtcgataacggagacaactggagcgtcggacagaggcagcttccttgctcgggaaga cagacagacgcagtgattcagaaaatcatccgcgaggactctgcggcctgtactataatc agcactgcccacagaataccaacagtcatggactgtgatagagctcttgttacagatgca ggtgccgatttctctccttttactttgtaccttattttgaatctgQCaaatgattattta tccçtatgtgatggtccccaaccaatcatagtcagtacctctatgaagaaattgcctaat SEK ID NO: 3 (Intron 1) gcCagaaccaaccttcggttiaagctgtctctgattctgccagctattttagccttatcttctatagttttatgcat SEK ID NO: 4 (Intron 2) gtatggctctcatccttctgtttgtttgattaatacaaactttgctgccaattaccttttgccccttgttgctacct cttttctgtggtataaaaaattaatgtaggctaatgtgtagagtggaggtattatatgcagaacaattgcaatcaag caattacctgtgagatactattttgttttcatattagtggactggtacattctcattggtgtatcgtttgatctcca ccaaagcagaggttttactggccgacagagtcaaactactgtgcttcactccttttactccaatccttagtagtctt catatttacattttctgcttggttgtctattactctggataacagtcctaaatgcaagcaaaatcaactgtgttttc agtcttgagctgaccaattagttcatgatgtcctcagcttgtccaagctggtgcctcaccggaattatgtgggacct taattatttgctaacttactttaccaacccctcgtccaacag SEK ID NO: 5 (Intron 3) gttagaagtccacaatgtcatgtgtcattgaagatttaatttaagatagaaattacattgtttcattctgcaaatta tggacctatcagagaaaaatcatggattttgaatggctaccttccccagtgaagacacatatcatttcctgggagga agatgtgaaagtggcaagctatttactÜcaaaaagtataatctaaaagacttttattaagtttggaaggcttaatCC atcatttgttatctgttgtctacttgtctttattaaaattcttcttagtccaatcaccttcgatgaagttgactagt cttagtcacctgaatactttaaatctttgccttggtgtctctatattttcagccatctcaattccgaagctcatatt tgttttctCCttgtaatgtccatctgaaagtttcatgcttttttgcag SEK ID NO: 6 (Intron 4) gtaagtttcagagtgttttatcaacccctttggaaccaagtgtcaagagtagtgtttcttggttgttaaatgattca catgtgtgttggtttctataaaacctgaactttatgttttatcagagtgttttgctttcttgaag SEK ID NO: 7 (Intron 5) gtaaatttctgaggacaagtttttccttttgcatgtaaattcaaactttgctgcttagatgattaaataatgaaaaa tatccatcgcatgtçttaatgtgtatgacatgttagaattttgaatagaagttcattcactgatgttgagatgtttt SEK lD NO: 8 (Intron 6) gtatgagcactgtttataacagccgtccttttttcttttcttgtctgaactcaaatttgaatcctttgtttagaggc aattagtctgctctgagcattttggctgacagttattatgtatattaaaaggcaacttttttattcgttctgtccag ctaaaacttttcacttaaaatgtggttaactgcaCatttctgtgtctcctattttttgattatttgcaactctgatc aatccagatttggggaaggcccgttgttagttgacgactagatactaagctcacatctacattggttgcaagtagaa ttttcaagttgtcattcacttatattgtttgaactaggagattagcattcttctgcaaggagccctgaatgcttgaa aagttaaacagaaaagaaaaagttcagggcagatagacacaatgtgttaaagtaattcaattggagcacagatatat gacatgtgttatttgggagctacgaaaaagacaaggactattatgtagactacaattgaaataacaggtaattcatt SEK ID NO: 9 (Intron 7) gtataacaccgtccaatgctcatttatgggaattataaattctagtatttgataatccttctgtactttagatctac ctgctctactgaaaaatgaaatgagtatgaggaaatagaatatccgttgagcatttatgtctttctattaaaaattt gcattctatcttcttgtttcaagtcaaaatcttgaacaactacacctagagaattttcctccttgtgaagtaatgca tatatacatcaagagaagtcagagttgctgaanaaatagtagaccaaatCtaagCgttgtgcctataaagaattgt atggtgagattgaatatagtggtcatattattttctcaatcttagtgattaaagtattccatacaaacagacaagca tttagtcgtgcattcattggcactacaaaattatcaaccaagagtaatatCCCttcagctttcctctgtatatgtgt gttctattctggagctgaagataactaatattcttttttatttctacag SEK ID NO: 10 (Intron 8) gtaataattctaactaactctgtggttgctatttgctagcacttgcacaaaaggaaaactataaaaagttcatagta aggaagagagggtagctgtattaacaagcctacagattctttaatttcaaatatgttacgttgaatctctatattgt SEK ID NO: 11 (Intron 9) gtaaCCtaacctgccgactgaaataatttacaaaaatctcaaaatatagtacagagttagccaaacatgtcttctga gtgctgagatctttttggattataaattctgtaagagcaacatactatttgttagCQagaagaaaagcatatactcc agtgtcttgttabctcccagaatgtctctaacatgaaatcgtgtacattgcag SEKIDIVO:120nÜ0n10) gtaaattttcctcctctacgtcatccttgtggctctttgcggaattatgcaaccaactttttatgtgtttcaaatat atatactgataactgaatactgtcattggtaaatcatag SEK ID NO: 13 (Ekson 1) atggatacgaggaacagtatgtcttcagaatcttgtttagcaCCactttcttgttctgcctccacatttcaatcgtc agaggattcagcagttgttaaatggttaagattcattttcctctctccatgtccacaaaggactcttctatcttcca ttgatgtgctgcttttgcttactttcattgtatttgcagtacaaaagttgtactcaaagttgaggtccaatgagcac tctacttctagcattgataagcctctaattgcacacaacaggacttct SEK ID NO: 14 (Ekson 2) tcgccttggaaagtcatagatggactgtattggttgtttcaggcgattacacatgttgtaatcactatactaa tagttcatgagaaaagatttcacgctatttcccatccactgtccctgcgcgtgttttggattgcaaactttgt agttatgagtttgttctttggttgtgggatcacaaggcttgtgccacttaaggaaattgatcctaatttaaga atggatgatataagttcattagtttcatttcctatttctgttgttctcttcattgttgccattaaaggttcga ccggagttgctgtaattagtgattctgaatctcacttaagtgatgaaaccaatggttatgaactcctggataa atccagtgtgagtggctttgcttcagcttctctaatatcgaaagccttttggatttggatgaaccctttactg caaaaaggttacaagtcacctctcaagattgatgaagttccttcactttccccactgcatagagcagagaaaa tgtctcaacttttcgaaagaaattggcctaaacctgaagaaatatcaaagcatcctgtccgaacaacattgct gcgttgcttttggaaggaagctatttttactgccattcttgcagtaattagggtatgtgttatgtatgtaggg taggaactctcctaatagccaaatttgtggaagttctaacctctcatcagttcaactttaactcccaaaagct tggcatgcttattcgagcgacacttctcaettctttgtataagaaggggttaaggttgtcatgctcagctaga caggctcatggtgttggacagattgtaaattatatggccgtcgatgctcagcagctgtccgatatgatgctac agctacattccatttggctcatgccattgcaagtttctgtggctttaggcatcctttatacttacctcggtgc ttcaactgttgtaacgctagctggacttgcagcagtgatggtatttgtggtgtttggaactaaaagaaacaac aggtttcaatttaacatcatgaagaatcgtgattctagaatgaaagcgacaaatgagatgcttaattatatgc gcgttataaagttccaggcatgggaagaacattttaacaaaagaattgaatccttccgcgaatccgagtatgg atggttgtccaagttcttgtactcaatcgctgggaatatcattgtcttgtggagcactcctcttctagtggct acactcacttttggaagtgcaatcttgttgggaatcccgcttggtgcagggacagtgttcactgcaacatctc tcttcaagatgttgcaggaaccgaccagggctttccctcaatccatgatctcactttcacaagcaatgatatc tcttgatagattggacaaatatatgatgagtaaggagttagtggataaagctgtggaaagactagaaggttgt gggggtacaattgctatgcaggtgaaagatggagctttttgctgggatgatgaaaacagtaaagaagaattga aaaatgtaaactttgagattagaaaaggagagcttgcagcagtagtggggacagttggggcggggaagtcttc cctccttgcatctgtacttggtgagatgcacaagttgtcgggtcag SEK ID NO: 15 (Ekson 3) gtcacaatttgcggttcaactgcctatgttgcacaacatcgtggattcagaatggcacgatacaagaaaatatcctg tttggtatgccaatgaacagagacagatacaaggaagtgatccgggtttgctgcttggagaaggacttggaaataat ggagtttggagaccagactgaaataggagaacgtggcatcaacctcagtggtggtcagaagcagcgaatccagcttg caagagctgtttaccaggactgtgatatttatcttctagatgatgtattcagtgcagttgatgctcacactggctct SEK ID NO: 16 (Ekson 4) gaatgtgtgaggggaattcttaaagataaaaccattttgcttgtcacacaccaagttgacttcttgcataatgttga SEK ID NO: 17 (Ekson 5) gtcatgcgagatgggatgatcgtgcaatctggcaaatataatgagatattagaagctggaatggactttaaagagct agtagctgcacatgagacctctttagaacttgttgacgtggaaacaaccaaagagagcaacgcctccctcgaagaat caaaatcttctcgaagattatctaaggaagaaaacggagatgataaatctcaacagtctacatctgataggggggat tctaaacttataaaggaagaagaaagagaaactggaaaagtcagtcctcgtgtgtacaagctatatattactgaagc ttttggatggtggggtgtagtgctagttatcttgttttcgttcttgtggcaaagttctctaatggcaagtgatcatt ggctggcatatgaaacttcagcggatcgtgccatgtccttcaatccttctctgtttattgggatatacggtgttatt gcagttgtttcttcgttgctgatagtgaccaggatgtattttgtgacactcatggggctcaagactgcccaaatatt tttcggacagattctttacagcatactgcatgctcctatgtcattttttgacacaacaccttccggaagaattctga SEK ID NO: 18 (Ekson 6) gcatctaatgatcagaccaacattgatgtcttcctcccgttctttacgaatctcactttggccatgtttatcacact gctcggcatcatcatcatcacatgccaatattcttggcctaccgtactactcttgattcctctgggttggcttaata SEK ID NO: 19 (Ekson 7) ggacattatcttgcaacatctcgtgaactgactcggcttgactcaattacaaaagcacctgttattcatcatttctc tgaaagcatctcaggtgttatgactatacgttgctttaggaagcaggagatgttttgtaacgagaatgtaaaccgag tgaattccaatctgcgaatggatttccacaacaatggatccaatgaatggttgggctttcgactggaattgatggga agcttacttctttgtgcttctgcaatgttcatgattgtcttacctagcagcatcatcaagccag SEK ID NO: 20 (Ekson 8) aaaatgttggtttgtcactatcatatggcttgtctcttaatagtgtcctattctggtccatctttgtgagttgcttt gtggaaaataaaatggtttctgtcgaaagattaaaacagttctcagaaataccatcagaagcagagtggagaaagat ggattttctcccaccttcaagttggccaagccgtgggaatgtcgagcttgaaaacgtgcag SEK ID NO: 21 (Ekson 9) gttagatatcgtccgaacactcctctagtgcttaaaggagttactctcagcactagagggggagagaagataggtgt tgttggtcgtacagggggtggaaaatcaacattaatccaagctttctttcgtttggtggagCCCgcagctggaagaa taatcattgatgacgtagatatatccagacttgggcttcatgatcttagatctcgcttcgggatcattccccaagag ccagtcctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgaccccattggacaatattcagatgatgaaatttggaag SEK ID NO: 22 (Ekson 10) agcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaaacccgaaaaacttgattcaccag SEKIDIHO:23(RNAImzßU aagagccagtcctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgaccc cattggacaatatccagacgatgaaatttggaaggtaatctaacttgctgactgaaataa