BR112013005142A2

BR112013005142A2 - redução de metal pesado em planta

Info

Publication number: BR112013005142A2
Application number: BR112013005142-6A
Authority: BR
Inventors: Lucien Bovet
Original assignee: Philip Morris Products S.A.
Priority date: 2010-09-03
Filing date: 2011-08-31
Publication date: 2020-08-04
Also published as: AU2011297946A1; CN103228671A; EP2611824B1; PL2611824T3; CN103228671B; AP2013006799A0; JP2013542719A; US20150232867A1; EP3447065A1; EA030377B1; US9528118B2; JP2017060499A; MX2013002504A; EA201390325A1; EP2611824A2; WO2012028309A3; WO2012028309A2; AU2011297946B2; CO6690786A2; ES2698154T3

Abstract

REDUÇÃO DE METAL PESADO EM PLANTA. A presente invenção refere-se a uma planta ou célula vegetal mutante, que não ocorre naturalmente ou transgênica compreendendo (a) um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em: (i) um polinucleotídeo compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência tendo pelo menos 71% de identidade de sequência às SEQ ID NOs: 1,2,27,28 ou 29 ou 51; ou (ii) um polinucleotídeo compreendendo, menos 65% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 3 a 23 ou 30 a 50; (iii) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de NtMRP compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência tendo pelo menos 65% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs. 24 a 26 ou 52, e em que o polipeptídeo tem atividade de tranportador de metal pesado; ou (b) uma construção de polinucleotídeo de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos em comprimento que é pelo menos 65% idêntica a uma região de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 23 ou 27 a 51; ou (c) um RNA de filamento duplo compreendendo pelo menos duas sequências que são pelo menos parcialmente complementares entre si e em que um filamento de sentido compreende uma primeira sequência e um filamento de antissentido compreende uma segunda sequência e em que pelo menos uma das sequências compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de RNA de NtMRP; ou (d) um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo como apresentado em (i), (ii) ou (iii) ou a construção de polinucleotídeo como apresentado em (b).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "REDUÇÃO : DE METAL PESADO EM PLANTA". - CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a polinucleotídeos e polipeptídeos que codificam transportadores de ABC que estão envolvidos no transporte de metal pesado.

A presente invenção é também dirigida a modificar a ex- pressão dos ditos polinucleotídeos ou polipeptídeos em plantas.

Em particu- lar, a presente invenção refere-se a modular (por exemplo, reduzir ou inibir) . a expressão ou atividade de um ou mais transportadores de ABC envolvidos notransporte de metal pesado subcelular. « INTRODUÇÃO

. Plantas obtêm metais pesados essenciais - tais como zinco e cobre - absorvendo-se substratos de íon metálico de seu ambiente por vá- rios mecanismos de transporte mediados por transportadores de transmem- brana expressados na superfície de células de raiz e outros tecidos vascula- res.

Um mecanismo utiliza o transporte de toxinas fora do citosol.

Por exem- plo, a família de bomba de S-conjugado de glutationa (GS-X) é uma classe de transportadores de cassete de ligação de ATP (ABC) que é responsável pela eliminação/sequestro de compostos em plantas assim como células mamiíferas, de levedura.

A estrutura molecular e função de bombas de GS-X codificadas por genes mamíferos e vegetais MRP, cMOAT (transportador de ânion multiespecífico canalicular), e YCF1 (fator de cádmio de levedura) pa-

recem ter sido conservadas por toda a evolução molecular.

Plantas são expostas a toxinas exógenas - tais como produtos —microbianos, aleloquímicos, agroquímicos e metais pesados - tornando a sobrevivência celular dependente de mecanismos para desintoxicar ou redu- zir o acúmulo destes agentes.

Metais pesados - tais como chumbo, cádmio, mercúrio e assim por diante - são os principais tóxicos ambientais, que cau- sam geração de espécie de oxidação reativa, dano ao DNA, e inativação enzimática ligante-se a sítios ativos de enzimas em células de organismos vivos.

A contaminação do ambiente com metais pesados tem aumentado drasticamente devido à industrialização e aumentos no tamanho da popula-

ção. Solos contaminados com metais pesados inibem o crescimento de plan- : ta normal e causam contaminação de gêneros alimentícios. Muitos metais . pesados são muito tóxicos à saúde humana e carcinogênicos em concentra- ções baixas.

A redução no teor de metais pesados - tais como cádmio - de plantas ou produtos vegetais consumidos por animais e seres humanos é altamente desejável e urgentemente necessária. É um objetivo da presente invenção satisfazer esta necessidade.

ASPECTOS E MODALIDADES DA INVENÇÃO “o Aspectos e modalidades da presente invenção são apresenta- E dos nas reivindicações anexas. Em um aspecto, é fornecido um polinucleotídeo isolado selecio- nado do grupo consistindo em: um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência tendo pelo menos 71% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 51; um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo ou consistindo es- sencialmente em uma sequência tendo pelo menos 65% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 3 a 23 ou 30 a 50 ou 53; um —polinucleotídeo que codifica um polipeptíideo de NtMRP compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência tendo pelo menos 65% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 24 a 26 ou 52, e preferivelmente, em que o polipeptídeo tem atividade de transportador de metal pesado.

Em um outro aspecto, é fornecido um constructo de polinucleoti- deo de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos em comprimento que é pelo menos 65% idêntico a uma região de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 23 ou 27 a 51.

Em um outro aspecto, é fornecido um ribopolinucleotídeo de fi- lamento duplo compreendendo pelo menos duas sequências que são pelo menos parcialmente complementares entre si e em que um filamento de sentido compreende uma primeira sequência e um filamento de antissentido

: í 3/136 compreende uma segunda sequência e em que pelo menos uma das se- ' quências compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de RNA de - NtMRP. Adequadamente, o RNA de filamento duplo compreende uma primeira sequência tendo pelo menos 65% de identidade de sequência a pelo menos 10 nucleotídeos de DNA de NtMRP; uma segunda sequência; e uma terceira sequência tendo uma sequência complementar reversa da pri- meira sequência, posicionada na mesma orientação como a primeira se- quência, em que a segunda sequência é posicionada entre a primeira se- o quência e a terceira sequência, e a segunda sequência é ligada de maneira E operável à primeira sequência e à terceira sequência.

: Adequadamente, a primeira sequência tem pelo menos 65% de identidade de sequência a uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:7, SEQID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35,SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 53. Adequadamente, a terceira sequência tem pelo menos 65% de identidade de sequência ao complemento reverso da sequência correspon- dente à SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ 1D NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQIDNO:21,SEQID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID

NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, : SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID . NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 53. Em um outro aspecto, é fornecido um vetor de expressão com- — preendendo o polinucleotídeo isolado ou o constructo de polinucleotídeo.

Em um outro aspecto, é fornecida uma célula vegetal mutante, que não ocorre naturalmente ou transgênica compreendendo o polinucleoti- deo isolado, o constructo de polinucleotídeo, o ribopolinucleotídeo de fila- mento duplo ou o vetor de expressão.

“o Em um outro aspecto, é fornecida uma planta mutante, que não AA ocorre naturalmente ou transgênica compreendendo a célula vegetal mutan- te, que não ocorre naturalmente ou transgênica. : Em um outro aspecto, é fornecido material vegetal incluindo bi- omassa, semente ou folhas compreendendo células ou tecido da dita planta. Em um outro aspecto, é fornecido um produto de tabaco com- preendendo uma parte da dita planta ou célula vegetal ou do dito material vegetal.

Em um outro aspecto, é fornecida uma planta mutante, que não ocorre naturalmente ou transgênica, em que a expressão do polinucleotídeo deNtMRP ea atividade da proteína codificada desse modo ou a atividade da proteina codificada desse modo são diminuídas e as folhas da dita planta têm uma redução no teor de cádmio de pelo menos 5% quando comparado a uma planta de controle em que a expressão de polinucleotídeo de NtMRP e a atividade da proteína codificada desse modo ou a atividade da proteína codificada desse modo não diminuíram.

Em um outro aspecto, é fornecida biomassa, semente ou folhas compreendendo tecido da planta.

Em um outro aspecto, é fornecido um método para reduzir níveis de cádmio em pelo menos uma parte de uma planta, compreendendo a eta- padereduzira expressão de polinucleotídeo de NIMRP e a atividade da pro- teina codificada desse modo ou a atividade da proteína codificada desse modo quando comparado a uma planta de controle em que a expressão de polinucleotídeo de NtMRP e a atividade da proteína codificada desse modo É ou a atividade da proteína codificada desse modo não diminuíram. . Em um outro aspecto, é fornecida uma planta mutante, que não ocorre naturalmente ou transgênica obtida ou obtenível pelo método descrito aqui, em que existe uma redução no teor de cádmio de pelo menos cerca de 5% em pelo menos uma parte da planta quando comparado a uma planta de controle em que a expressão de polinucleotídeo de NtMRP e a atividade da proteína codificada desse modo ou a atividade da proteína codificada desse modo não diminuíram.

ET Em um outro aspecto, é fornecido um polipeptídeo de NtMRP i- eo solado expressado pela sequência apresentada em qualquer uma das SEQ . ID NOs: 24 a 26 ou SEQ ID NOs: 52, preferivelmente, em que o polipeptídeo tem atividade de transportador de metal pesado.

Em um outro aspecto, é fornecido um anticorpo que especifica- mente liga-se ao polipeptídeo isolado.

Em um outro aspecto, é fornecido um método de detectar um polinucleotídeo de NIMRP em uma amostra compreendendo a etapa de: (a) fornecer uma amostra compreendendo um polinucleotídeo; (b) contatar a dita amostra com um de mais iniciadores ou uma ou mais sondas para de- tectar especificamente pelo menos uma porção de polinucleotídeo de Nt- MRFP; e (c) detectar a presença de um produto de amplificação, em que a presença de um produto de amplificação é indicativa da presença do polinu- cleotídeo de NtMRP na amostra.

Outros aspectos da presente invenção são apresentados abaixo.

Um gene quimérico compreendendo o polinucleotídeo isolado |i- gado de maneira operável a uma ou mais sequências reguladoras.

Um constructo de polinucleotídeo ou um RNA de filamento duplo de acordo com a presente invenção, em que o polinucleotideo compreende, consiste ou consiste essencialmente em pelo menos 15 a 30 nucleotídeos, 30a50 nucleotídeos, 50 a 100 nucleotídeos, 100 a 150 nucleotídeos, 150 a 200 nucleotídeos, 200 a 300 nucleotídeos, 300 a 400 nucleotídeos, 400 a 500 nucleotídeos, 500 a 600 nucleotídeos ou 600 a 700 nucleotídeos.

Um conjugado compreendendo o polinucleotídeo isolado, o gene quimérico, o constructo de polinucleotídeo, ou o RNA de filamento duplo de . acordo com a presente invenção e pelo menos uma porção que não de nu- cleotídeo ou que não de polinucleotídeo covalentemente ligada a este.

Uma célula vegetal mutante, que não ocorre naturalmente ou transgênica compreendendo o polinucleotídeo isolado, o gene quimérico, o constructo de polinucleotídeo, o RNA de filamento duplo, o conjugado ou o vetor de expressão de acordo com a presente invenção.

: Uma planta mutante, que não ocorre naturalmente ou transgêni- ca compreendendo a célula vegetal mutante, que não ocorre naturalmente o ou transgênica de acordo com a presente invenção. : Adequadamente, a biomassa seca de folhas coletadas é cerca da mesma como a planta de controle. Biomassa, semente ou folhas compreendendo tecido da planta da presente invenção.

Um produto consumível incorporando ou utilizando biomassa, semente ou folhas de acordo com a presente invenção.

Biomassa, semente ou folhas de acordo com a presente inven- ção ou um produto consumível de acordo com a presente invenção, em que existe uma redução no teor de cádmio de pelo menos cerca de 5% neste quando comparado à biomassa, semente ou folhas de uma planta de contro- le em que a expressão de polinucleotídeo de NtMRP e a atividade da proteí- na codificada desse modo ou a atividade da proteína codificada desse modo não diminuíram.

Uma linhagem de célula compreendendo o polinucleotídeo iso- lado, o gene quimérico, o constructo de polinucleotídeo, o RNA de filamento duplo, o conjugado ou o vetor de expressão de acordo com a presente in- venção.

Um método para preparar uma planta mutante, que não ocorre naturalmente ou transgênica compreendendo a etapa de reduzir a expressão de polinucleotídeo de NtMRP e a atividade da proteína codificada desse mo- do ou a atividade da proteina codificada desse modo em pelo menos uma

: parte da dita planta quando comparado a uma planta de controle em que a expressão do polinucleotídeo de NtMRP e a atividade da proteína codificada .: desse modo ou a atividade da proteína codificada desse modo não diminuí- ram.

Um método para reduzir níveis de cádmio em pelo menos uma parte de uma planta, compreendendo a etapa de reduzir a expressão do po- linucleotídeo de NtMRP e a atividade da proteína codificada desse modo ou a atividade da proteína codificada desse modo quando comparado a uma - planta de controle em que a expressão do polinucleotídeo de NtMRP e a atividade da proteína codificada desse modo ou a atividade da proteína codi- Ee ficada desse modo não diminuíram.

. Adequadamente, o dito método compreende a primeira etapa de contatar a dita planta com o constructo de polinucleotídeo, o RNA de fila- mento duplo, o conjugado, o vetor de expressão, uma meganuclease, ou uma proteína dedo de zinco.

Adequadamente, o dito método compreende a etapa primária ou adicional de contatar a dita planta com um agente mutagênico.

Uma planta mutante, que não ocorre naturalmente ou transgêni- ca obtida ou obtenível pelos métodos da presente invenção, em que existe uma redução no teor de cádmio de pelo menos cerca de 5% em pelo menos uma parte da planta quando comparado a uma planta de controle em que a expressão do polinucleotídeo de NtMRP e a atividade da proteína codificada desse modo ou a atividade da proteína codificada desse modo não diminuí- ram.

Um método para modular (por exemplo, reduzir ou inibir) a ex- pressão do polinucleotíideo de NtMRP ou a atividade da proteína codificada desse modo em uma célula, o dito método compreendendo administrar o gene quimérico, o constructo de polinucleotídeo, o RNA de filamento duplo, o conjugado ou o vetor de expressão de acordo com a presente invenção.

Um método para detectar, isolar, ampliar ou analisar o polinucle- otídeo de NtMRP, o método compreendendo a etapa de fornecer uma amos- tra compreendendo polinucleotídeo e hibridizar o dito polinucleotídeo a uma

: molécula de polinucleotideo compreendendo uma sequência de nucleotideo de pelo menos 10 nucleotídeos contíguos da sequência de nucleotídeo iso- - lada de acordo com a presente invenção. Uso do agente que modula (por exemplo, reduz ou inibe) a ex- pressão do polinucleotideo de NtMRP e a atividade da proteína codificada desse modo ou a atividade da proteína codificada desse modo para reduzir o teor de cádmio em pelo menos uma parte de uma planta em pelo menos 5% quando comparado a uma planta de controle em que a expressão do polinu- cleotídeo de NtMRP e a atividade da proteína codificada desse modo ou a atividade da proteína codificada desse modo não diminuíram. O método ou o a uso de acordo com a presente invenção, em que o agente é ou é derivado : de polinucleotídeo de NtIMRP, um gene de NtMRP quimérico, um constructo de polinucleotídeo compreendendo polinucleotídeo de NtIMRP, um RNA an- tissentido, um RNA de filamento duplo, um cDNA, um conjugado compreen- —dendo polinucleotídeo de NtMRP e pelo menos uma porção que não de nu- cleotídeo ou que não de polinucleotídeo covalentemente ligada a este, uma ribozima, um agente mutagênico, um dedo de zinco, uma molécula pequena ou uma meganuclease. Em um outro aspecto, é fornecido um método de produzir um — produto de tabaco compreendendo as etapas de: (a) obter semente da plan- ta de tabaco mutante, que não ocorre naturalmente ou transgênica; (b) plan- tar e cultivar a semente em uma planta; (c) colher a planta; e (d) preparar um produto de tabaco a partir da planta colhida. As modalidades mencionadas acima são divulgadas como mo- —dalidades de cada um dos aspectos descritos acima.

ALGUMAS VANTAGENS Produzir plantas mutantes, que não ocorrem naturalmente ou transgênicas (incluindo biomassa, semente e folhas obtidas destas) em que quantidades mais baixas de cádmio estão presentes fornece várias vanta- gens. Por via de exemplo, as plantas, incluindo plantas mutantes, que não ocorrem naturalmente ou transgênicas, podem ser cultivadas em solos contendo concentrações de cádmio variáveis, ou em solos contendo menos concentrações de cádmio do que desejável. Estas plantas e sementes deri- - vadas podem fornecer mais opções para cultivá-las em uma faixa mais am- pla de ambientes terrestres, que podem aumentar a quantidade de solos — cultiváveis disponíveis aos profissionais (por exemplo, fazendeiros).

Por via de outro exemplo, as plantas mutantes, que não ocorrem naturalmente ou transgênicas (incluindo biomassa, semente e folhas obtidas destas) exibem teor de cádmio reduzido, comparado às contrapartes de con- . trole e podem ser consumidas diretamente como produtos comestíveis. O consumo destes produtos comestíveis pode ser uma opção mais saudável. de Plantas adequadas que podem ser manipuladas de acordo com os métodos divulgados incluem plantas cultiváveis para uso agrícola, incluindo tabaco, arroz, milho, abóbora, soja, alface, batatas, beterrabas, ervas, trigo, cevada e cenouras, etc.

Por via de outro exemplo, a altura e/ou peso das plantas mutan- tes, que não ocorrem naturalmente ou transgênicas são substancialmente os mesmos como as plantas de controle. Assim, nenhuma diferença significante é encontrada em folhas secas coletadas das plantas quando comparado a um controle assim indicando que a modulação de transcritos de NIMRP não têm nenhum efeito estatisticamente relevante sobre a biomassa seca. Isto é vantajoso porque plantas são usadas para a produção comercial de vários produtos incluindo tabaco onde alterações na aparência visual não seriam aceitáveis à indústria ou poderiam resultar em rendimentos de produção ina- ceitavelmente reduzidos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1. A Figura 1(a) é um diagrama esquemático do loco de NtMRP4; a Figura 1(b) mostra a sequência de nucleotídeo de NIMRP4 em que as regiões UTR 5' e 3' são sublinhadas; éxons são mostrados em letras maiúsculas e em negrito; íntrons são mostrados em letra minúscula e nor- —mal;ecódons de inícioe parada são mostrados em cinza. As sequências de iniciadores 5' e 3' para a geração de uma sequência de RNAi de NtMRP4 são indicadas em itálico e tachado.

A Figura 2 ilustra a expressão de polinucleotídeo de NtIMRP4 du- É rante o tratamento com cádmio sob condições hidropônicas por 7 dias. Mu- . das de KY14 de três semanas foram tratadas com O, 0,05 e 0,5 de CdCl? (a) e plântulas de N. rustica e N. tabacum (TN90) de 4 semanas foram tratadas comb0O,5micro.M de CdCl; por uma semana (b). O RNA foi isolado e subme- tido a RT-PCR semi-quantitativa. A Figura 3 ilustra a redução de cádmio nas folhas nas linhagens 1 e 2 de linhagens de RNAi de NtMRP4 comparado a plantas cultivadas no : campo do tipo selvagem.

A Figura 4 mostra a redução de cádmio na folha para duas |i- . nhagens cultivadas de RNAi de NtMRP4. Neste experimento um controle . vetorial sem uma inserção de NtMRP4 foi adicionado. A Figura 5 mostra a estrutura de íntron-éxon e localização de in- trons e éxons ao longo da sequência de clone BAC de NtPMI-BAC- GOTOWE 5 gDNA genômico transpondo a região de codificação de Nt- MRPA4. A homologia da sequência de cDNA (filamento superior de 1 a 4.521 pares de base) e sequência de clone BAC genômica compreendendo a regi- ão de codificação de MRP4 (filamento inferior de 61.781 a 69.748 pares de base) é 100%.

A Figura 6 mostra a sequência de nucleotideo de NIMRP3 em que as regiões UTR 5' e 3' são impressas em itálico; éxons são mostrados em letras maiúsculas e em negrito; íntrons são mostrados em letra minúscu- la e normal; e códons de início e parada são mostrados em letras maiúscu- las, em negrito e impressas em itálico.

DEFINIÇÕES Os termos técnicos e expressões usados dentro do escopo des- te pedido geralmente devem ser fornecidos para o significado comumente aplicado a eles na técnica pertinente de botânica e biologia molecular. Todas as definições de termos seguintes aplicam-se ao conteúdo completo deste — pedido. A palavra "compreendendo" não exclui outros elementos ou etapas, e o artigo indefinido "um" ou "uma" não exclui uma pluralidade. Uma etapa única pode satisfazer as funções de vários aspectos relatados nas reivindi-

cações. Os termos "essencialmente", "cerca de", "aproximadamente" e se- melhantes em relação a um atributo ou um valor particularmente também . definem exatamente o atributo ou exatamente o valor, respectivamente. O termo "cerca de" no contexto de um valor ou faixa numérico dado refere-se a um valor ou faixa que está dentro de 20%, dentro de 10%, ou dentro de 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% do valor ou faixa dado.

Um 'polinucleotídeo' refere-se a um polímero de nucleotídeos, que pode ser desoxirribopolinucleotídeo (DNA) ou ribopolinucleotídeo (RNA) . não modificados ou modificados. Consequentemente, um polinucleotídeo pode ser, sem limitação, um DNA genômico, DNA complementar (CDNA) e (por exemplo, SEQ ID NO: 27), MRNA, ou RNA antissentido. Além disso, um polinucleotídeo pode ser DNA de filamento único ou de filamento duplo, o DNA que é uma mistura de regiões de filamento único e de filamento duplo, uma molécula híbrida compreendendo DNA e RNA, ou uma molécula híbrida com uma mistura de regiões de filamento único e de filamento duplo. Além disso, o polinucleotíideo pode ser composto de regiões de filamento triplo compreendendo DNA, RNA, ou ambos. Um polinucleotídeo pode conter uma ou mais bases modificadas, tais como fosfotioatos, e pode ser um polinucle- otídeo peptídico (PNA). Geralmente, polinucleotídeos descritos aqui podem sermontados de fragmentos isolados ou clonados de cDNA, DNA genômico, oligonucleotídeos, ou nucleotídeos individuais, ou uma combinação do pre- cedente. Embora as sequências de polinucleotídeo descritas aqui sejam mostradas como sequências de DNA, as sequências incluem suas sequên- cias de RNA correspondentes, e suas sequências de DNA ou RNA comple- —mentares (por exemplo, completamente complementares), incluindo os com- plementos reversos destas.

O termo 'polinucleotideo de NtMRP' abrange polinucleotídeos em que um polímero de nucleotídeos compreende, consiste ou consiste es- sencialmente na sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 1, 2, 27, 28, 29 ou51.Estetermo também abrange uma sequência de polinucleotídeo com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou identidade substancial às SEQ ID NOs: 1, 2, 27, 28, 29 ou 51; fragmentos das SEQ ID

. NOs: 1, 2, 27, 28, 29 ou 51; e fragmentos das SEQ ID NOs: 1, 2, 27, 28, 29 ou 51 com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou iden- - tidade substancial à esta. A variante pode ter pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%. 98% ou 99% de identidade de sequência à sequência do gene de NtMRP isolado - tal como o gene de NtMRP3 ou o gene de NtMRP4. Embora as sequências de polinucleotideo de NIMRP des- critas aqui sejam mostradas como sequências de DNA, as sequências inclu- - em suas sequências de RNA correspondentes, e suas sequências de DNA ou RNA complementares (por exemplo, completamente complementares), e incluindo o(s) complemento(s) reverso(s) destas e sequências de DNA ou . RNA antissentido. Fragmentos exemplares são apresentados nas SEQ ID NOs: 3a 23e30a50e53.

O termo "polinucleotíideo de NtMRP3" refere-se a uma modali- dadeem que um polímero de nucleotídeos compreende, consiste ou consis- te essencialmente em um polinucleotídeo designado aqui como SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 51. O termo abrange variantes de po- linucleotídeo com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou identidade substancial à SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 51;fragmentos das SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 51; e fragmentos das SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 51 com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou identidade substancial à esta. Como descrito aqui, a variante pode ter pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à sequência do gene de NtMRP3 isolado. Fragmentos exempla- res são apresentados nas SEQ ID NOs: 30 a 50. O termo "polinucleotídeo de NtMRP4" refere-se a uma modali- dade em que um polímero de nucleotídeos compreende, consiste ou consis- te essencialmente em um polinucleotídeo designado aqui como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 27. O termo abrange variantes de poli- nucleotídeo com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência)

ou identidade substancial à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 27; fragmentos das SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 27; e : fragmentos das SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NQ: 27 com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou identidade substancial à esta. A variante pode ter pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à se- quência do gene de NtMRP3 isolado. Fragmentos exemplares são apresen- . tados nas SEQ ID NOs: 3 a 23 e 53. 1o O termo "polipeptíideo de NtMRP" refere-se a um polipeptídeo - compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma se- > quência de aminoácido que tem homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou identidade substancial às SEQ ID NOs: 24 a 26 e 52; fragmentos das SEQ ID NOs: 24 a 26 e 52; e fragmentos das SEQ ID NOs: 24a26e52 com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou identidade substancial à esta. Os polipeptídeos de NtMRP incluem frag- mentos e sequências compreendendo um grau suficiente ou substancial de identidade ou similaridade às SEQ ID NOs: 24 a 26 e 52 que podem funcio- nar transportando-se metais pesados (por exemplo, cádmio) através de “membranas celulares. polipeptídeos de NtMRP também incluem variantes ou mutantes produzidos introduzindo-se qualquer tipo de alterações (por e- xemplo, inserções, supressões, ou substituições de aminoácidos; mudanças em estados de glicosilação; mudanças que afetam a redobra ou isomeriza- ções, estruturas tridimensionais, ou estados de auto-associação), que po- dem ser deliberadamente engendrados ou isolados naturalmente. Polipepti- deos de NtMRP podem estar na forma linear ou ser ciclizados usando méto- dos conhecidos. A variante pode ter pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%,70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade à sequência do polipepti- deodeNtMRP4.

O termo "polipeptídeo de NtMRP3" refere-se a uma modalidade em que o polipeptídeo compreende, consiste ou consiste essencialmente na

. sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 52 ou a um polipeptídeo compre- endendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência de aminoácido com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou identidade substancial a NOs: 52; fragmentos da SEQ ID NO: 52; e frag- —mentos da SEQ ID NO: 52 com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou identidade substancial à esta. Os polipeptídeos de Nt- MRP3 incluem fragmentos e sequências compreendendo um grau suficiente ou substancial de identidade ou similaridade à SEQ ID NO: 52 que podem . funcionar transportando-se metais pesados (por exemplo, cádmio) através de membranas celulares. Polipeptídeos de NtMRP3 também incluem varian- O tes ou mutantes produzidos introduzindo-se qualquer tipo de alterações (por . exemplo, inserções, supressões, ou substituições de aminoácidos; mudan- ças em estados de glicosilação; mudanças que afetam a redobra ou isomeri- zações, estruturas tridimensionais, ou estados de auto-associação), que po- dem ser deliberadamente engendrados ou isolados naturalmente. Polipepti- deos de NtMRP3 podem estar na forma linear ou ser ciclizados usando mé- todos conhecidos. Como descrito aqui, a variante pode ter pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade à sequência do polipeptídeo de NtMRP3.

O termo "polipeptídeo de NtIMRP4" refere-se a uma modalidade em que o polipeptídeo compreende, consiste ou consiste essencialmente na sequência apresentada em SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, ou SEQ ID NO: 26 ou a um polipeptídeo compreendendo, consistindo ou consistindo essen- —cialmente em uma sequência de aminoácido com homologia substancial (is- to é, similaridade de sequência) ou identidade substancial à SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, ou SEQ ID NO: 26; fragmentos da SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, ou SEQ ID NO: 26; e fragmentos da SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, ou SEQ ID NO: 26 com homologia substancial (isto é, similaridade de sequência) ou identidade substancial à esta. Os polipeptídeos de NtMRP4 incluem fragmentos e sequências compreendendo um grau suficiente ou substancial de identidade ou similaridade às SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO:

25, ou SEQ ID NO: 26 que podem funcionar transportando-se metais pesa- é dos (por exemplo, cádmio) através de membranas celulares. Polipeptídeos É de NtMRP4 também incluem variantes ou mutantes produzidos introduzindo- se qualquer tipo de alterações (por exemplo, inserções, supressões, ou substituições de aminoácidos; mudanças em estados de glicosilação; mu- danças que afetam a redobra ou isomerizações, estruturas tridimensionais, ou estados de auto-associação), que podem ser deliberadamente engendra- dos ou isolados naturalmente. Polipeptídeos de NIMRP4 podem estar na : forma linear ou ser ciclizados usando métodos conhecidos. Como descrito aqui, a variante pode ter pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, ' 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade à sequência do polipeptídeo de Nt- : MRP4.

O termo 'isolado' significa uma entidade que é tomada de seu ambiente natural, mas o termo não conota qualquer grau de purificação. 'Sequência genética' refere-se à sequência de nucleotídeo de uma molécula de polinucleotídeo ou polinucleotídeo que codifica um polipep- tídeo ou um RNA biologicamente ativo, e abrange a sequência de nucleotí- deo de uma sequência de codificação parcial que apenas codifica um frag- mentode uma proteína.

O termo 'vetor' refere-se a um veículo de polinucleotídeo que compreende uma combinação de componentes de polinucleotídeo para permitir o transporte de polinucleotídeo, constructos de polinucleotídeo e conjugados de polinucleotídeo e semelhantes. Vetores adequados incluem epissomas capazes de replicação extra-cromossômica tais como plasmídeos de polinucleotídeo de filamento duplo, circulares; plasmídeos de polinucleo- tídeo de filamento duplo linearizados; e outros vetores de qualquer origem. 'Vetor de expressão' refere-se a um veículo de polinucleotídeo que compre- ende uma combinação de componentes de polinucleotídeo para permitir a expressão de polinucleotídeo, constructos de polinucleotídeo e conjugados de polinucleotídeo e semelhantes. Vetores de expressão adequados incluem epissomas capazes de replicação extra-cromossômica tais como plasmídeos

: de polinucleotídeo de filamento duplo, circulares; plasmídeos de polinucleo- tídeo de filamento duplo linearizados; e outros vetores de expressão funcio- . nalmente equivalentes de qualquer origem. Um vetor de expressão compre- ende pelo menos um promotor posicionado a montante e ligado de maneira —operávela um polinucleotídeo, constructos de polinucleotídeo ou conjugado de polinucleotídeo, como definido abaixo. Um 'constructo' refere-se a um fragmento de polinucleotídeo re- combinante, de filamento duplo compreendendo um ou mais polinucleotí- : deos de NtMRP. O constructo compreende um "filamento padrão" pareado em base com um "filamento de sentido ou codificação" complementar. Um : constructo dada pode ser inserida em um vetor em duas orientações possí- veis, na mesma orientação (ou sentido) ou na orientação reversa (ou antis- : sentido) com respeito à orientação de um promotor posicionado dentro de um vetor - tal como um vetor de expressão.

1 O termo "conjugado" refere-se a um composto formado pela |i- gação covalente ("conjugação") de um polinucleotídeo a uma ou mais por- ções que não são por si só polinucleotídeos ou monômeros ("porções conju- gadas").

'Filamento padrão' refere-se ao filamento compreendendo uma sequência que complementa aquela do "filamento de sentido ou codificação" de um dúplex de polinucleotídeo, tal como um fragmento genômico de Nt- MRP, cDNA de NtMRP, ou constructo de NtMRP, ou qualquer fragmento de polinucleotídeo compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que pode ser transcrita pela RNA polimerase. Durante a transcrição, RNA polimerase — pode deslocar ao longo do filamento padrão na direção 3' a 5' durante a sin- tese de RNA nascente. 'Filamento de sentido' é usado permutavelmente aqui com o termo "filamento de codificação" e refere-se ao filamento compreen- dendo uma sequência que complementa aquela do filamento padrão em um dúplex de DNA. Por exemplo, a sequência do filamento de sentido ("sequên- ciade sentido”) para o clone genômico de NtMRP identificado é designada como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Por exemplo, se o filamento de senti- do compreende uma sequência hipotética 5-TAATCCGGT-3', então a se-

. quência substancialmente idêntica correspondente dentro de um mRNA alvo hipotético é -UAAUCCGGU-3". - 'Sequência complementar reversa' refere-se à sequência que complementa a "sequência de sentido" de interesse (por exemplo, sequência deéxon) posicionada dentro do mesmo filamento, na mesma orientação com respeito à sequência de sentido.

Por exemplo, se um filamento compreende uma sequência hipotética 5-TAATCCGGT-3', então a sequência comple- mentar reversa 5-ACCGGATTA-3' pode ser ligada de maneira operável à . sequência de sentido, separada por uma sequência espaçadora. 'NtMRP', 'NtMRP3' ou 'transcrito de RNA de NtMRP4' inclui mo- - léculas de polirribopolinucleotídeo produzidas dentro de uma célula vegetal hospedeira de interesse, resultante da transcrição do gene ou cDNA de Nt- MRP3 ou NtMRP4 endógeno como descrito aqui.

Assim, o termo inclui quaisquer espécies de RNA ou variantes de RNA produzidas como produtos transcricionais de NIMRP3 ou NtIMRP4 ou RNA de NtMRP3 ou NtMRPA4 in- cluindo aquelas espécies de RNA ou variantes de RNA que têm similaridade suficiente em níveis estruturais/funcionais.

Por exemplo, transcritos de Nt- MRP3 ou RNA de NtMRP3 incluem, mas não são limitados a: (1) pré- MRNAs e mRNAs produzidos da transcrição do NIMRP3 ou gene ou cCDONA de NtMRP3 isolado; (2) pré-mRNAs e mRNAs produzidos da transcrição de quaisquer genes tendo pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência do gene de NtMRP3 isolado (isto é, outros genes distintos substancialmente idênticos ao gene de NtMRP3 identificado e que codifica isoformas relacio- nadas de transportadores de ABC); e (3) pré-mRNAs e mRNAs produzidos da transcrição de alelos do gene de NtMRP3. Os transcritos de RNA de Nt- MRP3 incluem variantes de RNA produzidas como um resultado de reações de splicing de RNA alternativas de RNAs heteronucleares ("hnRNAs") de um gene particular, variantes de mMRNA resultantes de tais reações de splicing de RNA alternativas, e quaisquer variantes de RNA intermediárias.

Por via de outro exemplo, transcritos de NIMRP4 ou RNA de

: NtMRP4 incluem: (1) pré-mRNAs e mRNAs produzidos da transcrição do NtMRP4 ou gene de NtMRP4 ou cDNA isolado, como descrito aqui; (2) pré- . MRNAs e mRNAs produzidos da transcrição de quaisquer genes tendo pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72% 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% ou mais de identidade de sequência à sequência do gene de NtMRP4 isolado (isto é, outros genes distintos substancialmente idênticos ao gene de NtMRP4 identificado e que codifica isoformas relacionadas de transportado- Á res de ABC); e (3) pré-mRNAs e mRNAs produzidos da transcrição de alelos dogene de NtMRP ou NtMRP4. Os transcritos de RNA de NtMRP e NtMRP4 Ao incluem variantes de RNA produzidas como um resultado de reações de s- plicing de RNA alternativas de RNAs heteronucleares ("hnRNAs") de um ge- ne particular, variantes de mRNA resultantes de tais reações de splicing de RNA alternativas, e quaisquer variantes de RNA intermediárias.

'Homologia', 'identidade' ou 'similaridade' refere-se ao grau de similaridade de sequência entre dois polipeptídeos ou entre duas moléculas de polinucleotideo comparadas por alinhamento de sequência. O grau de homologia entre duas sequências de polinucleotídeo separadas sendo com- paradas é uma função do número de nucleotídeos idênticos, ou complemen- tares em posições comparáveis. O grau de similaridade expressado em ter- mos de porcentagem de identidade pode ser determinado por inspeção vi- sual e cálculo matemático. Alternativamente, a porcentagem de identidade de duas sequências de polinucleotídeo pode ser determinada comparando- se a informação de sequência usando o programa de computador GAP, ver- são6.0 descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) e dispo- nível da University of Wisconsin Genetic Computer Group (UWGCG), Clus- talW, BLAST, FASTA ou Smith-Waterman. Parâmetros predefinidos típicos para o programa GAP incluem: (1) uma matriz de comparação unária (con- tendo um valor de 1 para identidades e O para não-identidades) para nucleo- tídeos, e a matriz de comparação ponderada de Gribskov e Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, como descrito por Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundati-

: on, páginas 353 a 358, 1979; (2) uma penalidade de 3,0 para cada intervalo e uma penalidade de 0,10 adicional para cada símbolo em cada intervalo; e - (3) nenhuma penalidade para intervalos finais. Vários programas conhecidos a pessoas habilitadas na técnica de comparação de sequência podem ser alternativamente utilizados.

O termo "a montante" refere-se a uma direção/posição relativas com respeito a um elemento de referência ao longo de uma sequência de polinucleotídeo linear, que indica uma direção/posição para a extremidade 5' : da sequência de polinucleotídeo. "A montante" pode ser usado permutavel- mente com a extremidade "5' de um elemento de referência.” a 'Ligado de maneira operável' refere-se à união de elementos de polinucleotídeo, fragmentos, ou sequências distintos para produzir uma uni- dade transcricional funcional ou um vetor de expressão funcional.

Um 'promotor' refere-se a um elemento/sequência de polinucleo- tídeo, tipicamente posicionado a montante e ligado de maneira operável a um fragmento de DNA de filamento duplo - tal como um constructo de RNAi de NtMRP. Por exemplo, um promotor adequado permite que a ativação transcricional de um constructo de RNAi de NtMRP recrutando-se o comple- xo transcricional, incluindo a RNA polimerase e vários fatores, inicie a sínte- sede RNA. Promotores podem ser derivados inteiramente de regiões próxi- mas a um gene nativo de interesse, ou podem ser compostos de elementos diferentes derivados de diferentes promotores nativos ou segmentos de DNA sintéticos.