tttacaaaaatctcaaaacatagtacagagttagccaaacatgtctcctgagtgctgaga tcttcttggactataaattctgtaagagcaacatactatttgttagtgagaagaaaagca tatactccagtgttttgttatctcccagaatgtctctaacatgaaatcgtgtacattgca accaggtaaattttcctcctctacgtcatccttgtggttctttgcggaattatgcaacca actttttathQtttcaaatatatatactgacaactgaatactgtcattggtaaatcata gttgttgataacggagacaactggagtgtcggacagaggcagcttctttgcttgggaaga gtgatgctaaaacgcagcagacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgattca cagacagatgcagtgattcagaaaatcatccgcgaggactttgcggcctgtactataatc agcattgcccacagaataccaacagtcatggactgtgatagagttcctgttatagatgca ggtgctgatttctctccctttactttgtacctCattttgaatctggcaaatgattattta tctgcatgtgatggtttccaaccaaccacagtcagtacatttatgaagaaattgcctaat tttcatactccaaactggaagcttacgctatactatctgatcccttgtttgtatagattg ctttcttttcctttttctcggatttatcttatatataagcggacagagLaaaagaatgta aacatgcgtaacttgacctattatagcagaCtatttgtcttattttccaggtcgctgatt ccacttattaggagtagttacacgtatttatcttttaagtgaaataatagtgtaaagttt cttttggcactgtcggtgtaaagaagtcaaactcctttctttaaccccggcatttcttat tcatgcaggaatagcaaaagagcctgacaaaccatctcgtttgcttgaaaggccttcact ttttggggctttggttcaagaacatgccaaccgac SEK ID NO: 24 (NtMRP4 'ün protein sekansi; 5'-3 'çerçeve 1; - varsayilan durdurma kodonunu gösterir) MDMRNSMSSESCLASLSCSASTFQSSEDSAVVKWLRFIFLSPCPQRTLLSSIDVLLLLTF EKRFHAISHPLSLRVFWIANFVVMSLFFGCGITRLVSLKEIDPNLRMDDISSLVSFPISV VLFIVAIKGSTGVAVISDSESHLSDETNGYELLDKSSVSGFASASLISKAFWIWMNPLLQ KGYKSPLKIDEVPSLSPLHRAEKMSQLFERNWPKPEEISKHPVRTTLLRCFWKEVIFTAI LAVIRVCVMYVGPTLIQRFVDYTAGKRTSPYEGYYLIGTLLIAKFVEVLTSHQFNFNSQK LGMLIRATLLTSLYKKGLRLSCSARQAHGVGQIVNYMAVDAQQLSDMMLQLHSIWLMPLQ VSVALGILYTYLGASTVVTLAGLAAVMVFVVPGTKRNNRFQFNIMKNRDSRMKATNEMLN YMRVIKFQAWEEHFNKRIESPRBSEYGWLSKFLYSIAGNIIVLWSTPLLVATLTFGSAIL LGIPLGAGTVFTATSLFKMLQEPIRAFPQSMISLSQAMISLDRLDKYMMSKBLVDKAVER LEGCGGTIAMQVKDGAFCWDDENSKEELKNVNFEIRKGELAAVVGTVGAGKSSLLASVLG EMHKLSGQVTICGSTAYVAOTSWIQNGTIQENILFGMPMNRDRYKEVIRVCCLEKDLEIM EFGDQTEIGERGINLSGGQKQRIQLARAVYQDCDIYLLDDVFSAVDAHTGSEIFKECVRG VDVETTKESNASLEESKSSRRLSKEENGDDKSQQSTSDRGDSKLIKEEERETGKVSPRVY KLYITEAFGWWGVVLVILFSFLWQSSLMASDYWLAYETSADRAMSFNPSLFIGIYGVIAV VSSLLIVIRMYFVTLMGLKTAQIFFGQILYSILHAPMSFFDTTPSGRILSRASNDQTNID VFLPFFMNLTLAMFITLLGIIIITCQYSWPTVLLLIPLGWLNIWYRGYYLATSRELTRLD SITKAPVIHHFSESISGVMTIRCFRKQEMFCNENVNRVNSNLRMDFHNNGSNEWLGFRLE LMGSLLLCVSAMFMIVLPSSIIKPENVGLSLSYGLSLNSVLFWSIFVSCFVENKMVSVER LKQFSEIPSEAEWRKMDFLPPSSWPSRGNVELENVQVRYRPNTPLVLKGVTLSIRGGEKI GVVGRTGGGKSTLIQVFFRLVEPAAGRIIIDDVDISRLGLHDLRSRFGIIPQEPVLFEGT VRSNIDPIGQYSDDEIWKEPRTLPTQRCGVFKTRKT-FTSC--RR-LECRTEAASLLGKS DAKT-QTSIYG-GNCLC~FTDRCSDSENHPRGLCGLYYNQHCPQNTNSHGL--SSCYRCR C-FLSFYFVPYFESGK-LFICM-WFPTNHSQYLYEEIA-C-PSSSKCM SEK ID NO: 25 (NtMRP4 'ün protein sekansi; 5'-3 'çerçeve 2; - varsayilan durdurma kodonunu gösterir) WI-GTVCLQNLV-HHFLVLPPHFNRQRIQQLLNG-DSFSSLHVHKGLFYLPLMCCFCLLS LYLQYKSCTQS-GPMSTLLLALISL-LHTTGLLRLGKS-MDCIGCFRRLHML-SLY--FM RKDFTLFPIHCPCACFGLQTL-L-VCSLVVGSOGLCHLRKLILI-EWMI~VH-FHFLFLL FSSLLPLKVRPELL-LVILNLT-VMKPMVMNSWINPV-VALLQLL-YRKPFGFG-TLYCK KVTSRLSRLMKPLHFPHCIEQRKCLNFSKEIGLNLKKYQSILSEQHCCVAFGRKLFLLPF LO-LCYVLCM~GOHSYKDLLITQQERGHLLMKDTTL-ELS--PNLWKF-PLISSTLTPKS LACLFERHFSLLCIRRG-GCHAQLDRLMVLDRL-IIWPSMLSSCPI-CYSYIPFGSCHCK FLWL-ASFILTSVLQLL-R-LDLQQvWYLWCLELKETTCFNLTSvRIVILE'KRQMRCLI WESRLVQGQCSLQHLSSRCCRNRSGLSLNP-SHFHKQ-YLLIDWTNI--VRS-WIKLWKD ~KVVGVQLLCR-KMELFAGMMKTVKKN-KM-TLRLEKESLQQ-WGQLGRGSLPSLHLYLV RCTSCRVRSOFVVQLPMLHKHRGFRMARYKKISCLVCQ-TBTDTRK-SGFAAWRRTWK-W SLETRLK-ENVASTSVVVRSSESSLQELFTRTVIFIF~MMYSVOLMLTLALKSSRNV-GE FLKIKPFCLSHTKLTSCIMLT-SLSCEMG-SCNLANIMRY-KLEWILKS--LHMRPL-NL LTHKQPKRAMPPLKNQNLLEDYLRKKTEMINLNSLHLIGGILNL-RKKKEKLEKSVLVCT SYILLKLLDGGV-C-LSCFRSCGKVL-WQVIIGWHMKLQRIVPCPSILLCLLGYTVLLQL FLRC---SGCIL-HLWGSRLPKYFSDRFFTAYCMLLCHPLTQHLPBEP-VGHLMIRPTLM SSSRFL-ISLWPCLSHCSASSSSHANILGLPYYF-FLWVGLISGTGDIILQHLVN-LGLT QLQKHLLFIISLKASQVL-LYVALGSRRCFVTRMvTE-IPICENISTTMDPMNGWAFDWN -WEAYFFVFLQCS-LSYLAASSSQKMLVCHYHMACLLIVSYSGPSL-VALWKIKWFLSKD -NSSQKYHQKQSGERWIFSHLQVGQAVGMLSLKTCRLDIVRTLL-CLKELLSALEGERR- VLLVVQGVENQH-FKFSFVWWSLQLEE-SLMT-IYPDLGFMILDLASGSFPKSQSFLKEL -EATLTPLDNIOMMKFGRSLERCQLKDVVSLKPEKLDSPVVDNGDNWSVGQRQLLCLGRV MLKRSRLLFMDEATASVDSQTDAVIOKIIREDFAACTIISIAHRIPTVMDCDRVLVIDAG ADFSPFTLYLILNLVNDYLSVCDGFQPIIVSTFMKKLPNVSQVVVNA- SEK ID NO: 26 (NtMRP4 'ün protein sekansi; 5'-3 'çerçeve 3; - varsayilan durdurma kodonunu gösterir) GYEEQYVFRILFSITFLFCLHISIVRGFSSC-MVKIHFPLSMSTKDSSIFH'CAAFAYFH CICSTKVVLKVEVQ-ALYF-H'-ASNCTQQDFFALESHRWTVLVVSGDYTCCNHYTNSS- EKISRYFPSTVPARVLDCKLCSYEFVLWLWDHKACVT-GN-S-FKNG~YKFISFISYFCC SLHCCH-RFDRSCCN--F-ISLK--NQWL-TPG-IOCEWLCFSFSNIESLLDLDEPPTAK RLQVTSQD~-SSFTFPTA-SRENVSTFRKKLA-T-RNIKASCPNNIAALLLEGSYFYCHS CSN-GMCYVCRANTHTKIC~LHSRKEDISL~RILPYRNSPNSQICGSSNLSSVQL-LPKA WHAYSSDTSHFFV-EGVKVVMLS-TGSWCWTDCKLYGRRCSAAVRYDATATFHLAHAIAS FCGFRHPLYLPRCFNCCNASWTCSSDGICGVWN-KKQQVSI-HHEES~F YARYKVPGMGRTF-QKN-ILPRIRVWMVVQVLVLNRWEYHCLVEHSSSSGYTHFWKCNLV GNPAWCRDSVHCNISLQDVAGTDQGFPSIHDLTFTSNDIS--IGQIYDE-GVSG-SCGKT RRLWGYNCYAGERWSFLLG--KQ-RRIEKCKL-D-KRRACSSSGDSWGGEVFPPCICTW- DÃQVVGSGHNLWFNCLCCTNIVDSEWHDTRKYPVWYANEQRQIQGSDPGLLLGEGLGNNG VWRPD-NRRTWHQPQWWSEAANPACKSCLPGLvYLSSR-CIQCS-CSHNL-NLQGMCEGN S-R-NHFACHTPS-LLA-C-PDPCHARWDDRAIWQI~-DIRSWNGF-RASSCT-DLFRTC -RGNNQREOCLP-RIKIFSKII-GRKRR--ISTVYI~-GGF-TYKGRRKRNWKSOSSCVQ AIYY-SFWMVGCSASYLVFVLVAKFSNGK-LLAGI-NFSGSCHVLQSFSVYWDIRCYCSC FFVADSDQDVFCDTYGÂQDCPNIFRTDSLQHTACSYVIF-HNTFRKNSESGI-'SDQH-C LPPVFYESHFGHVYHTARHHHHHMPIFLAYRTTFDSSGLA-YLVPGILSCNIS-IDSA-L NYKSTCYSSFL-KHLRCYDYTLL-EAGDVL~RECKPSEFQSANGFPOOWIQ'MVGLSTGI DGKLTSLCFCNVHDCLT-QHHQARKCWFVTIIWLVSv-CPILVHLCELLCGK-NGFCRKI KTVLRNTIRSRVEKDGFSPTFKLAKPWEC-A-KRAG-ISSEHSSSAâRSYSOH-RGREDR CCWSYRGWKININSSFLSFGGACSWKNNH--RRYIQTWAS-S-ISLRDHSPRASPF-RNC EKQH-PHWTIFR--NLEGASNAANSKMWCL-NPKNLIHQLLITEITGVSDRGSFFAWEE- C-NVADPYLWMRQLPLLIHRQMQ-FRKSSARTLRPVL-SALPTEYQQSWTVIEFLL-MQV LISLLLLCTLF-IW-MIIYLYVMVSNQS-SVPL-RNCLMLAK---MH SEK ID NO: 27 (cDNA'nin dogrudan dizilemesinden türetilen NtMRP4'ün cDNA sekansi) cattagLLLcatLLcctaLtLchLtg: ::cttcat:gLLgccat:aaaggttcgaccggugLLQCLngaLLagL gat:ctgaa:ctcacttaagtgazgaaaccaatggrLaLgaacCcctggataoatcnngtg:çagtggctttgc:tc agctzctcLuqLatcgaaagcctCLLggatLCggaCgaaccctLtactgcaaaaaggCtacaagtcacctCLCaagu aagaggacatctccttatgaaggatactaccctataggaaCICCCccaacagccaaacttgtggaagttcidacctc ggttaaggttgtcatgctcagctagacaggctcatggtgctggacagattgtaaattatatggccgtcgaigctcag ctauaagaaacaacaggtttcaaLL:uacatCdtgaugaa:cgaga:tctagan:gaadgcgacaaatqagatgctt aattatatgcgcgttataaagicccaggcacgggaagaacattttaacaaaagaattgaacccttccgcgaatccga gtatggacggttgtccaagttc(LgtacccaatcgcigggnntatcaLtgtCtrgrggagcacccctcttctaqtgg agaazggcacgatacaagaaaatatcccgttcggtatgccaatqaacagagacagatacaaggaagtgacccgggtt gaagaaaacggagatgataautctcuacagtctacuLchutdgggggguttc:aaacttazaaaggaaqaaqaaaq aqaaactqgaaaagtcaqccctcgtqtgtacaagctatatattactgaagcttttggatggtggggcgtagtgctag LtatcLLgLLLchLLCCCQLQQCaaugLZCt:taatggcaagtgaLcaLLQQCLggcaLa:qaaacttcagcggat gaLcaggaigts:LtLgcgacacttatggggcLcaagactgcccaaaLanthtcggucagattc::tacagcatac tctgcgaatggattLccacaacaatggaLccaacgaatggttçggctcCcgactggaattgacgggaagcttacttC tttgtgtttctgcaatgttcatgattgtcttacctagcagcatcatcaagccagaaaatgttggtttgtcactatca tatggcttgtctcutaatagtgtcctattctggtccatctttgtgagttgctttgtggaaaataaaatggtttctgt Cgaaagattaaaacagttctcagaaataccatcagaagcagagtggagaaagatggattttctcccaccttcaagtt ggccaagccgtgggaatgttgagctCQaaaacgtgcaggttagatatcgtccgaacactcctctagtgcttaaagga gttactctcagcattagagggggagagaagataggtgttgttggtcgtacagggggtggaaaatcaacattaattca agttttcnttcgtttggtggagcctgcagctggaagaataatcattgatgacgtagatatatccagacttgggcttc atgatcttagatctcgcttcgggatcattccccaagagccagtcctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgac cccattggacaatattcagatgatgaaatctggaagagcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaa acccgaaaaacttgattcaccagttgttgataacggagataactggagtgtcggacagaggcagcttctttgcttgg gaagagtgatgctaaaacgtagcagacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgattcacagacagatgca gtgattcagaaaatcatccgcgaggaccttgcggcctgtactataatcagcattgcccacagaataccaacagtcat ggactgtgatagagctcttgttatagatgcaggaatagcaaaagagtttgacaaaccatctcgtttQCttgaaaggc