Um 'realçador' refere-se a uma molécula de polinucleotídeo, ou uma sequência de polinucleotídeo, que pode recrutar proteínas reguladoras transcricionais tais como ativadores transcricionais, para realçar a ativação transcricional aumentando-se a atividade do promotor. Realçadores adequa- dos podem ser derivados de regiões próximas a um promotor nativo de inte- resse (fontes homólogas) ou podem ser derivados de contextos não nativos (fontes heterólogas) e ligados de maneira operável a qualquer promotor de interesse dentro de constructos de NIMRP - tais como vetores de expressão de RNAi - para realçar a atividade ou a especificidade em tecido de um pro- Ft

: motor.

Alguns realçadores podem operar em qualquer orientação com res- peito à orientação de uma unidade de transcrição.

Por exemplo, realçadores - podem ser posicionados a montante ou a jusante de uma unidade transcri- cional compreendendo um promotor e um constructo de NtMRP.

Como usado aqui, o termo 'planta' refere-se a qualquer planta em qualquer estágio de seu ciclo de vida ou desenvolvimento, e sua progê- nie.

Em uma modalidade, a planta é uma planta de tabaco, que refere-se a uma planta pertencendo ao gênero Nicotiana.

Espécies, cultivares, híbridos, é e variedades preferidos de planta de tabaco são descritos aqui.

O termo 'célula vegetal' refere-se a uma unidade estrutural e fisi- NS ológica de uma planta.

A célula vegetal pode estar na forma de um proto- plasta sem uma parede celular, uma célula única isolada ou uma célula culti- vada, ou como um parte de unidade organizada superior tal como mas não limitada a, tecido da planta, um órgão da planta, ou uma planta integral. 'Ma- terial vegetal' refere-se a qualquer composição sólida, líquida ou gasosa, ou uma combinação destas, obtenível de uma planta, incluindo biomassa, fo- lhas, limbo da folha, nervura central, caules, raízes, flores ou partes da flor, frutas, pólen, óvulos, zigotos, sementes, mudas, secreções, extratos, cultu- ras celulares ou teciduais, ou quaisquer outras partes ou produtos de uma planta.

Em uma modalidade, o material vegetal compreende ou consiste em biomassa, semente ou folhas.

Em uma outra modalidade, o material vegetal compreende ou consiste em folhas.

O termo "variedade" refere-se a uma população de plantas que compartilham características constantes que as separam de outras plantas das mesmas espécies.

Embora possuindo uma ou mais traços distintivos, uma variedade é caracterizada ainda por uma variação global muito peque- na entre indivíduos dentro desta variedade.

Uma variedade é frequentemen- te vendida comercialmente.

O termo "linhagem" ou "linhagem de reprodução" denota um grupo de plantas que são usadas durante a reprodução da planta.

Uma |i- nhagem é distinguível de uma variedade visto que ela exibe pouca variação entre indivíduos para um ou mais traços de interesse, embora possa haver alguma variação entre indivíduos para outros traços. O termo "reduz" ou "re- duzido" refere-se a uma redução de cerca de 10% a cerca de 99%, ou uma .: redução de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo me- nos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou pelo menos 100%, 200% ou 300% ou mais de uma quantidade ou uma atividade, tal como mas não limi- tada à atividade de polipeptídeo, atividade transcricional, e/ou expressão de . proteína.

O termo "inibir" ou "inibido" como usado aqui, refere-se a uma o redução de cerca de 98% a cerca de 100%, ou uma redução de pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas particularmente de 100%, de uma quantidade i ou uma atividade, tal como mas não limitada à atividade de polipeptídeo, atividade transcricional, e/ou expressão de proteina.

O termo "aumentar" ou "aumentado" refere-se a um aumento de cerca de 10% a cerca de 99%, ou um aumento de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo me- nos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou pelo menos 100%, 200% ou 300% ou mais de uma quantidade ou uma atividade, tal como mas não limitada à atividade de polipeptídeo, ativi- dade transcricional, e/ou expressão de proteína.

O termo "controle" no contexto de uma planta de controle ou cé- lulas vegetais de controle significa uma planta ou células vegetais em que a expressão ou atividade de um gene ou proteína particular - tal como NtMRP - não foi modificada (por exemplo, aumentada ou reduzida) e deste modo pode-se fornecer uma comparação com uma planta em que a expressão ou atividade de um gene ou proteína particular - tal como NtMRP - foi modifica- da. A planta de controle pode compreender um vetor vazio. A planta de con- trole pode corresponder a uma planta do tipo selvagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA Polinucleotídeos e polipeptídeos de NtMRP são descritos aqui

. incluindo polinucleotídeos e polipeptídeos de NIMRP3 e NtMRP4. Como mostrado na Figura 6, o clone genômico de NtMRP3, designado como SEQ : ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29 compreende: íntron 1 (SEQ ID NO: 30), íntron 2 (SEQ ID NO: 31), íntron 3 (SEQ ID NO: 32), íntron 4 (SEQ ID NO: 33), in- tron5(SEQID NO: 34), íntron 6 (SEQ ID NO: 35), íntron 7 (SEQ ID NO: 36), íntron 8 (SEQ ID NO: 37), íntron 9 (SEQ ID NO: 38), íntron 10 (SEQ ID NO: 39), éxon 1 (SEQ ID NO: 40), éxon 2 (SEQ ID NO: 41), éxon 3 (SEQ ID NO: 42), éxon 4 (SEQ ID NO: 43), éxon 5 (SEQ ID NO: 44), éxon 6 (SEQ ID NO: : 45), éxon 7 (SEQ ID NO: 46), éxon 8 (SEQ ID NO: 47), éxon 9 (SEQ ID NO: 48), éxon10(SEQID NO: 49) e éxon 11 (SEQ ID NO: 50). - Várias modalidades são dirigidas a polinucleotídeos isolados re- presentando fragmentos genômicos isolados no loco de NtMRP3, compre- endendo SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29, fragmentos da SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29, ou variantes destas.

Várias modalidades são dirigidas a polinucleotídeos isolados re- presentando as sequências de cDNA do loco de NtMRP3, compreendendo SEQ ID NO: 51, fragmentos da SEQ ID NO: 51, ou variantes destas.

Várias modalidades são dirigidas ao polinucleotídeo isolado de variantes de NIMRP compreendendo pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29, ou fragmentos da SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29. Várias modalidades são dirigidas a polinucleotídeos isolados que comple- mentam aquela de variantes de polinucleotídeo de NIMRP compreendendo pelo menos 71%, 72%, 73%, 74% 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 51 ou fragmentos da SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 51. Várias modalidades são dirigidas a polinucleotídeos isolados que podem especificamente hibridizar, sob condições moderadas a altamente severas, a polinucleotíideos compreendendo SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 51, ou fragmentos da SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 51.

. Como mostrado na Figura 1, o clone genômico de NtMRPA4, de- signado como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 compreende: íntron 1 (SEQ - ID NO: 3), íntron 2 (SEQ ID NO: 4), íntron 3 (SEQ ID NO: 5), íntron 4 (SEQ ID NO: 6), íntron 5 (SEQ ID NO: 7), íntron 6 (SEQ ID NO: 8), íntron 7 (SEQ IDNO:S9), íntron 8 (SEQ ID NO: 10), íntron 9 (SEQ ID NO: 11), íntron 10 (SEQ ID NO: 12), éxon 1 (SEQ ID NO: 13), éxon 2 (SEQ ID NO: 14), éxon 3 (SEQ ID NO: 15), éxon 4 (SEQ ID NO: 16), éxon 5 (SEQ ID NO: 17), éxon 6 (SEQ ID NO: 18), éxon 7 (SEQ ID NO: 19), éxon 8 (SEQ ID NO: 20), éxon 9 : (SEQ ID NO: 21), éxon 10 (SEQ ID NO: 22) e éxon 11 (SEQ ID NO: 53) ou SEQIDNO:23. E Várias modalidades são dirigidas a polinucleotídeos isolados re- presentando fragmentos genômicos isolados no loco de NtMRP4, compre- endendo SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, fragmentos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, ou variantes destas.

Várias modalidades são dirigidas ao cDNA isolado compreen- dendo SEQ ID NO: 27, fragmentos da SEQ ID NO: 27, ou variantes destas.

Várias modalidades são dirigidas a variantes de polinucleotídeo de NtMRP isoladas compreendendo pelo menos 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de se- —quência à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 27, ou fragmen- tos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 27. Várias modalidades são dirigidas a polinucleotídeos isolados que complementam variantes de polinucleotídeo de NIMRP compreendendo pelo menos 71%, 72%, 73%, 74% 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 27 ou fragmentos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 27 Várias modalidades são dirigidas a polinucleotídeos isolados que podem especificamente hibridizar, sob condições moderadas a altamente severas, a polinucleotídeos compreendendo SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 27, ou fragmentos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 27.

; Um polinucleotídeo como descrito aqui geralmente conterá liga- ções de fosfodiéster, embora em alguns casos, análogos de polinucleotídeo : são incluídos que podem ter estruturas principais alternadas, compreenden- do, por exemplo, fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato, ou ligações de O- metilfosforoamidita; e estruturas principais e ligações de polinucleotídeo peptídico. Outros polinucleotídeos análogos incluem aqueles com estruturas principais positivas; estruturas principais não iônicas, e estruturas principais que não ribose. Modificações da estrutura principal de ribose-fosfato podem . ser feitas por uma variedade de razões, por exemplo, para aumentar a esta- bilidade e meia-vida de tais moléculas em ambientes fisiológicos ou como O sondas em um biochip. Misturas de polinucleotídeos que ocorrem natural- : mente e análogos podem ser fabricadas; alternativamente, misturas de aná- logos de polinucleotídeo diferentes, e misturas de polinucleotídeos que ocor- rem naturalmente e análogos podem ser fabricadas.

Uma variedade de análogos de polinucleotídeo é conhecida, in- cluindo, por exemplo, ligações de fosforamidato, fosforotioato, fosforoditica- to, O-metitfosforoamíidita e estruturas principais e ligações de polinucleotídeo peptídico. Outros polinucleotídeos análogos incluem aqueles com estruturas principais positivas, estruturas principais não iônicas e estruturas principais que não ribose. Polinucleotídeos contendo um ou mais açúcares carbocícli- cos são também incluídos.

Outros análogos incluem polinucleotídeo peptídico (PNA) que são análogos de polinucleotídeo peptídico. Estas estruturas principais são substancialmente não iônicas sob condições neutras, ao contrário da estru- tura principal de fosfodiéster altamente carregada de polinucleotídeos que ocorrem naturalmente. Isto pode resultar em vantagens. Primeiro, a estrutura principal de PNA pode exibir cinética de hibridização melhorada. PNAs têm mudanças maiores na temperatura de fusão (Tm) para pares de base mal combinados versus perfeitamente combinados. DNA e RNA tipicamente exi- bem uma queda de 2 a4ºC em Tr, para uma má combinação interna. Com a estrutura principal de PNA não iônica, a queda é mais próxima de 7 a 9ºC. Similarmente, devido à sua natureza não iônica, a hibridização das bases ligadas a estas estruturas principais é relativamente insensível à concentra- ção de sal. Além disso, PNAs podem ser não degradados ou degradados a um menor grau por enzimas celulares, e assim podem ser mais estáveis.

Entre os usos dos polinucleotídeos de NtMRP divulgados, e combinações de fragmentos destes, está o uso de fragmentos como sondas em ensaios de hibridização de polinucleotídeo ou iniciadores para o uso em ensaios de amplificação de polinucleotídeo ou o uso de fragmentos no de- senvolvimento de vários constructos de polinucleotídeo - tais como molécu- : las de RNAi. Tais fragmentos geralmente compreendem pelo menos cerca de10,11,12,13,14,15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ou mais nucleotídeos contí- : guos de uma sequência de DNA. Em outras modalidades, um fragmento de : DNA compreende pelo menos cerca de 10, 15, 20, 30, 40, 50 ou 60 ou mais nucleotídeos contíguos de uma sequência de DNA. Assim, em um outro as- pecto, também é fornecido um método para detectar polinucleotídeos de NtMRP compreendendo o uso das sondas e/ou dos iniciadores descritos aqui.

Os parâmetros básicos que afetam a escolha de condições de hibridização e orientação para planejar condições adequadas são apresen- tados por Sambrook, J., E. F. Fritsch, e T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Usando conhecimento do código genético em combinação com as sequências de aminoácido apresentadas acima, conjuntos de oligo- nucleotídeos degenerados podem ser preparados. Tais oligonucleotídeos são úteis como iniciadores, por exemplo, em reações em cadeia de polime- —rase (PCR), por meio das quais fragmentos de polinucleotídeo são isolados e ampliados. Em certas modalidades, iniciadores degenerados podem ser usados como sondas para bibliotecas genéticas não humanas. Tais bibliote- cas incluiriam mas não são limitadas a bibliotecas de cDNA, bibliotecas ge- nômicas, e ainda EST eletrônico (rótulo de sequência expresso) ou bibliote- casde DNA. Sequências homólogas identificadas por este método depois seriam usadas como sondas para identificar homólogos não humanos das sequências de NtMRP identificadas aqui.

: Também de uso potencial são polinucleotídeos e oligonucleotí- deos (por exemplo, iniciadores ou sondas) que hibridizam sob condições de - severidade reduzida, tipicamente moderadamente severas, e comumente condições altamente severas, a um polinucleotídeo de NtMRP descrito aqui. — Os parâmetros básicos que afetam a escolha de condições de hibridização e orientação para planejar condições adequadas são descritos em Sambrook, J., E.

F.

Fritsch, e T.

Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manu- al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) e podem ser facilmente determinados por aqueles tendo habilidade comum na técnica com base, por exemplo, no comprimento ou composição de base do polinu-

. cleotídeo. . Um modo de obter condições moderadamente severas envolve o uso de uma solução de pré-lavagem contendo 5x Citrato de Sódio Padrão, 0,5% de Dodecil Sulfato de Sódio, 1,0 MM de Ácido Etilenodiaminotetraacé- tico(pH8,0), tampão de hibridização de cerca de 50% de formamida, 6x Ci- trato de Sódio Padrão, e uma temperatura de hibridização de cerca de 55ºC (ou outras soluções de hibridização similares, tal como uma contendo cerca de 50% de formamida, com uma temperatura de hibridização de cerca de 42ºC), e condições de lavagem de cerca de 60ºC, em 0,5x Citrato de Sódio Padrão, 0,1% de Dodecil Sulfato de Sódio.

Geralmente, condições altamente severas são definidas como condições de hibridização como acima, mas com lavagem a aproximadamente 68ºC, 0,2x Citrato de Sódio Padrão, 0,1% de Dodecil Sulfato de Sódio.

SSPE (1x SSPE é 0,15 M de cloreto de sódio, 10 mM de fosfato de sódio, e 1,25 mM de Ácido Etilenodiaminotetraacético, pH7,4)pode ser substituído no lugar de Citrato de Sódio Padrão (1x Citrato de Sódio Padrão é 0,15 M de cloreto de sódio e 15 mM de citrato de sódio) nos tampões de hibridização e lavagem; lavagens são realizadas por 15 mi- nutos depois que a hibridização é concluída.

Deve ser entendido que a tem- peratura de lavagem e concentração de sal de lavagem podem ser ajustadas — conforme necessário para obter um grau de severidade desejado aplicando- se os princípios básicos que governam reações de hibridização e estabilida- de de dúplex, como conhecido àquelas habilitados na técnica e descrito mais abaixo (ver, por exemplo, Sambrook, J., E.

F.

Fritsch, e T.

Maniatis (1989, | Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory : Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Quando da hibridização de um polinucleo- tideo a um polinucleotídeo alvo de sequência desconhecido, o comprimento —híbridoé considerado ser aquele do polinucleotídeo de hibridização.

Quando polinucleotídeos de sequência conhecida são hibridizados, o comprimento híbrido pode ser determinado alinhando-se as sequências dos polinucleoti- deos e identificando-se a região ou regiões de complementaridade de se- : quência ideal.

A temperatura de hibridização para híbridos previstos serem menos do que 50 pares de base em comprimento deve ser 5 a 10ºC menos o do que a temperatura de fusão (Tm) do híbrido, onde T,, é determinada de acordo com as equações seguintes.

Para híbridos menores do que 18 pares de base em comprimento, Tr (*C) = 2 (número de bases A+T) + 4 (número de bases G+C). Para híbridos acima de 18 pares de base em comprimento, Tn(ºC)=81,5+ 16,6 (log10 [Nat]) + 0,41 ( de % G+C) - (600/N), onde Néo número de bases no híbrido, e [Na+] é a concentração de íons sódio no tampão de hibridização ([Na+] para 1x Citrato de Sódio Padrão = 0,165 M). Tipicamente, cada um de tal polinucleotídeo de hibridização tem um com- primento que é pelo menos 25% (comumente pelo menos 50%, 60%, ou 70%, ,eomaiscomumente pelo menos 80%) do comprimento de um polinu- cleotídeo ao qual ele hibridiza, e tem pelo menos 60% de identidade de se- quência (por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,

97,5%, ou pelo menos 99%) com um polinucleotídeo ao qua! ele hibridiza.

Como será entendido pela pessoa habilitada na técnica, um —DNA linear tem duas orientações possíveis: a direção 5'-a-3' e a direção 3-a- 5'. Por exemplo, se uma sequência de referência é posicionada na direção 5'-a-3', e se uma segunda sequência é posicionada na direção 5'-a-3' dentro da mesma molécula/filamento de polinucleotídeo, então a sequência de refe- rência e a segunda sequência são orientadas na mesma direção, ou têm a mesma orientação.

Tipicamente, uma sequência promotora e um gene de interesse sob a regulação do promotor dado são posicionados na mesma orientação.

Entretanto, com respeito à sequência de referência posicionada

. na direção 5'-a-3', se uma segunda sequência é posicionada na direção 3"'-a- 5' dentro da mesma molécula/filamento de polinucleotídeo, então a sequên- cia de referência e a segunda sequência são orientadas em direção antis- sentido, ou têm orientação de antissentido. Duas sequências tendo orienta- ções antissentido com respeito uma a outra podem ser alternativamente descritas como tendo a mesma orientação, se a sequência de referência (direção 5'-a-3') e a sequência complementar reversa da sequência de refe- rência (sequência de referência posicionada na direção 5'-a-3') são posício- S nadas dentro da mesma molécula/filamento de polinucleotídeo. As sequên- cias apresentadas aqui são mostradas na direção 5'-a-3'.

Ds Polipeptídeos de NtMRP incluem variantes produzidas introdu- Ê zindo-se qualquer tipo de alterações (por exemplo, inserções, supressões, ou substituições de aminoácidos; mudanças em estados de glicosilação; mudanças que afetam a redobra ou isomerizações, estruturas tridimensio- nais, ou estados de auto-associação), que podem ser deliberadamente en- gendradas ou isoladas naturalmente. Polipeptídeos de NIMRP3 ou NtMRP4 podem estar na forma linear ou ciclizados usando métodos conhecidos. Po- lipeptídeos de NtMRP4 compreendem pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, ou pelo menos 40 aminoácidos contíguos.

Várias modalidades são dirigidas a polipeptíideos de NtMRP3 i- solados codificados por uma sequência de polinucleotideo compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente na SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 51 e fragmentos da SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 51, ou variantes destas.

Várias modalidades são dirigidas a polipeptídeos de NtMRP4 i- solados codificados por uma sequência de polinucleotideo compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 27, fragmentos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 27, ou variantes destas.

Várias modalidades são dirigidas a variantes de polipeptídeo de NtMRP isolado compreendendo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 1

: ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 51 ou fragmentos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou - SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 51. Variantes de polipeptídeo mutantes de NtMRP, NtMRP3 e Nt- —MRP4 também são abrangidas pelas reivindicações e são divulgadas aqui como são as plantas mutantes, que não ocorrem naturalmente ou transgêni- cas (por exemplo, plantas de tabaco mutantes, que não ocorrem naturalmen- te ou transgênicas) compreendendo as variantes de polipeptídeo mutantes de NtMRP e/ou MIMRP3 e/ou NtMRP4.

O termo 'que não ocorre naturalmente' como usado aqui descre- O, ve uma entidade (por exemplo, um polinucleotídeo, uma mutação genética, : um polipeptídeo, uma planta, uma célula vegetal e material vegetal) que não é formada por natureza ou que não existe na natureza. Tais entidades que não ocorrem naturalmente ou entidades artificiais podem ser fabricadas, sin- tetizadas, iniciadas, modificadas, interpostas, ou manipuladas por métodos descritos aqui ou que são conhecidos na técnica. Assim, por via de exemplo, uma planta que não ocorre naturalmente, uma célula vegetal que não ocorre naturalmente ou material vegetal que não ocorre naturalmente podem ser fabricados usando técnicas de reprodução de planta tradicionais - tal como retrocruzamento - ou por tecnologias de manipulação genética - tais como RNA antissentido, RNA interferente, meganuclease e semelhantes. Por via de outro exemplo, uma planta que não ocorre naturalmente, uma célula ve- getal que não ocorre naturalmente ou material vegetal que não ocorre natu- ralmente podem ser fabricados por introgressão de ou transferindo-se uma ou mais mutações genéticas (por exemplo um ou mais polimorfismos) de uma primeira planta ou célula vegetal em uma segunda planta ou célula ve- getal (que podem por si só estar ocorrendo naturalmente), tal que a planta, célula vegetal ou material vegetal resultantes ou a progênie destes compre- endem uma constituição genética (por exemplo, um genoma, um cromosso- mo ouum segmento desta) que não é formada por natureza ou que não e- xiste na natureza. A planta, célula vegetal ou material vegetal resultantes são assim artificiais ou que não ocorrem naturalmente. Consequentemente,

. uma planta ou célula vegetal artificiais ou que não ocorrem naturalmente podem ser fabricadas modificando-se uma sequência genética em uma pri- - meira planta ou célula vegetal que não ocorrem naturalmente, mesmo se a sequência genética resultante ocorre naturalmente em uma segunda planta ou célula vegetal que compreende um fundamento genético diferente da primeira planta ou célula vegetal.

Diferenças no fundamento genético podem ser detectadas por diferenças fenotípicas ou por técnicas de biologia mole- cular conhecidas no ramo - tais como sequenciamento de polinucleotídeo, presença ou ausência de marcadores genéticos (por exemplo, marcadores deRNA de microssatélite). A Um polipeptídeo pode ser preparado cultivando-se células hos- : pedeiras transformadas ou recombinantes sob condições de cultura adequa- das para expressar um polipeptídeo.

O polipeptídeo expressado resultante depois pode ser purificado a partir de tal cultura usando processos de purifi- cação conhecidos.

A purificação do polipeptídeo também pode incluir uma coluna de afinidade contendo agentes que se ligarão ao polipeptídeo; uma ou mais etapas de coluna sobre tais resinas de afinidade tais como conca- navalina A-agarose, heparin-toyopearlº ou Cibacrom blue 3GA Sepharose*; uma ou mais etapas envolvendo cromatografia por interação hidrofóbica u- sando tais resinas como éter fenílico, éter butílico, ou éter propílico; ou cro- matografia de imunoafinidade.

Alternativamente, o polipeptídeo também po- de ser expressado em uma forma que facilitará a purificação.

Por exemplo, ele pode ser expressado como um polipeptídeo de fusão, tais como aqueles de polipeptídeo de ligação de maltose (MBP), glutationa-5-transferase (GST) outioredoxina (TRX). Kits para a expressão e purificação de tais polipepti- deos de fusão estão comercialmente disponíveis da New England BioLab (Beverly, Massa.), Pharmacia (Piscataway, N.J.), e InVitrogen, respectiva- mente.

O polipeptídeo também pode ser rotulado com um epítopo e subse- quentemente purificado usando-se um anticorpo específico dirigido a tal epí- topo.

Finalmente, uma ou mais etapas de cromatografia líquida de alto de- sempenho de fase reversa (RP-HPLC) utilizando meios de RP-HPLC hidro- fóbicos, por exemplo, gel de sílica tendo grupos metila ou outros grupos ali-

: fáticos pendentes, pode ser utilizado para purificar ainda mais o polipeptí- deo. Algumas ou todas as etapas de purificação precedentes, em várias - combinações, também podem ser utilizadas para fornecer um polipeptídeo recombinante substancialmente homogêneo. O polipeptídeo assim purificado é substancialmente livre de outros polipeptídeos e é definido aqui como um "polipeptídeo substancialmente purificado"; tais polipeptídeos purificados incluem polipeptídeo, fragmento, variante de NIMRP, e semelhantes. Ex- pressão, isolamento, e purificação dos polipeptídeos e fragmentos podem : ser realizados por qualquer técnica adequada, incluindo mas não limitada aosmétodos descritos aqui.

ds Também é possível utilizar uma coluna de afinidade tal como um anticorpo monoclonal gerado contra polipeptídeos, para purificar por afinida- de polipeptídeos expressados. Estes polipeptídeos podem ser removidos de uma coluna de afinidade usando técnicas convencionais, por exemplo, em um tampão de eluição com alto teor de sal e depois dialisados em um tam- pão com teor de sal mais baixo para o uso ou por pH mutável ou outros componentes dependendo da matriz de afinidade utilizada, ou ser competiti- vamente removidos usando o substrato que ocorre naturalmente da porção de afinidade, tal como um polipeptídeo derivado da divulgação.

Um polipeptídeo também pode ser produzido por síntese quími- ca convencional conhecida. Métodos para construir os polipeptídeos ou fragmentos destes por meios sintéticos são conhecidos àquelas habilitados na técnica. As sequências de polipeptídeo sinteticamente construídas, em virtude de compartilhar características estruturais ou conformacionais primá- rias, secundárias ou terciárias com um polipeptídeo nativo podem possuir propriedades biológicas em comum com estes, incluindo atividade biológica Modalidades são dirigidas a composições e métodos para pro- duzir plantas mutantes, que não ocorrem naturalmente ou transgênicas que foram modificadas para reduzir ou impedir o transporte de metal pesado (por exemplo, cádmio) à limbo da folha reduzindo-se os níveis de expressão de polinucleotídeo de NtMRP ou reduzindo-se a atividade da proteína codifica- da desse modo. O nível no estado estacionário de transcritos de RNA de

: NtMRP pode ser diminuído quando comparado a uma planta de controle. Consequentemente, o número de transportadores de NtMRP funcionalmente É ativos disponíveis para transportar metais pesados (por exemplo, cádmio) através de membranas celulares pode ser diminuído tal que o nível de cád- miona plantatambém é diminuído.

A redução na expressão de polinucleotídeo de NtMRP pode ser de cerca de 5% a cerca de 100%, ou uma redução de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo me- : nos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou até 100%, À que inclui uma redução na atividade transcricional ou expressão de proteína. : A redução na atividade de proteína de NIMRP pode ser de cerca de 5% a cerca de 100%, ou uma redução de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou até 100%.

Inibição refere-se a uma redução de cerca de 98% a cerca de 100%, ou uma redução de pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas particu- larmente de 100%.

Polinucleotídeos e constructos recombinantes descritos aqui po- dem ser usados para modular (por exemplo, reduzir ou inibir) a expressão de um polipeptídeo de NtMRP em uma espécie de planta de interesse. Vários métodos com base em polinucleotídeo, incluindo RNA antissentido, clivagem de RNA dirigida a ribozima, silenciamento genético pós-transcricional (PTGS), por exemplo, interferência de RNA (RNAi), e silenciamento genético transcricional (TGS) são conhecidos inibir a expressão do gene em plantas. Polinucleotideos adequados incluem polinucleotídeos de tamanho natural que codificam polipeptídeos de NtMRP ou fragmentos de tais polinucleoti- deos de tamanho natural. Em algumas modalidades, um complemento do —polinucleotideo de tamanho natural ou um fragmento deste pode ser usado. Tipicamente, um fragmento é pelo menos de 10 nucleotídeos contíguos, por exemplo, pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,

à. 24, 25, 26, 27, 30, 35, 40, 50, 80, 100, 200, 500 nucleotídeos contíguos ou mais. Geralmente, homologia superior pode ser usada para compensar pelo . uso de uma sequência mais curta.

Assim, composições que podem modular (por exemplo, reduzir ouinibira expressão ou a atividade de NIMRP incluem, mas não são limita- das a, polinucleotídeos específicos de sequência que podem interferir com a transcrição de um ou mais genes de NtMRP endógenos; polinucleotídeos específicos de sequência que podem interferir com a tradução de transcritos : de RNA de NtMRP (por exemplo, RNAs de filamento duplo, siRNAs, ribozi- mas); polipeptídeos específicos de sequência que podem interferir com a “o estabilidade de proteínas de NtIMRP; polinucleotídeos específicos de se- : quência que podem interferir com a atividade enzimática de proteína de Nt- MRP ou a atividade de ligação de proteina de NIMRP com respeito a subs- tratos ou proteínas reguladoras; anticorpos que exibem especificidade para proteina de NIMRP; compostos de molécula pequena que podem interferir com a estabilidade de proteina de NtMRP ou a atividade enzimática de pro- teina de NtMRP ou a atividade de ligação de proteína de NtMRP; proteínas dedo de zinco que ligam-se a polinucleotídeo de NtIMRP; e meganucleases que têm atividade para polinucleotídeo de NtMRP. Tecnologia antissentido é um método bem conhecido que pode ser usado para modular (por exemplo, reduzir ou inibir) a expressão de um polipeptídeo de NtMRP. Um polinucleo- tídeo de um gene a ser reprimido é clonado e ligado de maneira operável a uma região reguladora e uma sequência de término de transcrição de modo que o filamento de antissentido de RNA seja transcrito. O constructo recom- —binante é depois transformada em plantas, como descrito aqui, e o filamento de antissentido de RNA é produzido. O polinucleotídeo não precisa ser a sequência inteira do gene a ser reprimido, mas tipicamente será substanci- almente complementar a pelo menos uma porção do filamento de sentido do gene a ser reprimido. Um polinucleotídeo pode ser transcrito em uma ribozima, ou RNA catalítico, que afeta a expressão de um mMRNA. Ribozimas podem ser designadas para especificamente emparelhar com virtualmente qualquer

RNA alvo e clivam a estrutura principal de fosfodiéster em uma localização específica, desse modo funcionalmente inativando o RNA alvo. Polinucleoti- . deos heterólogos podem codificar ribozimas designadas para clivar transcri- tos de MRNA particulares, impedindo assim a expressão de um polipeptídeo.

—Ribozimas tipo cabeça de martelo são úteis para destruir MRNAs particula- res, embora várias ribozimas que clivam mRNA em sequências de reconhe- cimento específicas de sítio possam ser usadas. Ribozimas tipo cabeça de martelo clivam mRNAs em locais ditados flanqueando-se regiões que for- À mam pares de base complementares com o mRNA alvo. O único requisito é queo RNA alvo contenha uma sequência de nucleotídeo 5-UG-3'. O cons- as tructo e produção de ribozimas tipo cabeça de martelo são conhecidas na . técnica. Sequências de ribozima tipo cabeça de martelo podem ser embuti- das em um RNA estável tal como um RNA de transferência (tRNA) para au- mentar a eficiência de clivagem in vivo.

Por exemplo, um constructo pode ser preparada que inclui uma sequência que é transcrita em um RNA que pode recozer à ela mesma, por exemplo, um RNA de filamento duplo tendo uma estrutura de haste-alça. Em algumas modalidades, um filamento da porção de haste de um RNA de fila- mento duplo compreende uma sequência que é similar ou idêntica à se- —quência de codificação de sentido ou um fragmento desta de um polinucleo- tídeo de NtMRP, e que é de cerca de 10 nucleotídeos a cerca de 2.500 nu- cleotídeos contíguos em comprimento. O comprimento da sequência que é similar ou idêntica à sequência de codificação de sentido pode ser de 10 nu- cleotídeos contíguos a 500 nucleotídeos contíguos, de 15 nucleotídeos con- tíguos a 300 nucleotídeos contíguos, de 20 nucleotídeos contíguos a 100 nucleotídeos contíguos, ou de 25 nucleotídeos contíguos a 100 nucleotídeos contíguos. O outro filamento da porção de haste de um RNA de filamento duplo compreende uma sequência que é similar ou idêntica ao filamento de antissentido ou um fragmento deste da sequência de codificação do polinu- — cleotídeo de NtMRP, e pode ter um comprimento que é mais curto, o mesmo como, ou mais longo do que o comprimento correspondente da sequência de sentido. Em alguns casos, um filamento da porção de haste de um RNA

. de filamento duplo compreende uma sequência que é similar ou idêntica à região não traduzida 3' ou 5', ou um fragmento desta, de um MRNA que co- - difica um polipeptídeo de NtMRP, e o outro filamento da porção de haste do RNA de filamento duplo compreende uma sequência que é similar ou idênti- caà sequência que é complementar à região não traduzida 3' ou 5', respec- tivamente, ou um fragmento desta, do MRNA que codifica o N!IMRP. Em ou- tras modalidades, um filamento da porção de haste de um RNA de filamento duplo compreende uma sequência que é similar ou idêntica à sequência de . um Ííntron, ou um fragmento deste, no pré-mRNA que codifica um polipepti- deode NtMRP, e o outro filamento da porção de haste compreende uma Dor sequência que é similar ou idêntica à sequência que é complementar à se- . quência do íntron, ou um fragmento desta, na pré-mRNA.

A porção de alça de um RNA de filamento duplo pode ser de cerca de 3 nucleotídeos a cerca de 5.000 nucleotídeos - tal como de cerca de15 nucleotídeos a cerca de 1000 nucleotídeos, de cerca de 20 nucleoti- deos a cerca de 500 nucleotídeos, de cerca de 25 nucleotídeos a 250 nucle- otídeos. A porção de alça do RNA pode incluir um íntron ou um fragmento deste. Um RNA de filamento duplo pode ter zero, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, ou mais estruturas de haste-alça.

Um constructo incluindo uma sequência que é ligada de maneira operável a uma região reguladora ou uma sequência de término de transcri- ção, e que é transcrita em um RNA que pode formar um RNA de filamento duplo, pode ser transformada em plantas como descrito aqui. Métodos para usar RNAi para inibir a expressão de um gene são conhecidos àqueles de habilidade na técnica.

Constructos compreendendo regiões reguladoras ligadas de maneira operável a moléculas de polinucleotídeo em orientação de sentido também podem ser usados para inibir a expressão de um gene. O produto de transcrição pode ser similar ou idêntico à sequência de codificação de sentido, ou um fragmento desta, de um polipeptídeo de NtMRP. O produto de transcrição também pode ser não poliadenilado, carecer de uma estrutura de tampão 5', ou conter um íntron não unível. Métodos de inibir a expressão

; do gene usando um cDNA de tamanho natural assim como uma sequência de cDNA parcial são conhecidos na técnica. - Em algumas modalidades, um constructo compreendendo um polinucleotídeo tendo pelo menos um filamento que é um padrão tanto para sequências de sentido quanto antissentido que são complementares entre si é usada para inibir a expressão de um gene.

As sequências de sentido e antissentido podem ser parte de uma molécula de polinucleotídeo maior ou podem ser parte de moléculas de polinucleotídeo separadas tendo sequên- cias que não são complementares.

A sequência de sentido ou antissentido pode ser uma sequência que é idêntica ou complementar à sequência de um To MRNA, a região não traduzida 3' ou 5' de um mMRNA, ou um íntron em um : pré-mRNA que codifica um polipeptídeo de NtMRP, ou um fragmento de tais sequências.

Em algumas modalidades, a sequência de sentido ou antissen- tido é idêntica ou complementar a uma sequência da região reguladora que conduz a transcrição do gene que codifica um polipeptídeo de NtMRP.

Em cada caso, a sequência de sentido é a sequência que é complementar à se- quência de antissentido.

As sequências de sentido ou antissentido podem ser de um comprimento maior do que cerca de 10 nucleotídeos (por exemplo, cerca de 10/11,12/13,14, 19,16, 17, 18,19, 20,21, 22,29, 24,20, 26,27, 28,29, 30, ou mais nucleotídeos). Por exemplo, uma sequência de antissentido po- de ser cerca de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucleotídeos em comprimento.

Tipicamente, as sequências de sentido ou antissentido variam em comprimento de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 30 nucleotídeos, —porexemplo, de cerca de 18 nucleotídeos a cerca de 28 nucleotídeos, ou de cerca de 21 nucleotídeos a cerca de 25 nucleotídeos, ou de cerca de 23 nu- cleotídeos a cerca de 25 nucleotídeos.

Em algumas modalidades, uma sequência de antissentido é uma sequência complementar a uma sequência de mRNA, ou um fragmento des- ta, que codifica um polipeptídeo de NtMRP descrito aqui.

A sequência de sentido complementar à sequência de antissentido pode ser uma sequência presente dentro do mRNA do polipeptídeo de NtMRP.

Tipicamente, sequên-

: cias de sentido ou antissentido são designadas para corresponder a uma sequência de nucleotídeo de 15 a 30 de um mRNA alvo tal que o nível deste

MRNA alvo é reduzido.

Em algumas modalidades, um constructo compreendendo um —polinucleotídeo tendo pelo menos um filamento que é um padrão para mais do que uma sequência de sentido (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5,6,7,8, 9, 10 ou mais sequências de sentido) pode ser usada para inibir a expressão de um gene.

Do mesmo modo, um constructo compreendendo um polinucle- : otídeo tendo pelo menos um filamento que é um padrão para mais do que uma sequência de antissentido (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5,6,7,8,9, 10 ou mais sequências de antissentido) pode ser usada para inibir a expres- . são de um gene.

Por exemplo, um constructo pode conter um polinucleotí- deo tendo pelo menos um filamento que é um padrão para duas sequências de sentido e duas sequências de antissentido.