Cttcactttttggggctttggttcaagaatatgccaaccgatcctctgagctctaa SEK ID NO:28 (5 've 3' UTR ile NtMRPS'ün DNA sekansi) tcaaLLtcccaccziatactcatlatlaLatLtaatcaatcaaarcaangttggaaaaaaagçgagtautaatcadd ircraqccacctqat tâênTtCûâgââCCâLdCCsttC*Cga aactttgtgtttacaacaatttgaatgtantfgagtcaagtgattagttagttaagagtgcacggattctgctact tctgggtaaaagaagcaauccttgrtgtrnxgagtcginigt gaai: cactaqtgtcgaattttgccgcataagcta SEK ID NO:29 (5 've 3' UTR 'SIZ NtMRP3'ün DNA dizisi) ttgtttqaLqLLachttca SEK ID NO: 30 (NtMRPS 'ün Intron 1 'i) gtatgttggcgttgatgaatccctccgaaaccccattttcttacgtgtcattagttgttctttgcacctgggattgttcctt gtaattcttgggttgtgttgttggaatacaatcag SEK ID NO: 31 (NtMRPS 'ün Intron 2 'si) gtaagtcctttcatataCatgctttattttcatgcttgatatattttacctagccacttgattgacccatcctttaa SEK ID NO: 32 (NtMRP3 'ün Intron 3 'ü) gtactctttcctttcagtaattatggtttgcttaatatcatatatagacttaacceatttaactatgatatttctct SEK ID NO: 33 (NtMRP3 'ün Intron 4 'ü) gtaagtgaatgatcacattttctttatttagccccttttttttccttattagtgtcaatctttctgttacatgacta atcaatgttttgtgaaaattagctagtaatttcagaattaactcaaatgtactttggtatgaaaacag SEK ID NO: 34 (NtMRP3 'ün Intron 5 'i) gttgctaagaccacctttttcgtgttctttgccttcacaattattctactatatgctttttcacaaagtgagtcata actttagcgacattcacaaacgtgagttacatttaagtggtgagtttgttctcattgcag SEK lD NO: 35 (NtMRP3 'ün Intron 6 'si) gtaagttctctatcttcatgttttctttccttgaagtttgttgtgttgaataactcttaagagcacattttctccgt SEK lD NO: 36 (NtMRP3 'ün Intron 7 'si) gtaaattaagttattctctggcgctaattatgcaggttaatttgttggtatgggttggtatatctgaaaacttttaa SEK ID NO: 37 (NtMRP3 'ün Intron 8'i) gtgacagcttggttttgcctatttttggatttattttgtttcagataggaaaatgacaaattttattttattgagaa SEK ID NO: 38 (NtMRP3 'ün Intron 9 'u) SEK ID NO: 39 (NtMRP3 'ün Intron 10 'u) gtaagaatcatcgtttatgttctggagcaagcggagaaggaaattcttggtagttaccttttttttatgctatgctg SEK ID NO: 40 (NtMRP3 'ün Eksonu 1 'i) SEK ID NO: 41 (NtMRP3 'ün Ekson 2 'Si) SEK ID NO: 46 (NtMRPB 'ün Ekson 7 'si) SEK ID NO: 48 (NtMRP3 'ün Ekson 9 'u) SEK lD NO: 51 (BAC klon dizisinden tahmin edilen NtMRP3 'ün cDNA dizisi) atggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgaggagggacaataatgctggc cacaaacagagtagtactaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaccttgttttgt tcaataggtctagccatctctagctttgtgttatgttLgLLdgctcacctttattggtat agaaatggttggccagaagaaaaaattataacccttttggattttgcaCtaaagttgcta gctcggttgtcaatctctgctttcttgcacacccagttccttaattcttgtgaaaccaaa taccctcttgttttaagagtttggtgggggcttttcttccttgtttcttgttattgcctt gttatagaccttgtttatggggaaaagaaccaatctLcaccaactcaactttgtataccc gagagtgaggagaatatgcctcaggaacccctcttaaatggtagtgttgccaatggcatg gactcaaagaagcctactggggatcaaactgtcaccccCCaCQccaatgctaacattttt agtctctttactctctcttggatgggtcccccaatttctgttggcaacaagaaaccattd gaccttgaggatgttcctcagcttcaccttgatgatagtgtcaaagggagttttcccatt ctggtgaaggctttggttttcacaqcacggaaggagatagtgttatcggctctcttcgtg ctgaatggaaaacgagactttgataacgaaggttacgtcttagtggctgcattcttcgtt gcaaagttggtggagtgtttggcgcaaaggcactggtttttcaaggtgcagcagggaggg cagtcaaagcaaagccacactagcggagagatcatcaattttatgacagttgatgccgag aggattggtgacttcggttggtacatgcatgatccctggatggtaatcatacaagttgct ctggcattggtgatactctataaaaatcttggcctagctgctatcgccgcgcttgttgct acaataatagtgatgttggcaaacatccctttagggagtttgcaggagaagtttcaggag aaactcatggaatcgaaagatagaaggatgaaggctacatctgaagtcttaaggaatatg agaacactcaagcttcaagcttgggagatgaagttCctgtctaggatcttggacctcagg accacagaggcaggatggctganaaatatgtgtacacatcagctatgactacttttgtc ttctgggttgctcctacatttgcctCtgtgacgacctttggcgctgcaatgcttatggga atcccacttgaatctgggaagatatcgtctgcacttgcgacatttagaattcttcaagag cccatctacaatctcccagatacaatttcaatgattgctcaaaccaaagticctcttgat cgtactgcatctCLcctttctcttgatgacttgcagcctgacgccatagagaagcctcca aaaggtagttctgatgaagcaactgagattgtaggtgggaacttcgcttgggatgcatcc acctcgactccacttCCaaaggatgtaaatcttagagtgcttaatggcatgagagctgcc atctgtggtacagttggtccaggaaaatcaagcttactgtctagcattttaggagagatg cccaaattatcagggactattaaacCCagtggaacgaaggcttacgttgcacagtcgccc tggatacagagtggaaagatagaggagaacatattatccggtaaagagatgcagagggag aagtatgataaagttcttgaagcgtgctccttaaagaaagacctggaaatcctctctttt ggcgatcaaacagaaataggggagaggggcattaatttgagcggtggacagaagcagaga atacagatcgctcgtgctctttaccaagatgctgatgtttacctatttgatgatccgctc agtgctgtggatgctcataccggatcccatctcttcagtgaatgtataatggggctattg atCttggtcatgaaagatggaaggatcagtgaaactgggaaatacaatgatctcctcaaa ttaggtagtgaCCCCatggaacttgtgggtgctcaccaagaagctttaacagcaattgac acagttaagggagaagcaccgagaaagagtgaggaaatgaccggtgataatacaaatgta cagaaggataaaaatatttcagatggccaaaatggtaaagtggatgatattgttggaaca aagggacaaattgttcaggaggaggaaagagagaaaggtagcgttggtctttcagtttac tggaaatatataacaactgcatatggaggtgctcttgtgccatttatgctgttggcacaa gttggttttcagctccttcaaattggaagcaattattggacggcgtgggcaacCcccgtc tcaaagagtgagccacctcctgttgggagttctactctcaCCattgtctatgctgcttta ggaattgcaagtgctttatgcatcdttgctagaaccatgttccttgttaccgctggatat aagacagcctctttgcttctccataaaatgcatctttgcattttccgtgctccaatgtcc ttcttcgatgccacaccgagtgggcggattctaaacagagcatcgacagatcaaagtgca attgatctgaatgttcccattcaagttggatcctttgccttcacaataatacagctctta gggattattggagtaatgtcacaagttgcatggcaggtcttcattgcccttattCCQQCC attgcagtttgcatctggctggagcaacattacataccatcagcacgagaactggcacgg ctaaatgggacatgcaaagctccagtaatacagcactttgccgagacaatttcaggatca agcacaattagaagtttcgatcaggaatctagatcccaggacacaagtatgaaattgaca gacaattattctcggcctaagtttcacatcgctgctgcaatggagtggctttgtttgcgt ttggatatgttatctctgatcacttttgctttctctttaattttCCCgatCCthttcct gttggaacaattgacccaagtgttgctggcttagctgctacatatgggcttaatctgaac ataatacaagctcgggttgtttggaatctttgtatgatggaaaataaaattatttCCgtt gaaagaatacttcagtatactgctcctccaagtgaatctcctcttatcatagaacccaac agaccagaccctaactggccatcttgtggagaggttgattttagcaatcttcaggtccga tatgctcctcacatgcctctcgtgttgcgaggccttacatgcactttthtggtggaaag aagactggaattgtcggtaggacaggcagcggtaaatctactctaatacagaccctcttc cgcatagttgaaccagctgctggacaaataaaaatagatggtatcagcatctCCCCaatt ggaacagttcgcagcaacctagacccgcttgaagagtactcagatgaacaaatttgggag gcgctcgataagtgccagctaggagaagaagtgaggaagaaagaaggcaaactttattct acagtacctgagaatggagagaactggagtgtaggccaaaggcagctggtctgccttggc cgtgtgctactgaaaaagagcaaggtcctggtccttgacgaggccacagcatctgtcgac actgcaactgataatcctattcagcaaactctaaggctgcacttctctgattccacggtt ataaccattgctcataggattacatctgtgcttgacagtgatatggtcctactattagat catgggctcattgctgaatacggcactccagccaggttgttagagaacgaatcctcattg cttgctaagctcgtggcagagcatagtatgaggtcaaattcaagttttgagaatgtttca SEK ID NO: 52 (NtMRP3 *ün protein sekansi; 5'-3'; - varsayilan durdurma kodonunu gösterir) MHTÃKGMSVFQSLÃRDNNRGFKQSSTRNÂRFLYYFSTLFCSIGLÄIFSFVLCLLÃHFYWY îîDLVYGRKNQSLPTQFCIPDVVFTLMGLFFCFVGFIVKTESEENMLÇEPLLN$SVANGM DSKKSTGUQIV”PZANENIESLFTFSNMGPLISV.NKKFLDLEDVFÇLHFDDSVKGSFPI FREKLESVGGGKSNRVTTFHLVKÃLUFTÄFKEIVLSÂLFVLLYALASFVprLIDTLVQY LNGKRDFDNBGYVLVÂAFFVRKLUECLAQFHWFFKVQQGG?RÃRÂÄL?SKIYNKGLTLSC OSKCSHTSGEIINFMTVDÄEPIGDFGWYMHDPWMVIIQVALÂLVILYKHLGLÂRIAAFVR TIIVMLANIPLGSLOEKFÇEKLMESKDRRMKATSEVLRNMRILKLQAWEMKFLSRILGLR TTEÃCWLMKtVYTSÃHTTFVFWVÄPTFTSVTTFGAÄMLMGZFLESCK!LSALÃTFRILQE PIYNLPUTISMIÂQTKUSLUR-ÂSFLSLDDLQF VIEKLPKCSSDERI3IVGGNFAWDAS TSIPLLKDVNLRVLHGMRVAICGTVGSGKSSLLSSILGEMPKLSGTIKLGCTKÃYVAQSP WIOQSKIEENILFGKEMQREKYDKVLEÂCSLKKDLEILSFGOQTEIGEPGINLSGGOKCR QKUHHISUCQNGKVJUI?CTKÜQIVQESSHEKGS?GFSVYWKYITTRYCCALVkEH LAQ VGFQLLQIGSNYWMAEÃTPVSKSEPPPVQSSTLIIVYVALGlüSÂLCILARTHFLVTRGY KTAGLLFHKMHLCIFRÄFMSFFDÃTPSG?TLNRASTDQSÂIÜLNVPEQVGGFâFTI:URL GITGUHSÜUÂÄQUFIUFIPVIÂ7CIWLEQYYT?SERELARLNGTÇKAPVIÇHFâETISGS STIPSFDOEBRFQDTSNKLIBNTSRFKFHIAAAMENLuLRLÜMLSLITFkFSLIFLISLP VGTIDPSVAGLAVTYGLNLNLIQARVVWNLCMMENKI SVSRILQYTÂLFââîpLIIESN RFDPNRPSCGEVDFSHLOVRZAPHMPLVLRGLTCTFFGGKKTGIVGRTGSGKSTLIOTL! RIVEPAAGQIKIDGISISSIGLHDLRSRLSIlPQDPTMFEGTVRSNLDPLEEYSDEQIWB ALDKCQLGEEVRKKEGKLYSTVSENGBNWSVGQRQLVCLGRVLLKKSKVLVLDEATASVD TRTDNLIQQTLRLHFSDSTVITIÄHRITSVLDSDMVLLLDHGLIAEYGTPARLLENBSSL FAKLVAEYSMRSNSSFENVSDM- SEK ID NO: 53 (NtMRP4'ün Eksen 11 'i) ttgttgataacggagataactggagtgtcggacagaggcagcttctttgcttgggaaga gtgatgctaaaacgtagcagacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgattca cagacagatgcagtgattcagaaaatcatccgcgaggactttgcggcctgtactataatc agcattgcccacagaataccaacagtcatggactgtgatagagttcttgttatagatgca ggtgctgacttctctccttttactttgtaccttattttgaatctggtaaatgattattta tctgtatgtgatggtttccaaccaatcatagtcagtacctttatgaagaaattgcctaat SEKANSLAR (gölge eksonlarin konumunu isaret eder) SEK ID No. 1 (5' and 3' UTR ile NtMRP4 'ün DNA sekansi) atggdidLgdggâdcagtatgtc:ccagaatcLLgLLLaQCdLcacCttC:îgCLchc CtCCdcatttcaatcchagagçaCtcagcagttgttaaatggttaagaîtcattttcct ctctcnatgfaranaaaggactcttCLaLcttarattgatgtgctgcttitgcttacttt ggttattgtgggaaactcccagtcgccttggaaagccatagaLggactgtactggtLgtL tatttcccacccactgtccctgcgcgtgLtttggattgcaaactttgtaqttatgagttt gttctttggttgtgqqatcacaaqqcttqtqccacttaaggaaattqatcctaatttaag tctcaagatcgacgaagctccttcacttCccccactgcatagagcagagaaaatgtctca acttttcgaaagaaattggcctaaacctgaagaaacatcaaagcacectgtccgaacaac atCgctgcgctgctcttggaaggaagctacttttactgccattcttgcagtaattagggt agcgacactLctcactLctttgtataagaaggggttaaggctgtcatgctcagccagaca ggctcatggtgttggacagattgtaaattatatggccgtcgatgcccagcagctgtccga catcctttatacttaccceggtgctccaactgtcgtaacgctagccggacttgcagcagt gaachLgaLtctagaacgaaagcgacaaacgagaCQcttaattatacgcgcgttacaaa gctccaggcatgggaagaacattCtaacaaaagaatLgaatccttccgcgaatccgagta tgcagggacagtgttcactgcaacacetctcttcaagatgttgcaggaaccgatcagggc tttccctcaatccatgatctcacttCcacaagcaatgacatctcttgatagattggacaa atacatgatgagtaaggagtcagCggataaagctgtggaaagactagaaggttgtggggg tacaattgccatgcaggcgaaagatggagctLLttgctgggatgatgaaaacagtaaaga agaattgaaaaatgtaaactttgagattagaaaaggagagcttgcagcagtagtggggac attacictggataacagtcctaaatgcaagcaaaatcaactgtgttLtcagicttgagct gcacgatacaagaaaataccctgttiggtatgccaanaacagagacagatacaaggaag tgatccgggCCCgctgctCggagaaggacttggaaataatggagtttggagaccagaccg aaataggagaacgtggcatcaacctcagtggtggtcagaagcagcgaatccagctcgcaa CtcacactggctcCgaaaLcttcaaggttagaagtccacaatgtcacgcgtcaccgaaga tttaatttaagatagaaattacactgtttcattctgcaaattatggacctatcagagaaa aatcatggattttgaatggctactttccccagtgaagacacatatcatttcctgggagga >gqcciaatccatsatttqttaictgiLchLdztLchLttdCLâdddZLcit guc(CqqtqtctctaLaLLLLcaQCCdiCLCduttccgddgctcntatLtgiiitctc tgraatqtccutctgauugiitcatqCttrtttgcaqqaaîgîqtqaqqqqaaîrcrt dauqataaadccaLLLiçcLLgtcucacaccaagrtgacztcttgcataatgtTgaccrg gdaagrggcaagctattraÇtCCdaaaagtataatc:aaaagaCLLiidttaag agrrarrrrgrfrrcqttcrrgrggcaaagttrLwtaatggcaagtgattattggctggc atatqaaact[CâQCQQâCCQtQCCdtçlCCL:cant:cLLchLgtttattgggatatu tccccgcccgaactcaaactcgaaccciitgLttagaggcaaitagtctgctctgagcat ttgcaactctgatcaatcragattrggggaaggcttgrtgrtagrtgarqarragatact LLgddaLaauaggiduiicuLLLCLggLLLacagggdLa:LaLctLgcaa:aLchgLga thaggrgttafgartaracgttgcrrtaggaagnaggagargrrrrgraargagaargf daLgaaaLgdgldtgagguudLdgddtdtccgttgagzaitLaLHLCLLLCLaLtaaaaa FC(fCLLgtgddgtddîgcata{atacakCaagagadgtcugagttgctgddtgdautag taqatcaaattzaachttqiqcccataaaqaattgtatggtgagatLgaatatagtggL cacattattttcccaazcctagtgattaaagtattccatacaaacagacaagcatttagt cqtqcathaczqqcacracaaaaitatcaaccaagaqtaatat:Ctttcaqctttcctc aaaatgLLggLLLchacLatcatuLgchLgLchLLaaLdgLgtchaLLCLgchcu nagaaataccaîcagaaçnaqaqtqqagaaagatggatctLctcccarcricaagttggc cLaLatLgLLLgLtctachgLCdacaggLLaguLach:ccgaacachcicLagLgct taaaggogttnctctcagcattagagggggagagaagataggtgttgttggtcgtacagg aataatcaztgatgacgtagatatarccagacttgggctrnargarattagarcrcgcrr cttacaaaaatctcaaaaiatagtacagagtLagccaaacatgtcrtrtgagtgctgaga gagcctcgaacgcigccaactcaaagatgtggtgtctttaaaacccgaaaaacttgattc accaggtaaatttzchcctccacgicatccttgtggttctttgcggaattaigcaacca actttttatgtgtitcaaatacatatactgdtaactgdaLaCLgEcatCggtaaaCCata gttgtcgataacggagataactggugtgtcggacagaggcagcttctttgctigggaaga gtgazgctaaaacgtagcagacttctatttatgganaggcaactgcctccgLtgattca ogcattgcccacagaaLaccaacagtcacggactgtgatagagtzcttgttatagatgca SEK ID No. 2 (5' ve 3' UTR'siz NtMRP4 'ün DNA sekansi) atggatatqagqaacagtacgtcttcagaatcttgtttagcatcactttcttgttctgc ctccacatttcaatcgtcagaggattcagcagttgttaaatggttaagattcattttcct ctccccatgtccacaaaggactctcctatcttccattgaigtgctgcttttgcttaccct catcgtatttgcagtacaaaagtthactcaaagttgaggtccaatgagcactctacttc LdgcaLtgdtaagchcLaattgcacacaacaggacttctgttagaaccaatctttggtt ggrtattgtgggaaattcccagtcgccttggaaagtcatagatggactgtattggttgcc tcaggcgattacacatgttgtaatcactatactaaCagtzcatgagaaaagatttcacgc tatttcccatccactgtccctgcgcgtgttttggaCCgcaaactCtgtagctatgagttt gttctttggttgtgggatcacaaggcttgtgtcacttaaggaaattgatcctaatttaag aatggatgatataagttcattagtitcacttcctacttczgttgttctcttcaCCgttgc cantaaaggttcgaccggagttgctgtaattagtgattctgaatctcaCCCaagtgatga aaccaatggctatgaactcctggataaatccagtgtgagtggcttCgcttcagcttctct aatatcgaaagccttttggatttggatgaaccctttactgcaaaaaggctacaagtcacc acttttcgaaagaaattggcctaaacctgaagaaaCatcaaagcatcccgtccgaacaac attgctgcgttgcttttggaaggaagttatttttactgccattcCtgcagtaactagggt gaggucaLchcLLdLgaaggatactacctcataggaactcccctaatagccaaatttgt ggaagttctaacctctcatcagttcaactttaactcccaaaagcttggcatgcttattcg agcgacacttctcacttctttgtataagaaggggttaaggctgtcatgctcagctagaca ggctcatggtgttggacagactgtaaattatatggccgtcgatgctcagcagctgtccga tatgatgctacagctacattccattcggctcatgccattgcaagtctctgtggctttagg catcccttatacttacctcggtgcttcaactgttgtaacgctagctggacttgcagcagt gatggtatttgtggtgtttggaactaaaagaaacaacaggcttcaattcaacatcatgaa gaatcgtgattctagaatgaaagcgacaaatgagatgcttaattatatgcgcgttataaa gttccaggcatggguagaacattttaacaaaagaattgaatccttccgcgaatccgagta tggatggttgtccaagttcttgtactcaatcgctgggaatacCâttgtCttgtggagcac LcctcttctagtggctacactcactttCggaagtgcaatctcgttgggaatcccgcctgg tgcagggacagtgttcactgcaacatctctcttcaagatgctgcaggaaccgatcagggc tttccthaatccacgatctcastttcacaagcaatgatatctcttgatagattggacaa atatatgatgagtaaggagtCagtggataaagctgtggaaagactagaaggttgtggggg agaattgaaaaatgtaaactttgagattagaaaaggagagcttgcagcagtagtggggac agttggggcggggaagccttccctccttgcatctgtacttggtgagatgcacaagttgtc gggtcaggtatggctctcatccttctgcttgtttgattaatacaaactttgctgccaatc accttctgccccttgttgctacctcttthtgtggtataaaaaatCaatgtaggccaatg attagctgattagttactttacaattccagagcatatttacattttctgcttggttgtct u“.tattctggaraaiwaQZCCZaaatg ad igcaaaatcaa: tgrgrrrrtagtct' gdgCL gdc:auLLaqc::atçatgîccîcaîctL gt cadgî tgqthC-Cüpcqgaâ' 1d' 31% gga; Cttcqta: t: aaLc &:11311cacwcttctLthaaaaaLatfqaatqa: c: ga :c aaraggtca: dJL"FLLQC_CJJC_QCCTdtC[CgCd aaacatrgtggatî cagaat -g gta; gala; aaqaaaacat:ctgtttjgtatgi'adLuaaLaUAgdÇugatdLadggddd aaataggagaa: g: 35 ti1^rrrngrqqraqtcaqaaQCaqrqaa'-caqrr qraa cicacactggc LÇLJüJJZLL-ÇJJ”5 tagaagtccacaatgtcatgî gtcaftgaaga JJJLÜLgJüdgLqQLdJuL'J' -1;-Ccaaaaaqtataatc taaaaqacztttattaaq Ctîuuicnud°?ictttcgaignAJtrgi tagtcttag: _acctgaazactttaaatcc LLLCLLggLLgLdedLgdLLCaCaLgLgLgLLggttLCLdeâââCCngdCEL[dtgt caaatataatgaqatattagaagctqgaatqqattttaaagagctagLBQCCgCacatça qacctctttagaactcgîtgacgtggaaacaaccaaagagagcaatgcctcccttgaaga tacatctgataggggggattctaaacttataaaggaagaagaaagagaaactggaaaagc cagtcctcqtgtgtacaagctatatattactgaaqcttttggatgqtggggtgtagtgct agLLaLCLLgLLLLcgLtctLgLggcuaagttchtaatggcaagtgactaCCggctng gaaaaatatccattgcatgttttaatgtgtatgacatgttagaactccgaatagaagttc gcatcatcatcatcacatgccaatattcttggcctaccgtactacttttgattcctctqq LLc:LchigdduLcaaattLgaazcctLLgLLLagaggcaattagtctgctctgagcat ttgcaactctgatcaâLcLagaLLLggggacgchLgttgtLugttganncLagatact tgaactaggagar.tagcattente: qcaaqgaqccc'gaatcç'tgaauagtraaa"aaa LLgaaataacaggtaattcaCttciggtttacagggatattaccttgcaacatctcgtga gggc!