As sequências de sentido múltiplas podem ser idênticas ou diferentes.

As sequências de antissentido múltiplas podem ser idênticas ou diferentes.

Por exemplo, um constructo pode compreender um polinucleotídeo tendo um filamento que é um padrão para duas sequências de sentido idênticas e duas idêntica sequências de antissentido que são complementares às duas sequências de sentido idênti- cas.

Alternativamente, um polinucleotídeo isolado pode compreender um filamento que é um padrão para (1) duas sequências de sentido idênticas de cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 ou mais nucleotídeos em comprimento, (2) uma sequência de antissentido que é complementar às duas sequências de sentido idênticas decercade10,11,12,19,14,15,16, 17, 18,19, 20,21, 722,293,24, 25,26, 27, 28, 29 ou 30 ou mais nucleotídeos em comprimento, (3) uma sequência de sentido de cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 ou mais nucleotídeos em comprimento, e (4) três sequências de antissentido idênticas que são complementares à sequência de sentido de cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24,25, 26, 27, 28, 29 ou 30 ou mais nucleotídeos em comprimento.

As cons- tructos fornecidas aqui podem ser designadas para ter qualquer arranjo de

: sequências de sentido ou antissentido. Por exemplo, duas sequências de sentido idênticas podem ser seguidas por duas sequências de antissentido - idênticas ou podem ser posicionadas entre duas sequências de antissentido idênticas.

S Um polinucleotídeo compreendendo pelo menos um filamento que é um padrão para uma ou mais sequências de sentido ou antissentido pode ser ligado de maneira operável a uma região reguladora para conduzir a transcrição de uma molécula de RNA compreendendo a(s) sequência(s) à de sentido ou antissentido. Além disso, um tal polinucleotídeo pode ser liga- do de maneira operável a uma sequência terminadora de transcrição, tal o como o terminador do gene de nopalina sintase (nos). Em alguns casos, du- as regiões reguladoras podem direcionar a transcrição de dois transcritos: À um do filamento de topo, e um do filamento de fundo. As duas regiões regu- ladoras podem ser as mesmas ou diferentes. Os dois transcritos podem for- mar moléculas de RNA de filamento duplo que induzem a degradação do RNA alvo. Em alguns casos, um polinucleotídeo pode ser posicionado dentro de um T-DNA ou DNA de transferência derivado de planta (P-DNA) tal que as sequências de margem de T-DNA esquerda e direita, ou as sequências semelhantes à margem esquerda e direita do P-DNA, flanqueiam ou estão em qualquer lado do polinucleotídeo. A sequência de polinucleotídeo entre as duas regiões reguladoras pode ser de cerca de 15 a cerca de 300 nucleo- tídeos em comprimento, de cerca de 15 a cerca de 200 nucleotídeos em comprimento, de cerca de 15 a cerca de 100 nucleotídeos em comprimento, de cerca de 15 a cerca de 50 nucleotídeos em comprimento, de cerca de 18 a cercade 50 nucleotídeos em comprimento, de cerca de 18 a cerca de 40 nucleotídeos em comprimento, de cerca de 18 a cerca de 30 nucleotídeos em comprimento, ou de cerca de 18 a cerca de 25 nucleotídeos em compri- mento.

Consequentemente, composições que podem modular (por e- xemplo, infrarregular) a expressão ou a atividade de proteina de NIMRP in- cluem polinucleotídeos específicos de sequência que podem interferir com a transcrição de um ou mais genes de NtMRP endógenos; polinucleotídeos específicos de sequência que podem interferir com a tradução de transcritos de RNA de NtMRP (por exemplo, RNAs de filamento duplo, siRNAs, ribozi- mas); polipeptídeos específicos de sequência que podem interferir com a estabilidade de proteínas de NtMRP; polinucleotídeos específicos de se- — quência que podem interferir com a atividade enzimática de proteína de Nt- MRP ou a atividade de ligação de proteína de NIMRP com respeito a subs- tratos ou proteínas reguladoras; anticorpos que exibem especificidade para a proteína de NtMRP; compostos de molécula pequena que podem interferir à. com a estabilidade de proteina de NtIMRP ou a atividade enzimática de pro- teinade NtMRP ou a atividade de ligação de proteina de NtMRP; proteínas e dedo de zinco que ligam-se a polinucleotídeo de NtMRP; e meganucleases que têm atividade para polinucleotídeo de NtMRP.

Um antagonista eficaz pode reduzir o transporte de metal pesa- do (por exemplo, cádmio) na folha (por exemplo, estruturas de limbo da fo- lha) em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. Em uma modalidade, os polinucleotídeos específicos de sequência que podem interferir com a tradução de transcrito(s) de RNA de NtMRP é RNAi.

Interferência de RNA ("RNAi") ou silenciamento de RNA é um processo evolucionariamente conservado pelo qual mMRNAs específicos po- dem ser alvejados para a degradação enzimática. Um RNA de filamento du- plo (RNA de filamento duplo) deve ser introduzido ou produzido por uma cé- lula (por exemplo, vírus de RNA de filamento duplo, ou polinucleotídeos de —RNAide NtMRP) para iniciar a via de RNAi. O RNA de filamento duplo pode ser convertido em dúplexes de siRNA múltiplos de comprimento de 21 a 23 pb ("siRNAs") por RNases Ill, que são endonucleases específicas de RNA de filamento duplo ("Dicer"). Os siRNAs podem ser subsequentemente reco- nhecidos por complexos de sinalização induzida por RNA ("RISC") que pro- movem o desenrolamento de siRNA através de um processo dependente de ATP. O filamento de antissentido desenrolado do sSiRNA guia i RISC ativado ao mMRNA alvejado (por exemplo, variantes de RNA de NtMRP) compreen-

dendo uma sequência complementar ao filamento de siRNA de antissentido. : O mRNA alvejado e o filamento de antissentido podem formar uma hélice na forma A, e a ranhura principal da hélice na forma A pode ser reconhecida pelo RISC ativado.

O mRNA alvo pode ser clivado por RISC ativado em um único sítio definido pelo sítio de ligação da extremidade 5' do filamento de SIRNA.

O RISC ativado pode ser reciclado para catalisar um outro evento de clivagem.

Vetores de expressão de RNAi de N!IMRP compreendendo cons- ; tructos de RNAi de NtMRP que codificam polinucleotídeos de RNAi de Nt- MRP exibem atividade de interferência de RNA reduzindo-se o nível de ex- pressão de mRNAs de NtMRP, pré-mRNAs de NtMRP, ou variantes de RNA de NtMRP relacionadas.

Os vetores de expressão podem compreender um | promotor posicionado a montante e ligado de maneira operável a um cons- tructo de RNAi de NtMRP, como descrito ainda aqui.

Vetores de expressão de RNAi de NtIMRP podem compreender um promotor de núcleo mínimo adequado, um constructo de RNAi de NtMRP de interesse, uma região regu- ladora a montante (5'), uma região reguladora a jusante (3'), incluindo sinais de terminação e poliadenilação de transcrição, e outras sequências conheci- das a pessoas habilitadas na técnica, tais como vários marcadores de sele-

ção

Os polinucleotídeos de NIMRP podem ser produzidos em várias formas, incluindo como estruturas de filamento duplo (isto é, uma molécula de RNA de filamento duplo compreendendo um filamento de antissentido e um filamento de sentido complementar), estruturas semelhantes a grampo de cabelo de filamento duplo ("dsRNAi"), estruturas de filamento único (isto é, uma molécula de ssRNA compreendendo apenas um filamento de antis- sentido). As estruturas podem compreender um dúplex, dúplex assimétrico, estrutura secundária tipo grampo de cabelo ou grampo de cabelo assimétri- co, tendo filamentos de sentido e antissentido auto-complementares.

O ds- —RNAide NtMRP pode ser enzimaticamente convertido a siRNAs de NtMRP de filamento duplo.

Um dos filamentos do dúplex de siRNA de NtMRP pode recozer a uma sequência complementar dentro do MRNA de NtMRP alvo e variantes de RNA de NtMRP relacionadas. Os dúplexes de siRNA/MRNA são reconhecidos por RISC que podem clivar RNAs de NtMRP em sítios múltiplos em uma maneira dependente de sequência, resultando na degra- dação do mRNA de NtMRP alvo e variantes de RNA de NtMRP relaciona- das As moléculas de RNA de filamento duplo podem incluir molécu- las de siRNA montadas de um único oligonucleotíideo em uma estrutura de haste-alça, em que regiões de sentido e antissentido auto-complementares da molécula de siRNA são ligadas por meio de um ligador com base em po- linucleotídeo ou com base em não-polinucleotídeo, assim como RNA circular de filamento único tendo duas ou mais estruturas de alça e uma haste com- preendendo filamentos de sentido e antissentido auto-complementares, em que o RNA circular pode ser processado in vivo ou in vitro para gerar uma molécula de siRNA ativa capaz de mediar RNAi.

Moléculas de RNA tipo grampo de cabelo (ShRNA) pequenas também são divulgadas aqui, compreendendo uma sequência de antissenti- do específica além da sequência de complemento reverso (sentido), tipica- mente separada por uma sequência espaçadora ou de alça. A clivagem do espaçador ou alça fornece uma molécula de RNA de filamento único e seu complemento reverso, tal que eles podem recozer para formar uma molécula de RNA de filamento duplo (opcionalmente com etapas de processamento adicionais que podem resultar na adição ou remoção de um, dois, três ou mais nucleotídeos da extremidade 3' ou da extremidade 5' de qualquer um ou ambos filamentos). O espaçador pode ser de um comprimento suficiente para permitir que as sequências de antissentido e sentido recozem e formem uma estrutura de filamento duplo (ou haste) antes da clivagem do espaçador (e, opcionalmente, etapas de processamento subsequentes que podem re- sultar na adição ou remoção de um, dois, três, quatro, ou mais nucleotídeos da extremidade 3' ou da extremidade 5' de qualguer um ou ambos filamen- tos). A sequência espaçadora é tipicamente uma sequência de nucleotídeo não relacionada que é situada entre duas regiões de sequência de nucleotí- deo complementares que, quando recozidas em um polinucleotídeo de fila-

, mento duplo, compreendem um shRNA. A sequência espaçadora geralmen- te compreende entre cerca de 3 e cerca de 100 nucleotídeos. . Qualquer polinucleotídeo de RNA de NtMRP de interesse pode ser produzido selecionando-se uma composição de sequência adequada, tamanho da alça, e comprimento da haste para produzir o dúplex tipo gram- po de cabelo de NtMRP. Uma faixa adequada para designar comprimentos de haste de um dúplex tipo grampo de cabelo, inclui comprimentos de haste de pelo menos cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleotí- deos - tal como cerca de 14 a 30 nucleotídeos, cerca de 30 a 50 nucleotí- deos,cercade 50 a 100 nucleotídeos, cerca de 100 a 150 nucleotídeos, cer- ' ca de 150 a 200 nucleotídeos, cerca de 200 a 300 nucleotídeos, cerca de . 300 a 400 nucleotídeos, cerca de 400 a 500 nucleotídeos, cerca de 500 a 600 nucleotídeos, e cerca de 600 a 700 nucleotídeos. Uma faixa adequada para designar comprimentos de alça de um dúplex tipo grampo de cabelo, inclui comprimentos de alça de cerca de 4 a 25 nucleotídeos, cerca de 25 a 50 nucleotídeos, ou mais longo se o comprimento da haste do dúplex tipo cabelo for substancial. Em certas modalidades, uma molécula de RNA de filamento duplo ou ssRNA está entre cerca de 15 e cerca de 40 nucleotídeos em comprimento. Em uma outra modalidade, a molécula de siRNA é uma molécula de RNA de filamento duplo ou ssRNA entre cerca de 15 e cerca de í 35 nucleotídeos em comprimento. Em uma outra modalidade, a molécula de sSIiRNA é uma molécula de RNA de filamento duplo ou ssRNA entre cerca de 17 e cerca de 30 nucleotídeos em comprimento. Em uma outra modalidade, a molécula de siRNA é uma molécula de RNA de filamento duplo ou ssSRNA entrecercade 19e cerca de 25 nucleotideos em comprimento. Em uma ou- tra modalidade, a molécula de siRNA é uma molécula de RNA de filamento duplo ou ssRNA entre cerca de 21 a cerca de 23 nucleotídeos em compri- mento. Em certas modalidades, estruturas tipo grampo de cabelo com regi- ões de dúplex mais longas do que 21 nucleotídeos podem promover silenci- amento dirigido por siRNA eficaz, não obstante da sequência e comprimento da alça.

A sequência de mRNA alvo está tipicamente entre cerca de 14 a cerca de 50 nucleotídeos em comprimento. O mRNA alvo pode, portanto, ser varrido para regiões entre cerca de 14 e cerca de 50 nucleotídeos em com- : primento que preferivelmente satisfazem um ou mais dos critérios seguintes : para uma sequência alvo: uma razão de A+T/G+C entre cerca de 2:1 e cerca de1:2;um dinucleotídeo de AA ou um dinucleotídeo de CA na extremidade 5' da sequência alvo; uma sequência de pelo menos 10 nucleotídeos conse- cutivos únicos para o MRNA alvo; e nenhuma "rodada" de mais do que três nucleotídeos de guanina (G) consecutivos ou mais do que três nucleotídeos de citosina (C) consecutivos. Estes critérios podem ser avaliados usando váriastécnicas conhecidas no ramo, por exemplo, programas de computador f tais como BLAST podem ser usados para pesquisar bases de dados publi- camente disponíveis para determinar se a sequência alvo selecionada é úni- i ca para o MRNA alvo. Alternativamente, uma sequência alvo pode ser sele- cionada (e uma sequência de siRNA designada) usando software de compu- tador comercialmente disponível (por exemplo, OligoEngine.TM. (Seattle, Wash.); Dharmacon, Inc. (Lafayette, Colo.); Target Finder da Ambion Inc.

(Austin, Tex.) e a siRNA Design Tool da QIAGEN, Inc. (Valencia, Calif.)). õ Em uma modalidade, sequências de mMRNA alvos são selecio- nadas que estão entre cerca de 14 e cerca de 30 nucleotídeos em compri- mento que satisfazem um ou mais dos critérios acima. Em uma outra moda- - lidade, sequências alvos são selecionadas que estão entre cerca de 16 e cerca de 30 nucleotídeos em comprimento que satisfazem um ou mais dos critérios acima. Em uma outra modalidade, sequências alvos são seleciona- das que estão entre cerca de 19 e cerca de 30 nucleotídeos em comprimen- to que satisfazem um ou mais dos critérios acima. Em uma outra modalida- de, sequências alvos são selecionadas que estão entre cerca de 19 e cerca de 25 nucleotídeos em comprimento que satisfazem um ou mais dos crité- rios acima.

Em uma modalidade exemplar, as moléculas de siRNA compre- endem uma sequência de antissentido específica que é complementar a pe- lo menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou mais nucleotídeos contíguos de qualquer uma das sequências como apresentado nas SEQ ID NOs: 1 a 23. ! A sequência de antissentido específica compreendida pela mo- . lécula de siRNA pode ser idêntica ou substancialmente idêntica ao comple- mento da sequência alvo. Em uma modalidade, a sequência de antissentido específica compreendida pela molécula de siRNA é pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao comple- mento da sequência de mRNA alvo. Métodos de determinar a identidade de sequência são conhecidos na técnica e podem ser determinados, por exem- plo, usando-se o programa BLASTN da University of Wisconsin Computer Group (GCG) software ou fornecidos no sítio eletrônico de NCBI. ' A sequência de antissentido específica das moléculas de siRNA descritas aqui pode exibir variabilidade diferindo-se (por exemplo, por substi- : tuição de nucleotídeo, incluindo transição ou transversão) em um, dois, três, quatro ou mais nucleotídeos da sequência do MRNA alvo. Quando tais subs- tituições de nucleotídeo estão presentes no filamento de antissentido de uma molécula de RNA de filamento duplo, o nucleotídeo complementar no fila- mento de sentido com que o nucleotídeo substituto tipicamente formaria pa- ! reamento de base de ligação de hidrogênio pode ser ou não corresponden- temente substituído, moléculas de RNA de filamento duplo em que uma ou mais substituições de nucleotídeo ocorrem na sequência de sentido, mas , não no filamento de antissentido, também são consideradas. Quando a se- quência de antissentido de uma molécula de siRNA compreende uma ou mais más combinações entre a sequência de nucleotídeo do siRNA e a se- quência de nucleotídeo alvo, como descrito acima, as más combinações po- dem ser encontradas no término 3', no término 5' ou na porção central da sequência de antissentido.

Em uma outra modalidade, as moléculas de siRNA compreen- dem uma sequência de antissentido específica que é capaz de hibridizar seletivamente sob severa condições a uma porção de um gene alvo ou mR- NA alvo que ocorrem naturalmente. Condições severas adequadas incluem, por exemplo, hibridização de acordo com procedimentos de hibridização convencionais e condições de lavagem de 1 a 3 vezes Citrato de Sódio Pa-

drão, 0,1 a 1% de Dodecil Sulfato de Sódio, 50 a 70 graus C com uma mu- f dança da solução de lavagem depois de cerca de 5 a 30 minutos. Como co- - nhecido àqueles de habilidade comum na técnica, variações na severidade de condições de hibridização podem ser obtidas alterando-se o tempo, tem- peratura ou concentração das soluções usadas para as etapas de hibridiza- ção e lavagem. Condições adequadas também podem depender em parte das sequências de nucleotídeo particulares usadas, por exemplo da sequên- cia do MRNA ou gene alvos. . Moléculas de RNAi tendo uma estrutura de dúplex ou filamento duplo, por exemplo RNA de filamento duplo ou shRNA, podem ter extremi- Í dades cegas, ou podem ter projeções 3' ou 5'. Como usado aqui, "projeção" refere-se ao nucleotídeo ou nucleotídeos não pareados que projetam-se de | uma estrutura de dúplex quando um término 3' de um filamento de RNA es- tende-se além do término 5' do outro filamento (projeção 3'), ou vice versa (projeção 5'). Os nucleotídeos compreendendo a projeção podem ser ribo- - nucleotídeos, desoxirribonucleotídeos ou versões modificadas destes. Em uma modalidade, pelo menos um filamento da molécula de RNAi tem uma projeção 3' de cerca de 1 a cerca de 6 nucleotídeos em comprimento. Em outras modalidades, a projeção 3' é de cerca de 1 a cerca de 5 nucleotídeos, de cercade 1a cerca de 3 nucleotídeos e de cerca de 2 a cerca de 4 nu- - cleotídeos em comprimento.

Quando a molécula de RNAi compreende uma projeção 3' em uma extremidade da molécula, a outra extremidade pode ser de extremidade cega ou têm também uma projeção (5' ou 3'). Quando a molécula de RNAi compreende uma projeção em ambas as extremidades da molécula, o com- primento das projeções pode ser o mesmo ou diferente. Em uma modalida- de, a molécula de RNAi descrita aqui compreende projeções 3' de cerca de 1 a cerca de 3 nucleotídeos em ambas as extremidades da molécula. Em uma outra modalidade, a molécula de RNAi é um RNA de filamento duplo tendo uma projeção 3'de 2 nucleotideos em ambas as extremidades da molécula. Ainda em uma outra modalidade, os nucleotídeos compreendendo a proje- ção do RNAi são dinucleotídeos de TT ou dinucleotídeos de UU.

Quando da determinação da porcentagem de identidade da mo- : lécula de RNAi compreendendo uma ou mais projeções à sequência de : MRNA alvo, a(s) projeção(ões) podem ser ou não consideradas. Por exem- plo, os nucleotídeos de uma projeção 3' e até 2 nucleotídeos do término 5' ou3' do filamento duplo podem ser modificados sem perda significante de atividade da molécula de siRNA.

As moléculas de RNAi podem compreender uma ou mais estru- turas de tampão 5' ou 3'. A molécula de RNAi pode compreender uma estru- tura de tampão na extremidade 3' do filamento de sentido, do filamento de antissentido, ou tanto dos filamentos de sentido quanto de antissentido; ou Do na extremidade 5' do filamento de sentido, do filamento de antissentido, ou tanto dos filamentos de sentido quanto de antissentido da molécula de RNAi.

! Alternativamente, a molécula de RNAi pode compreender uma estrutura de tampão tanto na extremidade 3' quanto na extremidade 5' da molécula de RNAi O termo "estrutura de tampão" refere-se a uma modificação química - incorporada em qualquer término de um oligonucleotídeo (ver, por exemplo, Pat. U.S. Nº 5.998.203), que protege a molécula de degradação de exonu- : clease, e também pode facilitar a liberação ou localização dentro de uma célula.

Uma outra modificação aplicável a moléculas de RNAi é a liga- ção química à molécula de RNAi de uma ou mais porções ou conjugados que realçam a atividade, distribuição celular, captação celular, biodisponibili- dade ou estabilidade da molécula de RNAi. Os polinucleotídeos podem ser sintetizados ou modificados por métodos bem estabelecidos na técnica. Mo- —dificações químicas podem incluir, mas não são limitadas a modificações em 2', introdução de bases não naturais, ligação covalente a um ligante, e subs- tituição de ligações fosfato com ligações tiofosfato. Nesta modalidade, a in- tegridade da estrutura de dúplex é reforçada por pelo menos uma, e tipica- mente duas, ligações químicas. Ligação química pode ser obtida por qual- — queruma de uma variedade de técnicas bem conhecidas, por exemplo intro- duzindo-se ligações covalentes, iônicas ou hidrogênio; interações hidrofóbi- cas, interações de van der Waals ou de empilhamento; por meio de coorde-

nação de íon metálico, ou através do uso de análogos de purina. | Ainda em uma outra modalidade, os nucleotídeos em um ou . ambos dos dois filamentos únicos podem ser modificados para impedir ou : inibir a ativação de enzimas celulares, tais como, por exemplo, sem limita- ção, certas nucleases. Técnicas para inibir a ativação de enzimas celulares são conhecidas no ramo incluindo, mas não limitadas a, modificações de 2'- amino, modificações de 2'-fluoro, modificações de 2'-alquila, modificações de estrutura principal não carregada, modificações de morfolino, modificações de 2'-O-metila, e fosforamidato. Assim, pelo menos um grupo 2'-hidroxila dos nucleotídeos em um RNA de filamento duplo é substituído por um grupo E químico. Também, pelo menos um nucleotídeo pode ser modificado para formar um nucleotídeo bloqueado. Tal nucleotídeo bloqueado contém uma À ponte de metileno ou etileno que conecta o 2'-oxigênio de ribose com o 4- carbono de ribose. A introdução de um nucleotídeo bloqueado em um oligo- —nucleotídeo melhora a afinidade por sequências complementares e aumenta - a temperatura de fusão em vários graus.

Ligantes podem ser conjugados a uma molécula de RNAi, por exemplo, para realçar sua absorção celular. Em certas modalidade, um li- gante hidrofóbico é conjugado à molécula para facilitar a permeação direta da membrana celular. Estes métodos foram usados para facilitar a permea- S ção celular de oligonucleotídeos de antissentido. Em certos exemplos, a con- jugação de um ligante catiônico a oligonucleotídeos frequentemente resulta em resistência melhorada a nucleases. Exemplos representativos de ligantes catiônicos são propilamônio e dimetilpropilamônio. Oligonucleotídeos de an- tissentido podem manter sua afinidade de ligação alta a mMRNA quando o ligante catiônico é disperso por todo o oligonucleotídeo.

As moléculas e nucleotídeos descritos aqui podem ser prepara- dos usando a técnica bem conhecida de síntese de fase sólida. Qualquer outro meio para tal síntese conhecida na técnica pode adicional ou alternati- vamente ser utilizado.

Várias modalidades são dirigidas a vetores de expressão de Nt- MRP (por exemplo, vetores de expressão de NtMRP3) compreendendo poli-

nucleotídeo de NtMRP ou constructos de RNAi de NtMRP que compreen- j dem um ou mais de: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 51, íntron : 1 (SEQ ID NO: 30), íntron 2 (SEQ ID NO: 31), íntron 3 (SEQ ID NO: 32), ín- : tron 4 (SEQ ID NO: 33), íntron 5 (SEQ ID NO: 34), íntron 6 (SEQ ID NO: 35), íntron7(SEQID NO: 36), íntron 8 (SEQ ID NO: 37), íntron 9 (SEQ ID NO: 38), íntron 10 (SEQ ID NO: 39), éxon 1 (SEQ ID NO: 40), éxon 2 (SEQ ID NO: 41), éxon 3 (SEQ ID NO: 42), éxon 4 (SEQ ID NO: 43), éxon 5 (SEQ ID NO: 44), éxon 6 (SEQ ID NO: 45), éxon 7 (SEQ ID NO: 46), éxon 8 (SEQ ID NO: 47), éxon 9 (SEQ ID NO: 48), éxon 10 (SEQ ID NO: 49) ou éxon 11 (SEQID NO: 50) e fragmentos destas, e variantes destas. Como descrito aqui, referência às sequências específicas também inclui o complemento ou complemento reverso destas.

Várias modalidades são dirigidas a vetores de expressão de Nt- MRP (por exemplo, vetores de expressão de NIMRP4) compreendendo poli- —nucleotídeo de NIMRP ou constructos de RNAi de NtMRP que compreen- : dem um ou mais de: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 27, íntron 1 (SEQ ID NO: 3), íntron 2 (SEQ ID NO: 4), íntron 3 (SEQ ID NO: 5), íntron 4 : (SEQ ID NO: 6), íntron 5 (SEQ ID NO: 7), íntron 6 (SEQ ID NO: 8), íntron 7 (SEQ ID NO: 9), íntron 8 (SEQ ID NO: 10), íntron 9 (SEQ ID NO: 11), íntron 10(SEQID NO: 12), éxon 1 (SEQ ID NO: 13), éxon 2 (SEQ ID NO: 14), é- à. xon 3 (SEQ ID NO: 15), éxon 4 (SEQ ID NO: 16), éxon 5 (SEQ ID NO: 17), éxon 6 (SEQ ID NO: 18), éxon 7 (SEQ ID NO: 19), éxon 8 (SEQ ID NO: 20), éxon 9 (SEQ ID NO: 21), éxon 10 (SEQ ID NO: 22), éxon 11 (SEQ ID NO: 53) ou SEQ ID NO: 23 e fragmentos destas, e variantes destas. Como des- crito aqui, referência às sequências específicas também inclui o complemen- to ou complemento reverso destas.

Várias modalidades são dirigidas a vetores de expressão com- preendendo: um ou mais polinucleotídeos de NtMRP ou constructos de RNAi de NtMRP (por exemplo, polinucleotideo de NIMRP3 ou Constructos de —RNAi de NtMRP3) tendo pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência a uma se- quência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO:

29, íntron 1 (SEQ ID NO: 30), íntron 2 (SEQ ID NO: 31), íntron 3 (SEQ ID NO: 32), íntron 4 (SEQ ID NO: 33), íntron 5 (SEQ ID NO: 34), íntron 6 (SEQ . ID NO: 35), íntron 7 (SEQ ID NO: 36), íntron 8 (SEQ ID NO: 37), íntron 9 É (SEQ ID NO: 38), íntron 10 (SEQ ID NO: 39), éxon 1 (SEQ ID NO: 40), éxon 2(SEQIDNO:41), éxon 3 (SEQ ID NO: 42), éxon 4 (SEQ ID NO: 43), éxon 5 (SEQ ID NO: 44), éxon 6 (SEQ ID NO: 45), éxon 7 (SEQ ID NO: 46), éxon 8 (SEQ ID NO: 47), éxon 9 (SEQ ID NO: 48), éxon 10 (SEQ ID NO: 49), é- xon 11 (SEQ ID NO: 50) ou SEQ ID NO: 51 e fragmentos destas, e variantes destas ou uma combinação de duas ou mais destas. Como descrito aqui, ; 10 referência às sequências específicas também inclui o complemento ou com- E plemento reverso destas. Várias modalidades são dirigidas a vetores de expressão com- preendendo: polinucleotídeo de NtMRP ou constructos de RNAi de NtMRP (por exemplo, polinucleotídeo de NtIMRP4 ou constructos de RNAi de Nt- MRP4) tendo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, . 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência a uma se- quência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, íntron 1 (SEQ ID NO: 3), íntron 2 (SEQ ID NO: 4), íntron 3 (SEQ ID NO: 5), íntron 4 (SEQ ID NO: 6), íntron 5 (SEQ ID NO: 7), íntron 6 (SEQ ID NO: 8), íntron7(SEQID NO: 59), íntron 8 (SEQ ID NO: 10), íntron 9 (SEQ ID NO: . 11), íntron 10 (SEQ ID NO: 12), éxon 1 (SEQ ID NO: 13), éxon 2 (SEQ ID NO: 14), éxon 3 (SEQ ID NO: 15), éxon 4 (SEQ ID NO: 16), éxon 5 (SEQ ID NO: 17), éxon 6 (SEQ ID NO: 18), éxon 7 (SEQ ID NO: 19), éxon 8 (SEQ ID NO: 20), éxon 9 (SEQ ID NO: 21), éxon 10 (SEQ ID NO: 21), éxon 11 (SEQ 1DNO: 22) ou SEQ ID NO: 23 e fragmentos destas, e variantes destas ou uma combinação de duas ou mais destas. Como descrito aqui, referência às sequências específicas também inclui o complemento ou complemento re- verso destas.

Várias modalidades são dirigidas a vetores de expressão com- — preendendo: polinucleotídeo de NtIMRP ou constructo de RNAi de NtMRP que codifica polinucleotídeos de RNAi de NtMRP (por exemplo, polinucleoti- deo de NtMRP3 ou constructos de RNAi de NtMRP3 que codificam polinu-

cleotídeos de RNAi de NtMRP3) capazes de auto-recozimento para formar õ uma estrutura tipo grampo de cabelo, em que o constructo compreende (a) . uma primeira sequência tendo pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, é 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência a uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, íntron 1 (SEQ ID NO: 30), íntron 2 (SEQ ID NO: 31), íntron 3 (SEQ ID NO: 32), íntron 4 (SEQ ID NO: 33), íntron 5 (SEQ ID NO: 34), íntron 6 (SEQ ID NO: 35), íntron 7 (SEQ ID NO: 36), íntron 8 (SEQ ID NO: 37), íntron 9 (SEQ ID NO: 38), íntron 10 (SEQ ID NO: 39), éxon 1 (SEQ ID NO: 40), éxon2(SEQID NO: 41), éxon 3 (SEQ ID NO: 42), éxon 4 (SEQ ID NO: 43), : éxon 5 (SEQ ID NO: 44), éxon 6 (SEQ ID NO: 45), éxon 7 (SEQ ID NO: 46), éxon 8 (SEQ ID NO: 47), éxon 9 (SEQ ID NO: 48), éxon 10 (SEQ ID NO: õ 49), éxon 11 (SEQ ID NO: 50) ou SEQ ID NO: 51 e fragmentos destas, e variantes destas ou uma combinação de duas ou mais destas; (b) uma se- —gunda sequência que codifica um elemento espaçador delas forma uma alça , da estrutura tipo grampo de cabelo; e (c) uma terceira sequência compreen- dendo uma sequência complementar reversa da primeira sequência, posi- . cionada na mesma orientação como a primeira sequência, em que a segun- da sequência é posicionada entre a primeira sequência e a terceira sequên- cia ea segunda sequência é ligada de maneira operável à primeira sequên- - cia e à terceira sequência.

Como descrito aqui, referência às sequências específicas também inclui o complemento ou complemento reverso destas.

Várias modalidades são dirigidas a vetores de expressão com- preendendo: polinucleotídeo de NIMRP ou constructo de RNAi de NtMRP — que codifica polinucleotídeos de RNAi de NtMRP (por exemplo, polinucleoti- deo de NtMRP4 ou constructos de RNAi de NtMRP4 que codificam polinu- cleotídeos de RNAi de NtMRP4) capazes de auto-recozimento para formar uma estrutura tipo grampo de cabelo, em que o constructo compreende (a) uma primeira sequência tendo pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de sequência a uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, intron 1 (SEQ ID NO: 3), íntron 2 (SEQ ID NO: 4), íntron 3 (SEQ ID NO:

5), íntron 4 (SEQ ID NO: 6), íntron 5 (SEQ ID NO: 7), íntron 6 (SEQ ID NO: ! 8), íntron 7 (SEQ ID NO: 9), íntron 8 (SEQ ID NO: 10), íntron 9 (SEQ ID NO: . 11), íntron 10 (SEQ ID NO: 12), éxon 1 (SEQ ID NO: 13), éxon 2 (SEQ ID É NO: 14), éxon 3 (SEQ ID NO: 15), éxon 4 (SEQ ID NO: 16), éxon 5 (SEQ ID -. 5 —NO:17), éxon6 (SEQ ID NO: 18), éxon 7 (SEQ ID NO: 19), éxon 8 (SEQ ID NO: 20), éxon 9 (SEQ ID NO: 21), éxon 10 (SEQ ID NO: 22), éxon 11 (SEQ 1D NO: 53), SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 51 e fragmentos destas, e vari- antes destas ou uma combinação de duas ou mais destas; (b) uma segunda sequência que codifica um elemento espaçador delas forma uma alça da estrutura tipo grampo de cabelo; e (c) uma terceira sequência compreen- : dendo uma sequência complementar reversa da primeira sequência, posi- cionada na mesma orientação como a primeira sequência, em que a segun- É da sequência é posicionada entre a primeira sequência e a terceira sequên- cia, e a segunda sequência é ligada de maneira operável à primeira sequên- ciae à terceira sequência. Como descrito aqui, referência às sequências específicas também inclui o complemento ou complemento reverso destas. As sequências divulgadas podem ser utilizadas para construir : vários polinucleotídeos de NtIMRP que não formam estruturas tipo grampo de cabelo. Por exemplo, um RNA de NtMRP de filamento duplo pode ser formado (1) transcrevendo-se um primeiro filamento do CDNA de NtMRP por . ligação de maneira operável a um primeiro promotor, e (2) transcrevendo-se a sequência complementar reversa do primeiro filamento do fragmento de CDNA de NtMRP por ligação de maneira operável a um segundo promotor. Cada filamento do polinucleotídeo de NtMRP pode ser transcrito do mesmo vetor de expressão, ou de vetores de expressão diferentes. O dúplex de RNA de NtMRP tendo atividade de interferência de RNA pode ser enzimati- camente convertido a siRNAs para reduzir níveis de RNA de NtMRP.

Várias modalidades são dirigidas a vetores de expressão de Nt- MRP compreendendo polinucleotídeo de NtMRP ou constructo de RNAi de —NtMRP que codifica polinucleotíideos de RNAi de NtMRP (por exemplo, veto- res de expressão de NtMRP3 compreendendo polinucleotídeo de NtMRP3 ou constructos de RNAi de NIMRP3 que codificam polinucleotídeos de RNAi de NtMRP3) capazes de auto-recozimento, em que o constructo compreen- Ê de (a) uma primeira sequência tendo pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ & 5 IDNO:28,SEQID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 “10 eSEQIDNO: 51, e fragmentos destas, e variantes destas ou uma combina- : ção de duas ou mais destas; e (b) uma segunda sequência compreendendo uma sequência complementar (por exemplo, complementar reversa) da pri- Ú meira sequência, posicionada na mesma orientação como a primeira se- quência. Como descrito aqui, referência às sequências específicas também incluio complemento ou complemento reverso destas.

: Outras modalidades são dirigidas a vetores de expressão de NtMRP compreendendo polinucleotídeo de NtMRP ou constructo de RNAi de NtMRP que codifica polinucleotídeos de RNAi de NtMRP (por exemplo, vetores de expressão de NtMRP4 compreendendo polinucleotídeo de Nt- MRP4 ou constructos de RNAi de NIMRP4 que codificam polinucleotídeos .: de RNAi de NtIMRP4) capazes de auto-recozimento, em que o constructo compreende (a) uma primeira sequência tendo pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identi- dade de sequência a uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQIDNO:1,SEQID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID —NO:23,SEQID NO: 27 e SEQ ID NO: 53 e fragmentos destas, e variantes destas ou uma combinação de duas ou mais destas; e (b) uma segunda se- quência compreendendo uma sequência complementar (por exemplo, com-

plementar reversa) da primeira sequência, posicionada na mesma orienta- : ção como a primeira sequência. Como descrito aqui, referência às sequên- cias específicas também inclui o complemento ou complemento reverso des- Ú tas.

. 5 Várias composições e métodos são fornecidos para modular (por exemplo, reduzir) os níveis de expressão endógena para membros da famí- lia de gene de NtIMRP promovendo-se a co-supressão da expressão de ge- ne de NtMRP. O fenômeno de co-supressão ocorre como um resultado de introduzir cópias múltiplas de um transgene em um hospedeiro de célula ve- o getal. A integração de cópias múltiplas de um transgene pode resultar em o expressão reduzida do transgene e do gene endógeno alvejado. O grau de co-supressão é dependente do grau de identidade de sequência entre o transgene e o gene endógeno alvejado. O silenciamento tanto do gene en- dógeno quanto do transgene pode ocorrer por metilação extensiva dos locos silenciados (isto é, o promotor endógeno e o gene endógeno de interesse) que podem impedir a transcrição. Alternativamente, em alguns casos, a co- supressão do gene endógeno e do transgene pode ocorrer por silenciamento ' genético pós-transcricional ("PTGS"), em que transcritos podem ser produzi- dos mas taxas realçadas de degradação impedem o acúmulo de transcritos.

O mecanismo para a co-supressão por PTGS é considerado assemelhar-se : à interferência de RNA, em que o RNA parece ser tanto um iniciador impor- tante quanto um alvo nestes processos, e pode ser mediado pelo menos em parte pelo mesmo mecanismo molecular, possivelmente através de degra- dação guiada por RNA de mRNAs.