&tcgactggaaligaigggaagnrtac(tctttgtgtttCthaatgttcatga: attacaaattCtaqtatttqataatcctcctqtactttagatctachgCLCLactgaau cgtgcattcatCggcactacaaaattatcaaccaaqaqtaatattctttcagctttcctc tgtatatgtgtgtLctattctggdgctgaagataactaacattcttttttatttccacag aaaatgttggtCCgtcascancatatggcttgtctcctaatagtgtcctatcccggtcca taaaggagttactctcagcattagagggggagagaagataggtgttgttggtcgLacagg gggzggaaaatcaacattaattcaagttttctttcgtttggtggagcctgcagctggaag aataatcattgatgacgtagatatatccagacttgggcttcatgatcttagatctcgctt tttacaaaaatctcaaaatatagtacagagctagccaaacatgtcttctgagtchgagd tatactccagtgttttgttatcccccagaacgtctccaacacgaaatcgtgtacattgca gagcctcgaacgCCgccaactcaaagatgtggtgtctttaaaacccgaaaaacttgattc accaggtaaatttccctcctczacgtcatccttgtggttctttgcggaatcatgcaacca gtCgttgataacggagataactggagtgtcggacagaggcagcttctttgcttgggaaga gtgatgcraaaacgtagcagacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgattca cagacagatgcagcgattcagaaaatcatccgcgaggactttgcggcctgtactataatc agcattgcccacagaataccaacagtcatggaCCQtgatagagttctcgttatagatgca ggtgctgatttctthcttttactttgtaccttaCtttgaatctggtaaatgattattta gtcagccaagtagtagtaaatgcagagtcattagcctatttgttttggattttgtgag cCCcatacttcaaactggaagcttatgctatactatctgatcccttgtttgtatagattg Ctttcttctcctttttctcggatttatcttatatataagcggacagagtaaaagaatgta aacatgcgtaatttgacctattatagcagattatttgtcttattttccaggtcgccgatt ccacttattaggagtagttacacgtatttacctLttaagtgaaataatagtgtaaagttt cttttggcactgtcggtgtaaagaagctaaactcctttCtttaaccccggcatttctcaL ttttggggctttggttcaagaatatgccaaccgatcctctgagctctaac SEK lD NO: 3 (Intron 1) gtatggctctcatccttctgtttgtttgattaatacaaactttgcthCaattaccttttgccccttgttgctacct cttttctgtggtataaaaaattaatgtaggctaatgtgtagagtggaggtattatatgcagaacaattgcaatcaag caattacctgtgagatactattttgttttcatattagtggactggtacattctcattggtgtatcgtttgatctcca ccaaagcagaggttttactggccgacagagtcaaactactgtgcttcactccttttactccaatccttagtagtctt tgcttctaatgaacttcaagcgtgtaatagaaacaccattatattattagctgattagttactttacaattccagag catatttacattttctgcttggttgtctattactctggataacagtcctaaatgcaagcaaaatcaactgtgttttc agtcttgagctgaccaatcagttcatgatgtcctcagcttgtccaagctggtgcctcaccggaattatgtgggacct tcgtacttaatcaactagttcaccttcttcttaaaaatattgaatgatttgattggttaatagttccttaaatgtag taattatttgctaacttactttaccaaccccttgtccaacag SEK ID NO: 4 (Intron 2) gttagaagtccacaatgtcatgtgtcattgaagatttaatttaagatagaaattacattgtttcattctgcaaatta tggacctatcagagaaaaatcatggattCtgaatggctactttccccagtgaagacacatatcatttcctgggagga agatgtgaaagtggcaagctatttactccaaaaagtataatctaaaagacttttattaagttcggaaggcttaatcc atcatttgttatctgttgtctacttgtctttattaaaattcttcttagtccaatcactttcgatgaagttgactagt cttagtcacctgaatactttaaatctttgccttggtgtctctatattttcagccatcccaattccgaagctcatatt tgttttctctttgtaatgtccatctgaaagtttcatgcttctttgcag SEK ID NO: 5 (Intron 3) gtaagtttcagagtgttttatcaacccctttggaaccaagtgtcaagagtagtgtttcttggttgttaaatgattca catgtgtgttggttcctataaaacctgaaccttatgttttatcagagtgttttgctttcttgaag SEK lD NO: 6 (Intron 4) gtaaatttctgaggacaagtttttccttttgcatgtaaattcaaactttgctgcttagatgattaaataatgaaaaa tatccattgcatgttttaatgtgtatgacatgttagaattttgaatagaagttcattcactgatgttgagatgtttt SEK ID NO: 7 (Intron 5) gtatgagcactgtCtataacagccgtccttttttcttttcttgtctgaactcaaatttgaatcctttgtttagaggc aattagtctgctctgagcattttggctgacagttattatgtatattaaaaggcaacttttttattcgttctgtccag ctaaaactttttacttaaaatgtggttaaccgcatatttctgtgtctcctattttttgattatttgcaactctgatc aatctagatttggggaaggcttgttgttagttgatgactagatactaagctcacatctacattggttgcaagtagaa ttttcaagttgtcattcacttatattgtttgaactaggagattagcattcttctgcaaggagccctgaatgcttgaa aagttaaacagaaaagaaaaagttcagggcagatagacataatgtgttaaagtaattcaattggagcacagatatat gacatgtgttatttgggagctacgaaaaagataaggactattatgtagactacaattgaaataacaggtaattcatt SEK ID NO: 8 (Intron 6) gtataacaccgtccaatgctcatttatgggaattataaattctagtatttgataatccttctgtactttagatctac ctgctctactgaaaaatgaaatgagtatgaggaaatagaatatccgttgagcatttatgtctttccattaaaaactt gcattctatcttcttgtttcaagtcaaaatcttgaacaactatatctagagaattttccttcttgtgaagtaatgca tatatacatcaagagaagtcagagttgctgaatgaaatagtagatcaaatttaagtgttgtgcctataaagaattgt atggtgagattgaatatagtggtcatattattttctcaatcttagtgattaaagtattccatacaaacagacaagca tttagtcgtgcattcattggcactacaaaattatcaaccaagagtaatattctttcagctttcctctgtatatgtgt SEK ID NO: 9 (Intron 7) gtaataattctaactaattctgtggttgctatttgctagcatttgcacaaaaggaaaactataaaaagttcatagta aggaagagagggtagcEgtattaacaagcctacagattctttaatttcaaatatgttacgttgaatctctatattgt SEK ID NO: 10 (Intron 8) gtaatctaacttgctgactgaaataatttacaaaaatctcaaaatatagtacagagttagccaaacatgtcttctga gtgctgagatctttttggattataaattctgtaagagcaacatactatttgttagtgagaagaaaagcatatactcc agtgttttgttatctcccagaatgtctctaacatgaaatcgtgtacattgca SEK lD NO: 11 (Intron 9) agtcattagcctacttgctttggattttgtgagtttcatacttcaaactggaagcttatgctatactatctgatccc ttgtttgtatagattgctttcttttcctttttctcggatttatcttatatataagcggacagagtaaaa SEK ID NO: 12 (Intron 10) agtcattagcctatttgttttggattttgtgagtttcatacttcaaactggaagcttatgctatactatctgatccc ttgtttgtatagattgctttcttttcctttttctcggatttatcttatatataagcggacagagtaaaa SEK ID NO: 13 (Ekson 1) tggatatgaggaacagtatgtcttcagaatcttgtttagcatcactttcttgttctgcctccacatttcaatcgtca gaggattcagcagttgttaaatggttaagattcattttcctctctccatgtccacaaaggactcttctatcttccat tgatgtgctgcttttgcttactttcattgtatttgcagtacaaaagttgtactcaaagttgaggtccaatgagcact ctacttctagcattgataagcctctaattgcacacaacaggacttctgttagaaccaatctttggtttaagctgtct Ctgattttgtcagctattttagccttatcttctatagttttangcattttggttattgtgggaaattcccagtcgcc agaaaagatttcacgctatttcccatccactgtccctgcgcgCgttttggattgcaaactttgtagttatgagtLtg ttctttggttgtgggatcacaaggcttgtgtcacttaaggaaattgatcctaatttaagaatggatgatataagttc attagtttcatttcctatttctgttgttctcttcattgttgccattaaaggttcgaccggagttgctgtaattagtg attctgaatCtcacttaagtgatgaaaccaatggttatgaactcctggataaatccagtgtgagtggctttgcttca gcttctctaatatcgaaagccttttggatttggatgaaccccttactgcaaaaaggttacaagtcacctctcaagat tgatgaagttccttcactttccccactgcatagagcagagaaaatgtctcaacttttcgaaagaaattggcctaaac Ctgaagaaatatcaaagcatcctgtccgaacaacattgctgcgttgcttttggaaggaagttatttttactgccatt Cttgcagtaattagggtatgtgttatgtatgtagggccaacactcatacaaagatttgttgattacacagcaggaaa gaggacatctccctacgaaggatactaccttataggaactctcctaatagccaaatttgtggaagttctaacctctc atcagttcaactttaactcccaaaagcttggcatgcttattcgagcgacacttctcactcctttgtataagaagggg ttaaggttgtcatgctcagctagacaggctcatggtgttggacagattgtaaattatatggccgtcgatgctcagca gccgtccgatatgatgctacagctacattccatttggctcatgccattgcaagtttctgtggctttaggcatccttt atacttacctcggtgcttcaactgttgtaacgctagctggacttgcagcagtgatggtatttgtggtgtttggaact aaaagaaacaacaggtttcaatttaacatcatgaagaatcgtgattctagaatgaaagcgacaaatgagatgcttaa ttatatgcgcgttataaagttccaggcatgggaagaacattttaacaaaagaattgaatccttccgcgaatccgagt atggatggttgtccaagttcttgtactcaatcgctgggaatatcattgtcttgtggagcactcctcttctagtggct acactcacttttggaagtgcaatcttgttgggaatcccgcttggtgcagggacagtgttcactgcaacatctctctt caagatgttgcaggaaccgatcagggctttccctcaatccatgatctcactttcacaagcaatgatatctcttgata gattggacaaatatatgatgagtaaggagttagtggataaagctgtggaaagactagaaggttgtgggggtacaatt gctatgcaggtgaaagatggagctttttgctgggatgatgaaaacagtaaagaagaattgaaaaatgtaaacttcga gattagaaaaggagagcttgcagcagtagtggggacagttggggcggggaagtcttccctccttgcatctgtacttg SEK ID NO: 14 (Ekson 2) gtcacaatttgtggttcaactgcctatgttgcacaacatcgtggattcagaatggcacgatacaagaaaatatcctg tttggtatgccaatgaacagagacagatacaaggaagtgatccgggtttgctgcttggagaaggacttggaaataat ggagtttggagaccagactgaaataggagaacgtggcatcaacctcagtggtggtcagaagcagcgaatccagcttg caagagctgtttaccaggactgtgatatctatcttctagatgatgtattcagtgcagttgatgctcacactggctct SEK ID NO: 15 (Ekson 3) gaatgtgtgaggggaattCttaaagataaaaccattttgcttgtcacacaccaagttgacttcttgcataatgttga SEK ID NO: 16 (Ekson 4) gtcatgcgagatgggatgatcgtgcaatctggcaaatataatgagatattagaagctggaatggattttaaagagct agtagctgcacatgagacctctttagaacttgttgacgtggaaacaaccaaagagagcaatgcctcccttgaagaat caaaatcttctcgaagattatctaaggaagaaaacggagatgataaatctcaacagtctacatctgataggggggat tctaaacttataaaggaagaagaaagagaaactggaaaagtcagtcctcgtgtgtacaagctatatattaccgaagc ttttggatggtggggtgtagtgctagttatcttgttttcgttcttgtggcaaagtCctctaatggcaagtgattatt ggctggcatatgaaacttcagcggatcgtgccatgtccttcaatccttctctgtttattgggatatacggtgttatt gcagttgtttcttcgttgctgatagtgatcaggatgtattttgtgacacttatggggctcaagactgcccaaatatt tttcggacagattctttacagcatactgcatgctcctatgtcattttttgacacaacaccttecggaagaattctga SEK ID NO: 17 (Ekson 5) gcatctaatgatcagaccaacattgatgtcttcctcccgttttttatgaatctcactttggccatgtttatcacact gctcggcatcatcatcatcacatgccaatattcttggcctaccgtactacttttgattcctctgggttggcttaaca SEK ID NO: 18 (Ekson 6) ggatattatcttgcaacatctcgtgaattgactcggcctgacccaattacaaaagcacctgttattcatcatttctc tgaaagcatctcaggtgttatgactatacgttgctttaggaagcaggagatgttttgtaacgagaatgtaaaccgag tgaattccaaCCtgcgaatggatttccacaacaatggatccaatgaatggttgggctttcgactggaattgatggga agcttacttctttgtgtttctgcaatgttcatgattgtcttacctagcagcatcatcaagccag SEK ID NO: 19 (Ekson 7) aaaatgttggtttgtcactatcatatggcttgtctcttaatagtgtcctattctggtccatctttgtgagttgcttt gtggaaaataaaatggtttCtgtcgaaagattaaaacagttctcagaaataccatcagaagcagagtggagaaagat ggattttctcccaccttcaagttggccaagccgtgggaatgtCgagcttgaaaacgtgcag SEK lD NO: 20 (Ekson 8) gttagatatcgtccgaacactcctctagtgcttaaaggagttactctcagcattagagggggagagaagataggtgt tgttggtcgcacagggggtggaaaatcaacattaattcaagtttCctttcgtttggtggagcctgcagctggaagaa taatcattgatgacgtagatatatccagacttgggcttcatgatcttagatctcgcttcgggatcattccccaagag ccagtcctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgaccccattggacaatattcagatgatgaaatttggaag SEK lD NO: 21 (Ekson 9) Agcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaaacccgaaaaacttgattcaccag SEK ID NO: 21 (Ekson 10) ttgttgataacggagataactggagtgtcggacagaggcagcttctttgcttgggaagagtgatgctaaaacgtagc agacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgattcacagacagatgcagtgattcagaaaatcatccgcga ggactttgcggcctgtactataatcagcattgcccacagaataccaacagtcatggactgtgatagagttcttgtta SEK ID NO: 22 (Ekson 11) gaatagcaaaagagtttgacaaaccatctcgtttgcttgaaaggccttcactttttggggctttggttcaagaatat SEKIDIHO:23(RNAIÜZßD aagagccagccctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgaccc cattggacaatattcagatgatgaaatttggaaggtaatctaacttgctgactgaaataa Lttacaaaaatctcaaaatatagtacagagttagccaaacatgtcttctgagtgctgaga tatactccagtgttttgttatctcccagaatgtctctaacatgaaaCCgtgtacattgca gagcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaaacccgaaaaacttgattc accaggtaaaCCttccccctctacgtcacccttgtggttctctgcggaattacgcaacca actttttatgcgtttcaaatatatatactgataactgaatactgtcattggcaaatcata gttgttgataacggagataactggagtgtcggacagaggcagcttctttgcttgggaaga gtganctaaaacgtagcagacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgattca cagacagatgcagtgactcagaaaatcatccgcgaggactttgcggcctgtactataatc agcactgcccacagaaCaccaacagtcatggactgtgatagagttcttgttatagatgca tctgtatgtgatggttcccaaccaatcatagtcagtaccttCatgaagaaaccgcctaat gttagccaagtagtagcaaatgcatgaagtcattagcctatttgttttggaccttgtgag tttcatacttcaaactggaagcttatgctatactatctgatcccttgtttgtatagattg ccacctattaggagtagttacacgtatttatcttttaagtgaaataatagtgtaaagttt cttccggcaccgtcggtgtaaagaagttaaacccctttctttaaccccggcacttctcat ttttggggctttggttcaagaatatgccaaccgat SEK ID NO: 24 (NtMRP4 'ün protein sekansi; 5'-3' çerçeve 1; - varsayilan durdurma kodonunu gösterir) MDMRNSMSSBSCLÃSLSCSASTFQSSEDSAVVKWLRFIFLSPCPQRTLLSSIDVLLLLTF EKRFHAISHPLSLRVFWIANFVVMSLFFGCGITRLVSLKEIDPNLRMDDISSLVSFPISV VLFIVAIKGSTGVAVISDSESHLSDETNGYELLDKSSVSGFASASLISKAFWIWMNPLLQ KGYKSPLKIDEVPSLSPLHRAEKMSQLFERNWPKPEEISKHPVRTTLLRCFWKEVIFTAI LAVTRVCVMYVGPTLTOHFVDYTACKRTSPYFGYYLIGTLLIÂKFVEVLTSHQFNFNSQK LGMLIRATLLTSLYKKGLRLSCSARQAHGVGOIVNYMAVDAQQLSDMMLQLHSIWLMPLQ VSVALGILYîYLGASTVVTLAGLAAVMVFVVFGTKRNNRFQFNIMKNRDSRMKATNEMLN YMRVIKFOAHEEHFNKRIESFRESEYGWLSKFLYSIAGNIIVLWSTPLLVATLTFGSAIL LGIPLGAGTVFTATSLFKMLQEFIRAFPQSMISLSQAMISLDRLDKYMMSKELVDKAVER LEGCGGTIAMQVKDGAFCWDDENSKEELKNVNFEIRKGELAAVVGTVGAGKSSLLASVLG EMHKLSGQVTICGSTAYVAQTSWIQNGTIQENILFGMPMNRDRYKEVIRVCCLEKDLEIM EFGDOTEICERGINLSGGOKORIQLARAVYQDCDIYLLDDVFSAVDAHTGSEIFKECVRG VDVETTKESNASLBESKSSRRLSKEENGDDKSQQSTSDRGDSKLIKESERETGKVSPRVY KLYITEAFGWWGVVLVILFSFLWOSSLMASDYWLAYETSADRAMSFNPSLFIGIYGVIAV VSSLLIVIRMYFVTLMGLKTAQIFFGQILYSILEAPMSFFDTTPSGRILSRASNDQTNID VFLPFFMNLTLAMFITLLCIIIITCQYSWPTVLLLIPLGWLNIWYRCYYLATSRELTRLD SITKAPVIHHFSESISGVMTIRCFRKOEMFCNENVNRVNSNLRMDFHNNGSNEWLGFRLE LMGSLLLCVSAMFMIVLPSSIIKPENVGLSLSYGLSLNSVLFWSIFVSCFVENKMVSVER LKQFSEIPSEAEWRKMUFLPPSSWPSRGNVELENVQVRYRPNTPLVLKGVTLSIRGGEKI GVVGRTGGGKSTLIQVFFRLVEPAAGRIIIDDVDISRLGLHDLRSRFGIIPQEPVLFEGT VRSNIDPIGQYSDDEIWKEPRTLPTQRCGVFKTRKT-FTSC--RR-LECRTEAASLLGKS DAKT-QTSIYG-GNCLC-FTDRCSDSENHPRCLCGLYYNQHCPQNTNSHGL SSCYRCR C-FLSFYFVPYFESGK-LFICM-WFPTNHSQYLYRETÄ-C-PSSSKCM SEK ID NO: 25 (NtMRP4 'ün protein sekansi; 5'-3' çerçeve 2; - varsayilan durdurma kodonunu gösterir) NI-GTVCLQNLV-HHFLVLPPHFNRQRIQQLLNG-DSFSSLHVHKGLFYLPLMCCFCLLS LYLOYKSCTQS-GPMSTLLLALISL-LHTTGLLRLGKS-MDCIGCFRRLHML-SLY--FM RKDFTLFPIHCPCACFGLQTL-L-VCSLVVGSQGLCHLRKLILI-EWMI*VH-FHFLFLL FSSLLPLKVRPELL-LVILNLT-VMKPMVMNSWINPV-VALLOLL-YRKPFGFG-TLYCK KVTSHLSRLMKFLHFPHCIEQRKCLNFSKEIGLNLKKYQSILSEÇHCCVÂFGRKLFLLPF LQ-LGYVLCM-GQHSYKDLLITQOERGHLLMKDTTL-ELS--PNLWKF-PLISSTLTPKS LACLFERHFSLLCIRRG-GCHAQLDRLMVLDRL-IIWPSMLSSCPI-CYSYIPFGSCHCK FbWL-ASFLLTSVLQLg-R-LDLQQ-WYLWCLELKETTGFNLTS-RlVlLE-KRQMRCLI WESRLVQGQCSLOHLSSRCCRNRSGLSLNP-SHFHKQ-YLLIDWTNI--VRS-WIKLWKD -KVVGVQLLCR-KMELFAGMMKTVKKN-KM-TLRLEKESLQQ-WGQLGRGSLPSLHLYLV RCTSCRVRSQFVVQLPMLHKHRGFRMARYKKISCLVCQ-TETDTRK-SGFAAWRRTWK-W SLETRLK-ENVASTSVVVRSSESSLQELFTRTVIFIF-HMYSVQLMLTLALKSSRNV-GE FbKlKPFCLSHTKLTSCIMLT'SLSCEMG-SCNLANIMRY-KLEWILKS--LHMRPL-NL LTWKQPKRAMPPLKNQNLLEDYLRKKTEMINLNSLHLIGGILNL-RKKKEKLEKSVLVCT SYILLKLLDGCV-C-LSCFRSCCKVL-WOVIIGWHMKLQRIVPCPSILLCLLGYTVLLQL FLRC---SGCIL-HLNGSRLPKYFSDRFFTAYCMLLCHFLTQHLPEEF-VGHLMIRPTLM SSSRFL-ZSLWPCLSHCSASSSSHANILCLPYYF-FLWVGLISGTGDIILQHLVN-LGLT QLQKHLLFIISLKASQVL-LYVALGSRRCFVTRM-TE-IPICEWISTTMDPMNGWAFDWN -WEAYFFVFLQCS-LSYLAASSSQKMLVCHYHMACLLIVSYSGPSL-VALWKIKWFLSKD -NSSQKYHQKQSGERWIFSHLQVGQAVGMLSLKTCRLDIVRTLL-CLKELLSALEGERR- VLLVVQGVENQH-FKFSFVWWSLQLEE-SLMT-IYPDLGFMILDLASGSFPKSQSFLKEL -EATLTPLDNICMMXFGRSLERCOLKDVVSLKPEKLDSPVVDNGDNWSVGOROLLCLGRV NLKRSRLLFMDEATASVDSQTDAVIQKIIREDFAACTIISIAHRIPTVMDCDRVLVIDAG ADFSPFTLYLILNLVNDYLSVCDGFQPIIVSTFMKKLPNVSOVVVNA- SEK ID NO: 26 (NtMRP4 'ün protein sekansi; 5'-3' çerçeve 3; - varsayilan durdurma kodonunu gösterir) GYEEQYVFRILFSTTFLFCLHISIURGFSSC-MVKIHFPLSMSTKDSSIFH-CAAFAYFH CICSTKVVLKVEVQ-ÃLYF-H--ASNCTQQDF?ALESHRWTVLVVSSDYTCCNHYTNSS- EKlSRYFFSTVPARVLBCKLESYEFVLNLNDHKÃCVT-GN-S-FKNS-YKPISFISYFCC SLHCCH-RFDRSCCN--F-LSLK--NOWL-TPG-IQCEWLCFSPSNIESLLDLDEPFTAK RLOVTSQD--SSFTFPTA-SRSNVSTFRKKLA-T-RNIKASCPNNIAALLLEGSYFYCHS CSN-GMCYVCRANTHTXIC-LHSRKEDISL›RILPYRNSPNSQICGSSNLSSVQL-LPKA WHAYSSDTSHFFV-EGVKVVMLS-TGSWCWTDCKLYGRRCSAAVRYDATATFHLAHAIAS FCGFRHPLYLPRCFNCCNASWTCSSDGICGVWN-KKQQVSI-HHEES-F-NESDK-DA-L YARYKVPGMCRTF-OKN-ILPRIRVWMVVQVLVLNRWEYHCLVEHSSSSGYTHFWKCNLV GNPAWCRDSVHCNISLQDVAGTDQGFPSIHDLTFTSNDIS--IGOIYDE-GVSG-SCGKT RRLWGYNCYAGERWSFLLG--KQ-RRIEKCKL-D-KRRACSSSGDSWGGEVFPPCICTW- DAOVVGSGHNLWFNCLCCTNIVDSEWHDTRKYPVWYANEOROIOGSDPGLLLGEGLGNNG VWRPD~NRRTWHQPOWWSEAANPACKSCLPGLoYLSSR-CEQCS-CSHWL-NLQGMCEGN S-R-NHFÄCHTPS-LLÂ-C-PDPCHARWDDRAIWQI--DIRSWNGF-RASSCT~DLFRTC -RGNNQREQCLP-RIKIFSKII-GRKRR--ISTVYI--GGF-TYKGRRKRNWKSQSSCVQ AlYY-SFWMVGCSASYLVFVLVAKFSNGK-LLAGI-NFSGSCHVLQSFSVYWDIRCYCSC FFVADSDQDVFCDTYGAQDCPNIFRTDSLQHTACSYVIFvHNTFRKNSESGI--SDQH-C LPPVFYESHFGHVYHTARHHHHHMPIFLAYRTTFDSSGLA-YLVPGILSCNIS-IDSA~L NYKSTCYSSFL-KHLRCYDYTLL-EAGDVL-RECKPSEFQSANGFPQQWIQ-MVGLSTGI DCKLTSLCFCNVHDCLT-QHHOARKCWFVTIIWLVS--CPILVHLCELLCGK-NGFCRKI KTVLRNTIRSRVEKDGFSPTFKLAKPWEC-A-KRAG-ISSEHSSSA-KSYSOH'RGREDK CCWSYRCWKININSSFLSFCCACSWKNNH--RRYIQTWAS S ISLRDHSPRASPF RNC EKQH-PHWTIFR--NLEGASNAÂNSKMWCL-NPKNLIHQLLITEITGVSDRGSFFANEE- C-NVADFYLWMRQLPLLIHRQMQ-FRKSSARTLRPVL-SALPTEYQQSWTVIEFLL-MQV LISLLLLCTLF-:W-MIIYLYVMVSNQS-SVPL-RNCLMLAK---MH SEK ID NO: 27 (cDNA'nin dogrudan dizilemesinden türetilen NtMRP4'ün cDNA sekansi) Jtggjtutguggauragtntqtctttuana:ctrgrrrngrntcafttccttgttctçc:: ` :acazttcaatcgtc agacgart^agcagttgrtaaa'qgttaaga'tcart'cccrrict rfdtçt.ccac anaqq a:w::t:cta:ct:cc Lv`dçiîLraqLartqa'aaqvr 'tda“tqcucaciaçiggacttLtg-tagaaLcaatctt-gg--taag::gtc ctça:: ttg: cagctatt: tagcctcatcitctatagctccatgcati'tggiLettgtqgqaaa:.:.c~caq'.cqr c:igg=aaqi- u: uqa: qqa7.qfarrqqtLqtt*ragccgattacaca*CC gtaatcacta- ac:aacagt:.cat gugaaauqat'ltdiu'Pa'!(r^'at"rdr'*fr ' grqcqtqttttgcattqcaaactttgtagzta_gagttt gttct::gg-:gtgçgatcacaaggcttgtgicacttaaggaaâttgatcctâat:ladgaatqqazqararnnqtt nsttaqtttuatticctarrrniqltgt:FtCLtcat:gttgccattaançg:cc;nc:ggag::gc:gnaatîagt ga:t:ZgaatctcacttaagtgatgaaaccaaLggLLaigaastcctqgdiauaîccngtgtgagtggctttgcrtc agCLLrtcLadîarcgandgSC*1tzggatt:çgatgaacccttia:tgcaaaadgglLduddQZCACC:Cîcaaga LLÜaLguagL'""LcaCL'Lccucactgca:aqaccaqngaaaatgtctcaact:C1:gaaagaaat'03CLdea -cczgaagaaa: atcaaa3catcctgtcsgaac3a0dt:gctgzgtrçstttt;gaagqaaqttatttttaczgcca ..(LLgcagtadt-aggglatg-gt-utgta-çtaggJC"aa^actParacaaacat'Lg" ':tacacaqcagua ggttdaqqtt ::azchcaqctaqarnqgctcatgg:9LtggacagattgtaddtLaldtggccgL:gaLchcaq cLaaaagaaacaacagchicaa:LtaacatcaLgnogaatcgtga:tctagaatgaaagcgacaaaLgaga!get: uiaiunntuqr'quraag'tvt'*Luc*caatcgctgggaataLcaLLgrCLL"ggauPact:c°c1'ctaqtqq Ctacactcactîttggaag_ gcaaic- tgLLgggaitcc. îgc.r.qqt qrngqganaq'.gttcnctgcaacatctc LC ttcaaçatqttqcaqqaaccqatcagggccttccctcaatccaLgu1:::actttcacaagrnntgntatctcttqa LagaiLgqa:aaaLaLaLgaLçagiaagçaqLtagcggataaagczgtggaaagactagaaggttgigggggtaCES ttgctatgcaggtgaaaga:gçagcttîttgctgggacgaLgaaaacaqtaaagaaqanttsaaaautgtaaactt: CaganLagaaaaogagagcttc*a0"au!da!aggaacag'*ggqgcggggaaqtcttchL::Lrgc~tctqLac' (ggtgagatgcacaagt (g. cgggtcaggtcaCaattLgtcgtt Hacc gcctatg: t.qcacianca: (9: cga: tc ug:n' ggrucg.1'aiaagauauLn*rf'qr*tqçtatgccaa»gaacugagacaja-âcaagjadgtgaLchggiç tgctçcttggagaaggacttggaaaLaatggngt:Lg;açaccagactgaaataggagaacgtgçca:taarrthas KqqtqqtçaqadqcaqcgdatUcaqcttqcaaqaqctg::Lacvaqqacîqtgata:LLatCLtCLaqatgaLgtat Lcaçigcagtcgaig::udcactggctctgaaatcztcaaggaâLgigLga3gggauLLuLLauagaiaaaaccctt aL:ngcaaaiazaaLqaqataLLaçaaçszqqaa:ggaLL:zaaaqaqc:aqtagctgcacatgaqafxtLtLtd? caacaaaaîqcaaatgataâa: “tiaacagr ctacatczca: aqgqqaqaîtLLauu'l'ataaaqgdaqaana ac agaadeggaadagt::gtcc:ngqtqzacaa-QC:aLara:::::gaaqct_:(ggatggtggggZgtaqtqC.OC ttatcttçtt:t:gttcctgtgçcaaag:LLLCLaatggcaaçLgaLLa::ggttggca:dtgucu::Xcagvggat cqtqccatqLcct:cant:Ct::tctg::taztgggatatacggtg:t a::gcagLLçLitcttcg::gctgacagt gatcdggdLgLaLLInggauuulzdrggggnrcaugaczguczuauuta:i tt: cggacagattîtttacaqca :ac t;catgct::Eacgtcacttt:t35cacaacacc::C:ggaagaattctgagt.Lgggcranciaa' g:: cagacc='< atrgatgt:trcztcccgttt:ttatqaat::cathtqg:catqLLta-caCüL-gLLL3g_u__a:LaLcatLuc dLgcc::LaLLu;LggucLaucngcLacLLLLgaLL:ciztgggitggcrraatacctggtaccggqgatattaCC frqrnarnrrrnqrqnqrrqarrronrr'gartraattapaaaagcacctPtLuttcatCnttictzzguaagcatc LL aggtgtCatgacta- acgt: :CLtiçgaig': aggaqatgttttgtaacgagaal._ ui.aaa:ugau'ga::.z.c:aa tc Cgcgaatgga; Ltciacaacaa: gg:: c'ualguaîgul'ucgLLLt ga::qqaatcqatqqqaaqct:actb: tttngtttL-qLaatgttLaLçaîtg_ct-Jthag_aqca::atLaagccaguaadhgftgghL,gicisiaLLd gLLnuLcL:agcattagaggggcauagaagatmggtgî.'gt1ggLCgiacaçggggtgcaaaathaca:taattCü Jqtt:tctttcgtttggtggagcc: Câgczggaâgaa_ aa- CdL'gdLgdcnggitatuL::agacttsgchtc argatrt&ugurrrrgrtrrggçafcattccccaagagccagtcct:tttgaaggaach:_ .agaagcaaLaitgac acccgaaaaacttgattcaccaçttgttga:aacggaga:aactggagtglcggucaqaqqcnqctLetttqctiqq qaagagLgaLchaaddrg:agcnga:ttctutttutggutgaggcnactgcctctgztga:tcacagacagatgca atga't”acaaaatca'ccgcoagaa^tttgcgg^c*g'ac*aLaaLCaqcaitqvccucaguatücxaacagtcai cg-r°gtuatuüag'tcttgttatagatchaggaa agcaaaagagt: tgacaaaccaccicgt:Lgcitgeaaggc -Cttca2CECLCggggcttLggCL:aagsaialqCCndccgaîcctrtgdgrtCtaa SEK ID No. 28 (5' ve 3' UTR ile NtMRP3'ün DNA sekansi) ccgtcaacccagtcttggccaccacataaacacagctttgacttgtctctcccttttccctattttcaccacccttt tcaatttcccaccttatattcattattatatttaatcaatcaaatcaaagttggaaaaaaagggagtaataatcaaa tggagtagtatatacataccagaacaatgaaagagcactcataagctaaagcccataattcatcacgaaaccacaat atagaggaaacctgacgtgtcccttaaaatctaaccttgaacctctgagacctccaaaaaaaacatCq aLtaCdtttC:tt:attîagcc:ctt::ttttccttat'agtgtcaatcztt cttuCntqkciaaL"aaL1Lk-L grguaaattaçr agranrr. Cagaa>tnarrci.aatg. actttgqtatq3; gacai` ' gntgsn adttnggggd"rr:aga"ncrar"trncr"garug gtîrtçagtt rcatctgîçgacaccatagcttg aaca:- 3JaccaacgaaatgçaggL.angutg'Pcct'gagguaauL.gu n aa`crtatqqtagqqaaaqaaacc Ldcacctaçtu qatqcaatatt-qatt gtqaactqgcatttqttt ttgtttagacttzttgatgagaaaaîgtatacgL aacttcgtçtttacaacaa:LLgaaLgLaLgtigagtcaagigatzagtcagtcaaqaqtqcargguthtgctazt tctgggraaaagaagtaaaccctgîCçttgagagttgaaagtgüaatCactaqtgicgauLittgccgcdtaagcta aatgaasCdctiLLucgatdanrî:Ctagtgaaauaaaggnnaan*trnrrgqraagactagctgtttatçtttcac SEK ID No. 29 (5' ve 3' UTR`Siz NtMRP3'ün DNA sekansi) Ü'E'qâddl'îffül agiaLucaa tcaçtr'tiv'qt'aratgdi. datnûatgitLLg' gauaatLag:Lugt.aartt.cagaat.Laactr anitgta aaqttctctatc2tcazqt:ttCtttccttqaaq:tLq&tqtqttqaataactcttaagagcasaz:::ctccgiL: SEK ID No. 30 (NtMRP3'ün Intron 1'i) gtathtggcgttgatgaatccctccgaaaccccattttcttacgtgtcattagttgttctttgcacctgggattgttcctt gtaattcttgggttgtgttgttggaatacaatcag SEK ID No. 31 (NtMRP3'ün Intron 2'si) gtaagtcctttcatatatatgctttattttcatgcttgatatactttacctagccacttgattgacccatcctttaa SEK ID No. 32 (NtMRP3'ün Intron 3'ü) gtactctttcctttcagtaattatggtttgcttaatatcatatatagacttaactcatttaactatgatatttctct SEK ID No. 33 (NtMRP3'ün Intron 4'ü) gtaagtgaatgattacattttctttatttagccccttttttttccttattagtgtcaatctttCtgttacatgacta atcaatgtCttgtgaaaattagctagtaatttcagaattaactcaaatgtactttggtatgaaaacag SEK ID No. 34 (NtMRP3'ün lntron 5'i) gttgctacgaccacctttttcgtgttctttgccttcacaattattctactatatgctttttcacaaagtgagtcata actttagcgacattcataaacgtgagttacatttaagtggtgagtttgttttcattgcag SEK ID No. 35 (NtMRP3'ün Intron 6'Si) gtaagttctctatcttcatgttttctttccttgaagtttgttgtgttgaataactcttaagagcacattttctccgt SEK ID No. 36 (NtMRP3'ün Intron 7'si) gtaaattaagttattctctggtgttaattatgcaggttaatttgttggtatgggttggtatatctgaaaacttttaa SEK ID No. 37 (NtMRP3,ün Intron 8'i) gtgacagcttggttttgcctatttttggatttattttgtttcagataggaaaatgacaaattttattttattgagaa SEK ID No. 38 (NtMRP3,ün Intron 9'u) gtaacttcaagaaccacatcattttctgatgatttccacttttagagctgtaataatcatcttcattgcgttgctgc SEK ID No. 39 (NtMRP3'ün Intron 10'u) gtaagaatcatcgtctatgttctggagcaagcggagaaggaaattcttggtagttaccttttttttanctatgctg SEK ID NO. 40 (NtMRPS'ün Ekson 1`i) Atggaaatgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgag SEK ID No. 41 (NtMRPS'ün Ekson 2`si) SEK ID No. 43 (NtMRP3'ün Ekson 4`ü) SEK ID No. 45 (NtMRPS'Ün Ekson G'si) 41:44“ "Ig- , SEK ID No. 48 (NtMRP'BfÜn Ekson 9'u) SEK ID No. 49 (NtMRPS'ün Ekson 10'u) SEK ID NO: 51 (BAC klon dizisinden tahmin edilen NtMRP3 'ün CDNA dizisi) atggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgaggagggacaataatgctggc cacaaacagagtagtactaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaccctgttttgt agaaatggttggtcagaagaaaaaattataacccttttggattttgcattaaagttgcta gcttggttgtcaacctctgtttccttgcacacccagttccttaattcttgtgaaaccaaa gaichg:LiLçacici:atggggttattctCÇLgc:Ltgtigggtttattgttaaaaca uLquuaaqgcâiigstitLcacagcdcggauggagataçtgtLatcggctrtcttcqtq CL:CtttacgttclggugzccitLgLLggcccgLachCdLLguLdcciiagLLcagtat ttctgggttgctcctacatttgtttctgcgacgacctttggcgctgcaacgctzaiggga aaaggtagttctgatgaagcaattgagattgtaqqtqqqaactccqctCqqqaîgcatcc ggcgatcaaacagaaataggggagaggggcattaattLgagcggLggacagadgcagdga aattcaaaaacagctctatatgttacacatcaagLggagtttctgcctgctgcqgatttg aagggacaaattgttcaggaggaggaaagaqaqaaagqtaqtqttggcttttcagtttac gttggtttLcuchccttcaaattggaagcaattaitqqatqchrqqqcaactcccqtc ggaattgcaagtgcttcatgcatCCZLchagaaccatgLLLctLgttaccgctggatat tccttcqatqccacaccqaq:qqçcqqattutaadudgagCdchdcagatcadagtgca CLaaaLgggucaLgcaadchccagLaatacagcactttgccgagacaazttcaggatca gLtggaacaattgacccaagtgttgctggctcagctgrtacaLatggchtaatctgaac gaaaguatacttcagtatactgctcttccaagtgaatctcctcttatcatagaatccaac agaccagaccctaactggccatcLLgtggagaggttgattttagcaatcttcaggcçcga tatgctcctcacatgcctctcgtqttgcgaggccttacatgcaccttstttggtggaaaq aagactggaattgtcggtaggacaggcagcggtaaatctactctaatacagaccctcttc ggLitgcaLgaLcLacgQLCLagaLLgagLataatLccucaggatccaactargtrrgag ggaacagLtcgcagcaacctagacccgcttgaagagtattcagatgaacaaatttgggag gcgctcgataagtgtcagctaggagaagaagtgaggaagaaagaaggcaaacttLaitct acagtatctgagaatggagagaactggagtgtaggccaaaggcagctggtctgcctzggc cgtgtgctactgaaaaagagcaaggtcctggtccttgacgaggctacagcatctgtcgac tctgccaagctcgtggcagagtatagtatgaggtcaaattcaagrtttgagaatgtttca 353036: wâmzmzmnmmg mamamsmnacowcg mzmamamucovooiaouw mâwzmaw covooitßm mâmzmamncgc_ mâmsmzmnmcmm wâmsmzmuîih îgîggîîêigîgrî+ I ggtggsccaqatccttttccçggggggggggggSEEEgttgagcttcatttctcttattt atagaqaaaatcttttqatqqggatgqttttttttctcttttgcattaatgattagaatt Latcattgttaaatgqtactcccccaataactttttgatttaaaaaaaaanctgtccttt cattcataatcatcatctcctttattatattactctaaactgttgctaaagttcctggçg gtatattttqqgggggggggggggggçgggggtgtgaaagttgatgaacttttattgtdc aatgttttgggggggsagcggggagcccttttatttaattctgagaggtctccttctctt tctcttcacactttcacatgtttccgtztcctgtagatttctcctttctctttccttggt tctttttccaactcanaatccLcaLgtgatttcaatttttgtttgtttttattccaççct ttgtctcttttgatatgggtgacaaacatcttctcttgctgaataaaaatttcaccfftt (b) cmmmwccmrrmmnmmmmmmmccr CTCTCCATGTCQCMAGGICTCTTCTATCHCCATTGATGTGCTGCTTTTGCTTACTTT CAHGTAMTMGTMTWWTMTCTACTTC TAGCÄTTGATAAGCCTCTMWACTTCTgt tagaaccaa tctttgg: t TCAGGCGÂTTACACASGTTGTAÄJCACTATACTAATAGTTCATGAGRAAAGATTTCACGC TATTTCCCATCCACTGTCCCTGCGCGTGTTTTGGATTGCAAACTTTGTAGTTATGAGTTT AATGGRTGATATAAGTTCAITAGTTTCATTTCCTATTTCTGTTGTTCTCTTCATTGTTGC mmTGGHITGAACTCCTGGATAMTCCAGmTGAGTGGCTTTGCTTQGCHCTCT