A co-supressão de polinucleotídeo de NIMRP pode ser obtida in- tegrando-se cópias múltiplas do cDNA de NtMRP ou fragmentos deste, co- mo transgenes, no genoma de uma planta de interesse. A planta hospedeira pode ser transformada com um vetor de expressão compreendendo um promotor ligado de maneira operável ao cDNA de NtMRP ou fragmentos deste. Várias modalidades são dirigidas a vetores de expressão para promo- ver a co-supressão de genes endógenos de NtMRP compreendendo: um promotor ligado de maneira operável a NIMRP (por exemplo, cDNA de Nt-

MRP) identificado como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 28, SEQ : ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 51 ou um fragmento destas - tal como qualquer . uma das SEQ ID NOs 3 a 23 ou 30 a 50 - ou uma variante destas tem pelo : menos cerca de 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de se- quência à esta.

Várias modalidades são dirigidas a métodos para modular (por exemplo, reduzir ou inibir) o nível de expressão de polinucleotídeo de Nt- MRP integrando-se cópias múltiplas de polinucleotideo de NtIMRP (por e- : 10 xemplo, cDNA de NtMRP) identificadas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 51 ou um fragmento des- tas - tal como qualquer uma das SEQ ID Nos 3 a 23 ou 30 a 50 ou 53 - ou uma variante destas tem pelo menos cerca de 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou99% de identidade de sequência à esta em um genoma de planta, com- : preendendo: transformar um hospedeiro de célula vegetal com um vetor de expressão que compreende um promotor ligado de maneira operável à SEQ À ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 289 ou SEQ ID NO: 51 ou um fragmento destas - tal como qualquer uma das SEQ ID NOs 3 a 23 ! 20 ou30a50-ouuma variante destas tem pelo menos cerca de 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à esta.

Várias composições e métodos são fornecidos para reduzir o ní- vel de expressão de gene endógeno de NtMRP inibindo-se a tradução de mMRNA de NtMRP.

Uma célula vegetal hospedeira pode ser transformada com um vetor de expressão compreendendo: um promotor ligado de manei- ra operável a polinucleotídeo de NIMRP ou uma variante ou fragmento des- te, posicionado em orientação de antissentido com respeito ao promotor pa- ra permitir a expressão de polinucieotídeos de RNA tendo uma sequência complementar a uma porção de MRNA de NtMRP.

Vários vetores de expressão para inibir a tradução de mRNA de NtMRP podem compreender: um promotor ligado de maneira operável a Nt-

MRP (por exemplo, cDNA de NtMRP) identificado como SEQ ID NO: 1 ou : SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID No, 28 ou SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 51 ou um fragmento destas - tal como qualquer uma das SEQ - ID NOs 3 a 23 ou 30 a 50 ou 53 - ou uma variante destas tem pelo menos . 5 cerca de 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência à esta em que a sequência é posicionada em orientação de antissentido com respeito ao promotor. Os comprimentos de polinucleotídeos de RNA de Nt- MRP de antissentido podem variar, e podem ser de cerca de 15 a 20 nucleo- “10 tídeos, cerca de 20 a 30 nucleotídeos, cerca de 30 a 50 nucleotídeos, cerca - de 50 a 75 nucleotídeos, cerca de 75 a 100 nucleotídeos, cerca de 100 a 150 nucleotídeos, cerca de 150 a 200 nucleotídeos, e cerca de 200 a 300 É nucleotídeos.

Métodos para obter polinucleotídeos e polipeptídeos de NtIMRP mutantes também são fornecidos. Qualquer planta de interesse, incluindo . uma célula vegetal ou material vegetal, pode ser geneticamente modificada pelos vários métodos conhecidos induzir mutagênese, incluindo mutagênese síitio-dirigida, mutagênese dirigida por oligonucleotídeo, mutagênese quimi- camente induzida, mutagênese induzida por irradiação, mutagênese utili- zando bases modificadas, mutagênese utilizando DNA de dúplex aberto, : mutagênese de quebra de filamento duplo, mutagênese utilizando cepas hospedeiras deficientes de reparo, mutagênese por síntese de gene total, embaralhamento de DNA e outros métodos equivalentes. Alternativamente, genes de NtMRP podem ser alvejados para —inativação introduzindo-se transposons (por exemplo, elementos IS) nos ge- nomas de plantas de interesse. Estes elementos genéticos móveis podem ser introduzidos por interfertiização sexual e mutantes de inserção podem ser triados quanto à perda na atividade de proteína de NtMRP, tal como transporte de cádmio reduzido. O gene de NtMRP rompido em uma planta — precursora pode ser introduzido em outras plantas cruzando-se a planta pre- cursora com a planta não submetida à mutagênese induzida por transposon, por exemplo, por interfertilização sexual. Quaisquer técnicas de reprodução padrão conhecidas a pessoas habilitadas na técnica podem ser utilizadas. ' Em uma modalidade, um ou mais genes relacionados a NIMRP podem ser inativados pela inserção de um ou mais transposons. Mutações podem re- : sultar em rompimento homozigótico de um ou mais genes de NtMRP, em rompimento heterozigótico de um ou mais genes de NtMRP, ou uma combi- nação tanto dos rompimentos homozigóticos quanto heterozigóticos se mais do que um gene de NtMRP é rompido. Elementos de transposição adequa- dos podem ser selecionados de duas classes amplas, designadas como Classe | e Classe !l. Elementos de transposição de Classe | adequados in- : 10 —cluem retrotransposons, retroposons, e elementos semelhantes a SINE. Tais o métodos são conhecidos a pessoas habilitadas na técnica. Alternativamente, genes de NtMRP podem ser alvejados para inativação introduzindo-se ribozimas derivadas de vários RNAs circulares pequenos que são capazes de auto-clivagem e replicação em plantas. Estes

15. RNAs podem replicar sozinhos (RNAs de viróide) ou com um vírus auxiliar . (RNAs de satélite). Exemplos de RNAs adequado incluem aqueles derivados de RNAs de viróide do bronzeamento do abacate e de satélite derivados de vírus da mancha anular do tabaco, vírus das estrias transitórias da alfafa, vírus do mosqueado aveludado do tabaco, vírus do mosqueado de Solanum nodiflorum, e vírus do mosqueado do trevo subterrâneo. Várias ribozimas . específicas de RNA alvo são conhecidas a pessoas habilitadas na técnica. Em algumas modalidades, a expressão de um polipeptídeo de NtMRP é modulada, reduzida, ou inibida por meios não transgênicos, tal como criando uma mutação em um gene de NtMRP, incluindo um gene de NtMRP3 e/ou NIMRP4. Métodos que introduzem uma mutação aleatoria- mente em uma sequência genética podem incluir mutagênese química, mu- tagênese por EMS e mutagênese por radiação. Métodos que introduzem uma ou mais mutações alvejadas em uma célula incluem mas não são limi- tados a tecnologia de edição de genoma, particularmente mutagênese medi- ada por nuclease dedo de zinco, tilling (lesões locais induzidas por alveja- mento em genomas), recombinação homóloga, mutagênese dirigida por oli- gonucleotídeo, e mutagênese mediada por meganuclease.

Alguns exemplos de mutações são supressões, inserções e mu- É tações com troca de sentido de pelo menos um nucleotídeo, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), uma repetição de sequência simples. Depois É da mutação, triagem pode ser realizada para identificar supressões que cri- : 5 am códons de parada prematuros ou de outro modo genes de NtIMRP não funcionais. A triagem de mutantes pode ser realizada por sequenciamento, ou pelo uso de uma ou mais sondas ou iniciadores específicos ao gene de NtMRP ou proteína. Mutações específicas em polinucleotídeos de NtMRP também podem ser criadas que podem resultar em expressão de gene de : 10 NtMRP diminuída, estabilidade diminuída de MRNA de NtMRP, ou estabili- o dade diminuída da proteína de NtMRP. Tais plantas são referidas aqui como plantas "que não ocorrem naturalmente" ou plantas mutadas. P As plantas que não ocorrem naturalmente e mutantes podem ter qualquer combinação de uma ou mais mutações que resulta em níveis de —polipeptídeo de NtIMRP reduzidos. Por exemplo, as plantas podem ter uma única mutação em um único gene de NtMRP ou mutações múltiplas em um único gene de NtMRP. Consequentemente, plantas mutantes ou que não ocorrem naturalmente (por exemplo, plantas de tabaco mutantes, que não ocorrem naturalmente ou transgênicas e semelhantes, como descrito aqui) O compreendendo as variantes de polipeptídeo mutantes de NIMRP, NIMRP3 .: e NtMRP4 são divulgadas.

Em uma modalidade, sementes de plantas são mutagenizadas e depois cultivadas em plantas mutantes de primeira geração. As plantas de primeira geração são depois deixadas autopolinizar e sementes da planta de primeira geração são cultivadas em plantas de segunda geração, que depois são triadas quanto às mutações em seus locos de NtMRP. Ainda que o ma- terial vegetal mutagenizado possa ser triado quanto a mutações, uma vanta- gem de triar as plantas de segunda geração é que todas as mutações somá- ticas correspondem a mutações de linhagem germinativa. Uma pessoa de — habilidade na técnica entenderia que uma variedade de materiais vegetais, incluindo mas não limitados a, sementes, pólen, tecido da planta ou células vegetais, pode ser mutagenizada de modo a criar as plantas mutadas de

NtMRP. Entretanto, o tipo de material vegetal mutagenizado pode afetar : quando o polinucleotídeo da planta é triado quanto a mutações. Por exem- plo, quando pólen é submetido à mutagênese antes da polinização de uma planta não mutagenizada, as sementes resultantes desta polinização são . 5 cultivadas em plantas de primeira geração. Cada célula das plantas de pri- meira geração conterá mutações criadas no pólen; assim estas plantas de primeira geração depois podem ser triadas quanto a mutações de NtMRP ao invés de esperar até a segunda geração. Agentes mutagênicos que criam principalmente mutações de ponto e supressões, inserções, transversões curtas, e ou transições, incluindo agentes mutagênicos químicos ou radia- po ção, podem ser usados para criar as mutações. Agentes mutagênicos inclu- em, mas não são limitados a, metanossulfonato de etila (EMS), metanossul- í fonato de metila (MMS), N-etil-N-nitrosureia (ENU), trietilmelimbo (TEM), N- metil-N-nitrosoureia (MNU), procarbazina, clorambucil, ciclofosfamida, sulfa- to de dietila, monômero de acrilamida, melfalano, mostarda de nitrogênio, vincristina, dimetilnitrosamina, N-metil-N'-nitro-Nitrosoguanidina (MNNG), nitrosoguanidina, 2-aminopurina, 7,12 dimetil-benz(a)antraceno (DMBA), óxido de etileno, hexametilfosforamida, bisulfan, diepoxialcanos (diepoxioc- tano (DEO), diepoxibutano (BEB), e semelhantes), dicloridreto de 2-metóxi- 6-cloro-9[3-(etil-P-cloro-etil)aminopropilamino]acridina (ICR-170), e formalde- . ido. Mutações espontâneas no loco de NtMRP que podem não ter sido dire- tamente causadas pelo agente mutagênico também são consideradas con- tanto que elas resultem no fenótipo desejado descrito aqui. Agentes muta- gênicos adequados também incluem, por exemplo, radiação ionizante - tais —comoraios X, raios gama, irradiação com nêutrons rápidos e radiação UV. Qualquer método de preparação de polinucleotídeo de planta conhecido àquelas de habilidade na técnica pode ser usado para preparar o polinucleotídeo de planta para triagem de mutação de NtMRP.

O polinucleotídeo preparado de plantas individuais pode opcio- —nalmente ser combinado de modo a apressar a triagem quanto a mutações no gene de NtMRP da população inteira de plantas originando-se do tecido de planta mutagenizado. Uma ou mais gerações subsequentes de plantas,

células vegetais ou material vegetal podem ser triadas. O tamanho do grupo ' opcionalmente combinado é dependente da sensibilidade do método de tria- : gem usado.

: Depois que as amostras de polinucleotídeo são opcionalmente . 5 combinadas, elas podem ser submetidas a técnicas de amplificação especí- ficas de polinucleotídeo de NtMRP, tal como Reação em Cadeia de Polime- rase (PCR). Qualquer um ou mais iniciadores ou sondas específicos para o gene de NtMRP ou as sequências imediatamente adjacentes ao gene de NtMRP podem ser utilizados para ampliar as sequências de NtMRP dentro “10 da amostra de polinucleotideo combinado. Preferivelmente, um ou mais ini- * ciadores ou sondas são designados para ampliar as regiões do loco de Nt- MRP onde mutações úteis devem surgir o mais provavelmente. O mais pre- ' ferivelmente, um ou mais iniciadores ou sondas são designados para detec- tar mutações dentro de regiões exônicas de polinucleotídeo de NtMRP. Adi- cionalmente, é preferível que um ou mais iniciadores ou sondas evitem sítios polimórficos conhecidos de modo a facilitar a triagem quanto a mutações de ponto. Para facilitar a detecção de produtos de amplificação, um ou mais í iniciadores ou sondas podem ser rotulados usando qualquer método de rotu- lagem convencional. Um ou mais iniciadores ou sondas podem ser designa- dos com base nas sequências de NtMRP descritas aqui usando métodos que são bem entendidos na técnica. Polimorfismos podem ser identificados por meios conhecidos na técnica. Em um outro aspecto é fornecido um método de preparar uma planta mutante. O método envolve fornecer pelo menos uma célula de uma planta compreendendo um gene que codifica um polipeptídeo de NIMRP funcional. Em seguida, o pelo menos uma célula da planta é tratada sob condições eficazes para modular a atividade do gene de NtMRP. O pelo me- nos uma célula vegetal mutante é depois propagada em uma planta mutan- te, onde a planta mutante tem um nível modulado de polipeptídeo de NIMRP quando comparado àquele de uma planta de controle. Em uma modalidade deste método de fabricar uma planta mutante, a etapa de tratamento envolve submeter o pelo menos uma célula a um agente de mutagenização química como descrito acima e sob condições eficazes para produzir pelo menos É uma célula vegetal mutante.

Em uma outra modalidade deste método, a eta- . pa de tratamento envolve submeter o pelo menos uma célula a uma fonte de : radiação sob condições eficazes para produzir pelo menos uma célula vege- tal mutante.

O termo "planta mutante" inclui plantas mutantes em que o ge- nótipo é modificado quando comparado a uma planta de controle, adequa-

damente por meios exceto engenharia genética ou modificação genética.

Em certas modalidades, a planta mutante, célula vegetal mutan- te ou material vegetal mutante podem compreender uma ou mais mutações que ocorreram naturalmente em uma outra planta, célula vegeta! ou material o vegetal e conferem um traço desejado.

Esta mutação pode ser incorporada (por exemplo, introgredida) em uma outra planta, célula vegetal ou material vegetal (por exemplo, uma planta, célula vegetal ou material vegetal com um fundamento genético diferente à planta da qual a mutação foi derivada) para conferiro traço à esta.

Assim por via de exemplo, uma mutação que ocorreu - naturalmente em uma primeira planta pode ser introduzida em uma segunda planta - tal como uma segunda planta com um fundamento genético diferen- õ te à primeira planta.

A pessoa habilitada é portanto capaz de pesquisar e identificar um planta que carrega naturalmente em seu genoma um ou mais alelos mutantes do gene de NtMRP que conferem um traço desejado.

O(s) . alelo(s) mutante(s) que ocorrem naturalmente podem ser transferidos para a segunda planta por vários métodos incluindo reprodução, retrocruzamento e introgressão para produzir linhagens, variedades ou híbridos que têm uma ou mais mutações no gene de NtMRP.

Plantas que mostram um traço dese- jado podem ser triadas fora de uma combinação de planta mutantes.

Ade- quadamente, a seleção é realizada utilizando o conhecimento das sequên- cias de nucleotideo de NIMRP como descrito aqui.

Consequentemente, é possível triar quanto a um traço genético sendo indicativo para níveis modu- lados (por exemplo diminuídos) de cádmio quando comparado a um contro- le Um tal método de triagem pode envolver a aplicação de técnicas de am- plificação e/ou hibridização de polinucleotídeo convencionais como debatido aqui.

Assim, um outro aspecto refere-se a um método para identificar uma planta mutante compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma amostra compreendendo um polinucleotídeo de NtMRP a partir de uma planta; e (b) S determinar a sequência de polinucleotídeo do polinucleotideo de N'IMRP, em É que uma diferença na sequência do polinucleotídeo de NIMRP quando com- ; 5 parado ao polinucleotideo de NIMRP de um planta de controle é indicativo de que a dita planta é uma planta mutante de NIMRP.

Em um outro aspecto é fornecido um método para identificar uma planta mutante que acumula ní- veis modulados (por exemplo diminuídos) de cádmio quando comparado a uma planta de controle compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma a- “10 mostra de uma planta a ser triada; (b) determinar se a dita amostra compre- “oo ende uma ou mais mutações no polinucleotídeo de NtMRP; e (c) determinar o teor de cádmio em pelo menos uma parte da dita planta; em que se a dita amostra compreende uma ou mais mutações no polinucleotideo de NIMRP que modula (por exemplo diminui) a expressão ou a atividade da proteina codificada quando comparado a uma planta de controle e pelo menos uma parte da planta tem um teor de cádmio modulado (por exemplo diminuído) quando comparado a uma planta de controle em que a expressão ou a ativi- ' dade de NtMRP não foi modulada (por exemplo diminuída) é indicativo de uma planta mutante que ocorre naturalmente que acumula níveis modulados (por exemplo diminuídos) de cádmio.

Em um outro aspecto é fornecido um . método para preparar uma planta mutante que acumula níveis modulados (por exemplo diminuídos) de cádmio quando comparado a uma planta de controle compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma amostra de uma primeira planta; (b) determinar se a dita amostra compreende uma ou mais mutações no polinucleotideo de NtIMRP que resulta em níveis modulados (por exemplo diminuídos) de cádmio neste; e (c) transferir uma ou mais mu- tações em uma segunda planta.

A(s) mutação(ões) podem ser transferidas na segunda planta usando vários métodos que são conhecidos na técnica - tais como por engenharia genética, manipulação genética, introgressão, re- — produção da planta, retrocruzamento e semelhantes.

Em uma modalidade, a primeira planta é uma planta que ocorre naturalmente.

Em uma modalidade, a segunda planta tem um fundamento genético diferente da primeira planta.

Em um outro aspecto é fornecido um método para preparar uma planta mu- : tante que acumula níveis modulados (por exemplo diminuídos) de cádmio : quando comparado a uma planta de controle compreendendo as etapas de: À (a) fornecer uma amostra de uma primeira planta; (b) determinar se a dita : 5 amostra compreende uma ou mais mutações no polinucleotideo de NIMRP que resulta em níveis modulados (por exemplo diminuídos) de cádmio neste; e (c) introgredir uma ou mais mutações da primeira planta em uma segunda planta. Em uma modalidade, a etapa de introgressão compreende reprodu- ção da planta, opcionalmente incluindo retrocruzamento e semelhantes. Em : 10 uma modalidade, a primeira planta é uma planta que ocorre naturalmente. o Em uma modalidade, a segunda planta tem um fundamento genético dife- rente da primeira planta. Em uma modalidade, a primeira planta não é um K cultivar ou um cultivar de elite). Em uma modalidade, a segunda planta é um cultivar ou um cultivar de elite). Um outro aspecto refere-se a uma planta mutante (incluindo uma planta mutante de cultivar ou cultivar de elite) obtida ou obtenível pelos métodos descritos aqui. Em certas modalidades, as plan- tas mutantes podem ter uma ou mais mutações localizadas apenas a uma ! região específica da planta - tal como dentro da sequência do polinucleoti- deo de NtMRP. De acordo com esta modalidade, a sequência genômica re- manescente da planta mutante será a mesma ou substancialmente a mesma . como a planta antes da mutagênese.

Em certas modalidades, as plantas mutantes podem ter uma ou mais mutações localizadas em mais do que uma região da planta - tal como dentro da sequência do polinucleotídeo de NtMRP e em uma ou mais regi- ões adicionais do genoma. De acordo com esta modalidade, a sequência genômica remanescente da planta mutante não será a mesma ou não será substancialmente a mesma como a planta antes da mutagênese. Em certas modalidades, as plantas mutantes podem não ter uma ou mais mutações em um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais éxons do polinucleotideo de N!IMRP; ou podem não ter uma ou mais muta- ções em um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais íntrons do polinucieotídeo de NtMRP; ou podem não ter uma ou mais mutações em um promotor do polinucleotídeo de NtMRP; ou podem não ter : uma ou mais mutações na região não traduzida 3' do polinucleotídeo de Nt- : MRP; ou podem não ter uma ou mais mutações na região não traduzida 5' . do polinucleotideo de NtMRP; ou podem não ter uma ou mais mutações na : 5 região de codificação do polinucleotídeo de NtIMRP; ou podem não ter uma ou mais mutações na região que não de codificação do polinucleotídeo de NtMRP; ou qualquer combinação de duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais; ou seis ou mais destas partes destes.

Em um outro aspecto é fornecido um método de identificar uma planta, uma célula vegetal ou material vegetal compreendendo uma mutação , em um gene que codifica NIMRP compreendendo: (a) submeter uma planta, uma célula vegetal ou material vegetal à mutagênese; (b) obter uma amostra : de polinucleotídeo da dita planta, célula vegetal ou material vegetal ou des- cendentes destes; e (c) determinar a sequência de polinucleotídeo do gene que codifica NIMRP ou uma variante ou um fragmento deste, em que uma - diferença na dita sequência é indicativo de uma ou mais mutações nesta. Proteínas dedo de zinco podem ser usadas para modular (por : exemplo, reduzir ou inibir) a expressão ou a atividade de NtMRP. Em várias modalidades, uma sequência genômica de polinucleotideo compreendendo uma parte de ou toda a sequência de codificação de um polinucleotídeo de .: NtMRP é modificada por mutagênese mediada por nuclease dedo de zinco. A sequência genômica de polinucleotídeo é investigada quanto a um sítio único para ligação da proteína dedo de zinco. Alternativamente, a sequência genômica de polinucleotídeo é investigada quanto a dois sítios únicos para ligação da proteina dedo de zinco em que ambos os sítios estão em filamen- tos opostos e próximos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5,6 ou mais pares de base à parte. Consequentemente, proteínas dedo de zinco que ligam a polinucleoti- deos de NtMRP são fornecidas. Um domínio ou motivo de ligação de DNA dedo de zinco consiste em aproximadamente 30 aminoácidos que dobram em uma estrutura beta-beta-alfa da qual a alfa-hélice (a-hélice) insere na hélice dupla de DNA. Uma "alfa-hélice" refere-se a um motivo na estrutura secundária de uma proteina que é espiralada à direita ou à esquerda em que o hidrogênio de cada grupo N-H de um aminoácido é ligado ao grupo C=O Í de um aminoácido na posição -4 em relação ao primeiro aminoácido. Um "barril beta" (barril B) como usado aqui refere-se a um motivo na estrutura | secundária de uma proteína compreendendo dois filamentos beta (filamen- , 5 tosB)emque o primeiro filamento é o hidrogênio ligado a um segundo fila- mento para formar uma estrutura fechada. Uma "estrutura beta-beta-alfa" como usado aqui refere-se a uma estrutura em uma proteina que consiste em um barril 8 compreendendo dois filamentos B anti-paralelos e uma a- hélice. O termo "domínio de ligação de DNA dedo de zinco" refere-se a um “10 domínio de proteina que compreende um íon zinco e é capaz de ligar-se a A uma sequência de DNA de três pares de base específica. O termo "domínio de ligação de DNA dedo de zinco não natural" refere-se a um domínio de 7 ligação de DNA dedo de zinco que não ocorre na célula ou organismo com- preendendo o DNA que deve ser modificado.

Ss Os aminoácidos chaves dentro de um domínio ou motivo de |i- gação de DNA dedo de zinco que ligam a sequência de três pares de base dentro do DNA alvo, são os aminoácidos -1, +1, +2, +3, +4, +5 e +6 em rela- ção ao começo da alfa-hélice (a-hélice). Os aminoácidos na posição -1, +1, +2, +3, +4, +5 e +6 em relação ao começo da a-hélice de um domínio ou motivo de ligação de DNA dedo de zinco podem ser modificados enquanto . mantendo a estrutura principal de barril beta (barril B) para gerar novos do- mínios ou motivos de ligação de DNA que ligam uma sequência de três pa- res de base diferente. Um tal domínio de ligação de DNA novo pode ser um domínio de ligação de DNA dedo de zinco não natural. Além do reconheci- —mentoda sequência de três pares de base pelos aminoácidos na posição -1, +1, +2, +3, +4, +5 e +6 em relação ao início da a-hélice, alguns destes ami- noácidos também podem interagir com um par de base fora do sítio de reco- nhecimento da sequência de três pares de base. Combinando-se dois, três, quatro, cinco, seis ou mais domínios ou motivos de ligação de DNA dedo de zinco, uma proteina dedo de zinco pode ser gerada que especificamente liga-se a uma sequência de DNA mais longa. Por exemplo, uma proteina dedo de zinco compreendendo dois domínios ou motivos de ligação de DNA dedo de zinco pode reconhecer uma sequência de seis pares de base espe- cífica e uma proteína dedo de zinco compreendendo quatro domínios ou mo- É tivos de ligação de DNA dedo de zinco pode reconhecer uma sequência de doze pares de base específica. Uma proteína dedo de zinco pode compre- . 5 enderdoisou mais domínios ou motivos de ligação de DNA dedo de zinco naturais ou dois ou mais domínios ou motivos de ligação de DNA dedo de Zinco não naturais derivados de uma proteína dedo de zinco natural ou do tipo selvagem por truncamento ou expansão ou um processo de mutagêne- se síitio-dirigida ligada a um método de seleção tal como, mas não limitado a, o seleção por exibição de fago, seleção bacteriana de dois híbridos ou seleção . bacteriana de um híbrido ou qualquer combinação de domínios de ligação de DNA dedo de zinco naturais e não naturais. "Truncamento" como usado den- tro deste contexto refere-se a uma proteína dedo de zinco que contém me- nos do que o número total de domínios ou motivos de ligação de DNA dedo de zinco encontrados na proteina dedo de zinco natural. "Expansão" como usado dentro deste contexto refere-se a uma proteina dedo de zinco que contém mais do que o número total de domínios ou motivos de ligação de DNA dedo de zinco encontrados na proteína dedo de zinco natural. Técnicas para selecionar uma sequência de polinucleotídeo dentro de uma sequência genômica para ligação da proteina dedo de zinco são conhecidas no ramo.

- Métodos para o projeto de domínios de proteína dedo de zinco que ligam sequências de nucleotídeo específicas que são únicas para um gene alvo são conhecidos na técnica. Calcula-se que uma sequência com- preendendo 18 nucleotídeos seja suficiente para especificar uma localização única no genoma de organismos superiores. Tipicamente, portanto, domí- nios de proteina dedo de zinco contêm 6 dedos de zinco, cada um com sua alfa hélice especificamente designada para interação com um tripleto parti- cular. Entretanto, em alguns exemplos, uma sequência alvo de nucleotídeo mais curta ou mais longa pode ser desejável. Assim, os domínios de dedo de zinco nas proteinas podem conter de 2 a 12 dedos - tais como 3 a 8 de- dos, 5 a 7 dedos, ou 6 dedos.

Proteínas dedo de zinco de uso podem compreender pelo me-

nos um polipeptídeo dedo de zinco ligado por intermédio de um ligador, pre- ferivelmente um ligador flexível, a pelo menos um segundo domínio de liga- : ção de DNA, que opcionalmente é um segundo polipeptídeo dedo de zinco. , A proteína dedo de zinco pode conter mais do que dois domínios de ligação . 5 de DNA, assim como um ou mais domínios reguladores. Os polipeptídeos dedo de zinco podem ser engendrados para reconhecer um sítio alvo sele- cionado no gene de escolha.

Em uma modalidade, a proteína dedo de zinco compreende uma estrutura (ou estrutura principal) derivada de uma proteina dedo de zinco “o que ocorre naturalmente. A estrutura (ou estrutura principal) derivada de : qualquer proteína dedo de zinco que ocorre naturalmente pode ser usada. Por exemplo, a proteina dedo de zinco compreendendo uma estrutura (ou É estrutura principal) derivada de uma proteína dedo de zinco compreendendo um motivo de C2H2 pode ser usada. io Em uma outra modalidade específica, a proteína dedo de zinco compreende uma estrutura (ou estrutura principal) derivada de uma proteína dedo de zinco que é naturalmente funcional em células vegetais. Por exem- Y plo, a proteína dedo de zinco pode compreender um dedo de zinco de C3H, um motivo de QALGGH, um motivo de dedo de zinco de RING-H2, um moti- vode C2H2 de 9 aminoácidos, um motivo de dedo de zinco de Arabidopsis : LSD1 e um motivo de dedo de zinco de proteínas de domínio de BBF/Dof.

A proteina dedo de zinco pode ser fornecida às células vegetais por intermédio de quaisquer métodos adequados conhecidos na técnica. Por exemplo, a proteína dedo de zinco pode ser exogenicamente adicionada às células vegetais e as células vegetais são mantidas sob condições tal que a proteina dedo de zinco liga-se à sequência de nucleotídeo alvo e regula a expressão do gene alvo nas células vegetais. Alternativamente, uma se- quência de nucleotídeo que codifica a proteina dedo de zinco pode ser ex- pressada nas células vegetais e as células vegetais são mantidas sob condi- ções tal que a proteina dedo de zinco expressada liga-se à sequência de nucleotídeo alvo e regula a expressão do gene alvo nas células vegetais.

O gene dedo de zinco pode ser expressado em uma planta u-

sando quaisquer vetores de expressão de planta adequados. Vetores típicos úteis para a expressão de genes em plantas superiores são bem conhecidos S na técnica. Além de domínios reguladores, frequentemente a proteína dedo : de zinco pode ser expressada como uma proteína de fusão com proteína de . 5 ligação de maltose ('MBP"), glutationa S transferase (GST), hexahistidina, c- myc, ou o epítopo FLAG, para facilidade de purificação, monitoramento da expressão, ou monitoramento da localização celular e subcelular. Em uma modalidade, uma planta mutada ou que não ocorre na- turalmente ou uma célula vegetal mutada ou que não ocorre naturalmente é | 10 produzida por mutagênese mediada por nuclease dedo de zinco.

' Em uma modalidade específica, uma sequência de DNA genô- mico compreendendo uma parte de ou toda a sequência de codificação de Ê polinucleotideo de NtMRP é modificada por mutagênese mediada por nucle- ase dedo de zinco. A sequência de DNA genômico é investigada quanto a um sítio único para ligação da proteína dedo de zinco. Alternativamente, a - sequência de DNA genômico é investigada quanto a dois sítios únicos para ligação da proteína dedo de zinco em que ambos os sítios estão em filamen- : tos opostos e próximos. Os dois sítios alvos de proteina dedo de zinco po- dem ser O, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais pares de base à parte. O sítio de ligação de proteina dedo de zinco pode estar na sequência de codificação da se- .: quência de gene de NtMRP ou um elemento regulador que controla a ex- pressão do gene de NtMRP, tal como mas não limitada à região promotora do gene de NtMRP. Particularmente, uma ou ambas as proteínas dedo de zinco são proteínas dedo de zinco não naturais Consequentemente, a divulgação fornece proteínas dedo de zin- co que ligam-se ao polinucleotídeo de NtMRP. Considera-se que um método para mutar uma sequência genéti- ca, tal como uma sequência de DNA genômico, que codifica o gene de Nt- MRP por mutagênese mediada por nuclease dedo de zinco compreenda op- cionalmente uma ou mais das etapas seguintes: (i) fornecer pelo menos du- as proteinas dedo de zinco que seletivamente ligam diferentes sítios alvos na sequência genética; (ii) construir dois constructos de expressão cada uma codificando uma nuclease dedo de zinco diferente que compreende uma das . duas proteínas dedo de zinco não naturais diferentes da etapa (1) e uma nu- . clease, ligada de maneira operável a sequências de controle de expressão ' operáveis em uma célula vegetal; (iii) introduzir os dois constructos de ex- pressão em uma célula vegetal em que as duas nucleases dedo de zinco diferentes são produzidas, tal que uma quebra de filamento duplo é introdu- zida na sequência de DNA genômico no genoma da célula vegetal, em ou perto de pelo menos um dos sítios alvos. A introdução dos dois constructos de expressão na célula vegetal pode ser realizada simultaneamente ou se- quencialmente, opcionalmente incluindo a seleção de células que adotaram no a primeiro constructo.

Uma quebra de filamento duplo (DSB) como usado aqui, refere- : se a uma quebra em ambos os filamentos do DNA ou RNA. A quebra de fi- lamento duplo pode ocorrer na sequência de DNA genômico em um sítio que nãoé mais do que entre 5 pares de base e 1500 pares de base, particular- : mente não mais do que entre 5 pares de base e 200 pares de base, particu- larmente não mais do que entre 5 pares de base e 20 pares de base removi- dos de um dos sítios alvos. A quebra de filamento duplo pode facilitar a jun- ção da extremidade não homóloga levando a uma mutação na sequência de DNA genômico em ou perto do alvo sítio. "Junção da extremidade não ho- ; móloga (NHEJ)" como usado aqui refere-se a um mecanismo de reparo que repara uma quebra de filamento duplo por ligação direta sem a necessidade para um padrão homólogo, e assim pode ser mutagênico em relação à se- quência antes que a quebra de filamento duplo ocorra. O método opcionalmente pode compreender ainda a etapa de (iv) introduzir na célula vegeta! um polinucleotídeo compreendendo pelo me- nos uma primeira região de homologia a uma sequência de nucleotídeo a montante da quebra de filamento duplo e uma segunda região de homologia a uma sequência de nucleotídeo a jusante da quebra de filamento duplo. O —polinucleotideo pode compreender uma sequência de nucleotídeo que cor- responde à sequência de polinucleotídeo de NIMRP que contém uma su- pressão ou uma inserção de sequências de nucleotídeo heterólogas. O poli-

nucleotídeo pode assim facilitar a recombinação homóloga em ou perto do sítio alvo resultando na inserção da sequência heteróloga no genoma ou õ supressão da sequência de DNA genômico do genoma. A sequência de DNA genômico resultante na célula vegetal pode compreender uma mutação que interrompe a atividade enzimática de uma proteína de NIÍMRP mutante expressada, um códon de parada de tradução inicial, ou um motivo de se- quência que interfere com o processamento apropriado do pré-mRNA em um mRNA resultando na expressão ou inativação reduzidas do gene. Méto- dos para interromper a síntese de proteína mutando-se uma sequência ge- ! 10 —nética que codifica uma proteína são conhecidos àquelas habilitados na téc- dO nica.

Uma nuclease dedo de zinco pode ser construída fazendo-se É uma fusão de um primeiro polinucleotídeo que codifica uma proteina dedo de zinco que liga-se ao polinucleotídeo de NtMRP, e um segundo polinucleo- tídeo que codifica uma endonuclease não específica tal como, mas não limi- tada, àquelas de uma endonuclease do Tipo IIS. Uma endonuclease do Tipo 1IS é uma enzima de restrição tendo um domínio de reconhecimento separa- T do e um domínio de clivagem de endonuclease em que a enzima cliva o DNA em sítios que são removidos do sítio de reconhecimento. Exemplos nãolimitantes de endonucleases do Tipo IIS podem ser, mas não limitam-se ” a, Aarl, Bael, Cdil, Drdll, Ecil, Fokl, Faul, Gdill, Hgal, Ksp6321, Mboll, P- fI11081, RIe108I, RIeAI, Sapl, TspDTI ou UbaPI. Métodos para o projeto e constructo de proteínas de fusão, mé- todos para a seleção e separação do domínio de endonuclease do domínio de reconhecimento de sequência de uma endonuclease do Tipo IIS, méto- dos para o projeto e constructo de uma nuclease dedo de zinco compreen- dendo uma proteína de fusão de uma proteína dedo de zinco e uma endo- nuclease, são conhecidos na técnica. Em uma modalidade específica, o do- mínio de nuclease em uma nuclease dedo de zinco é Fokl. Uma proteína de fusão entre uma proteina dedo de zinco e a nuclease de Fokl podem com- preender um espaçador consistindo em dois pares de base ou alternativa- mente, o espaçador pode consistir em três, quatro, cinco, seis ou mais pares de base. Em uma modalidade, é descrita uma proteína de fusão com um é espaçador com sete pares de base tal que a endonuclease de uma primeira b nuclease dedo de zinco pode dimerizar em contatar uma segunda nuclease ; dedo de zinco, em que as duas proteínas dedo de zinco que compõem as : 5 ditas nucleases dedo de zinco podem ligar a montante e a jusante da se- quência de DNA alvo. Na dimerização, uma nuclease dedo de zinco pode introduzir uma quebra de filamento duplo em uma sequência de nucleotídeo alvo que pode ser seguida por junção da extremidade não homóloga ou re- combinação homóloga com uma sequência de nucleotídeo exógena tendo homologia às regiões flanqueando ambos os lados da quebra de filamento o duplo.

Ainda em uma outra modalidade, é fornecida uma proteína de : fusão compreendendo uma proteína dedo de zinco e uma proteína realçado- ra resultando em um ativador de dedo de zinco. Um ativador de dedo de zin- co pode ser usado para suprarregular ou ativar a transcrição do gene de Nt- - MRP, compreendendo as etapas de (i) engendrar uma proteína dedo de zin- co que liga uma região dentro de um promotor ou uma sequência operativa- : mente ligada a uma sequência de codificação do gene de NtMRP, (ii) prepa- rar uma proteína de fusão entre a dita proteína dedo de zinco e um ativador de transcrição, (iii) preparar um constructo de expressão compreendendo - uma sequência de polinucleotídeo que codifica o dito ativador de dedo de zinco sob o controle de um promotor ativo em uma célula, tal como célula vegetal, (iv) introduzir a dito constructo de gene na célula, e (v) cultivar a cé- lula e permitir a expressão do ativador de dedo de zinco, e (vi) caracterizar a —célulatendo uma expressão aumentada da proteína de NtIMRP.