MTANWWWTMCMWHMCACC TCTCAAGATTGATGAAGTTCCTTCACTTTCCCCACTGCATAGAGCAGAGAAAATGTCTCA ACMTCGWNGGCCTMACCTWTATMTCCMTCCW ATTGCTGCGTTGCTTTTGGAAGGAAGTTATTTTTACTCCCATTCTTCCACTAATTAGGGT ATGTGTTATGTATGTAGGGCCAACACTCATACAAAGATTTGTTGATTACACÂGCAGGAAA GGAAGTTCTMCCTCTCATCAGTTCAACTMWTCCCAAAAGCTTGGCATGCTTRTTCG AGCGACMWCMNGTATWTTWCÂTGCTCAGCTM GGCTCATGGTGTTGGÂCAGAITGTAAATTATÂTGGCCGTCGITGCTCAGCAGCTGTCCGA CÂTCCTTTATACTTACCTCGGTGCTTCAACTGTTGTAACGCTABCTGGACTTGCAGCAGT GATGGTATTTGTGGTGTTTGGAACTAAALGAAACAACAGGTTTCAATTTAACATCATGAA GALTCGTGAUCTAGMTGAMGCGACAMTGAGATGCTmTTATATGCGCGTTATm TGGATGGTTGTCCMGTTCTTGTACICAÂTCGCTGGGAATATCATTGTCTTGTGGAGCÂC TCCTCTTCTAGTGGCTACACTCLCTTITGGRAGTGCAATCTTGTTGGGMTCCCGCTTGG TWWWMMTGHWCGÂTCÂGGGC ATÃTÄTGÄTGÄGTÂAGGAGTTAGTGGÂTIAAGCTGTGGAAAGICTAGÂAGGTTGTGGGGG AGAATTGAAAAAIGTAAACTTTGAGATTAGAAAAGGBGRGCTTGCAGCAGTÂGTGGGGAC SEKIL 1 (devami) (b) atzttqttttcatat:agtqqactggtacattctca:Lggtgtatcgiugaictccacc atcctLagtagtciLtqcttctaacgaacttcaaqcgtgcaatagaaacaczattatatt attactctggataacagtcctaaatqcaaqcaaaatcaactgtgLtLtcagtcLLgagct ggttaatagttchtaadtgtagtaattatLtgctaactzactttaccaaccccttgtcc a a i? a qGTCÂCMTUGTGGTTCAÂCTGCCTÂTGTTWGTGGÂTMTG WQTWTANCWTATGCWWTW NATCCGGGTTTWWTWTMWWMCTG GMCTGTHACWTAMÂTCTTCIAGATGATGTAWTGCÂGTTGÂTG CTCACACTGGCTCMTCTTCAAGgt t: agaagt ccacaatgr catgt gr.:at:gaaga agaLgLgadagtggcdugctutLLchccaaaadgtalaaictaaaagactcttactaag cttagtccaatcacztrxcgatqaaqttqactagtcttagtcacctgaatactttaaaict LtgchLggLgLCLCLaLaLLLLcagccatctcaattccqaaqctcatatttgttttctc tttqtaatgtcca:.c:qaaaqttt--:atchLLLtLgcagGAATGTGTGÂGGGGAATTCTT MTMCQTTMGTMQCMTMTCTMTMTGTWCTG tttatcagagtgttt:getttcttgaagGTCATGCGAGATGGGATGkTCGTGCAATCTGG WTATMTMTAWWWWMAGCWTGA GACCTCTMAGHCWCGTMQACWGCMTGCCTCCCTW ATMTCTTCTCMTIÂTCTWGGÂGÂTGATWWQGTC TmTCTMTMMMAîmAWWT ETTÄTCMMCWTMNTMWTGITTAWGGC ATATWTQGCGGATCGTGCCATGTCCPICAATCCTTCTCTGTTTATTGGGRTATA CGGTGTTATTGCAGTTGTTICTTCGTTGCTGATAGTGATCÂGGÂTGTÂTTHGTGÂCÂCT TATWCWWTÂWMTTTMTWTGC aqgacaaqtttttcc::LchatqiaaaLtcaaacttLgctgcttagatgaziauataa: gaaaddtatccatigcatgttttaatgtgLaLgacatgttagaacttcgaazagaagttc SEKIL 1 (devami) a::cactçatgttqaqatqttttgtittctttctqcaqGCATCTAAIGAICAGACCAACA GCAICATCAICATCACATGCCAATÄTTCTTGGCCTACCGTACTACTTTTGATTCCTCTGG GTTGGCTTAATATCTGGTACCGGgiaLqagcacLqtLtataacagccgtccttttztctt tLcttgtctgaactcaaacttgaatccLtLgLttaqaggcaattagtctgctctgagcat LLgguLçduagLLaLLaLgLaLdLtdcaaggcaaCLLLLLLdLLugLLchLCCÖQCLö auacttttLacttaaaatgtggttaâctgcatatttctgtgtctcctattttttgattat aaqcicacatctacattgqttqcaaqcagaattttcaaqttgtcattcacttatattgtt aaagaaaaagttcaqqqcaqatagacataargtgtraaagraatrcaatfggagcacaga ttquadiaucaggtaatLCdLLLctggit acagGGATATTATCTTCCAACATCTCGTGA CTCAGGTGTTATGACTATACGTTGCTTTAGGAAGCAGGAGATGTTTTGTAACGAGAATGT ÂAACCGAGTGÄÂITCCÂAICTGCGÂATGGATTTCCACAACAATGGATCCÄATGAAIGGTT TGTCTTICCTIGCBGCATCATCAAGCCÂGQtataacaccqtccaatqctcatttatqgqa ccttctiqtqaagtaatgcatataLacaLcaagagaachagagttgctgaatgaaatag ngaicaaattLacgLgLLgtgcçtaLaaagaaLigLaLggLgagdLLsaa!diagtggt tgtaiatngLgLLcLaLLctggdgcLgddgutddciaatditctLLLLLdLLLCLdCug AAAATGTTGGTTTGTCACTATCATATGGCTTGTCTCTTARTAGTGTCCTATTCTGGTCCÂ TCTTTGTGAGSTGCTTTGTGGÂAAAIAAAATGGTTTCTGTCGAAAGATTAAALCAGTICT CAGAAATACCATChGAAGCAGÂGTGGÄGAAAGÂTGGÂTTTTCTCCCACCTTCAAGTTGGC CAAGCCGTGGGAATGTTGAGCTTGAAAACGTGCAGQtaaraartcraacraartctgtg ctatatzçtttgttctacLggtcaacagGTTAGATATCGTCCGAACACTCCTCTAGTGCT GGGTGGAAAATCAACATTAATTCAAGTTTTCTTTCGTTTGGTGGAGCCTGCAGCTGGAAG AATAATCÂTTGßTGACGTAGATATATCCAGACTTGGGCTTCATGATCTTAGRTCTCGCTT SEKIL 1 (devami) CÂTTGGÂCAATAITCRGtTGÄIGAAÄTTTGGAAGgtaatctaac:tgctgactgaaataa ngWTMWNmMTTTMWMHC acrt::taîgtqtttcaaatatatataczqataactqaacactgicatLquaaaLcaLa QWMTWGQMTWTGWWTNHTGCTW GMTGCTMCGTMHCTAMAWWTGCCTCTGHQM MWGATTCAMTCATCCGCGAGGACNTGCGGCCTGTACTATMTC MTTGCCMGMTMWQWTAWICWÄTWTGCA TCTGTATGTGATGGMCMCMTQTMMACCHTATWHGCCTMT GHAGCMTWAMAMWQbL-dt taqcctat. r_ LgL u. mgaiitt. iuigdg aacatgzgtaaLLLgachaLLaLagcggaLLdLLLuLcLLdLLLtccaggCcchuaLE gçdccLattagcagtagttacacqtatttaze:tttaagtgaaataataqtgtaaaqtct . pgçctctgpgçtctaaccocactatLt gtagatttttggaaatgtaacaararrgggatraacaattgtaattgatgaatctattaa LcaaaiacaaLg&LLaLtchLLaLaggggLagpccggggapggLtacazagactgatLg.

Claims (6)

ISTEMLER

1. Bir tütün bitkisinde eksprese edildiginde, NtMRP4 mRNA 'nin translasyonunu inhibe etmek için bir ekspresyon vektörü olup: (a) sekansi SEK ID NO:13-23 ya da 53 'ün herhangi birinden meydana gelen, transkripsiyon baslaticiya göre antisens dogrultuda konumlandirilmis bir polinükleotit; ya da (b) transkripsiyon baslaticiya göre antisens dogrultuda konumlanmis, SEK ID No:1 'in bir bölgesi ile en az %80 özdes, uzunluk olarak 15 ile 100 arasinda nükleotitten olusan bir polinükleotit yapi; ya da (0) SEK lD NO:1 ile en az %80 sekans özdesligine sahip 15 ile 300 arasinda nükleotitten meydana gelen bir birinci sekans; saç tokasi yapisinin bir halkasini olusturan bir mesafe tutucu elemani kodlayan bir ikinci sekans; ve birinci sekansin bir ters tamamlayici sekansina sahip olup, birinci sekans ile ayni yönde konumlanan bir üçüncü sekans içeren bir saç tokasi yapisi olusturmak üzere kendine baglanabilen bir RNAi polinükleotidini kodlayan bir polinükleotide faal olarak baglanabilen bir transkripsiyon baslatici içermekte olup, özelligi; içerisinde ikinci sekansin, birinci sekans ve üçüncü sekans arasinda yer almasi ve ikinci sekansin birinci sekansa ve üçüncü sekansa faal olarak bagli olmasidir.

2. istem 1 'e göre bir ekspresyon vektörü içeren bir transgenik tütün bitkisi ya da tütün bitki hücresi olup, özelligi; içerisinde ekspresyon vektörünün indüksiyonunun bir NtMRP4 RNAi polinükleotidinin ekspresyonuyla ve içerisinde NtMRP4 geninin ekspresyon ya da aktivitesinin ve/veya bu sekilde kodlanmis olan proteinin aktivitesinin azalmadigi bir kontrol bitkisi ile mukayese edildiginde kadmiyum oraninda transgenik bitkinin en azindan bir kismi içerisinde en az %5 oraninda bir azalmayla sonuçlanmasidir.

3. Biokütle, tohum ya da yapraklar dahil olmak üzere tütün malzemesi olup, özelligi; istem 2 'nin bitkisinden hücreler ya da dokular içermekte olup, istem 1 'e göre bir ekspresyon vektörü içermesidir.

4. Istem 3 'e göre bitki materyali ya da istem 2 'nin bitkisinin bir kismini içeren bir tütün mamulü olup, özelligi; istem 1 'e göre bir ekspresyon vektörü içermesidir.

5. Bir tütün bitkisinin en azindan bir kisminda kadmiyum seviyelerinin azaltilmasi için bir metot olup, NtMRP4 enterferans RNA 'nin bir transgenik polinükleotitten ekspresyonu adimini içermekte olup, polinükleotit: (i) sekansi SEK ID NO:13-23 ya da 53 'ün herhangi birinden meydana gelen bir polinükleotit: ya da (ii) uzunluk olarak 15 ile 100 nükleotit arasinda olup, SEK ID No:1 'in bir bölgesi ile en az %80 özdes olan bir polinükleotit yapi, ya da (iii) bir saç tokasi yapisi olusturmak üzere kendine baglanabilen bir RNAI polinükleotidini kodlayan bir polinükleotitten olusan gruptan seçilmekte olup, saç tokasi SEK ID No:1 ile en az %80 sekans özdesligine sahip 15 ile 300 arasinda nükleotitten meydana gelen bir birinci sekans; saç tokasi yapisinin bir halkasini meydana getiren bir mesafe tutucu elemani birinci sekansin bir ters tamamlayici sekansina sahip olup, birinci sekansla ayni oryantasyonda yerlestirilen bir üçüncü sekans içermekte olup, özelligi; içerisinde ikinci sekansin, birinci sekans ve üçüncü sekans arasina yer almasi ve ikinci sekansin birinci sekansa ve üçüncü sekansa faal olarak bagli olmasidir.

6. Bir saç tokasi yapisi olusturmak üzere kendine baglanabilen bir NtMRP4 RNAI polinükleotidi olup, saç tokasi yapisi: (0) SEK lD No:1 ile en az %80 sekans özdesligine sahip 15 ile 300 arasinda nükleotitten meydana gelen bir birinci sekans; saç tokasi yapisinin bir halkasini meydana getiren bir mesafe tutucu elemani birinci sekansin bir ters tamamlayici sekansina sahip olan, birinci sekansla ayni oryantasyonda yerlestirilen bir üçüncü sekans içermekte olup, özelligi; içerisinde ikinci sekansin, birinci sekans ve üçüncü sekans arasina yer almasi ve ikinci sekansin birinci sekansa ve üçüncü sekansa faal olarak bagli olmasidir.