Ainda em uma outra modalidade, a divulgação fornece uma pro- teina de fusão compreendendo uma proteína dedo de zinco e um repressor de gene resultando em um repressor de dedo de zinco. Um repressor de dedo de zinco pode ser usado para infrarregular ou reprimir a transcrição do —polinucleotideo de N!IMRP, compreendendo as etapas de (i) engendrar uma proteína dedo de zinco que liga-se a uma região dentro de um promotor ou uma sequência operativamente ligada ao polinucleotíideo de NtMRP, e (ii)

preparar uma proteína de fusão entre a dita proteína dedo de zinco e um repressor de transcrição, e (iii) desenvolver um constructo de gene compre- : endendo uma sequência de polinucleotíideo que codifica o dito repressor de í dedo de zinco sob o controle de um promotor ativo em uma célula, tal como ; 5 uma célula vegetal, e (iv) introduzir a dito constructo de gene na célula, e (v) levar em consideração a expressão do repressor de dedo de zinco, e (vi) caracterizar a célula tendo transcrição reduzida de polinucleotídeo de Nt- MRP.

Ainda em uma outra modalidade, a divulgação fornece uma pro- teínade fusão compreendendo uma proteína dedo de zinco e uma metilase : resultando em uma metilase dedo de zinco. A metilase dedo de zinco pode ser usada para infrarregular ou inibir a expressão de polinucleotídeo de Nt- õ MRP em uma célula, tal como célula vegetal, metilando-se uma região den- tro da região promotora de polinucleotídeo de NtMRP, compreendendo as etapas de (i) engendrar uma proteina dedo de zinco que pode ligar-se a uma região dentro de um promotor de polinucleotideo de NtMRP, e (ii) preparar uma proteína de fusão entre a dita proteína dedo de zinco e uma metilase, e É (iii) desenvolver um constructo de gene contendo um polinucleotídeo que codifica a dita metilase dedo de zinco sob o controle de um promotor ativo nacélula,e (iv) introduzir a dito constructo de gene na célula, e (v) permitir a : expressão da metilase dedo de zinco, e (vi) caracterizar a célula tendo ex- pressão reduzida ou essencialmente nenhuma expressão da proteina de NtMRP na célula. Em várias modalidades, uma proteína dedo de zinco pode ser selecionada de acordo com métodos descritos aqui para ligar-se a uma sequência reguladora de polinucleotídeo de NtMRP. Mais especificamente, a sequência reguladora pode compreender um sítio de início da transcrição, um códon de início, uma região de um éxon, um limite de um éxon-íntron, um terminador, ou um códon de parada. A proteína dedo de zinco pode ser fundida a uma nuclease, um ativador, ou uma proteína repressora. Em várias modalidades, uma nuclease dedo de zinco introduz uma quebra de filamento duplo em uma região reguladora, uma região de codificação, ou uma região que não de codificação de uma sequência de

DNA genômico de polinucleotídeo de NtMRP, e leva a uma redução, uma : inibição ou uma inibição substancial do nível de expressão do polinucleoti- : deo de NtMRP, ou uma redução, uma inibição ou uma inibição substancial À da atividade da proteína codificada desse modo.

A divulgação também fornece um método para modificar uma célula, tal como uma célula vegetal, em que o genoma da célula vegetal é modificado por mutagênese mediada por nuclease dedo de zinco, compre- endendo (a) identificar e preparar pelo menos duas proteínas dedo de zinco não naturais que seletivamente ligam sítios alvos diferentes para modifica- “10 ção na sequência de nucleotídeo genômica; (b) expressar pelo menos duas ro proteínas de fusão, cada uma compreendendo uma nuclease e uma de pelo menos duas proteínas dedo de zinco não naturais na célula vegetal, tal que í uma quebra de filamento duplo é introduzida na sequência de nucleotídeo genômica no genoma de planta, particularmente em ou próximo a um sítio alvona sequência de nucleotídeo genômica; e, opcionalmente (c) introduzir na célula um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo que compreende uma primeira região de homologia a uma sequência a mon- f tante da quebra de filamento duplo e uma segunda região de homologia a uma região a jusante da quebra de filamento duplo, tal que o polinucleotídeo —recombina com o DNA no genoma. Também descrito, são células compre- é endendo uma ou mais constructos de expressão que compreendem sequên- cias de nucleotídeo que codificam uma ou mais das proteínas de fusão.

Em um outro aspecto, a divulgação fornece ainda métodos para produzir plantas mutantes, que não ocorrem naturalmente ou transgênicas —oude outro modo geneticamente modificadas usando meganucleases - tais como |-Crel. Meganucleases que ocorrem naturalmente assim como mega- nucleases recombinantes podem ser usadas para causar especificamente uma quebra de filamento duplo em um sítio único ou em relativamente pou- cos sítios no DNA genômico de uma planta para levar em consideração a interrupção de um gene de NtMRP. A meganuclease pode ser uma meganu- clease engendrada com propriedades de reconhecimento de DNA alteradas propriedades de reconhecimento de DNA. Proteínas de meganuclease po-

dem ser liberadas em células vegetais por uma variedade de mecanismos diferentes conhecidos na técnica. A meganuclease pode ser uma meganu- : clease engendrada com propriedades de reconhecimento de DNA alteradas. : Esta citação descreve métodos para a engenharia com base em estrutura de - 5 —meganucleases derivadas da meganuclease que ocorre naturalmente |-Crel. Estas meganucleases engendradas podem ser fabricadas para reconhecer e cortar sequências de DNA de 22 pares de base predeterminadas encontra- das nos genomas de plantas. Proteínas de meganuclease podem ser libera- das em células vegetais por uma variedade de mecanismos diferentes co- —nhecidos na técnica. Aspectos da divulgação levam em consideração o uso de mega- nucleases para inativar polinucleotideo de NIMRP em uma célula vegetal ou ; planta. Aspectos também referem-se a um método para inativar o polinucleo- tídeo de NIMRP em uma planta usando uma meganuclease compreenden- do: (a) fornecer uma célula vegetal compreendendo polinucleotídeo de Nt- MRP; (b) introduzir uma meganuclease ou um constructo que codifica uma meganuclease na dita célula vegetal; e (c) permitir que a meganuclease ina- tive o polinucleotídeo de NtMRP.

Meganucleases podem ser usadas para clivar sítios de reconhe- cimento de meganuclease dentro das regiões de codificação do polinucleoti- - deo de NtMRP. Tal clivagem frequentemente resulta na supressão do DNA no sítio de reconhecimento de meganuclease a seguir do reparo de DNA mutagênico por junção da extremidade não homóloga. Tais mutações na sequência de codificação de gene são tipicamente suficientes para inativar o gene. Este método envolve, primeiro, a liberação de um cassete de expres- são de meganuclease a uma célula vegetal usando um método de transfor- mação adequado. Para eficiência mais alta, é desejável ligar o cassete de expressão de meganuclease a um marcador selecionável e selecionar quan- to a células transformadas com êxito na presença de um agente de seleção. Este método resultará na integração do cassete de expressão de meganu- clease no genoma, entretanto, que pode não ser desejável se a planta for provável a requerer aprovação reguladora. Em tais casos, o cassete de ex-

pressão de meganuclease (e gene marcador selecionável ligado) pode ser É segregado imediatamente em gerações de plantas subsequentes usando técnicas de reprodução convencionais.

Alternativamente, células vegetais É podem ser inicialmente transformadas com um cassete de expressão de —meganuclease que carece de um marcador selecionável e podem ser culti- vadas em meios que carecem de um agente de seleção.

Sob tais condições, uma fração das células tratadas adquirá o cassete de expressão de mega- nuclease e expressará a meganuclease engendrada transitoriamente sem integrar o cassete de expressão de meganuclease no genoma.

Porque isto : 10 não considera a eficiência da transformação, este último procedimento trans- Do formação requer que um maior número de células tratadas seja triado para obter a modificação de genoma desejada.

A seguir da liberação do cassete de expressão de meganuclea- se, células vegetais são cultivadas, inicialmente, sob condições que são típi- casparao procedimento de transformação particular que foi usado.

Isto po- de significar cultivar células transformada em meios em temperaturas abaixo de 26 graus C., frequentemente no escuro.

Tais condições padrão podem ' ser usadas por um período de tempo, preferivelmente 1 a 4 dias, para permi- tir que a célula vegetal se recupere do processo de transformação.

Em qual- quer ponto a seguir deste período de recuperação inicial, a temperatura de - crescimento pode ser elevada para estimular a atividade da meganuclease engendrada para clivar e mutar o sítio de reconhecimento de meganuclease.

Para certas aplicações, pode ser desejável remover precisamen- te o polinucleotídeo de NtMRP do genoma de uma planta.

Tais aplicações são possíveis usando um par de meganucleases engendradas, cada uma da qual cliva um sítio de reconhecimento de meganuclease em qualquer lado da supressão intencionada.

Constructos recombinantes fornecidas aqui po- dem ser usadas para transformar plantas ou células vegetais de modo a modular (por exemplo, reduzir ou inibir) níveis de expressão de proteína de —NtMRP.

Um constructo de polinucleotideo recombinante pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de NtMRP como descrito aqui, ligado de maneira operável a uma região reguladora adequada para expressar o polipeptídeo de NtMRP na planta ou célula.

Assim, um polinu- : cleotídeo pode compreender uma sequência de codificação que codifica o polipeptídeo de NIMRP como descrito aqui ou uma variante deste.

O polipeptídeo de NtMRP codificado por um polinucleotídeo re- à 5 combinante pode ser um polipeptídeo de NtMRP nativo, ou pode ser heteró- logo à célula.

Em alguns casos, o constructo recombinante contém um poli- nucleotídeo que reduz ou inibe a expressão de um polipeptídeo de modula- ção de NtMRP, ligado de maneira operável a uma região reguladora.

Exem- plos de regiões reguladoras adequadas são descritos aqui. “o Vetores contendo constructos de polinucleotídeo recombinante : tais como aquelas descritas aqui também são fornecidas.

Estruturas princi- pais de vetor adequadas incluem, por exemplo, aquelas rotineiramente usa- , das na técnica tais como plasmídeos, vírus, cromossomos artificiais, BACs, YACs, ou PACs.

Vetores de expressão adequados incluem, sem limitação, plasmídeos e vetores virais derivados de, por exemplo, bacteriófago, baculo- vírus, e retrovírus.

Numerosos vetores e sistemas de expressão estão co- mercialmente disponíveis. ' Os vetores também podem incluir, por exemplo, origens de repli- cação, regiões de interação com andaime (SARs) ou marcadores.

Um gene “20 marcador pode conferir um fenótipo selecionável em uma célula vegetal.

Por : exemplo, um marcador pode conferir resistência a biocida, tal como resis- tência a um antibiótico (por exemplo, canamicina, G418, bleomicina, ou hi- gromicina), ou um herbicida (por exemplo, glifosato, clorsulfuron ou fosfino- tricina). Além disso, um vetor de expressão podem incluir uma sequência de rótulo designada para facilitar a manipulação ou detecção (por exemplo, pu- rificação ou localização) do polipeptídeo expressado.

Sequências de rótulo, tais como sequências de luciferase, beta-glucuronidase (GUS), proteína fluo- rescente verde (GFP), glutationa S-transferase (GST), poliistidina, c-myc ou hemaglutinina tipicamente são expressadas como uma fusão com o polipep- tídeo codificado.

Tais rótulos podem ser inseridos em qualquer lugar dentro do polipeptídeo, incluindo no término carboxila ou amino.

Várias modalidades são dirigidas a plantas mutantes, que não ocorrem naturalmente ou transgênicas que são modificadas para reduzir o ' nível de expressão de gene de NtMRP por vários métodos que podem ser - utilizados para reduzir ou silenciar a expressão de gene de NtMRP, e desse modo, produzir plantas em que o nível de expressão de transportadores de . 5 — NtMRP pode ser reduzido dentro dos tecidos de plantas de interesse. Taxas de transporte de metal pesado e padrões de distribuição de transporte de metal pesado, em particular, transporte de cádmio, podem ser alteradas em plantas produzidas de acordo com os métodos e composições divulgados. Plantas adequadas para o uso na modificação genética incluem “10 plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas e sistemas de célula vegetal, To incluindo as espécies de uma das famílias seguintes: Acanthaceae, Alliace- ae, Alstroemeriaceae, Amarillidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteracea- : e, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucur- bitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxilaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiacea- e, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantagina- ' ceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanace- ae, Taxaceae, Theaceae, ou Vitaceae.

Espécies adequadas podem incluir membros dos gêneros Abel- . moschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Ca- lendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catha- ranthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchi- cum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Di- oscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxilum, Eucalipto, Festuca, Fra- garia, Galanthus, Glicina, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyosc- yamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodi- um, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Pani- cum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, San- guinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanace-

tum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, : Vitis, e Zea.

Espécies adequadas podem incluir Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropo- ' 5 gon gerardii (capim-andropogon), Pennisetum purpureum (capim-elefante), Phalaris arundinacea (capim-amarelo), “Cynodon dactylon (grama- bermudas), Festuca arundinacea (festuca), Spartina pectinata (cordgrass de pradaria), Medicago sativa (alfalfa), Arundo donax (cana-da-índia), Secale cereale (centeio), Salix spp. (salgueiro), Eucalyptus spp. (eucalipto), Tritico- secale (triticale x centeio), bambu, Helianthus annuus (girassol), Carthamus . tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (pinhão manso), Ricinus communis (mamona), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (linho), Brassica À juncea, Beta vulgaris (beterraba sacarina), Manihot esculenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca sativa (alface), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócolis, couve- flor, couve-de-bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (mo- rango), Theobroma cacao (cacau), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), " Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (pimenta picante & pimentão), Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cu- “20 curbita maxima (abóbora), Cucurbita moschata (abóbora), Spinacea olera- . cea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschus esculentus (quia- bo), Solanum melongena (berinjela), Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (cravo), Petunia spp. (petúnia), Poinsettia pulcherrima (poinsetia), Lupinus albus (tremoço), Uniola paniculata (aveia), agrótis (Agrostis spp.), Populus tremuloides (álamo tremedor), Pinus spp. (pinho), Abies spp. (abeto), Acer spp. (bordo), Hordeum vulgare (cevada), Poa pratensis (grama azul), Lolium Spp. (azevém) e Phleum pratense (capim-rabo-de-rato), Panicum virgatum (painço amarelo), Sorghum bicolor (sorgo, erva-do-sudão), Miscanthus gi- ganteus (miscanto), Saccharum sp. (cana energética), Populus balsamifera (álamo), Zea mays (milho), Glicina max (soja), Brassica napus (canola), Triti- cum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodão), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfalfa), Beta vulgaris (beter-

raba-sacarina), ou Pennisetum glaucum (milheto). : Várias modalidades são dirigidas a plantas mutantes, plantas S que não ocorrem naturalmente ou plantas transgênicas modificadas para é modular (por exemplo, reduzir ou inibir) níveis de expressão de gene de Nt- F 5 —MRP desse modo, produzindo plantas - tais como plantas de tabaco - em que o nível de expressão de NtMRP é reduzido dentro dos tecidos de plan- tas de interesse quando comparado a uma planta de controle. As composi- ções e métodos divulgados podem ser aplicados a quaisquer espécies do gênero Nicotiana, incluindo N. rustica e N. tabacum (por exemplo, LA B21, “o LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1, e Petico). E Outras espécies incluem N. acaulis, N. acuminata, N. acuminata var. multiflo- ra, N. africana, N. alata, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. bena- ! videsii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. Cleve- landii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N.

fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. híbrido, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. ob- " tusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. pa- niculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N.

raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, : N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. sua- veolens, N. syivestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N.

trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides, e N. x sanderae.

O uso de cultivares de tabaco e cultivares de tabaco de elite também é considerado aqui. A planta transgênica, que não ocorre natural- mente ou mutante portanto pode ser uma variedade de tabaco ou cultivar de tabaco de elite que compreende um ou mais transgenes, ou uma ou mais mutações genéticas ou uma combinação destes. A(s) mutação(ões) genéti- ca(s) (por exemplo, um ou mais polimorfismos) podem ser mutações que não existem naturalmente na variedade de tabaco ou cultivar de tabaco indi- viduais (por exemplo, cultivar de tabaco de elite) ou podem ser mutação(ões)

genética(s) que ocorrem naturalmente contanto que a mutação não ocorra ' naturalmente na variedade de tabaco ou cultivar de tabaco individuais (por : exemplo, cultivar de tabaco de elite). Variedades de Nicotiana tabacum particularmente úteis incluem —tabacos do tipo Burley, do tipo escuro, do tipo curado por combustão, e do tipo Oriental. Exemplos não limitantes de variedades ou cultivares são: BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Ouro, Coker 48, CD 263, DF911, tabaco DT 538 LC Galpao, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, Híbrido 403LC, Híbrido a 404LC, Híbrido 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, : KY907LC, KTY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-

15. 777LC, N-7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD í 7312 LC, tabaco 'Perique', PVHO3, PVHO09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R7 - 11, R7 - 12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, . Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TNB86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37 - 1, B 13P, Xanthi (Mitchell-Mor), Bel-W3, 79 - 615, Samsun Holmes NN, KTRDC número 2 Híbrido 49, Burley 21, KY 8959, KY 9, MD 609, PGO01, PG 04, PO1, PO2, PO03, RG11, RG 8, VA 509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma | Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpao Comum, HBO4P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, KutsageE1, LA BU 21,NC 2326, NC 297, PVH2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12 - 2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-

960, Ti-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xan- ' thi, GR149, GR153, Petit Havana. Subvariedades de conversor baixo do a- cima, mesmo se não especificamente identificadas aqui, também são consi- Ê deradas.

. 5 Em um outro aspecto, é fornecida uma planta mutante, que não ocorre naturalmente ou transgênica como descrito aqui que foi modificada ainda tal que a expressão de transportadores de NtHMA também é reduzida o que pode reduzir ainda o teor de cádmio na planta. O uso de transportado- res de NtHMA para reduzir o teor de cádmio na planta é descrito em “10 WOZ2Z009074325. Deste modo, de acordo com uma modalidade é fornecida E uma célula vegetal mutante, que não ocorre naturalmente ou transgênica compreendendo um polinucleotídeo isolado de NtIMRP, um gene de NtMRP É quimérico, um constructo de polinucleotídeo de N!IMRP, um RNA de NtIMRP de filamento duplo, um NtMRP conjugado e/ou um vetor de expressão de NtMRP junto com um polinucleotídeo de NtHMA isolado, um gene quimérico de NtHMA, um constructo de polinucleotídeo de NtHMA, um RNA de fila- mento duplo de NtHMA, um NtHMA conjugado e/ou um vetor de expressão " de NtHMA. Modalidades também são dirigidas a composições e métodos para produzir plantas mutantes, plantas que não ocorrem naturalmente, . plantas híbridas, ou plantas transgênicas que foram modificadas para modu- lar (por exemplo, reduzir ou inibir) a expressão ou atividade de NIMRP de modo que quantidades mais baixas de cádmio são acumuladas nestas quando comparado a um controle. Em certas modalidades, as plantas que são obtidas são similares ou substancialmente as mesmas em aparência global (por exemplo, fenótipo) às plantas de controle. Várias características fenotípicas tais como grau de maturidade, número de folhas por planta, altu- ra do pedúnculo, ângulo de inserção da folha, tamanho da folha (largura e comprimento), distância internódio, e razão de limbo-nervura central podem ser avaliados por observações de campo. Em uma modalidade preferida, a altura ou peso, ou altura e peso das plantas, são substancialmente os mes- mos como as plantas de controle. Em uma outra modalidade preferida, ne-

nhuma diferença significante é encontrada em folhas secas coletadas das ' plantas quando comparado a um controle assim indicando que a modulação : de transcritos de NIMRP não têm nenhum efeito estatisticamente relevante : sobre a biomassa seca > 5 Um aspecto é uma semente da planta mutante, da planta que não ocorre naturalmente, da planta híbrida ou da planta transgênica. Preferi- velmente, a semente é uma semente de tabaco. Um outro aspecto é pólen ou um óvulo da planta mutante, da planta que não ocorre naturalmente, da planta híbrida ou da planta transgênica. Além disso, uma planta mutante, “10 uma planta que não ocorre naturalmente, uma planta híbrida, uma planta Ea transgênica são descritas que compreendem ainda um polinucleotídeo que confere esterilidade masculina.

É A divulgação também fornece uma cultura tecidual de células regeneráveis da planta mutante, planta que não ocorre naturalmente, planta híbrida, ou planta transgênica ou uma parte desta, cultura esta que regenera : plantas capazes de expressar todas as características morfológicas e fisioló- gicas do precursor. As células regeneráveis incluem mas não são limitadas a células de folhas, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilos, raízes, pontas de raízes, anteras, flores e uma parte destas, óvulos, brotos, caules, pedúncu- los, medula e cápsulas ou calo ou protoplastas derivados destas.

: Em algumas modalidades, uma planta em que a expressão de polinucleotideo de NtMRP é modulada (por exemplo, reduzida ou inibida) pode ter níveis diminuídos de metal pesado - tal como cádmio - especial- mente nas folhas. O nível de cádmio pode ser diminuído em pelo menos cerca de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais - tal como 100%, 125%, 150% ou 200% ou mais quando comparado ao nível de cádmio em uma planta de controle correspondente em que a expressão de polinucleotídeo de NtMRP não foi modulada (por exemplo, reduzida ou inibida). Em algumas modalidades, uma planta em que a expressão de polinucleotídeo de NIMRP é modulada (por exemplo, reduzida ou inibida) pode ter níveis aumentados ou diminuídos de cádmio nas raízes. Em algumas modalidades, uma planta É em que a expressão de polinucleotídeo de NtMRP é modulada (por exemplo, : reduzida ou inibida) pode ter níveis diminuídos ou aumentados de cádmio nas raízes e níveis diminuídos de cádmio nas folhas. Em algumas modalida- - 5 des, uma planta em que a expressão de polinucleotídeo de NIMRP é modu- lada (por exemplo, reduzida ou inibida) pode ter níveis diminuídos de cádmio na biomassa colhível.

A expressão pode ser avaliada usando métodos incluindo, por exemplo, RT-PCR, Northern blots, proteção de RNase, extensões de inicia- dor, Western blots, eletroforese em gel de proteína, imunoprecipitação, imu- o noensaios ligados à enzima, ensaios de chip, e espectrometria de massa. Deve ser observado que se um polipeptídeo é expressado sob o controle de um promotor preferencial de tecido ou de expressão ampla, a expressão po- de ser avaliada na planta inteira ou em um tecido selecionado. Similarmente, seum polipeptídeo é expressado em um tempo particular, por exemplo, em um tempo particular no desenvolvimento ou na indução, a expressão pode ser avaliada seletivamente em um período de tempo desejado. É Uma população de plantas mutantes, que não ocorrem natural- mente ou transgênicas pode ser triada ou selecionada quanto àqueles mem- bros da população que têm um traço ou fenótipo desejado. Por exemplo, . uma população de progênie de um evento de transformação único pode ser triada quanto àquelas plantas tendo um nível desejado de expressão de po- lipeptídeo ou polinucleotídeo de NtMRP. Métodos físicos e bioquímicos po- dem ser usados para identificar níveis de expressão. Estes incluem análise de Southern ou amplificação por PCR para a detecção de um polinucleotí- deo; Northern blots, proteção de S1 RNase, extensão de iniciador, ou ampli- ficação por RT-PCR para detectar transcritos de RNA; ensaios enzimáticos para detectar a atividade de enzima ou ribozima de polipeptídeos e polinu- cleotídeos; e eletroforese em gel de proteina, Western blots, imunoprecipita- ção, e imunoensaios ligados à enzima para detectar polipeptídeos. Outras técnicas tais como hibridização in situ, manchamento enzimático, e imuno- manchamento também podem ser usadas para detectar a presença ou ex-

pressão de polipeptídeos ou polinucleotídeos. õ Uma população de plantas pode ser triada quanto àquelas pian- tas tendo um traço desejado, tal como um nível modulado (por exemplo, re- é duzido ou inibido) de cádmio.

Seleção ou triagem podem ser realizadas so- breuma ou mais gerações, ou em mais do que um local geográfico.

Em al- guns casos, plantas mutantes, que não ocorrem naturalmente ou transgêni- cas podem ser cultivadas e selecionadas sob condições que induzem um fenótipo desejado ou são de outro modo necessárias para produzir um fenó- tipo desejado em uma planta mutante, que não ocorre naturalmente ou “10 transgênica.

Além disso, seleção ou triagem podem ser aplicadas durante ... um estágio de desenvolvimento particular em que o fenótipo é esperado ser exibido pela planta.

Seleção ou triagem podem ser realizadas para escolher aquelas plantas mutantes, que não ocorrem naturalmente ou transgênicas tendo uma diferença estatisticamente significante em seu teor de cádmio em relação a uma planta de controle que em que a expressão ou atividade de . polinucleotídeo ou proteína de NIMRP não foi modulada (por exemplo, redu- zida ou inibida). Células vegetais e plantas mutantes, que não ocorrem natu- * ralmente ou transgênicas são descritas aqui compreendendo um ou mais polinucleotídeos recombinantes - tais como o polinucleotídeo isolado, o gene — quimérico, o constructo de polinucleotídeo, o RNA de filamento duplo, o con- ; jugado ou o vetor de expressão.

Uma planta ou célula vegetal pode ser transformada por ter o polinucleotídeo recombinante integrado em seu ge- noma para tornar-se estavelmente transformada.

Células estavelmente transformadas tipicamente retém o polinucleotídeo introduzido com cada divisão celular.

Uma planta ou célula vegetal também pode ser transitoria- mente transformada tal que o polinucleotídeo recombinante não é integrado em seu genoma.

Células transitoriamente transformadas tipicamente perdem todo ou alguma porção do polinucleotídeo recombinante introduzido com cada divisão celular tal que o polinucleotídeo recombinante introduzido não — pode ser detectado em células descendentes depois de um número suficien- te de divisões celulares.

Técnicas para introduzir polinucleotídeos em plan- tas monocotiledôneas e dicotiledôneas são conhecidos na técnica, e inclu-

em, por exemplo, transformação mediada por Agrobacterium, transformação É mediada por vetor viral, eletroporação e transformação por pistola de partí- F culas. O sistema de Agrobacterium para a integração de polinucleotídeo es- À tranho em cromossomos da planta foi extensivamente estudado, modificado, : 5 e explorado quanto à engenharia genética da planta. Moléculas de polinu- cleotídeo recombinante nus compreendendo sequências de polinucleotídeo correspondendo à proteína purificada objeto ligada de maneira operável, na orientação de sentido ou antissentido, a sequências reguladoras são unidas . às sequências de T-DNA apropriadas por métodos convencionais. Estas são introduzidas em protoplastas de tabaco por técnicas de polietilenoglicol ou s por técnicas de eletroporação, ambas as quais são padrão. Alternativamen- te, tais vetores compreendendo moléculas de polinucleotídeo recombinante : que codificam a proteína purificada objeto são introduzidos em células de Agrobacterium vivas, que depois transferem o polinucleotídeo nas células vegetais. A transformação por polinucleotídeo nu sem acompanhar sequên- cias de vetor de T-DNA pode ser realizada por intermédio de fusão de proto- plastas com polinucleotídeo -contendo lipossomas ou por intermédio de ele- É troporação. O polinucleotídeo nu desacompanhado por sequências de vetor de T-DNA também pode ser usado para transformar células por intermédio demicroprojéteis inertes, de velocidade alta.

- Se uma célula ou tecido cultivado são usados como o tecido re- ceptor para a transformação, plantas podem ser regeneradas de culturas transformadas se desejado, por técnicas conhecidas àqueles habilitados no ramo.

A escolha das regiões reguladoras a serem incluídas em um constructo recombinante depende de vários fatores, incluindo, mas não limi- tados a, eficiência, viabilidade de seleção, inducibilidade, nível de expressão desejado, e expressão preferencial de célula ou tecido. É uma matéria de rotina para uma pessoa de habilidade na técnica modular a expressão de uma sequência de codificação selecionando-se e posicionando-se apropria- damente regiões reguladoras em relação à sequência de codificação. A transcrição de um polinucleotídeo pode ser modulada em uma maneira simi-

lar. Algumas regiões reguladoras adequadas inicial a transcrição apenas, ou : predominantemente, em certos tipos de célula. Métodos para identificar e caracterizar regiões reguladoras em polinucleotídeo genômico de planta são À conhecidos na técnica.

Promotores adequados incluem promotores específicos de teci- do reconhecidos por fatores específicos de tecido presentes em diferentes tipos de tecidos ou célula (por exemplo, promotores específicos de raiz, promotores específicos de broto, promotores específicos de xilema), ou pre- sentes durante diferentes estágios de desenvolvimento, ou presentes em “10 resposta a diferentes condições ambientais. Promotores adequados incluem a promotores constitutivos que podem ser ativados na maioria de tipos de cé- lula sem requerer indutores específicos. Exemplos de promotores adequa- : dos para controlar a produção de polipeptídeo de RNAi de NtMRP incluem o vírus do mosaico da couve-flor 358 (CaMV/358), SSU, OCS, lib4, usp, S- TLS1,B33, nos ou promotores de ubiquitina ou faseolina. Pessoas habilita- das na técnica são capazes de gerar variações múltiplas de promotores re- combinantes.

" Promotores específicos de tecido são elementos de controle transcricional que são apenas ativos em células ou tecidos particulares em tempos específicos durante o desenvolvimento da planta, tal como em teci- : dos vegetativos ou tecidos reprodutivos. A expressão específica de tecido pode ser vantajosa, por exemplo, quando a expressão de polinucleotídeos em certos tecidos é preferida. Exemplos de promotores específicos de tecido sob controle de desenvolvimento incluem promotores que podem iniciar a transcrição apenas (ou principalmente apenas) em certos tecidos, tais como tecidos vegetativos, por exemplo, raízes ou folhas, ou tecidos reprodutivos, tais como fruta, óvulos, sementes, pólen, pistilos, flores, ou qualquer tecido embrionário. Promotores específicos de tecido reprodutivo podem ser, por exemplo, específico de antera, específico de óvulo, específico de embrião, — específico de endosperma, específico de tegumento, específico de semente e casca da semente, específico de pólen, específico de pétala, específico de sépala, ou combinações destes.

Promotores específicos de folha adequados incluem piruvato, 1 promotor de ortofosfato dicinase (PPDK) de planta C4 (milho), promotor de . cab-m1Ca+2 do milho, o promotor de gene relacionado a myb de Arabidop- ' sis thaliana (Atmyb5), os promotores de ribulose bifosfato carboxilase .: 5 (RBCS) (por exemplo, os genes de RBCS1, RBCS2 e RBCS3A de tomate expressados nas folhas e mudas cultivadas na luz, RBCS1 e RBCS2 ex pressados em frutas de tomate em desenvolvimento ou promotor de ribulose bisfosfato carboxilase expressado quase exclusivamente em células do me-

sófilo em limbos das folhas e bainhas das folhas em níveis altos). Promotores específicos de senescência adequados incluem um . promotor de tomate ativo durante amadurecimento de frutas, senescência e abscisão de folhas, um promotor do milho de gene que codifica uma cisteíina protease.

Promotores específicos de antera adequados podem ser usados.

Promotores preferidos de raiz adequados conhecidos a pessoas habilitadas —natécnica podem ser selecionados.

Promotores preferidos de semente ade- quados incluem tanto promotores específicos de semente (aqueles promoto- res ativos durante o desenvolvimento da semente tais como promotores de proteínas de armazenamento em semente) e promotores germinativos de semente (aqueles promotores ativos durante a germinação da semente). Tais promotores preferidos de sementes incluem, mas não são limitados a, . Cim1 (mensagem induzida por citocinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDa do mi- lho); milps (mio-inositol-1-fosfato sintase); mZE40-2, também conhecido co- mo Zm-40; nuclc; e celA (celulose sintase). Gama-zeina é um promotor es- pecífico de endosperma.

Glob-1 é um promotor específico de embrião.

Para — dicotiledôneas, promotores específicos de semente incluem, mas não são limitados a, beta-faseolina de feijão, napin, B-conglicinina, lectina de soja, cruciferina, e semelhantes.

Para monocotiledôneas, promotores específicos de semente incluem, mas não são limitados a, um promotor de zeína de 15 kDa do milho, um promotor de zeína de 22 kDa, um promotor de zeina de 27 kDa, um promotor de g-zeina, um promotor de y-zeina de 27 kDa (tal como promotor gzw64A, ver número de Acesso no Genbank S78780), um promo- tor ceráceo, um promotor de shrunken 1, um promotor de shrunken 2, um promotor de globulina 1 (ver número de Acesso no Genbank 122344), um : promotor Itp2, promotor cim1, promotores end1 e end2 do milho, promotor nucl, promotor Zm40, eep1 e eep2; lec1, promotor de tioredoxina H; promo- tor mlip15, promotor PONAZ; e o promotor de shrunken-2.

. 5 Exemplos de promotores induzíveis incluem promotores respon- sivos ao ataque de patógeno, condições anaeróbicas, temperatura elevada, luz, secura, temperatura fria, ou alta concentração de sal. Promotores indu- zíveis por patógeno incluem aqueles de proteínas relacionadas à patogêne- se (proteinas PR), que são induzidas a seguir da infecção por um patógeno : 10 (por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanase, quitinase). As Além de promotores de plantas, outros promotores adequados podem ser derivados de origem bacteriana por exemplo, o promotor de oc- : topina sintase, o promotor de nopalina sintase e outros promotores deriva- dos de plasmídeos Ti), ou podem ser derivados de promotores virais (por exemplo, promotores de RNA 358 e 198 de vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), promotores constitutivos de vírus do mosaico do tabaco, promoto- res 198 e 358 do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), ou promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária). Exemplos de porções conjugadas incluem compostos macromo- leculares tais como proteínas (por exemplo, anticorpos), cadeias de ácido Ê graxo, resíduos de açúcar, glicoproteínas, polímeros (por exemplo, polietile- noglicol), ou combinações destes. Um oligonucleotideo pode ser conjugado a uma porção que aumenta a captação celular do oligonucleotídeo. Exemplos não limitantes de porções incluem, mas não são limi- tados a, anticorpos, polipeptídeos, porções lipídicas tais como uma porção de colesterol, ácido cólico, um tioéter, por exemplo, Hexil-s-tritiltiol, um tioco- lesterol, uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos de dodecandiol ou un- decila, um fosfolipídeo, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou 1-di-o- hexadecil-rac-glicero-S-h-fosfonato de trietilamônio, uma poliamina ou uma cadeia de polietilenoglicol, um ácido acético de adamantana, uma porção palmiítila, uma porção octadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolestero!. A porção pode ser um polímero positivamente carregado - tal como um peptídeo positivamente carregado isto é, por exemplo, cerca de 1 : a 50 resíduos de aminoácido em comprimento ou óxido de polialquileno tal - como polietilenoglicol (PEG) ou polipropileno glicol.

Adequadamente o polí- : mero positivamente carregado, tal como um óxido de polialqguileno pode ser . 5 ligado ao oligômero por intermédio de um ligador tal como um ligador liberá- vel.

Quando a expressão do polipeptídeo de NtMRP está sendo me- dida, detectar a quantidade de mRNA que codifica um polipeptídeo de Nt- . MRP na célula pode ser quantificada por, por exemplo, PCR ou Northern blot Onde uma mudança na quantidade de polipeptídeo de NtMRP na a- mostra está sendo medida, detectar NIMRP pelo uso de anticorpos anti- NtMRP pode ser usado para quantificar a quantidade de polipeptídeo de Nt- MRP na célula usando técnicas conhecidas.

Alternativamente a atividade biológica (por exemplo, transporte de metal pesado - tal como cádmio) pode —sermedido antes e depois do contato com o agente de teste.

Em uma outra modalidade, anticorpos que são imunorreativos com os polipeptídeos são fornecidos aqui.

Os polipeptídeos de NtMRP, é fragmentos, variantes, polipeptídeos de fusão, e semelhantes, como apre- sentado aqui, podem ser utilizados como "imunógenos" em produzir anticor- pos imunorreativos com estes.

Tais anticorpos especificamente ligam-se aos - polipeptídeos por intermédio dos sítios de ligação de antígeno do anticorpo.

Anticorpos especificamente de ligação são aqueles que especificamente re- conhecerão e ligarão com polipeptídeos da família de NIMRP, homólogos, e variantes, mas não com outras moléculas.

Em uma modalidade, os anticor- pos são específicos para polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácido de NtMRP como apresentado aqui e não reagem cruzado com outros poli- peptídeos.

Mais especificamente, os polipeptídeos, fragmento, variantes, polipeptídeos de fusão, e semelhantes contêm determinantes antigênicos ou epítopos que evocam a formação de anticorpos.

Estes determinantes anti- gênicos ou epítopos podem ser lineares ou conformacionais (descontínuos). Epiítopos lineares são compostos de uma única seção de aminoácidos do polipeptídeo, enquanto epítopos conformacionais ou descontínuos são com- : postos de seções de aminoácidos de regiões diferentes da cadeia de poli- : peptídeo que são levados em proximidade imediata na dobra de polipepti- deo. Epítopos podem ser identificados por qualquer um dos métodos conhe- : 5 cidos na técnica. Adicionalmente, epitopos dos polipeptídeos podem ser u- sados como reagentes de pesquisa, em ensaios, e para purificar anticorpos específicos de ligação de substâncias tais como soros policlonais ou sobre- nadantes de hibridomas cultivados. Tais epítopos ou variantes destes podem ser produzidos usando técnicas conhecidas no ramo tais como síntese de fase sólida, clivagem química ou enzimática de um polipeptídeo, ou usando a tecnologia de DNA recombinante.

Tanto anticorpos policlonais quanto monoclonais para os poli- peptídeos podem ser preparados por técnicas convencionais. Linhagens de célula de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais específicos para os polipeptídeos também são consideradas aqui. Tais hibridomas podem ser produzidos e identificados por técnicas convencionais. Para a produção de anticorpos, vários animais hospedeiros podem ser imunizados por injeção com um polipeptídeo de NtMRP, fragmento, variante, ou mutantes destes. Tais animais hospedeiros podem incluir, mas não são limitados a, coelhos, camundongos, e ratos, para citar alguns. Vários ajudantes podem ser usa- . dos para aumentar a resposta imunológica. Dependendo da espécie hospe- deira, tais ajudantes incluem, mas não são limitados a, Freund's (completo e incompleto), géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias ati- vas de superfície tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptií- deos, emulsões oleosas, hemocianina da lapa californiana, dinitrofenol, e ajudantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (vacina contra tu- berculose) e Corynebacterium parvum. Os anticorpos monoclonais podem ser recuperados por técnicas convencionais. Tais anticorpos monoclonais podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo 19G, IgM, IgE, IgA, IlgD, e qualquer subclasse destes.

Os anticorpos também podem ser usados em ensaios para de- tectar a presença dos polipeptídeos ou fragmentos, in vitro ou in vivo. Os anticorpos também podem ser utilizados em purificar polipeptídeos ou frag- : mentos por cromatografia de imunoafinidade.

ás Várias modalidades fornecem plantas mutantes, que não ocor- rem naturalmente ou transgênicas, assim como biomassa e sementes em . 5 queonívelde expressão de polinucleotídeo de N!IMRP é substancialmente reduzido para reduzir ou impedir o transporte de cádmio no limbo da folha. O limbo da folha pode ser incorporado em vários produtos consumíveis - tais como vários artigos que podem ser fumados, tais como charutos, cigarros, e produtos de tabaco não fumigenos (isto é, não combustíveis). A % de redução de cádmio nestes artigos que podem ser fuma- f dos e produtos não fumígenos pode ser um valor de pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%, 200% ou 300% mais baixo, quando comparado a produtos consumíveis derivados de contrapartes não mutantes, que não ocorrem naturalmente ou não transgê- - nicas. Em algumas modalidades, o teor de cádmio destes artigos que podem ser fumados e produtos não fumígenos é um valor de uma faixa de cerca de ' 0,01 a cerca de 0,05 partes por milhão (ppm), de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 ppm, de cerca de 0,01 a cerca de 0,5 ppm, de cerca de 0,01 a cerca de 1,0ppm, ou de cerca de 0,01 a cerca de 5 ppm. Em algumas modalidades, o . teor de cádmio destes artigos que podem ser fumados e produtos não fumí- genos é cerca de 0,001 ppm ou menos, cerca de 0,01 ppm ou menos ou cerca de 0,05 ppm ou menos, ou cerca de 0,49 ppm ou menos ou cerca de 0,5 ppm ou menos. O grau de acúmulo de cádmio em plantas pode ser — substancialmente variável dependendo de vários parâmetros atribuídos à complexidade do genótipo e ao ambiente de crescimento. Por exemplo, con- centrações de cádmio em folhas de tabaco cultivadas no campo podem ser extremamente variáveis dependendo de fatores tais como o agroclima, qua- lidade do solo, cultivares, e o tipo e origem de fertilizante usado. Além disso, os padrões de distribuição de cádmio relativos dentro de porções diferentes de uma planta de tabaco podem variar de acordo com a espécie, o ór- gão/tecido, e condições de crescimento (isto é, cultivado em campo vs. hi-

droponicamente cultivado). Em média, as concentrações de cádmio medidas . em folhas de tabaco cultivadas no campo (incluindo nervuras centrais e vei- : as) podem estar na faixa de aproximadamente 0,5 a 5 ppm (partes por mi- lhão, ou micrograma/grama de peso seco de folhas de tabaco). Entretanto, à: 5 muitos níveis de cádmio publicados tipicamente não definem o estágio de maturidade do tabaco, a variedade de tabaco, ou as porções da folha parti- culares (isto é, remoção da posição do pedúnculo da folha) colhidas para análise.

Em algumas variedades, as folhas inferiores podem acumular níveis de cádmio mais altos do que as folhas intermediárias e superiores.

No nível intracelular, cádmio pode ser encontrado em vários componentes celulares "o de uma célula vegetal, incluindo a parede celular, citoplasma, cloroplasto, núcleo, e vacúolos.

Além disso, o teor de cádmio medido em folhas de tabaco pode variar substancialmente dependendo dos níveis de cádmio no ambiente ter- restre onde as plantas de tabaco foram cultivadas.

As folhas de tabaco culti- vadas em áreas contaminadas com cádmio podem acumular cádmio de cer- ca de 35 ppm ou mais alto, comparado às folhas de contrapartes genetica- í mente idênticas cultivadas em áreas não contaminadas, que podem acumu- lar cádmio em uma faixa de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 8 É 20 ppm.

Os vacúolos dentro das folhas de plantas cultivadas em áreas conta- s minadas com cádmio podem acumular concentrações de cádmio muito altas.

Métodos para aplicar as composições divulgadas a serem adequadas para uma espécie de planta de interesse dada são conhecidos às pessoas habili- tadas na técnica.

O teor de metal pesado em plantas pode ser medido usando vá- rios métodos conhecidos na técnica.

Um método preferido compreende o uso de espectrofotometria de plasma-masa ligada por indução ("ICP-MS," Agilent 7500A; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). As plantas mutantes, que não ocorrem naturalmente ou transgê- —nicas que são descritas aqui podem ter outros usos, por exemplo, na agricul- tura.

Por exemplo, plantas mutantes, que não ocorrem naturalmente ou transgênicas descritas aqui podem ser usadas para fabricar ração para ani-

mais e produtos alimentícios para o ser humano. Sementes de plantas des- À critas aqui podem ser condicionadas e ensacadas em material de empaco- tamento por meios conhecidos na técnica para formar um artigo de fabrica- ção. Material de empacotamento tal como papel e tecido são bem conheci- dos na técnica. Uma embalagem de semente pode ter um rótulo, por exem- plo, uma etiqueta ou rótulo presos ao material de empacotamento, um rótulo impresso no material de empacotamento, ou um rótulo inserido dentro da embalagem, que descreve a natureza das sementes nesta.

Uma planta que carrega um alelo de NIMRP mutante pode ser usada em um programa de reprodução de planta para criar linhagens, varie- dades e híbridos úteis. Em particular, o alelo de NIMRP mutante é introgre- dido nas variedades comercialmente importantes descritas acima. Assim, métodos para a reprodução de plantas são fornecidos, que compreendem cruzar uma planta mutante, uma planta que não ocorre naturalmente ou uma planta transgênica como descrito aqui com uma planta compreendendo uma - identidade genética diferente. O método pode compreender ainda cruzar a progênie da planta com uma outra planta, e opcionalmente repetir o cruza- S mento até que uma progênie com os traços genéticos ou fundamento gené- tico desejáveis seja obtida. Um propósito fornecido por tais métodos de re- produção é introduzir um traço genético desejável em outras variedades, - linhas de reprodução, híbridos ou cultivares, particularmente aqueles que são de interesse comercial. Um outro propósito é facilitar o empilhamento de modificações genéticas de genes diferentes em uma única variedade de planta, linhagens, híbridos ou cultivares. Cópulas entre animais intraespecífi- cas assim como interespecíficas são consideradas. As plantas de progênie que surgem de tais cruzamentos, também referidos como linhas de reprodu- ção, são exemplos de plantas que não ocorrem naturalmente. Em uma modalidade, um método é fornecido para produzir uma planta que não ocorre naturalmente compreendendo: (a) cruzar uma planta mutante ou transgênica com uma segunda planta para produzir semente de progênie; (b) cultivar a semente de progênie, sob condições de crescimento de planta, para produzir a planta que não ocorre naturalmente. O método pode compreender ainda: (c) cruzar a geração prévia da planta que não o- corre naturalmente com a planta propriamente dita ou uma outra planta para : produzir semente de progênie; (d) cultivar a semente de progênie da etapa (c) sob condições de crescimento de planta, para produzir plantas que não : 5 ocorrem naturalmente adicionais; e (e) repetir as etapas de cruzamento e crescimento de (c) e (d) tempos múltiplos para gerar outras gerações de plantas que não ocorrem naturalmente.

O método pode compreender opcio- nalmente antes da etapa (a), uma etapa de fornecer uma planta precursora que compreende uma identidade genética que é caracterizada e que não é “10 idênticaà planta mutante ou transgênica.

Em algumas modalidades, depen- dendo do programa de reprodução, as etapas de cruzamento e cultivo são repetidas de O a 2 vezes, de 0 a 3 vezes, de O a 4 vezes, 0 a 5 vezes, de 0 a 6 vezes, de 0 a 7 vezes, de 0 a 8 vezes, de O a 9 vezes ou de O a 10 vezes, de modo a gerar gerações de plantas que não ocorrem naturalmente.

O re- trocruzamento é um exemplo de um tal método em que uma progênie é cru- : zada com um de seus precursores ou uma outra planta geneticamente simi- lar ao seu precursor, de modo a obter uma planta de progênie na geração seguinte que tem uma identidade genética que é mais próxima àquela de um dos precursores.

Técnicas para reprodução da planta, particularmente re- : 20 produção de planta de tabaco, são bem conhecidas e podem ser usadas nos . métodos descritos aqui.

A divulgação fornece ainda plantas que não ocorrem naturalmente produzidas por estes métodos.

Em algumas modalidades dos métodos descritos aqui, linhagens resultantes da reprodução e triagem para genes de NtMRP variantes são avaliadas no campo usando procedimentos de campo padrão.

Genótipos de controle incluindo o precursor não mutagenizado original são incluídos e en- tradas são arranjadas no campo em um projeto de bloqueio completo ran- domizado ou outro projeto de campo apropriado.

Para tabaco, práticas agro- nômicas padrão são usadas, por exemplo, o tabaco é colhido, pesado, e ex- perimentado quanto ao teste químico e outro teste comum antes e durante a cura.

Análises estatísticas dos dados são realizadas para confirmar a simila- ridade das linhagens selecionadas à linhagem parental.

Análises citogenéti-

cas das plantas selecionadas são opcionalmente realizadas para confirmar : as relações de complemento de cromossomo e pareamento de cromosso- - mo.

Impressão genética de DNA, polimorfismo de nucleotídeo único, - 5 marcadores de microssatélite, ou tecnologias similares podem ser usados em um programa de reprodução de seleção assistida por marcador (MAS) para transferir ou reproduzir alelos mutantes do(s) gene(s) de NIMRP em outros tabacos, como descrito aqui. Por exemplo, um reprodutor pode criar : populações segregantes a partir de hibridizações de um genótipo contendo um alelomutante com um genótipo agronomicamente desejável. Plantas nas . gerações F2 ou de retrocruzamento podem ser triadas usando um marcador desenvolvido a partir de uma sequência genômica de NtMRP ou um frag- mento desta, usando uma das técnicas listadas aqui. Plantas identificadas como possuindo o alelo mutante podem ser retrocruzadas ou autopoliniza- das para criar uma segunda população a ser triada. Dependendo do padrão - de herança esperado ou da tecnologia de MAS usada, pode ser necessário autopolinizar as plantas selecionadas antes de cada ciclo de retrocruzamen- " to para ajudar na identificação das plantas individuais desejadas. Retrocru- zamento ou outro procedimento de reprodução podem ser repetidos até que ofenótipo desejado do precursor recorrente seja recuperado. De acordo com a divulgação, em um programa de reprodução, cruzamentos bem sucedidos produzem plantas F1 que são férteis. Plantas F1 selecionadas podes ser cruzadas com um dos precursores, e as plantas de primeira geração de retrocruzamento são autopolinizadas para produzir uma população que é novamente triada quanto à expressão do gene de Nt- MRP variante (por exemplo, a versão nula do gene de NtIMRP). O processo de retrocruzamento, autopolinização, e triagem é repetido, por exemplo, pelo menos 4 vezes até que a triagem final produza uma planta que é fértil e ra- zoavelmente similar ao precursor recorrente. Esta planta, se desejado, é au- topolinizada e a progênie é subsequentemente triada novamente para con- firmar que a planta exibe expressão de gene de NtMRP variante. Em algu- mas modalidades, uma população de plantas na geração F2 é triada quanto à expressão de gene de NtMRP variante, por exemplo, uma planta é identifi- : cada que falha para expressar NtiMRP devido à ausência de um gene de - NtMRP de acordo com métodos padrão, por exemplo, usando-se um método de PCR com iniciadores com base na informação da sequência de nucleotí- s 5 deoparaNtMRP descrito aqui.

Variedades híbridas podem ser produzidas impedindo-se a au- topolinização de plantas precursoras femininas (isto é, precursores de se- mente) de uma primeira variedade, permitindo que o pólen de plantas pre- ; cursoras masculinas de uma segunda variedade fertilizem as plantas precur- soras femininas, e permitindo que sementes híbridas F1 se formem nas - plantas femininas. A autopolinização de plantas femininas pode ser impedida emasculando-se as flores em um estágio inicial de desenvolvimento da flor.

Alternativamente, a formação de pólen pode ser impedida nas plantas pre- cursoras femininas usando uma forma de esterilidade masculina. Por exem- plo, a esterilidade masculina pode ser produzida por esterilidade masculina citoplasmática (CMS), ou esterilidade masculina transgênica em que um transgene inibe a microsporogênese e/ou formação de pólen, ou autoincom- patibilidade. Plantas precursoras femininas contendo CMS são particular- mente úteis. Em modalidades em que as plantas precursoras femininas são CMS, pólen é colhido de plantas férteis masculinas e aplicado manualmente : aos estigmas de plantas precursoras femininas CMS, e a semente F1 resul- tante é colhida.

Variedades e linhagens descritas aqui podem ser usadas para formar híbridos F1 de cruzamento único. Em tais modalidades, as plantas das variedades precursoras podem ser cultivadas como populações contí- guas substancialmente homogêneas para facilitar a polinização cruzada na- tural das plantas precursoras masculinas às plantas precursoras femininas. A semente F1 formada nas plantas precursoras femininas é seletivamente colhida por meios convencionais. Uma pessoa também pode cultivar as duas variedades de planta precursora em massa e colher uma combinação de semente híbrida F1 formada no precursor feminino e semente formada no precursor masculino como o resultado da autopolinização. Alternativamente,

cruzamentos de três vias podem ser realizados em que um híbrido F1 de cruzamento único é usado como um precursor feminino e é cruzado com um : precursor masculino diferente. Como um outra alternativa, híbridos de cru- | zamento duplo podem ser criados em que a progênie F1 de dois cruzamen- - 5 tos únicos diferentes é por si só cruzada.

Uma população de plantas mutantes, que não ocorrem natural- mente ou transgênicas pode ser triada ou selecionada quanto àqueles mem- bros da população que têm um traço ou fenótipo desejados. Por exemplo, : uma população de progênie de um evento de transformação único pode ser triada quanto àquelas plantas tendo um nível desejado de expressão de po- lipeptídeo ou polinucleotideo de NtMRP. Métodos físicos e bioquímicos po- dem ser usados para identificar níveis de expressão. Estes incluem análise de Southern ou amplificação por PCR para a detecção de um polinucleotí- deo; Northern blots, proteção de S1 RNase, extensão de iniciador, ou ampli- ficação por RT-PCR para detectar transcritos de RNA; ensaios enzimáticos * para detectar a atividade de enzima ou ribozima de polipeptídeos e polinu- cleotídeos; e eletroforese em gel de proteina, Western blots, imunoprecipita- ' ção, e imunoensaios ligados à enzima para detectar polipeptídeos. Outras técnicas tais como hibridização in situ, manchamento enzimático, e imuno- —manchamento também podem ser usadas para detectar a presença ou ex- . pressão de polipeptídeos ou polinucleotídeos.

Células vegetais e plantas mutantes, que não ocorrem natural- mente ou transgênicas são descritas aqui compreendendo um ou mais poli- nucleotídeos recombinantes - tais como um ou mais polinucleotídeos isola- dos de NtMRP, uma ou mais constructos de polinucleotídeo, um ou mais RNAs de filamento duplo, um ou mais conjugados ou um ou mais veto- res/vetores de expressão.

A expressão de NtMRP pode ser avaliada usando métodos in- cluindo, por exemplo, RT-PCR, Northern blots, proteção de RNase, exten- sões de iniciador, Western blots, eletroforese em gel de proteina, imunopre- cipitação, imunoensaios ligados à enzima, ensaios de chip, e espectrometria de massa. Deve ser observado que se um polipeptídeo é expressado sob o controle de um promotor preferencial de tecido ou de expressão ampla, a expressão pode ser avaliada na planta inteira ou em um tecido selecionado. : Similarmente, se um polipeptídeo é expressado em um tempo particular, por exemplo, em um tempo particular no desenvolvimento ou na indução, a ex- - 5 pressão pode ser avaliada seletivamente em um período de tempo desejado.

Sem limitação, as plantas descritas aqui podem ser modificadas para outros propósitos antes ou depois que a expressão ou atividade de Nt- MRP foi modulada (por exemplo, reduzida ou inibida). Uma ou mais das mo- õ dificações genéticas seguintes podem estar presentes nas plantas mutantes, que não ocorrem naturalmente ou transgênicas.

Em uma modalidade, um ou : mais genes adicionais que estão envolvidos na captação de metal pesado ou transporte de metal pesado são modificados resultando em plantas ou partes de plantas (tais como folhas) tendo um teor de metal pesado mais baixo do que plantas de controle ou partes destas sem a(s) modifica- ção(ões). Exemplos não limitantes incluem genes na família de facilitadores - de difusão de cátion (CDF), na família de proteinas semelhantes a Zrt, Irt (ZIP), na família de trocadores de cátion (CAX), na família de transportado- : res de cobre (COPT), na família de ATPases tipo P de metal pesado (HMAs, como descrito em WO2009074325), na família de homólogos de proteínas de macrófago associadas à resistência natural (NRAMP), e um outro mem- . bro da família de transportadores de cassete de ligação de ATP (ABC), que participam no transporte de metais pesados, tais como cádmio.

O termo me- tal pesado como usado aqui inclui metais de transição.

Em uma outra moda- lidade, um ou mais genes que estão envolvidos na conversão de intermediá- rios metabólicos nitrogenosos são modificados resultando em plantas ou partes de plantas (tais como folhas) que quando aquecidas, produzem níveis mais baixos de pelo menos uma nitrosamina específica de tabaco (por e- xemplo, 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona, N-nitrosonornicotina, N- nitrosoanatabina, e N-nitrosoanabasina) do que plantas de controle ou par- tes destas.

Exemplos não limitantes de genes que podem ser modificados incluem genes que codificam uma nicotina desmetilase, tais como CYP82E4, CYP82E5 e CYP82E10 que participam na conversão de nicotina a nornicoti-

na e são descritos em WOZ2006091194, WO2008070274, WO2009064771 e

S PCT/US2011/021088. . Exemplos de outras modificações incluem tolerância a herbicida, : por exemplo, glifosato é um ingrediente ativo de muitos herbicidas de espec- - 5 tro amplo.

Plantas transgênicas resistentes a glifosato foram desenvolvidas transferindo-se o gene aroA (uma glifosato EPSP sintetase de Salmonella typhimurium e E. coli). Pantas resistentes a sulfonilureia foram produzidas transformando-se o gene de ALS (acetolactato sintetase) mutante de Arabi- à: dopsis.

A proteina OB do fotossistema |1l de Amaranthus hybridus mutante foi transferida nas plantas para produzir plantas transgênicas resistentes a atra- zina; e plantas transgênicas resistentes a bromoxinila foram produzidas in- corporando-se o gene bxn da bactéria Klebsiella pneumoniae.

Uma outra modificação exemplar resulta em plantas que são resistentes a insetos.

To- xinas de Bacillus thuringiensis (Bt) podem fornecer um modo eficaz de retar- dara emergência de pragas resistentes a Bt, como recentemente ilustrado - em brócolis onde genes de Bt cryl/Ac e crylC piramidados controlaram traças- das-crucíferas resistentes a qualquer proteína única e significantemente re- Ê tardaram a evolução de insetos resistentes.

Uma outra modificação exem- plar resulta em plantas que são resistentes a doenças causadas por patóge- : 20 nos (por exemplo, vírus, bactérias, fungos). Plantas que expressam o gene - Xa21 (resistência à mancha bacteriana) com plantas expressando tanto um gene de fusão de Bt quanto um gene de quitinase (resistência a broca- amarela-do-colmo e tolerância à bainha) foram engendradas.

Uma outra modificação exemplar resulta em capacidade reprodutiva alterada, tal como esterilidade masculina.

Uma outra modificação exemplar resulta em plantas que são tolerantes a estresse abiótico (por exemplo, secura, temperatura, salinidade), e plantas transgênicas tolerantes foram produzidas transferindo- se a enzima de fosfato de acil glicerol de Arabidopsis; genes que codificam manitol desidrogenase e sorbitol desidrogenase que estão envolvidos na síntese de manitol e sorbitol melhoram a resistência à secura.

Uma outra modificação exemplar resulta em plantas que produzem proteínas que têm propriedades imunogênicas favoráveis para o uso em seres humanos.

Por exemplo, plantas capazes de produzir proteínas que substancialmente care- é cem de resíduos de fucose alfa-1,3-ligados, resíduos de xilose beta-1,2- : ligados, ou ambos, em seu N-glicano podem ser de uso. Outras modifica- ções exemplares podem resultar em plantas com proteínas e óleos de arma- . 5 zenamento melhorado, plantas com eficiência fotossintética realçada, plan- tas com vida de prateleira prolongada, plantas com teor de carboidrato real- çado, e plantas resistentes a fungos; plantas que codificam uma enzima en- volvida na biossíntese de alcalóides. Plantas transgênicas em que a expres- são de S-adenosil-L-metionina (SAM) e/ou cistationina gama-sintase (CGS) É 10 foimodulada também são consideradas.

- Sem limitação, as plantas descritas aqui podem ser ainda mais modificadas. Exemplos de tais modificações adicionais incluem, mas não são limitados a: (a) Plantas que podem tolerar herbicidas. Por exemplo, gli- fosato é um ingrediente ativo de muitos herbicidas de espectro amplo. Plan- tas transgênicas resistentes a glifosato foram desenvolvidas transferindo-se - o gene aroA (uma glifosato EPSP sintetase de Salmonella typhimurium e E. coli); plantas resistentes à sulfonilureia foram produzidas transformando-se o í gene de ALS (acetolactato sintetase) mutante de Arabidopsis; proteina OB do fotossistema |l de Amaranthus hybridus mutante foi transferida nas plan- tas para produzir plantas transgênicas resistentes à atrazina; e plantas : transgênicas resistentes a bromoxinila foram produzidas incorporando-se o gene bxn da bactéria Klebsiella pneumoniae; (b) Plantas são resistentes a insetos. Toxinas de Bacillus thuringiensis (Bt) podem fornecer um modo efi- caz de retardar a emergência de pragas resistentes a Bt, como recentemen- teilustrado em brócolis onde genes de Bt cry 1Ac e crylC piramidados contro- laram traças-das-crucíferas resistentes a qualquer proteina única e signifi- cantemente retardaram a evolução de insetos resistentes; (c) Plantas que são resistentes a vírus. Plantas com vírus do mosaico do tabaco foram pro- duzidas introduzindo-se proteinas de revestimento viral. Outras plantas transgênicas resistentes virais incluem plantas de batata resistentes ao vírus da batata, arroz resistente a RSV, e feijão-da-índia e feijáo-da-china resis- tentes a YMV; (d) Plantas que são resistentes a bactérias. Plantas que ex-

pressam o gene Xa21 (resistência à mancha bacteriana) com plantas ex- õ pressando tanto um gene de fusão de Bt quanto um gene de quitinase (re- : sistência a broca-amarela-do-colmo e tolerância à bainha) foram engendra- : das; (e) Plantas transgênicas tolerantes ao estresse: Plantas transgênicas : 5 fritas e tolerantes foram produzidas transferindo-se a enzima de fosfato de acil glicerol de Arabidopsis; genes que codificam manitol desidrogenase e sorbitol desidrogenase que estão envolvidos na síntese de manitol e sorbitol melhoram a resistência à secura; (f) Plantas que produzem proteínas que têm propriedades imunogênicas favoráveis para o uso em seres humanos.

o Por exemplo, plantas capazes de produzir proteínas que substancialmente carecem de resíduos de fucose alfa-1,3-ligados, resíduos de xilonse beta- 1,2-ligados, ou ambos, em seu N-glicano podem ser de uso; e (g) Outros exemplos de plantas transgênicas são plantas com proteínas e óleos de ar- mazenamento melhorado, plantas com eficiência fotossintética realçada, plantas com vida de prateleira prolongada, plantas com teor de carboidrato - realçado e plantas resistentes a fungos; plantas que codificam uma enzima envolvida na biossíntese de alquilóides; genes para uma via de desintoxica- í ção por mercúrio orgânico bacteriana (redutase mercúrica, merA) e liase or- ganomercurial, merB foram combinados por cruzamento em Arabidopsis, e : 20 plantas que expressam ambos os genes foram capazes de cultivar em con- .: centrações de metilmercúrio 50 vezes mais altas do que plantas do tipo sel- vagem Um ou mais de tais traços podem ser introgredidos nas plantas de tabaco mutantes, que não ocorrem naturalmente ou transgênicas de um outro cultivar de tabaco ou podem ser diretamente transformados nele. À introgressão do(s) traço(s) nas plantas de tabaco mutantes, que não ocor- rem naturalmente ou transgênicas pode ser obtida por qualquer método de reprodução da planta conhecido na técnica, por exemplo, reprodução de |i- nhagem, retrocruzamento, reprodução de duplo-haplóide, e semelhantes (ver, Wernsman, E. A, e Rufty, R. C. 1987. Capítulo Dezessete. Tabaco. Pá- ginas 669 a 698 Em: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MachMillan Publishing Co, Inc., New York, N.Y 761 páginas). Técnicas com base em biologia molecular descritas acima, em marcadores de RFLP e mi- À crossatélite particulares, podem ser usados em tais retrocruzamentos para . identificar a progênie tendo o grau de identidade genética mais alto com o J precursor recorrente. Isto permite que uma pessoa acelere a produção de .: 5 variedades tendo pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 99% de identidade genética com o precursor recorrente, ainda mais preferivelmente geneticamente idênticas ao precursor recorrente, e compreendendo ainda o(s) traço(s) introgredido(s) do precursor à doador. Tal determinação de identidade genética pode ser fundamentada em marcadores moleculares conhecidos na técnica.

- A última geração de retrocruzamento pode ser autofecundada para fornecer progênie de reprodução pura para o(s) polinucleotídeo(s) sen- do transferido(s). As plantas resultantes geralmente têm essencialmente to- das as características morfológicas e fisiológicas das plantas mutantes, que não ocorrem naturalmente ou transgênicas, além do(s) traço(s) transferido(s) . (por exemplo, um ou mais traços de gene único). O protocolo de retrocruza- mento exato dependerá do traço sendo alterado para determinar um proto- : colo de teste apropriado. Embora métodos de retrocruzamento sejam simpli- ficados quando o traço sendo transferido é um alelo dominante, um alelo ! 20 recessivo também pode ser transferido. Neste exemplo, pode ser necessário : introduzir um teste da progênie para determinar se o traço desejado foi transferido com êxito.

Várias modalidades fornecem plantas mutantes, plantas que não ocorrem naturalmente ou plantas transgênicas, assim como biomassa em queonívelde expressão de polinucleotídeo de NtMRP é reduzido de modo que quantidades mais baixas de cádmio são acumuladas nesta.

Partes das tais plantas, particularmente plantas de tabaco, e mais particularmente o limbo da folha e nervura central de plantas de tabaco, podem ser incorporadas em ou usadas em fabricar vários produtos consu- —miíveis incluindo mas não limitados a materiais de formação de aerossol, dispositivos de formação de aerossol, artigos de fumo, artigos que podem ser fumados, produtos não fumígenos, e produtos de tabaco. Exemplos de materiais de formação de aerosso! incluem mas não são limitados a compo- sições de tabaco, tabacos, extrato de tabaco, tabaco de corte, enchedor de corte, tabaco curado, tabaco expansível, tabaco homogeneizado, tabaco À reconstituído, e tabacos de cachimbo.

Artigos de fumo e artigos que podem . 5 — serfumados são tipos de dispositivos de formação de aerossol.

Exemplos de artigos de fumo ou artigos que podem ser fumados incluem mas não são limitados a cigarros, cigarrilhas, e charutos.

Exemplos de produtos não fumi- genos compreendem tabacos de mastigação, e rapés.

Em certos dispositi- vos de formação de aerossol, ao invés de combustão, uma composição de tabaco ou um outro material de formação de aerosso! é aquecida por uma ou : mais elementos de aquecimento elétrico para produzir um aerossol.

Em um outro tipo de dispositivo de formação de aerossol aquecido, um aerossol é produzido pela transferência de calor de um elemento combustível ou fonte de calor a um material de formação de aerossol fisicamente separado, que — pode ser localizado dentro, em torno ou a jusante da fonte de calor.

Produtos - de tabaco não fumígenos e vários materiais de formação de aerossol con- tendo tabaco pode conter tabaco em qualquer forma, incluindo como partícu- É las secas, fragmentos, grânulos, pós, ou uma pasta fluida, depositados em, misturados em, circundados por, ou de outro modo combinados com outros ingredientes em qualquer formato, tais como flocos, películas, tiras, espu- : mas, ou pérolas.

Como usado aqui, o termo 'fumaça' é usado para descrever um tipo de aerossol que é produzido por artigos de fumo, tais como cigarros,

ou por combustão de um material de formação de aerossol.

Em uma modalidade, também é fornecido material curado das plantas de tabaco mutantes, transgênicas e que não ocorrem naturalmente descritas aqui.

Processos de curar folhas de tabaco verdes são conhecidos por aqueles tendo habilidades na técnica e incluem sem limitação cura ao ar, cura por chama, cura por combustão e cura por sol.

O processo de curar folhas de tabaco verdes depende do tipo de tabaco colhido.

Por exemplo, o tabaco virgínia de combustão (brilhante) é tipicamente curado por combus- tão, Burley e certas cepas escuras são usualmente curados ao ar, e tabaco de cachimbo, tabaco de mastigação, e rapé são usualmente curados por chama. | Em uma outra modalidade, são descritos produtos de tabaco in- - cluindo materiais de formação de aerossol contendo tabaco compreendendo folhas, preferivelmente folhas curadas, das plantas de tabaco mutantes, - 5 —plantade tabaco transgênicas ou plantas de tabaco que não ocorrem natu- ralmente descritas aqui.

Os produtos de tabaco descritos aqui podem ser um produto de tabaco misco que pode compreender ainda tabaco não modifica- do. à As plantas mutantes, que não ocorrem naturalmente ou transgê- —nicas podem ter outros usos, por exemplo, na agricultura.

Por exemplo, plan- , tas mutantes, que não ocorrem naturalmente ou transgênicas descritas aqui podem ser usadas para fabricar ração para animais e produtos alimentícios para o ser humano.

A divulgação também fornece métodos para produzir sementes compreendendo cultivar a planta mutante, planta que não ocorre natural- mente, ou planta transgênica descritas aqui, e coletar sementes das plantas cultivadas.

Sementes de plantas descritas aqui podem ser condicionadas e Ú ensacadas em material de empacotamento por meios conhecidos na técnica para formar um artigo de fabricação.

O material de empacotamento tal como —papele tecido são bem conhecidos na técnica.

Uma embalagem de semente : pode ter um rótulo, por exemplo, uma etiqueta ou rótulo presos ao material de empacotamento, um rótulo impresso no material de empacotamento, ou um rótulo inserido dentro da embalagem, que descreve a natureza das se- mentes nesta.

Composições, métodos e kits para genotipar plantas para i- —dentificação, seleção, ou reprodução são abrangidos pela divulgação e po- dem compreender um meio de detectar a presença de um polinucleotídeo de NtMRP em uma amostra de polinucleotídeo.

Consequentemente, uma com- posição é descrita compreendendo um ou mais iniciadores para ampliar es- pecificamente pelo menos uma porção do polinucleotídeo de NtMRP e op- — cionalMmente uma ou mais sondas e opcionalmente um ou mais reagentes para conduzir a amplificação ou detecção.

Consequentemente, iniciadores de oligonucleotídeo específicos de gene ou sondas compreendendo cerca de 10 ou mais polinucleotídeos Y contíguos correspondendo ao polinucleotídeo de NtMRP são divulgados.

Os ditos iniciadores ou sondas podem compreender ou consistir em cerca de 15, 20, 25, 30, 40, 45 ou 50 mais polinucleotídeos contíguos que hibridizam : 5 (porexemplo, especificamente hibridizam) ao polinucleotideo de NÍIMRP.

Em algumas modalidades, os iniciadores ou sondas podem compreender ou consistir em cerca de 10 a 50 nucleotídeos contíguos, cerca de 10 a 40 nu- cleotídeos contíguos, cerca de 10 a 30 nucleotídeos contíguos ou cerca de 15 a 30 nucleotídeos contíguos que podem ser usados em métodos depen- dentes de sequência de identificação de gene (por exemplo, hibridização de : Southern) ou isolamento (por exemplo, hibridização in situ de colônias bacte- rianas ou placas de bacteriófago) ou detecção de gene (por exemplo, como um ou mais iniciadores de amplificação em amplificação ou detecção de po- linucleotídeo). Um ou mais iniciadores ou sondas específicos podem ser de- —signados e usados para ampliar ou detectar uma parte ou todo o polinucleo- tideo de NtMRP.

Por via de exemplo específico, dois iniciadores podem ser usados em um protocolo de reação em cadeia de polimerase para ampliar ' um fragmento de polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo de NtMRP - tal como DNA ou RNA.

A reação em cadeia de polimerase também pode ser í 20 realizada usando um iniciador que é derivado da sequência de polinucleoti- : deo de NtMRP e um segundo iniciador que hibridiza a uma sequência a montante ou a jusante da sequência de polinucleotideo de NtMRP - tal como uma sequência promotora de NtMRP, a extremidade 3' do precursor de mR- NA ou uma sequência derivada de um vetor.

Exemplos de técnicas térmicas e isotérmicas úteis para amplificação in vitro de polinucleotídeos são bem conhecidas no ramo.

A amostra pode ser ou pode ser derivada de uma plan- ta, uma célula vegetal ou material vegetal ou um produto fabricado ou deri-

vado da planta, da célula vegetal ou do material vegetal como descrito aqui.

Assim, em um outro aspecto, também é fornecido um método de detectar um polinucleotídeo de NIMRP em uma amostra compreendendo a etapa de: (a) fornecer uma amostra compreendendo, ou suspeita de com- preender, um polinucleotídeo; (b) contatar a dita amostra com um ou mais iniciadores ou uma ou mais sondas para detectar especificamente pelo me- Í nos uma porção do polinucleotídeo de NtMRP; e (c) detectar a presença de um produto de amplificação, em que a presença de um produto de amplifica- À ção é indicativo da presença do polinucleotídeo de NIMRP na amostra.

Em . 5 um outro aspecto, também é fornecido o uso de um ou mais iniciadores ou sondas para detectar especificamente pelo menos uma porção de polinucle- otídeo de NIMRP.

Kits para detectar pelo menos uma porção do polinucleo- tídeo de NtMRP também são fornecidos que compreendem um ou mais ini- ciadores ou sondas para detectar especificamente pelo menos uma porção do polinucleotíideo de NIMRP.

O kit pode compreender reagentes para am- plificação de polinucieotídeo - tal como reação em cadeia de polimerase (P- CR) - ou reagentes para tecnologia de hibridização-detecção de sonda de polinucleotídeo - tal como Southern Blots, Northern Blots, hibridização in situ, ou microarranjo.

O kit pode compreender reagentes para tecnologia de de- tecção de ligação do anticorpo tais como Western Blots, ELISAs, espectro- metria de massa SELDI ou tiras de teste.

O kit pode compreender reagentes para sequenciamento de DNA.

O kit pode compreender reagentes e/ou ins- : truções para determinar o teor de metal pesado - tal como cádmio.

Em al- gumas modalidades, um kit pode compreender instruções para um ou mais í 20 dos métodos descritos.

Os kits descritos podem ser úteis para determinação " da identidade genética, estudos filogenéticos, genotipagem, haplotipagem, análise da linhagem ou reprodução da planta particularmente com contagem codominante.

A presente divulgação também fornece um método de genotipar uma planta, uma célula vegetal ou material vegetal compreendendo um poli- nucleotídeo de NtMRP.

Genotipagem fornece um meio de distinguir homólo- gos de um par de cromossomo e pode ser usada para diferenciar segregan- tes em uma população de plantas.

Métodos de marcador molecular podem ser usados para estudos filogenéticos, caracterizando relações genéticas entre as variedades de safra, identificando cruzamentos ou híbridos somáti- cos, localizando segmentos cromossômicos que afetam traços monogêni- cos, clonagem com base em mapa, e o estudo da herança quantitativa.

O método específico de genotipagem pode utilizar qualquer número de técni- : cas analíticas de marcador molecular incluindo polimorfismos de comprimen- to de fragmento de amplificação (AFLPs). AFLPs são o produto de diferen- : ças alélicas entre fragmentos de amplificação causadas por variabilidade da . 5 sequência de nucleotídeo. Assim, um meio para seguir a segregação de Nt- MRP assim como sequências cromossômicas geneticamente ligadas a estes genes ou polinucleotídeos usando tais técnicas como análise AFLP é descri- to.

A invenção será descrita ainda nos exemplos seguintes, que não são intencionados a limitar o escopo da invenção descrita nas reivindica- : ções.

EXEMPLOS Os exemplos seguintes são fornecidos como uma ilustração e não como uma limitação. A menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais e métodos de biologia molecular, biologia vegetal, bioinformá- - tica, e reprodução da planta são utilizados. Exemplo 1: Identificação da sequência genômica de DNA de NtMRP3 Biblioteca de BAC do tabaco. Uma biblioteca de Cromossomo Artificial Bacteriano (BAC) é preparada como segue: núcleos são isolados de folhas de plantas cultivadas em estufa da variedade de Nicotiana tabacum Hicks Broad Leaf. DNA de peso molecular alto é isolado dos núcleos de a- cordo com protocolos padrão e parcialmente digeridos com BamHI e Hindtll e clonado nos sítios BamHI ou Hindill do vetor de BAC plINDIGOS5. Mais do que 320.000 clones são obtidos com um comprimento de inserção médio de — cobertura de 135 mega pares de base aproximadamente 9,7 vezes o geno- ma do tabaco.

Montagem da sequência de genoma de tabaco. Um grande nú- mero de clones de BAC aleatoriamente selecionados são submetidos ao sequenciamento usando o método de Sanger gerando mais do que

1.780.000 sequências brutas de um comprimento médio de 550 pares de base. Filtragem de metila é aplicada usando-se uma cepa Mcr+ de Escheri- chia coli para transformar e isolar apenas o DNA hipometilado. Todas as se-

quências são montadas usando o montador de genoma CELERA produzindo mais do que 800.000 sequências compreendendo mais do que 200.000 con- tigs e 596.970 sequências únicas. Tamanhos de contig estão entre 120 e

15.300 pares de base com um comprimento de 1.100 pares de base.

* 5 A sequência genômica de DNA de NtMRP3 é identificada se- quenciando-se um BAC contendo parte do genoma que inclui DNA de Nt- MRP3. A sequência é apresentada na Figura 6. Exemplo 2: Transformação das variedades de tabaco com vetores de ex- pressão de RNAi de NtMRP3 o Sementes de tabaco são esterilizadas e germinadas em uma - placa de petri contendo meio basal MS suplementado com 5 ml/L de mistura preservante de planta (PPM). Mudas, em aproximadamente 7 a 10 dias pós- germinação, são selecionadas quanto à transformação com vários vetores de expressão de RNAi de NtIMRP3. Uma única colônia de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 é inoculada em um meio LB líquido contendo 50 mg 1º - de canamicina (monossulfato de canamicina), e é incubada por 48 h a 28ºC com agitação recíproca (150 ciclos min”). Células cultivadas são coletadas À por centrifugação (6000xg, 10 min), e são colocadas em suspensão a uma densidade final de 0,4 a 0,7 ODsoo, com 20 ml de meio MS líquido contendo 20g” de sacarose. Os explantes de muda de 7 a 10 dias são imersos em : uma suspensão bacteriana por 5 min, e são manchados em papéis de filtro estéreis. Cinquenta explantes são colocados sobre alíquotas de 40 ml de meio ágar REG (meio basal MS suplementado com 0,1 mg 1 de ácido 1- naftalenoacético (NAA) e 1 mg | de benzilaminopurina (BAP)) em placas de —petride 100 mm X 20 mm. Os explantes são co-cultivados com Agrobacteri- um a 25ºC. Depois de 3 dias de co-cultivo, os explantes são lavados e trans- feridos para o meio RCPK (meio REG com 100 mg” de canamiícina, 500 mg 1 de carbenicilina, e 5 ml! de PPM) para selecionar quanto aos transforman- tes. Os explantes são subcultivados a cada 2 semanas. Depois de 8 a 12 semanas de crescimento sob condições seletivas, as plantas sobreviventes, representando transformantes que integraram as constructos de expressão de RNAi de NtMRP3 em seus genomas são transferidas para um meio de enraizamento (meio basal MS suplementado com 100 mg IM de Canamici- na). Plantas enraizadas são transferidas para vasos para promover o cres- cimento adicional.

: Exemplo 3: Expressão de polinucleotídeo de NtMRP3 em plantas de tabaco 2 5 Para determinar a expressão de polinucleotídeo de NtMRP3, RNA celular total é isolado de várias partes das plantas. O RNA total é isola- do usando Reagente TRIº (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Para remover im- purezas de DNA, o RNA purificado é tratado com DNase isenta de RNase : (TURBO DNA-free, Ambion, Austin TX). Para sintetizar o primeiro filamento decDNA, aproximadamente 10 ug do RNA total são transcritos reversos uti- lizando o High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para medir o nível de transcritos de NIMRP3 nas amostras, uma RT- PCR de 2 etapas quantitativa é realizada de acordo com a química com ba- se em sonda MGB Taqman. A mistura de RT contém 4 uM de mistura de dNTP, 1X iniciadores aleatórios, 1X Tampão de RT, 10 g de cDNA, 50U de - Multiscribe Reverse transcriptase (Applied Biosystems), 2U de Inibidor de RNase Superase-ln (Ambion), e água isenta de nuclease. A mistura de PCR À contém 1X Tagman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), 400 UM de iniciador dianteiro, 400 /M de iniciador reverso, 250 uM desondaMGB Taqgman, 2 pg de cDNA, e água isenta de nuclease. RT-PCR é realizada utilizando um ABI 7500 Real-Time System (Applied Biosystems, Foster City, CA) e sob condições de amplificação: 50ºC por 2 min; 95ºC por 10 min; 40 ciclos de 95ºC por 15 s; e 60ºC por 1 min Exemplo 4: Silenciamento da expressão de polinucleotídeo de NIMRP3 em —plantasde tabaco Uma primeira sequência parcial que codifica um transcrito de NtMRP3 putativo é encontrada usando anotações do Tobacco Genome Initi- ative (TGI). Desta sequência particular, iniciadores são gerados para silenci- ar a expressão de polinucleotideo de NIMRP3 em tabaco usando um método de RNAi A sequência de RNAi de NtMRP3 correspondente é ampliada do CDNA por RT-PCR e depois inserida no vetor de passagem pB7GWIWG?2(!l) por intermédio de um vetor de entrada, exatamente como detalhado pelo fabricante (Invitrogen). Este vetor contém um promotor para a expressão constitutiva (o promotor 358 do vírus do mosaico da couve-flor CaMV) do transgene em todos os tecidos da planta e o gene de barreira para a seleção ã de herbicida com Basta em placas de ágar (30 mg/ml). O constructo é de- . 5 pois inserida no genoma do tabaco de Burley KY14 por intermédio de Agro- bacterium tumefasciens usando um procedimento em disco de folha clássi- co.

A partir dos calos, linhagens individuais são regeneradas e selecionadas em Basta.

Linhas de silenciamento de RNAi são depois monitoradas por RT- PCR e cultivadas para a produção de semente.

Sementes T1 são coletadas, —recultivados em placas de ágar contendo Basta para seleção e plantas resis- - tentes são cultivadas em bandejas flutuantes antes do cultivo no campo.

Aproximadamente 500 mg da planta são pesados e digeridos em 10 ml de HNO; concentrado pelo sistema de digestão 5 do sistema de rea- ção acelerado por microondas (CEM corporation, Mathews, NC). Concentra- ções de metalpesado são analisadas utilizando espectrofotometria de plas- . ma-massa ligada por indução ("ICP-MS," Agilent 7500A; Agilent Technologi- es, Palo Alto, CA). Como controle de tabaco não transgênico, uma amostra É consistindo em folhas de tabaco virgínia certificadas por polimento, CTA- VTL-2, é preparada sob condições comparáveis.

Exemplo 5: ldentificação da sequência genômica de DNA de NtMRP4 - A sequência genômica de DNA de NtMRP4 é identificada se- quenciando-se um BAC contendo parte do genoma que inclui DNA de Nt- MRP4. A sequência é apresentada na Figura 1. Exemplo 6: Transformação das variedades de tabaco com vetores de ex pressão de RNAi de NtMRP4 Sementes de tabaco são esterilizadas e germinadas em uma placa de petri contendo meio basal MS suplementado com 5 ml/L de mistura preservante de planta (PPM). Mudas, em aproximadamente 7 a 10 dias pós- germinação, são selecionadas quanto à transformação com vários vetores de expressão de RNAi de NIMRP4. Uma única colônia de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 é inoculada em um meio LB líquido contendo 50 mg Y de canamicina (monossulfato de canamicina), e é incubada por 48 h a 28ºC com agitação recíproca (150 ciclos min”). As células cultivadas são coleta- das por centrifugação (6000xg, 10 min), e são colocadas em suspensão a uma densidade final de 0,4 a 0,7 ODgoo, com 20 ml de meio MS líquido con- tendo 20 g' de sacarose. Os explantes de muda de 7 a 10 dias são imersos em uma suspensão bacteriana por 5 min, e são manchados em papéis de filtro estéreis. Cinquenta explantes são colocados sobre alíquotas de 40 ml! de meio ágar REG (meio basal MS suplementado com 0,1 mg 1 de ácido 1- naftalenoacético (NAA) e 1 mg 1 benzilaminopurina (BAP)) em placas de petri de 100 mm X 20 mm. Os explantes são co-cultivados com Agrobacteri- uma25ºC. Depois de 3 dias de co-cultivo, os explantes são lavados e trans- : feridos para o meio RCPK (meio REG com 100 mg” de canamiícina, 500 mg | de carbenicilina, e 5 ml de PPM) para selecionar quanto aos transforman- tes. Os explantes são subcultivados a cada 2 semanas. Depois de 8 a 12 semanas de crescimento sob condições seletivas, as plantas sobreviventes, representando transformantes que integraram as constructos de expressão - de RNAi de NIMRP4 em seus genomas, são transferidas para um meio de enraizamento (meio basal MS suplementado com 100 mg 1 de Canamici- : na). Plantas enraizadas são transferidas para vasos para promover o cres- cimento adicional.

Exemplo7: Expressão de polinucleotídeo de N!IMRP4 em plantas de tabaco à: Para determinar a expressão de polinucleotídeo de NtMRP4, o RNA celular total é isolado de várias partes das plantas. O RNA total é isola- do usando o Reagente TRIº (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Para remover impurezas do DNA, RNA purificado é tratado com DNase isenta de RNase (TURBO DNA-free, Ambion, Austin TX). Para sintetizar o primeiro filamento de cDNA, aproximadamente 10 ug de RNA total são transcritos reversos uti- lizando o High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para medir o nível de transcritos de NIMRP4 nas amostras, uma RT- PCR de 2 etapas quantitativa é realizada de acordo com a química com ba- seem sondaMGB Tagman. A mistura de RT contém 4 UM de mistura de dNTP, 1X de iniciadores aleatórios, 1X de Tampão de RT, 10 g de cDNA, 50U de Multiscribe Reverse transcriptase (Applied Biosystems), 2U de Inibi-

dor de RNase Superase-ln (Ambion), e água isenta de nuclease. A mistura de PCR contém 1X Tagman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), 400 nM de iniciador dianteiro, 400 nM de iniciador reverso, 250 nM de sonda MGB Tagman, 2 ug de cDNA, e água isenta de nuclease. . 5 RT-PCR é realizada utilizando um ABI 7500 Real-Time Sistema (Applied Biosystems, Foster City, CA) e sob condições de amplificação: 50ºC por 2 min; 95ºC por 10 min; 40 ciclos de 95ºC por 15 s; e 60ºC por 1 min O polinucleotídeo de NIMRP4 é expressado em tecidos de taba- co, como determinado por RT-PCR usando cDNA de pétalas, estame, pistilo, sépalas, cápsula, caules, folhas e raízes.

Quando plantas de tabaco são cultivadas em uma solução hi- dropônica, a expressão de polinucleotídeo de NtMRP4 é levemente suprar- regulada por cádmio tanto na raiz quanto nas plântulas da folha de N. taba- cum (TN90, ver Figura 2). Entretanto, embora o polinucleotídeo de NtIMRP4 seja descoberto também ser induzido na folha de N. rustica, dados opostos - são observados nas raízes de N. rustica (infrarregulação) comparado a N. tabacum, desse modo sugerindo que o polinucleotideo de NIMRP4 pode É desempenhar um papel no acúmulo de cádmio na raiz e tolerância a cádmio elevada de N. rustica. Exemplo 8: Silenciamento da expressão de polinucleotídeo de NIMRP4 em plantas de tabaco Uma primeira sequência parcial (CHC) SL022xb24f1.ab1) que codifica um transcrito de NIMRP4 putativo (não mostrado) é encontrada u- sando anotações do Tobacco Genome Initiative (TGI). A partir desta se- —quência particular, iniciadores são gerados para silenciar a expressão de polinucleotídeo de NtMRP4 em tabaco usando um método de RNAi (Figura 1). A sequência de RNAi de correspondente é ampliada a partir do CDNA por RT-PCR e depois inserida no vetor de passagem pB7 GWIWG?2(II) por inter- médio de um vetor de entrada, exatamente como detalhado pelo fabricante — (Invitrogen). Este vetor contém um promotor para a expressão constitutiva (o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor CaMV) do transgene em todos os tecidos da planta e o gene de barreira para a seleção de herbicida com Basta em placas ágar (30 mg/ml). O constructo é depois inserida no genoma do tabaco Burley KY14 por intermédio de Agrobacterium tumefasci- ens usando um procedimento em disco de folha clássico.

A partir dos calos, : linhagens individuais são regeneradas e selecionadas em Basta.

Linhas de : 5 silenciamento de RNAi são depois monitoradas por RT-PCR e cultivadas para a produção de semente.

A Figura 3 mostra que o silenciamento de Nt- MRP4 é eficaz em linhagens transgênicas, incluindo linhagens 1 e 2. Se- mentes T1 são coletadas, recultivadas em placas ágar contendo Basta para seleção e plantas resistentes são cultivadas em bandejas flutuantes antes do cultivo no campo.

Aproximadamente 500 mg da planta são pesados e digeri- dos em 10 ml! de HNO; concentrado pelo sistema de digestão 5 de sistema de reação, acelerado por microondas (CEM corporation, Mathews, NC). Concentrações de metal pesado são analisadas utilizando espectrofotome- tria de plasma-massa ligada por indução ("ICP-MS," Agilent 7500A; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Como controle de tabaco não transgênico, - uma amostra consistindo em folhas de tabaco virgínia, certificadas por poli- mento, CTA-VTL-2, é preparada sob condições comparáveis. ' A Figura 4 mostra uma redução de cádmio nas folhas próximo a 20% nas duas linhagens de RNAi de NtMRP4 testadas (linhagens 1 e 2) a seguir de dois experimentos de campo sucessivos em dois anos consecuti- vos.

Em cada caso, as unidades experimentais consistem em quatro réplicas independentes de 4 plantas coletadas (em peso, linhagens 1 e 2 e plantas de controle de vetor no experimento de campo no segundo ano) que são randomizadas dentro dos blocos.

Além disso, amostras de controle são adi- —cionadas aos blocos de modo a controlar quanto a tendências espaciais.

Análises das linhagens de RNAi de NtMRP4 demonstraram um efeito forte e estatisticamente significante em reduzir o nível médio de cádmio.

Exemplo 9: Análise da altura e peso em plantas derivadas de plantas de ta- baco em que a expressão de polinucleotídeo de NtMRP4 é silenciada.

A altura e peso das linhagens de NtMRPA4 silenciadas são leve- mente afetados comparado às plantas de controle.

Entretanto nenhuma dife- rença significante é encontrada em folhas secas coletadas entre plantas de

RNAi de NtMRP4 e plantas de controle do tipo selvagem ou de vetor, indi- cando assim que a degradação de transcritos de NIMRP4 não tem nenhum efeito estatisticamente relevante sobre a biomassa seca. Estes dados são : confirmados por um outro experimento de campo que mostra que o AIMRP4 : 5 de superexpressão (homólogo ao polinucieotídeo de NtMRP4) na mesma base de tabaco (KY14) leva a 10 a 30% mais acúmulo de cádmio nas folhas (dependendo das linhagens transgênicas). É evidente que degradar a prote- ína de mRNA que codifica NIMRP4 significantemente reduz o nível de cád- mio na folha de tabaco. Exemplo 10: Identificação de mutantes induzidos por EMS em NtMRP4 Uma biblioteca de DNA é fabricada de plantas de Nicotiana ta- bacum que foram expostas a metanossulfonato de etila (EMS) e são tria- das quanto aos mutantes no éxon 1 e éxon 2 de polinucleotídeo de Nt- MRP4 sequenciando-se a parte relevante do gene de NIMRP4 de plantas individuais.

- Para o éxon 1 NIMRP4Exon1FW (5-CATCTCCTTACGAAGGAT ACTACC-3') e NIMRP4ExonIREV (5-GCTGCAAGCTCTCCTTITTCTAA-3') O são usados para o sequenciamento, e para o éxon 2, NIMRP4Exon2FW (5'- GTGCAATCTGGCAAATATAGTGAG-3') e NIMRP4Exon2REV (5-AAAATGA CATAGGAGCATGCAGTA-3') são usados para o sequenciamento.

: Uma visão geral de todos os mutantes encontrados para o éxon 1 e éxon 2 do polinucleotídeo de NtIMRP4 é apresentada na Tabela 1. O có- don original (códon ori) e códon mutado (códon mut) assim como o aminoá- cido original (AS ori) e substituição de aminoácido (AS mut) ou códon de pa- —radasão indicados. Exemplo 11: Protocolo de pesquisa para a seleção de sítios alvos de nucle- ase dedo de zinco Este exemplo ilustra como pesquisar o gene de NtMRP4 para triar quanto à ocorrência de sítios alvos únicos dentro da sequência genética dada comparado a uma base de dados de genoma dada para desenvolver ferramentas para modificar a expressão do gene. Os sítios alvos identifica- dos pelos métodos da divulgação, incluindo aqueles divulgados abaixo, os motivos de sequência, e uso de qualquer um dos sítios ou motivos em modi- ficar a sequência genética correspondente em uma planta, tal como tabaco, são abrangidos na divulgação. Algoritmo de pesquisa.

- 5 Um programa de computador é desenvolvido que permite que uma pessoa trie uma sequência de nucleotídeo de pesquisa de entrada (al- vo) quanto à ocorrência de dois motivos de DNA subcorrente de comprimen- to fixo separados por um tamanho de espaçador dado usando um arranjo de sufixo dentro de uma base de dados de DNA, tal como por exemplo a mon- tagem de sequência de genoma de tabaco do Exemplo 1. O constructo do arranjo de sufixo e a pesquisa usam a biblioteca 2.0.0 libdivsufsort de fonte aberta (htto://code .gooagle.eom/p/libdivsufsort/) que converte qualquer cadeia de entrada diretamente em uma cadeia transformada de Burrows-Wheeler. O programa varre a sequência de nucleotídeo de entrada total (alvo) e de- —volve todas as combinações subcorrentes que ocorrem menos do que um número selecionado de tempos na base de dados do DNA selecionado.

Seleção do sítio alvo para mutagênese mediada por nuclease dedo de zinco de uma sequência de consulta. Um domínio de ligação de DNA dedo de zinco reconhece uma sequência de três pares de base de nucleotídeo. Uma nuclease dedo de zin- : co compreende uma proteína dedo de zinco compreendendo um, dois, três, quatro, cinco, seis ou mais domínios de ligação de DNA dedo de zinco, e a nucleasse não específica de uma enzima de restrição Tipo IIS. Nucleases dedo de zinco podem ser usadas para introduzir uma quebra de filamento —duploem uma sequência alvo. Para introduzir uma quebra de filamento du- plo, um par de nucleases dedo de zinco, um dos quais liga-se ao filamento positivo (superior) da sequência alvo e o outro ao filamento negativo (inferi- or) da mesma sequência alvo separada por 0, 1, 2, 3,4, 5, 6 ou mais nucleo- tídeos é necessário. Usando-se os plurais de 3 para cada um dos dois moti- vosde DNA subcorrente de comprimento fixo, o programa pode ser usado para identificar dois sítios alvos de proteína dedo de zinco separados por um comprimento de espaçador dado.

Entradas do Programa:

1. A sequência de consulta de DNA alvo

2. A base de dados de DNA a ser pesquisada

3. O tamanho fixo do primeiro motivo de DNA subcorrente : 5 4. O tamanho fixo do espaçador

5. O tamanho fixo do segundo motivo de DNA subcorrente

6. O número de limiar de ocorrências da combinação de entra- das do programa 3 e 5 separado pela entrada do programa 4 na base de dados de DNA escolhidas da entrada do programa 2 Saídado programa:

1. Uma lista de sequências de nucleotideo com para cada se- quência o número de vezes que a sequência ocorre na base de dados de DNA com um máximo do limiar de entrada do programa 6. Exemplo 12: Definição do perfil de expressão de transcritos de NIMRP3 e NtIMRP4 em tabaco Desenvolvimento e análise de ExonArray do tabaco. Usando os clones de BAC obtidos como descrito no exemplo 1, 272.342 éxons são i- õ dentificados combinando-se e comparando-se dados de EST do tabaco e as sequências filtradas por metila obtidas do sequenciamento de BAC. Para cada um destes éxons, quatro oligonucleotídeos 25-mer são designados e . usados para construir um ExonArray de tabaco. O ExonArray é fabricado por Affymetrix (Santa Clara, USA) usando protocolos padrão. Expressão de NtIMRP3 e NtMRP4 em tabaco. RNA é isolado da espécie de Nicotiana cultivada em solos Cd+ (contaminados com Cd) e Cd- (deficientes de Cd), e analisada usando protocolos de hibridização padrão e ferramentas analíticas. A definição do perfil de expressão é realizada para identificar conjuntos de gene relacionados ao acúmulo de Cd e para deter- minar a influência do Cd no solo na variação dos transcritos de NIMRP3 e NtMRP4. Sondas de NtIMRP3 e NtMRP4 usadas são localizadas no primeiro e últimoéxons assim como na região 3UTR. Os resultados mostrados na tabela 2 indicam que folhas de plantas de N. tabacum cultivadas em um solo contaminado com Cd acumulam mais Cd do que plantas de N. rustica culti-

vadas no mesmo solo.

Raízes de plantas de N. tabacum acumulam menos Cd do que raízes de plantas de N. rustica.

Interessantemente, tanto NIMRP3 quanto NtMRP4 não são regulados por Cd mas sua expressão é diferente nas duas espécies de Nicotiana sugerindo que ambos os genes conduzem diferentemente a captação, deslocamento e acúmulo de Cd em acréscimos de Nicotiana (dados estão em log 2 correspondendo à média de três réplicas biológicas). Como controles, a expressão dos três genes de manutenção

(UBP12, éxons 1 e 2), a-tubulina e a proteina ribossômica S16 é mostrada.

Qualquer publicação citada ou descrita aqui fornece informação relevante divulgada antes da data de depósito do presente pedido.

Declara- ções aqui não devem ser interpretadas como uma admissão de que os in- ventores não são designados a antecipar tais divulgações.

Todas as publi- cações mencionadas no relatório descritivo acima são aqui incorporadas por referência.

Várias modificações e variações da divulgação estarão evidentes àquelas habilitados na técnica sem divergir do escopo e espírito da inven- ção.

Embora a invenção tenha sido descrita em relação a modalidades es- pecíficas preferidas, deve ser entendido que a invenção como reivindicado À não deve ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas.

De fato, várias modificações dos modos descritos para realizar a invenção que são óbvias àquelas habilitados na biologia celular, molecular e vegetal ou cam- : pos relacionados são intencionados a estar dentro do escopo das reivindica-

ções seguintes.

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SEQUÊNCIAS (sombreado indica a posição dos éxons) SEQ ID NO: 1 (sequência de DNA de NtMRP4 com UTR 5' e 3') caagcegtaggaatgrrgagettgaaaacgtgcaggtaataattctaactaattctgtog ttgctatttgcragcatttgcacaaaaggaaaactataaaaagttcatagtaaggaagag : agggtagctgtattaacaagccracagattctttaatttcaaatatgrtacgtrgaatet ctatattgrrtgrrcractggroaacaggrtagatategtecgaacactecterageger taaaggagttactctcageatrtagagggggagagaagataggtgttgttggregracago Ás gggtagaaaatcaacattaattcaagttttetttegtteggeggagectgcagertggaag aataatcattgatgacgragatatatccagacttgggctteatgatettagatcetegett cgggatcattcccraagagecagtecttttrgaaggaactgtgagaagcaacattgacce cattggacaatattcagatgatgaaatttggaaggraatctaacttgctgactgaaataa ttracaaaaatctcaaaatatagracagagttagccaaacatgtetretgagtgetgaga tctttrtggattataaattctotaagagcaacatactatttgttagtgagaagaaaagea tatactecagtgtettgrtatetoccagaatgtetotaacatgaaategtrgtacattgca gagcetegaacgetgccaacteaaagatgtggtgtoetttaaaaccegaaaaacttgatte accaggtaaatttrcetectetacgteatectrgtggetetttgeggaateatgeaacea actttttatgtgtttcaaatatatatactgataactgaatactgtcateggtaaatcata grtgtrgataacggagataactggagrgetcggacagaggcagettetttgertrgggaaga gtgatgctaaaacgtagcagacttctatttatagatgaggcaactgectotgttgattca cagacagatgcagtgattcagaaaatcatecgegaggactttgeggectatacrataate agcattgcccacagaatáccaacagtcatagactgtgatagagttettgrtatagatgca ggtgctgatttetetectrtrtactttgracettattttgaatctagraaatgatrattca tetgrtatgtgatggtttccaaceaatcatagtcageacetrttatgaagaaattgoctaat gttagccaagtagtagtaaatgcatgaagtcatragecratttgtrteggartrregegas tttcatacttcaaactggaagcttatgeratactatetgateccrrgrttgratagateg ctttettttecrtrtetoteggatttatettatatataageggacagagtaaaagaatgta aacatgegtaatrrgacetattatagcagattatttgtettattttccaggtegorgatt ccactrtattaggagtagrtacacgtatttatcttttaagtgaaataatagrgraaagett ctttrggeactgroeggrgtaaagaagtraaactectttetttaaceceggeatttectrat tcatgcaggaatagcaaaagagrrttgacaaaccatetegrrtgctrgaaaggecttcacr trrttggggctttagrtoaagaatatgccaacegatcetetgagetotaacoaçaçtattt tggcttroatgectttegetgtaaattgcagcetatotrogaggataggtgaaacaggaaa - aatacctatccaaatgttacatagatttecaaatagegrtatetectactaagetateca gtagatttttogaaatataacaatattgggattaaçaattogtaattgatgaatetattaa tcaaatacaatgattattctgttatagatgtagtctgtgcaatgrtatatagactgattto SEQ ID NO: 2 (sequência de DNA de NtMRP4 sem UTR 5' e 3') atggatatgaggaacagtatgtcttcagaatettgrttageateactttotegrretgo ctccacatttcaategrecagaggattcageagtegrtaaatogttaagattcattttecct ctetecatgtecacaaaggactettetatertecattgatgtgetgcttttgcttacret cattgtatttgcagtacaaaagttgtactcaaagtrgaggrecaatgageactetacreo tagcattgataagcctctaattgcacacaacaggacttctgttagaaccaatetttggtt taagctgtcetergatttrgreagetattttagecttatetretatagetetatgcatere ggttattgrgggaaatteccagtegecttggaaagrcatagatggactatattggrtgee tcaggcgattacacatgrtgtaatcactatactaatagttcatgagaaaagatttcacgc tatttcccatecactarecetgegegrgttttagattgcaaactttgtagtratygageet gttettrggrtgrgggarcacaaggettgrgrcacrtaaggaaattgatoctaatttaag aatggatgatataagttcattagttteatrttcetaretergregrecrerteattgtego cattaaaggttegaccggagetactataattagtgattctgaateteacttaagtgatga aaccaatggrtatgaactectagataaatecagegrgagrggetttgoertcagetteter aatatcgaaageccttrttggatttggatgaacccrrractgcaaaaaggttacaagteace teteaagattgatgaagrtccrrcactttececactgcatagageagagaaaataretea actttregaaagaaattggectaaacctgaagaaatatcaaagcatectgrocgaacaao attgctgcgttgctttrogaaggaagtrattrtttactgccattettgcagtaattagggt atgtgttatgratgtagggecaacacteatacaaagatttgrttgattacacagcaggaaa gaggacatctccttatgaaggatactaccttataggaacterectaatagecaaattege ggaagttetaacetetcateagtteaacttraacteccaaaagettggeatgetratreg agegacactreteacrtctregrataagaaggggrtaaggttoteatgeteagetagaca ggectcatggtgttogacagattgtaaattatatggcegregatgetcageagetgtecga tatgatgctacagctacattccatttggcteatgccattacaagettetgtggetttagg catcectttatacttacctegargetrteaactgttgtaacgetagerggactrgcageagt gatggtatttgtogrgrttggaactaaaagaaacaacaggtttoaatrtaacatcatgaa gaatcgtgattctagaargaaagegacaaatgagatgcttaattatatgcgegrtataaa grtccaggeatgggaagaacattrraacaaaagaattgaatecttecgegaatecgagta tggatggttgtccaagrtettgracteaategetgggaatatcattgtcrtgarggageac tcetettcragtggeracacteactettggaagegeaatottgttgggaatecogettgg tgcagggacagtgttcactgcaacatetetetteaagatgttgcaggaacegatcaggge

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7 agttggggeggggaagtetteceteettgcatetgracttggtgagatgcacaagttgtc gggtcaggtatggctercatecttetgrtegrregacttaatacaaacttegergocaatt acettttgocecrrgergetacetetrttctgrggrataaaaaattaatagtaggctaato tgtagagtggaggtattatatgcagaacaattgcaatoaageaattacctgtgagatact attttgttttcatatragtggactagtacatteteattggrgtategrttgatetecace aaagcagaggttttactagecgacagagtcaaactactgrgetteactecttttacteca atccttagragtetttgcttetaatgaacttcaagegrgraatagaaacaccattatatt attagctgattagrtactttacaattccagageatattrtacattttetgettggttgtet attactetggataacagtectaaatgcaageaaaatcaactgtgrtrtcagretegaget gaccaattagttcatgatgtccteagettgtecaagertggegecteaceggaattatoto ggaccttogractraatcaactagttoacctrottctraaaaatattgaatgatttgatt ggttaatagttccttaaatgragtaattatttgotaacttactttaccaaçocottgtoo aacaggtcacaatttgtggrrcaactgcctatgrtgcacaaacategtggattcagaato gcacgatacaagaaaatatccrgtrrggratgccaatgaacagagacagatacaaggaag tgatcegggtttgorgortggagaaggacttggaaataatggagrtrggagaccagacto aaataggagaacgtggcatcaacctcagtggtggreagaageagegaatecagettgcaa gagctgtrtraccaggactgtgatattratcetroetagatgatgtattcagtgcagtegato ctcacactggctetgaaatotteaaggrtagaagtccacaatgtcatgrgtoattgaaga trtaatttaagatagaaattacattgtttcattetgcaaattatggacctatcagagaãa aatcatggattttgaatggctactttecccagtgaagacacatateatttectgaggagga agatgtgaaagtggcaagctatttactecaaaaagtataatctaaaagacttttattaag f tttggaaggerttaatecateattrtgrttatergregecrtactegectetatraaaatectt cttagtecaatceactttegatgaagttgactagtcttagtcacctgaatactttaaatet ttgccttagtatetetarattttcagecateteaatteegaagetcatatttgtrttete ie trtgtaatgtecatetgaaagtttcatgettttttgcaggaatotgtagaggggaattectt aaagataaaaccattttgcttgtcacacaccaagttgacttettgcataatgttgaceto atccttgtaagtttcagagtgttttatcaacccetttggaaccaagtgtcaagagtagtg e tttcttggttgtraaatgattcacatgtgrattggrrretataaaacectgaaçtttatot trttatcagagtgtrttgortrettgaaggrcatgcgagatgggatgategrgcaatetgg caaatataatgagatattagaagetggaatogatttrtaaagagctagtagetgcacatga gacctctrttagaacttgttgacgrggaaacaaccaaagagageaatgcetecettgaaga É atcaaaatcttctegaagattatetaaggaagaaaacggagatgataaatctcaacagte tacatcrtgataggggggatretaaacttataaaggaagaagaaagagaaactggaaaage cagrccregrgrgracaagetatatattactgaagetrttggatggtggggtgtagtgct agttatcttgrtttegrrertgtggcaaagetetotaatggeaagtgatrtattggetgge atartgaaacttcagcggategrtgceatgtcctteaatecttetetgrtrratryggatata cggtgtrattgcagttgttrettegrrgergatagtgatcaggargtattttgtgacact tatggggctcaagactgcccaaatattttteggacagattettracagcatactgcatgo tcctatgtcattrettgacacaacaccttccggaagaattctgagtegggtaaatttotg aggacaagttttrecttrtgcatgtaaatrcaaactttgetgcttagatgattaaataat gaaaaatatecattgcatgttttaatgtgtatgacatgtrtagaatttrgaatagaagtte attcactgatgttgagatgttttgrtttttrtorgcaggcatotaatgatcagaccaaca ttgatgtettcctocegtttteratgaateteactttogecatgrtratcacactgeteg gcatcatcatcatcacatgccaatatrettggecrtacegtactacttttgattectetas gttggcttaatatetggtacegggtatgageactgtttataacageegtecttetetetre ttettgtetgaacteaaatttgaatoctttgretagaggeaatrageetgerotgageat tttggctgacagrtattatgtatattaaaaggcaactttttratregttetgtecageta aaacttttracttaaaatgrggrtaactgcatatrtetgtatetectatrtttegattac ttgcaactctgatcaatetagatttggggaaggettgttgrtagregatgactagatact aagctcacatcrtacattggrtgcaagragaatttteaagttgtoatrcacttatattger tgaactaggagattagcattettetgoaaggagecetgaa tgctrgaaaagttaaacaga aaagaaaaagttcagggçagatagacataatgtgrraaagtaattcaattggagcacaga tatatgacatytgrtarttrgggagetacgaaaaagataaggactattatgtagactacaa ttgaaataacaggtaatrcatttetggrtracagggatattatetrgcaacatetegtga attgacteggcttgactcaattacaaaageacetgttattcatcatttetotgaaageat ctcaggtgttatgactatacgrtgettraggaageaggagatgttttgtaacgagaatot aaaccgagtgaattccaatetgogaatggatttoecacaacaatagatccaatgaatogtt gggctttegactagaattaatgggaagetracttetttgrgettotgcaatgttcatgar

” tgtetracctagcageatcatcaagecaggtataacaccgtecaatgctcatttatagga attataaattctagrattrgataatecttotgtactttagatetacetgetetactgaaa aatgaaatgagtatgaggaaatagaatatcegtrgageatttatgtetttetatraaaaa

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* grgatgctaaaacgtagcagacttetatttatggatgaggcaactgcctetgttgattea cagacagatgcagtgattcagaaaatcatcegegaggactttgeggectatactataate agcattgeccacagaataccaacagtcatggactgtgatagagttcettgtratagatgca ggtgctgattteteteettrtactttgraccetratretgaatoetggraaatgatrattta rr tetgtatgtgatggtttccaaceaatcatagteagtacettratgaagaaattgectaat gttagccaagtagtagtaaatgcatga

. SEQ ID NO: 3 (Íntron 1) gttagaaccaatctttggrrtaagetgtetetgattrtgtcagetattttagecttatetretatagttttatgcat Ereggtrattgegggaaat teccag SEQ ID NO: 4 (Íntron 2) gratggcteteatecttetgetegretgattaatacaaacttegergecaattacoretigocectegrtgeracet ctttrcrgrggrataaaaaattaatgraggcraatgrgragagragaggtattatatgcagaacaattgcaatcaag caattacctgrgagatactatttegrrtrcatattagrggactggracatectcattggrgrategrtigatetcca ccasagcagaggretracrggecgacagagrcaaactactgrgettcactecrtrractecaatectragtagectt tgcttetaatgaacttcaagegrgtaatagaaacaccattatattattagetgattagttactttacaattecagag catattracattttctgctiggrtgroratractetggataacagrectaaatgcaageaaaatcaactgtotttre agtcttgagctgaccaattagrrcatgatgtcctcagertgrccaaget gatgootcaceggaattatgtaggacer tegtactraatcaactagttcacetrettertaaaaatatrgaatgattegattagetaacagrtccrtadatotag taatrattrgetaactractttaccaacccctrgrecaacas SEQ ID NO: 5 (Íntron 3) gttagaagrccacaatgtcatgtgtcartgaagattrtaatrtaagatagamattacategrtecattctgcaaatta tggacctatcagagazasatcatagat Lttgaatggcractttecocagrgaagaçacatatcatttccigggagãa agatgtgaaagrggeaagetatttacrocaaaaagtataacotaaaagacrtrtatraagetiggaaggertaateo atcatttgttatetattgtetactegretetatrtaaaattcttettagtecaateactttegatgaagtrgactage ctragtcacetgaatactttaaatetttgoctrggtgretetatatettcagecateteaatecogaagetcatatt tgtrtecetetttgraatgtccatotgaaagtrtoatgortrrtegeag

SEQ ID NO: 6 (ÍIntron 4) graagtttcagagegtttratoaacccotttagaaceaagrgtcaagagtagtgrctottggrrgttaaatgatrea catgrgtgtrgatrtcrataaaacetgaacttratotrrtatcagagegreetgetttettgaag , SEQ ID NO: 7 (Íntron 5) gtaaatttctgaggacaagttrrtccrrtrgoargtaaattcasactrtgorgoertagatgattaaataatgaaaaa tatccatracatgttrraatgregratgacatgatragaatttrgaatagaagttoattcactgatgttgagatgttrt grecrerttetgeag SEQ ID NO: 8 (Íntron 6) gratgagcactgtttataacagecgtecttrttrettrtetegretgaactoaaatttgaatccrttgrrtagagge aattagtctgoetetgageatttrtggoeraacageratratgratatragaaggeaacttrtetattegrtotatecas ctaaaacttttracttaaaatotggttaactgcatattretgtgrorcotatetretgateattegeoaacretgate aatctagatttogggaaggctrgetgrragergargacragatactaagetcacatetacattggttgcaageagea tttrcaagtegecattcacrtatattgrtrgaacraggagatrageatretecrgeaaggagecctgaatgcttgaa aagrtaaacagaaaagaaaaagttcagggeagatagacataatgrgrtaaageaattcaatrggageacagatatat gacatgtgttatttoggagetacgaaaaagataaggactattatgtagactacaattgaaataacaggtaattcatt tetggtttacag SEQ ID NO: 9 (Íntron 7) grataacaccgtccaatgctcatetatgggaattataaatretagtatttgataatecttetgtactttagatetac ctgetetactgaaaaatgaaatgagtatgaggaaatagaatatcegrrgagcatetatgtetrttoetattaaaaattt gcattetatettettgrttcaagtcaaaatcttgaacaactatatctagagaattttectretrgrgaagtaatgca tatatacatcaagagaagtcagagttgcrgaatgaaatagtagatcaaatttaagrgttgtacctataaagaattge atggtgagattgaatatagrggtcatattatectercaatettagtgatraaagrattocatacaaaçagacaagea trrtagtegegeatteattggeactacaaaatratcaaccaagagraatattettrcagetttectetgratatgtgt gttetattctggagetgaagataactaatattettrtetatetetacag SEQ ID NO: 10 (Íntron 8) graataattctaactaatrctgtggregeratetgerageatregeacaaaaggaaaactataaaaagtrcatagta aggaagagagggtagctgtattaacaagectacagattcrtraatttoaaatatgtracgttgaatotetatattgt ttgetetacrggreaacag - SEQ ID NO: 11 (Íntron 9) graatctaactrgctgactgaaataatrtacasaaatctcaaaatatagracagagttagecaaaçatgtettetga gtgctgagatcttttrggattataaattetataagageaacatactatttgrragegagaagaaaageatatactec agegrtetgrtatorcecagaargtetoraacatgaaategegracattgcas SEQ ID NO: 12 (Íntron 10) . gtaaattttcctectetacgteatecttgtagrtetrtgoggaattatgcaacoaactetttatgrartteaaatat atatactgataactgaatactgtcattgogranatcatag SEQ ID NO: 13 (Éxon 1) atggatatgaggaacagtatgtettcagaatettgrtttageatcactrreregrtetgeetoçacatrtcaategte agaggattcagcagrrattaaatggrtaagattcatettocretetecatgrecacaaaggactetrctatcttcca trgargegorgetttegorractttcattgratrtgcagtacasaagergracrtoaaagrrgaggrocaatgageac tetacttctagcattgataagectetaattgcacacaacaggacttet

SEQ ID NO: 14 (Éxon 2) tegeettggaaagreatagatogactgtattggttgtrteaggegattacacatgttgtaatcactatactaa tagrecatgagaaaagatttcacgetatttcccatecactgrecetgegegtgttttggartgcaaacrttgr agttatgagtttortettrgotegrgggatcacaaggettgrgtcacttaaggaaattgatcctaatttaaga atggatgatataagetcattagettcatttcctatttctgtegttetoettcattgtrgecatrtaaaggttoga ir ceggagttgetgtaatrtagtgattetgaatetoacttaagtgatgaaaccaatggtratgaactectggataa atccagrgtgageggettegetrcagettetotaatatogaaagecttetggatttagatgaacectttacrg caaaaaggtracaagrcacetotcaagattgatgaagrtcettoactetececactgcatagageagagasaa tgtctcaacttttcgaaagaaattggcotaaacctgaagaaatatcaaageatcoctgtcoegaacaacattgot gegttgcttttggaaggaagttatttttactgccatteregeageaattaggotatgtgrratogratgtagag ccaacactcatacaaagatttgtrtgattacacagcaggaaagaggacatctccttatgaaggatactacctta taggaactetccraatagecaaatetgrggaagetctaacctorcarcagttcaactttaactoccaaaaget tggcatgctrattegagegacacttcteactrotttgrataagaaggggttaaggttgreatgetcagetaga caggctcatggtgrtggacagattgtaaattatatggccogtogatgctoageagetgtoegatatgatgetac agetacattccatttggcteatgccattacaagettetgtggetttaggeatectttatacttaceteggtgc trcaactgtrgraacgetagetggacttgeageagtgatggratttgrggegeteggaacraaaagaaacaac aggtttcaattrtaacatcatgaagaatcgtgattctagaatgaaagegacaaatgagargettaatratatgo gegrrataaagttecaggcatgggaagaacatrttaacaaaagaategaatocttcogegaatccgagtatgg atggttgtccaagttettgtactcaategetgggaatatcattgrcettgtggageactectetrctagtoger acactcacttttggaagtgcaatctegrtoggaatoccgeteggracagggacagrgetoactgcaacatcte tcttcaagatgttgcaggaacogatcagggerttooctoaatecatgatercacrttcacaageaatgatate tortgatagattagacaaatatatgatgagtaaggagttagrggaraaagetgtggaaagactagaagge tar gggggtacaatrgctatgcaggtgaaagatggagettrttgertoggatgatgaaaacagtaaagaagaatega aaaatgtaaacttrgagattagaaaaggagagettgcagcagtagtggggacagttggggeggggaagectte ceteettgeatetgtacttggtgagatgcacaagttgtegggreag SEQ ID NO: 15 (Éxon 3) gtcacaattratggtteaacrgcetatgtrgcacaacategtggattcagaatggcacgatacaagaaaatatecto trrggrtatgccaargaacagagacagatacaaggaagt gatccgggttrgotgoriggagaaggactiggaaataat ggagrttggagaccagacrgaaataggagaacgtageateaacctcageggtggtcagaagcagegaatocagetto Caagagergtetaccaggactatgatatrtartetecragatgatgratrcagrgcagrtgatgctcacactagetet : gaaatettcaag SEQ ID NO: 16 (Éxon 4) - gaatgrgtgaggygaatrottaaagataamaccatttrgotrgrcacacaceaagregactrctegeataargetga cergatcert . SEQ ID NO: 17 (Éxon 5) gtcatgcgagataggatgatcgrgcaatetggeaaatataatgagatattagaagctggaatggattttaaagager agragetgcacatgagacetotttagaacttgrtgacgrggaaacaaccaaagagageaatgcctocctraaagaat caaaatettctogaagattatctaaggaagasãaacggagatgataaatetcaacagtotacatetgataggggggat : tetasacttataaaggaagaagaaagagaaactggaaaagtcagtectegtgtgtacaagetatatattactgaago trrtrogatggtggggtgatagtgctagetatetegttttogttertgrogeaaagttetetaatggeaagegatratrt ggctggcatatgaaacttcageggategtgecatgrecttcaatecetectetgtrtattgggatatacggtgtrart gcagtrgtttertegregergatagrgatcaggatgtartrrgrgacacttatggggctoaagactococaaatatt ttteggacagattcttracageatactgcatgetcetatgtcattrtetgacacaacaccttcoggaagaattetga

IEEFF SEQ ID NO: 18 (Éxon 6) geatectaatgatcagaccaacattgatgtettcotecegrretetatgaatetcacrteggecatgttrarcacact geteggcatcatcateatcacatgceaatatterrggectacegracractetegattcotetgggttogettaata terggtacesg ggatattatotrgcaacatetegrgaattgacteggettgactcaattaçaaaageacetgttattcateattecte tgasagcatctcaggrarratgacratacgttgctrrtaggaageaggagatgrtrtgraacgagaatgraaacogag tgaattccaatergogaatggatttccacaacaatggatccaatgaatçgtigggetttogactggaattgatggga agetracttctrtgegretergcaatgetoatgatrgrertacetageageatcatoaagecag SEQ ID NO: 20 (Éxon 8) aaaatgrtggretgtoactateatataggettgtetettaatagegtectattetagrecatetttgrgagrtgotet gtggasaataaaatggtttctgrogaaagattaaaacagtteteaganataccatcagaageagagtogagaaagat ggattttcteccacettcaagtrggecaagecgrgggaatgrrgagettgaaaacgtgcag

SEQ ID NO: 21 (Exon 9) gttagatatcegrcogaacactectetagroctraaaggagttactctcageattagagggggagagaagataggtot tgrtggregtacaggaggrggaaaatoaacattaatrcaagetrretttegrttgorggagectgcagetggaagaa taatcattgatgacgragatatatccagacrigggettcatgatettagatctogcttogggatcattccccaagas ccagtecttrrigaaggaactgrgagaageaaçatrgaceccattggacaatatrcagatgatgaaatttggaag SEQ ID NO: 22 (Exon 10) agcetegaacgetgecaacteaaagatgtggrgtetttaaaacccgaaaaacttgattcaceag SEQ ID NO: 23 (sequência de RNAIi) aagagecagtcctttrtgaaggaactgrgagaageaacattgacce cattggaçaatattcagatgatgaaatttggaaggtaatctaacttgctgactgaaataa tttacaaaaatctcaaaatatagtacagagttagccaaacatgtcttcetgagtgcrgaga tettrrttggatrataaatrotataagageaacatactatrrgrragrgagaagaaaagea tatactccagtgttrrgrratctceccagaatgretetaacatgaaatcgtgtacattgca gagcctegaacgctgccaactcaaagatgeggrgtottraaaacecgaaaaacttgatte accaggtaaattttcetoectetacgrteatecttgtggttetrtgoggaattatgcaacca acttttratgrgtttcaaatatatatactgataactgaatactgtcattggtaaatcata gttgttgataacggagataactggagteteggacagaggcagetterttgertgggaaga gtgatgctaaaacgtagcagacttetattrtatggatgaggcaactgcctetrgttgattcoa cagacagatgcagtgattcagaaaatcatcegegaggactttgeggcetgractataate agcattgcccacagaataccaacagtcatggactgtgatagagttctrgttatagatgca ggtgcrgattteterecttetactetgracettatetegaatetagtaaatgattateta tetagtatgtgatggrtrecaaceaateatagtcagtacctttatgaagaaattgecctaat grtagccaagtagtagtaaatgcatgaagtcattagectatttgttrtogattrtargag tttcatacttcaaactggaagetratgctatactatetgatcecrtgrttgratagatto ctttoettttcecterttateggatrratetratatataageggacagagtaaaagaatgta aacatgegtaatttgacctattatagcagattatttgtettatttrecaggregetgatt - ccactrattaggagtagttacacgrtatttatoettttaagtgaaataatagtgtaaagttt ecttttggeactgteggtgtaaagaagtraaactcctttcttraaceceggeatrretrar tcatgcaggaatagcaaaagagt ttgacaaaccatetegttrgcrtgaaaggecttcact . tttrogggctttggrtcaagaatatgccaacegat SEQ ID NO: 24 (sequência de proteina de NIMRPA; estrutura 1 5-3'; - deno- ta códon de parada putativo)

MDMRENSMSSESCLASLSCSASTFQOSSEDSAVVKWLRFIFLSPCPORTLLSSIDVLLLLTF IVFAVOKLY SKLRSNEHSTSSIDKPLIAHNRTSSPWKVIDGLYWLFQAITHVVITILIVH EKRFHAISHPLSLRVFWIANFVVMSLFFGCGITRLVSLKEIDPNLRMDDISSLVSFPISV VLFIVAIKGSTGVAVISDSESHLSDETNGYELLDKSSVSGFASASLISKAFWIWMNPLLO KGYKSPLKIDEVPSLSPLHRAEKMSQLFERNWPKPEEISKHPVRTTLLRCFWKEVIFTAI LAVIRVCUMY VGPTLIQRFVDYTAGKRTSPYEGYYLIGTLLIAKFVEVLTSHOFNFNSOK LGMLIRATLLTSLYKKGLRLSCSARQAHGVGQIVNYMAVDAQOLSDMMLOLHSIWLMPLO VSVALGILYTY LGASTVVTLAGLAAVMVEVVFGTKRNNRFQOFNIMKNRDSRMKATNEMLN YMRVIKFOAWEEHFNKRIESFRESEYGWLSKFLYSIAGNIIVLWSTPLLVATLTFGSAIL LGIPLGAGTVFTATSLFKMLQEPIRAFPQSMISLSOAMISLDRLDKYMMSKELVDKAVER LEGCGGTIAMQVKDGAFCWDDENSKEELKNVNFEIRKGELAAVVGTVGAGKSSLLASVLG EMHKLSGQVTICGSTAYVAQTSWIQNGTIQENILFGMPMNRDRY KEVIRVCCLEKDLEIM EFGDQTEIGERGINLSGGQOKORIQLARAVYQDCDIY LLDDVFSAVDAHTGSEIFKECVRG ILKDKTILLVTHOVDFLHNVDLILVMRDGMIVOSGKYNEILEAGMDFKELVAAHETSLEL VDVETTKESNASLEESKSSRRLSKEENGDDKSQQOSTSDRGDSKLIKEEERETGKVSPRVY KLY ITEAFGWWGVVLVILFSFLWOSSLMASDYWLAYETSADRAMSFNPSLFIGIYGVIAV VSSLLIVIRMYFVTLMGLKTAQIFFGQILYSILHAPMSFFDTTPSGRILSRASNDQOTNID VELPFFMNLTLAMFITLLGIIIITCQYSWPTVLLLIPLGWLNIWYRGYYLATSRELTRLD SITKAPVIHKHFSESISGVMTIRCFRKOQEMPFCNENVNRVNSNLRMDFHNNGSNEWLGFRLE LMGSLLLCVSAMEFMIVLPSSIIKPENVGLSLSYGLSLNSVLFWSIFVSCFVENKMVSVER LKQFSEIPSEAEWRKMDFLPPSSWPSRGNVELENVOVRYRPNTPLVLKGVTLSIRGGEKI GVVGRTGGGKSTLIQVFFRLVEPAAGRIITDDVDISRLGLHDLRSRFGIIPQEPVLFEGT VRSNIDPIGQYSDDEIWKEPRTLPTORCGVFKTRKT-FTSC--RR-LECRTEAASLLGKS DAKT-QTSIYG-GNCLC-FTDRCSDSENKEPRGLCGLY YNOHCPONTNSHGL--SSCYRCR C-FLSFYFVPYFESGK-LFICM-WFPTNHSQYLYEEIA-C-PSSSKCM

SEQ ID NO: 25 (sequência de proteína de NIMRPA4; estrutura 2 5"-3'; - deno- ta códon de parada putativo) WI-GTVCLQONLV-HHFLVLPPHENRORIQQOLENG-DSFSSLHVHKGLFYLPLMCCFCLLS LYLQYKSCTQS-GPMSTLLLALISL-LHTTGLLRLGKS-MDCIGCFRRLHML-SLY--FM REKDFFLFPIHCPCACEGLOTL-L-VCSLVVGSQGLCHLRKLILI-EWMI - VH-FHFLFLL FSSLLPLKVRPELL-LVILNLT-VMKPMVMNSWINPV- VALLOLL-YRKPFGFG-TLYCK

KVTSHLSRLMKFLHFPHCIEQRKCLNFSKEIGLNLKKYQS ILSEQHCCVAFGRKLFLLPF LQ-LGYVLCM- GOHSYKDLLITQOQERGHLLMKDTTL-ELS--PNLWKF- PLI SSTLTPKS LACLFERHFSLLCIRRG-GCHAQLDRLMVLDRL- IIWPSMLSSCPI-CYSYIPFGSCHCK FLWL-ASFILTSVLOLE-R-LDLOQ-WYLWCLELKETTGFNLTS-RIVILE-KRQMRCLI ICAL-SSRHGKNILTKELNPSANPSMDGCPSSCTOSLGISLSCGALLF -WLHSLLEVOSC WESRLVOGOCSLOHLSSRCCRNRSGLSLNP-SHFHKQ- YLLIDWINI - - VRS-WIKLWKD -KVVGVQLLCR- KMELFAGMMKTVKKN-KM-TLRLEKESLQOQ-WGQOLGRGSLPSLHLYLV RCTSCRVRSQFVVOLPMLHKHRGFRMARYKKISCLVCO-TETDTRK-SGFAAWRRTWK-W SLETRLK-ENVASTSVVVRSSESSLOELFTRTVIFIF-MMYSVQLMLTLALKSSRNV-GE FLKIKPFCLSHTKLTSCIMLT-SLSCEMG-SCNLANIMRY - KLEWILKS--LHMRPL-NL LTWKQOPKRAMPPLKNQONLLEDYLRKKTEMINLNSLHLIGGILNL-RKXKEKLEKXSVLVCT SYILLKLLDGGV-C-LSCFRSCGKVL-WQVI IGWHMKLORIVPCPSILLCLLGYTVLLOUL FLRC---SGCIL-HLWGSRLPKYFSDRFFTAYCMLLCHFLTQOHLPERF - VGHLMIRPTLM SSSRFL-ISLWPCLSHCSASSSSHANILGLPYYF-FLWVGLISGTGDT1ILQOHLVN-LGLT QLOKHLLFIISLKASQVL.- LYVALGSRRCFVTRM-TE-T. PICENWISTTMDPMNGWAFDKWN -WEAYFFVFLOCS-LSYLAASSSQKMLVCHYHMACLLIVSYSGPSL-VALWKIKWFLSKD -NSSQKYHQKQSGERWIFSHLQVGOAVGMLSLKTCRLDIVRTLL-CLKXELLSALEGERR- VLLVVQGVENQH - FKFSFVWWSLOLEE-SLMT- IYPDLGFMILDLASGSFPKSQSFLKEL -EATLTPLDNIQMMKFGRSLERCQLKDVVSLKPEKLDSPVVDNGDNWSVGOROLLCLGRV

MLKRSRLLFMDEATASVDSQTDAVIOKI IREDFAACTIISIAHRIPTVMDCDRVLVIDAG ADFSPFTLYLILNLVNDYLSVCDGFOPIIVSTFMKKLPNVSQVVVNA- SEQ ID NO: 26 (sequência de proteína de NtMRP4; estrutura 3 5'-3'; - deno- ta códon de parada putativo) GYEEQYVFRILFSITFLFCLHISIVRGFSSC-MVKIHFPLSMSTKDSSIFH-CAAFAYFH CICSTKVVLKVEVO-ALYF-H--ASNCTQCDFFALESHRWTVLVVSGDYTCCNHYTNSS- EXKISRYFPSTVPARVLDCKLCSYEFVLWLWDHKACVT-GN-S-FKNG-YKFISFISYFCC - SLHCCH- REDRSCCN--F-I1SLK--NQWL-TPG-IQCEWLCFSFSNIESLLDLDEPFTAK RLQVTSQOD--SSFTFPTA-SRENVSTPRKKLA-T-RNIKASCPNNIAALLLEGSYFYCHS CSN-GMCYVCRANTHTKIC-LHSRKEDISL-RILPYRNSPNSQICGSSNLSSVQOL -LPKA WHAYSSDTSHFFV-EGVKVVMLS- TGSWCWIDCKLYGRRCSAAVRYDATATFHLAHATAS FCGFRHPLY LPRCFNCCNASWTCSSDGICGVWN-KKQQVSI-HHEES-F-NESDK-DA-L YARYKVPGMGRTF-QKN-ILPRIRVWMVVQVLVLNRWEYHCLVEHSSSSGYTHFWKCNLV GNPANCRDSVHCNISLODVAGTDOGFPSIHDLTFTSNDIS--IGQIYDE-GVSG-SCGKT RRLWGYNCYAGERWSFLLG--KQ-RRIEKCKL-D-KRRACSSSGDPSWGGEVFPPCICTW-

DAQVVGSGHNLWFNCLCCTNIVDSEWHDTRKY PVWYANEQRO IQGSDPGLLLGEGLGNNG VWRPD- NRRTWHOPOWWSEAANPACKSCLPGL-YLSSR-CIQCS-CSHWL-NLOGMCEGN S-R-NHFACHTPS- LLA-C-PDPCHARWDDRAIWOI - - DIRSWNGF-RASSCT-DLFRTC -RGNNQOREQCLP-RIKIFSKII-GRKRR--ISTVYI- -GGF-TYKGRRKRNWKSQOSSCVO AIYY-SFWMVGCSASYLVFVLVAKFSNGK-LLAGT -NFSGSCHVLOSFSVYWDIRCYCSC FFVADSDODVFCDTYGAQDCENIFRTDSLQOHTACSYVIF- HNTFRENSESGI--SDOH-C LPPVFYESHFGHVYHTARHHHHHMPIFLAY RTTFDSSGLA-YLVPGILSCNIS-IDSA-L NYKSTCYSSFL-KHLRCYDYTLL- EAGDVL- RECKPSEFOSANGFPOQWIO-MVGLSTGI DGKLTSLCFCNVHDCLT - QIHOARKCWPVTIIWLVS--CPILVHLCELLCGK-NGFCRKI KTVLRNTIRSRVEKDGFSPTFKLAKPWEC-A-KRAG-ISSEHSSSA-RSYSQH-RGREDR CCWSYRGWKININSSFLSFGGACSWKNNH- - RRY IQTWAS-S- ISLRDHSPRASPF-RNC EKQH- PHWTIFR- -NLEGASNAANSKMKWCL - NPKNLIHQLLITEI TGVSDRGSFFAWEE- C-NVADFYLWMRQLPLLIHROMO-FRKSSARTLRPVL-SALPTEYQQSWIVIEFLL- MOV LISLLLLCTLF-IW-MIIYLYVMVSNQS-SVPL-RNCLMLAK- - -MH

SEO ID NO: 27 (sequência de cCDNA de NtMRP4 como derivado de sequen- ciamento direto de cCDNA) atggatatgaggaacagratgrettoagaatettgttrageateactttetigttetgectecacatttcaategro agaggattcagcagttgttaaatggttaagattcatrttcctetatecatgrecacaaaggactettetatottcca 7 trgargtgergertrrgetractrtcatrgratregcagracaaaagrtgracteaaagttgaggroçaatgageac tetactrerageattgataagecteraattgcacacaacaggacttotgttagaaccaatettrggretaagetoto tetgattrtrgrcagetatetragectratetretatagtrrtratgcattregatrategegggaaattcccagtego &: creggaaagtcatagatggacrgratrogtrgrrrcaggegatracacatgregraateactatactaatagttcat gagaaaagatttcacgetatrteceatecactgtecetgegegrgettggattgeaaacrtegragetargagett gttctttggrtgtgggatcacaaggettgratcacttaaggaaatrgatcctaatrraagaatogatgatataaget cattagteteatttcotatetertgtegrtetettearrattgecattaaaggrtegaceggamtrgetgraateage gattetgaatoetcacttaagtgargaaaccaatggttatgaactcctggataaatccagtgtgagtrogetrrgerte agettetetaatategaaagecttetrggattiggargaacecrttactgcaaaaaggttacaagrcacctetcaaga ttgatgaagttectreactttececactgcatagagcagagaaaatotctcaactttrogaaagaaattggectaaa ccrgaagaaatatcaaageatcctgrecgaacaacatrgetgegrtgertitagaaggaagetatttttactgeca ttcttgcagraattagggratgrgrratgratgragggecaacacteatacaaagatrtgtrgattacacagcagga aagaggacatetecctratgaaggatactaccttataggaactctoctaatagecaaatrrgrggaagetotaacete tcatcagrecaactrtaacteccaaaagettggcatgorratrogagegacacrrctcacrretrtgrataageago ggrtaaggttgroatgeteagetagacaggetcatggtgttagacagattgtaaattatatggcegregatgctcag cagctgteegatatgatgcrtacagcracattccatttggoreatgccattgcaagttrctgtggettraggeatoct ttatactracetegatgctteaactgttgtaacgctagetggacttgcageagrgatggratrtgtogrgrttogaa ctasaagaaacaacaggrttcaattraacatcatgaagaategegattctagaatgaaagegacaaatgagatgctt aatratatgegegttataaagttccaggcatgggaagaacattrtaacaaamagaatrgaatecttcegegaatecga gratggatggrtgtccaagrtetegracteaategetgggaatatcategrettgrggageactecrertctagrog Ctacactcactttrggaagtgcaatcttgtrgggaateceget tagrgeagggacagrgrtoactacaacatetete trcaagatgrrgcaggaacegat cagggcrreccetoaatocatgateteactetcacaageaatgatatetetega tagattagacaaatatatgatgagtaaggagrtagtggataaagetgrggaaagactagaaggttotoggggtacaa ttgctatgcaggrgaaagatggagettetrgorgggatgatgaaaacagraaagaagaatrgaaaaatgraaacttt gagattagaaaaggagagcttgcagcagtagtggagacagttggggeggggaagterecectecrtgearetgtact tggtgagatgcacaagttgtcgggrcagatcacaattegrggrtecaactgectatgttgcacaaacategrggatte agaatggcacgatacaagaaaatatccrgtttagtatgccaatgaacagagacagatacaaggaagrgatecgggrt tgctacttggagaaggacttggaaataatggagtttggagaccagactgaaataggagaacgtggcatcaacetoag tggrggtcagaageagegaatccagettgcaagagetgtttaccaggactgtgatattrtatotoctagatgatgtat tcagtgcagrtgatoctcacactggetoetgaaatettcaaggaatgtgtgaggyggaattetrtaaagataaaaccatt ttgcttgtcacacaccaagrtgactrcttgcataatgrtgacctgatecttgecatgegagataggatgategtgca atctggcaaatataatgagatattagaagerggaatggatrrtaaagagetagtagetgeacatgagacetetttag aacttgttgacgtggaaacaaccaaagagageaatgccteccrrgaagaateaaaatertetegaagartatetaag gaagaaaacggagatgataaatctcaacagtctacatctgataggggggattetaaactrataaaggaagaagaaag agaaactggaaaagtcagtcctegrgrgtacaagetatatattactgaagettttggatggrgggagrgragtocrag " ttatctegrrecegrrecorgrggcaaagetetetaatggcaagtgattattggetggcatatgaaactrcageggat cgrgccatgrecttcaatecttotetgrtrtartgggatatacggtgttatrgcagregetrettegregergatage gatcaggargtattttgrgacacttatggggetoaagactgcccaaatatttrecggacagattettracageatac tgcatgctectatgtcatrtrtrgacacaacaceteccggaagaattergagtegggcarctaargarcagaccaac attgatgtettcctecegtrttttatgaateteactttggecargrttateaçactgeteggcatrateateateac atgccaatattctrggcotacegractacttttgattoctotaggteggcrraatatetggtaceggggatattate trgcaacatctcgrgaatrgacteggctrgactcaattacaaaagecacctatrattcatcatttctotgaaageate traggrgrratgactatacgtrgcrrtaggaageaggagatgtttrotaacgagaatgtaaaccgagrgaattccaa tctgegaatggatttecacaacaatogatccaatgaatggttgggotttegactggaattgatgggaagettactte tttgtgtrtetgcaatgttcatgatrgtortacetageageateatoaagecagaaaatattogrrtgroactarca tatggcttgtetorttaatagtgteerattetggtecatetttgegagttgcrttgeggaaaataaaatggtttergt cgaaagattaaaacagttcteagaaataccatcagaageagagtggagasagatggattttctocoacerteaaget ggccaagecgrgggaatattgagetegaaaacygtgcaggttagaratcgtocgaacactectetagegettaaagga gtracteteageattagagggggagagaagataggrgrtgttggrogracagggggtggaaaatcaacattaattca agttrtettrogrteggatggagectacagetggaagaataatcattgargacgtagatatatccagacttgggerte atgatettagatetegetregagateattececaagagecagtecrrrceigaaggaactgtoagaageaaçattgso cccatrggacaatattcagatgatgaaatttggaagagectogaacgctgccaactcaaagatgrggrgrorttaaa accegaaaaacttgattcaccagttattgataacggagataactggagrgtoggacagagacagetretregertag guagagrgatgctaaaacgtageagacttetattratggatgaggcaactgcctotgtrgattcacagacagatgca grgattcagaaaatcatcegegaggacrtrgeggectgractataatcagcatrgcccacagaataccaacagecat Gggactgtgatagagttettgtratagatgcaggaatageaaaagagttrgacaaaccatetegtttgettgaaagge cttcactrtttrggggetttggtroaagaatatgccaacegatcotetgagetotasa

SEQ ID NO: 28 (sequência de DNA de NtMRP3 com UTR 5' e 3') Cegtcaacccagtcttggecaccacataaacacagetttgacttgtetetecettticectatittca ccaceecttttcaatttcccacettatattcattattatatttaateaatcaaatcaaagttggaaaaa aagggagtaataatcaaatggagtagtatatacataccagaacaatgaaagagcactcataagctaaa geccataattcatcacgaaaccacaatatagaggaaacctgacgtagtecettaaaatctaacettgaa À cetetgagacetecaaaaaaaacatcatagaaattgcaaagggcatgtetgtatttcaatetttgaga tatgttagegt tgatgaateceteegaaaceceattttettacgtgteattagttgttctttgcacet agggattatteettgtaattettagatrgtattattagaatacaatcaggagggacaataatagctggec Ê acasacagagtagtactáaggaatgctaggttcttgtactacaaateaacettgttttgtreaataggt etagccatetttagetttgtgttatatttgttageteatttttattggratagaaatggttagtcaga agaaaaaattataacccttttaogattttgcattaaagttactagettagttateaatetetgttttot tgcacacccagttcettaattcttgtgaaaccaaatacec tcttgttttaagagtttagtgggggcttttettetttatttottgrtattgcettgttatagacctto tttatggggaaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacctgatgttgtttteactettato gggttattcttetgttttgttgggrtrtattgttaaaacagagagtgaggagaatatgcttcaggaaco cectettaaatggtagtgttgccaatageatggactoaaagaagtetactagggatcaaactgtcaceo cttatgccaatgctaacatttttagtetetttactrtetettggatgggteccctaatttetgtigge aacaagaaaccattagaccttgaggatgttccteagetteactttgatgatagtgtcaaagggagttt tectatttrttagagaaaaactagaatctgtgggtggaggaaatagtaacegtgtgactacctteatgo tggtgaaggctttagttttcacageacggaaggagatagtgttateggetetettegtgettetttac gectetggegtettttattagecegtaccteattgataccttagttcagtatetgaatagaaaacgaga ctttgataatgaaggttatgtcttagtggetgcattettegrtgcaaagttagtogagtgtttagege aaaggcattggtttttcaaggtgcageagggagggtatcgageacgggcageactaggtttccaaaate tacaacaagggtttaaccctectcctgtcagtcaaageaaagecacactagtggagagatcatcaattt tatgacagttgatgccgagaggattagtgacttcggttggtatatgcatgatecttggatagtaatoa tacaagttgctetggeattggtgatactetataaaaatettggoctagetgetategeegegrtiget gctacaataatagtgatgttggcaaacatecetttagggagtttgcaggagaagtttcaggagaaact catggaatcgaaagatagaaggatgaaggctacatctgaagtcttaaggaatatgagaatacteaage f ttcaagcttaggagatgaagtttctatetaggatettggaccteaggactacagaggcaggatagtto atgaaatatgtgtacacátcagctatgactacttttgtottotaggttgctectacatttgrttotgt gacgacctttggcgctacaatgcttatoggaatcccacttgaatctgggaagatattatetgcactto . cgacatttágaattcttcaagagcccatctacaatotecccagatacaatttcaatgattgctoaãaco aaágtttotettgategtattgcatetttectrtotettgatgacttgeagectgatatcatagagas gecttccaaaaggtagttctgatgaageaattgagattgtaggataggaacttegettgggatgcateca : cetegactecacttetaaaggatgtaaatettagagrgcttaatggeatgagagttgccatttgtggt acagttggttcaggaaaatcaagettactgtetageattttaggagagatgcccaaattatcagggac tattaaaCttagtggaacgaaggcttatattgcacagtegecetggatacagagtggaaagatagago . agaacatattatttggtasagagatocagagggagaagtatgataaagttocttgaagegtgotectta aagaàagacctggaaattctctettitagegatcaaacagaaataggggagaggggcattaatttgag cggtggacagaagcagagaatacagattgctegtgetetttaccaagatgctgatatttacctattto atgatcegttcagtgctgtagatgctcataceggatcecatetettcagtgtaagtectttoatatat atgctttattttcatgettgatatattttacctagecacttgattgacccatcctttaattgcaggaá tgtataatggggctatigaattcaaaaacagttttatatgttacacatcaagtggagtttttgcctge tgeggatttgatettggtactetttoetttcagraattatggtttgcttaatateatatatagactta actcatttaactatgatatttctcttcaggteatgaaagatggaaggatcagtgaaactagggaaátac aatgatcttctcaaattaggtagtgacttcatggaacttgtaggtgctcaccaagaagetttaacage aattgacacagttaagggagaagcattgagaaagagtgaggaaatgactagtgataatacaaatgtac agaaggataaaaatatttcagatggccaaaatggtaaagtggatgatattgttagaacaaagggacaa attgttcaggaggaggaaagagagaaagatagtgttggtttttcagrttactagaaatatataacaac tgcatatoagaggtgctettatgccatttatgctgttggcacaagttaggttttcagetectteoaaatto gaagcaattattggatggegtgggcaactecegteteasagagtgagecacetectgttaggagttet actctcateattgtetatgtrgetttaggaattgcaagtgetttatgcatecttgctagaaccatatt tettgttacegetagatataagacagectetttgettttccataaaatgcatetttgcattttecata ctccaatgtecttcttogatgecacacegagtgggeggattetaaacagagtaagtgaatgattacat tttctttatttagecectttttrttecttatragtgteaatetttotattacatgactaatcaatott ttgtgaaaattagctagtaatttcagaattaactcaaatgtactttogtatgaaaacaggcategaca gatcaaagtgcaattgatctgaatgttoccattcaagttggatecttigecttcacaataatacaget tttagggattattggagtaatgtcacaagttgcatageaggtottcattgtetttattecagtcatta cagtttgcatetagttagagattgotacgaccacettrttegrgttetrtgoectrtcacaattatteta ctatatgcttttrcacaaagtgagtcataactttagegacatteataaacgtgagttacatttaagto gtgagtttgttrtcattgcagcaatattacataccatcagcacgagaactggcacggctaaataggac atgcaaagetecagtáatacagcactttgccgagacaatttcaggatcaageacaattagaagttteg atcaggaatctagattccaggacacaagtatgaaattgatagacaattattcteggectaagttteao ategectgetgcaatggagtggetttgtttacatttagatatgttatetetgatcacttttgcttteto tttaattttcttgatetetettcctgttagaacaattgacceaagtaagttetetatetteatgtttt ctttecttgaagtttagttgtgttgaataactettaagageacatttteteegtttettgatttacagg tgttgctggcttagetattacatataggcttaatoetgaacataatacaagetegggttgtttggaate

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' attttgcegeataagetaaatgaaacacttttacgataaactcctagtgcaacaaaggaaaaattcat taggcaagactagctgtttatgtttcacgac

SEQ ID NO: 29 (sequência de DNA de NtMRP3 sem UTR 5' e 3') atggaaattgcaaagggcatgtetgtgtttcaatetttgagatatgttggegttgatgaatcceteeg aaaccccattttettacgtgteattagttgttetrtgcacetaggattgttecttataattettgagt à: tgtgttgttggaatacaatcaggagggacaataatgctagecacaaacagagtagtactaggaatagct aggttcttgtactacaaatcaaccttgttttgttcaataggtotagecatetttagetttatattata tttgttagctcatttttattggtatagaaatggttagtcagaagaaaaaattataacccttttagatt ttgcattaaagttgctagettagttgteaatetetgttttettacacacecagttecttaattecttgt gaaaccaaataccctecttgttttaagagtttggtgggggettttottetttagtttettgttattgeot tgttatagaccttgtttatggggaaaagaaccaatctttaccaacteaattttgtatacctgatgtto ttttcactettatagagttattettetgttrtgttgaggttrattgttaaaacagagagtgaggagaat atgcttcaggaaccectettaaatggtagtgttgccaatggeatggactcaaagaagtetactgggga teaaactgtcacccecttatgccaatgetaacatttttagtetetttactetetettagatgggtecce taatttctgttggcaacaagaaaccattagaccttgaggatgttectragetteactttgatgatagt gtcaaagggagttttcctatttttagagaaaaactagaatctgtgggtgggagaaatagtaacegtoat gactaccttcatgctggtgaaggctttggttttcacageacggaaggagatagtgttateggetetet tegtgettetttacgetetggegtettttgattggecegtaceteatigatacettagtteagtatetga aatggaaaacgagactttgataatgaaggttatagtcttagtagetgcattettegrtacaaagttogt ggagtgtttggegcaaaggcattggtttttcaaggtgcageagggagggtategggeacgggeageac tggtttccaaaatetacaacaagggtttaaccetetectgtcagtcaaageaaagecacactagtaga gagatcatcaattttatgacagttgatgccegagaggattggrgactteggttagtatatgcatgatco ttggatggtaatcatacaagttgctoctageattggtgatactetatáaaaatettagectagetgeta tegcegegtttgrtgotacaataatagtgatgttggcaaacateccetttagggagtttgcaggagaag tttcaggagaaactcatggaatcgaaagatagaaggatgaaggetacatctgaagtettaaggaatat gagaatactcaagcttcaagettaggagatgaagtttoertgtetaggatettagaceteaggactacag aggcaggatggttgatgaaatatgtgtacacatcagctatgactacttttgtettetgggttgetect acatttgtttctgtgacgacctttagegetgcaatgcttataggaatcceacttgaatctaggaagat attgtctgcacttgcgacatttagaattottcaagageccatctacaatetcccagatacaattteaa tgattgctcaaaccaaagtttetettgategrattgcatetttectttotettgatgacttgcagect gatgtcatagagaagcttccaaaaggtagttetgatgaageaattgagattgtaggtgggaacttege ttgggatgcatccacctegactecacttetaaaggatgtaaatcttagagtgcttaatggcatgagag

. ttgccatttgtggtacagttagttcaggaaaatcaagettactgtctagcattttaggagagatgece aaattatcagggactattaaacttagtggaacgaaggcttatgttgcacagtegecetagatacagag tggaaagatagaggagaacatattatttggtaaagagatgcagagggagaagtatgataaagttetto

S aagegtgctecttaaagaaagacetagaaattetotettitagegateaaacagaaataggggagago ggcattaatttgagcggtggacagaagcagagaatacagattgctegtgctetttaccaagatgctga tgtttacctatttgatgatcegttcagtgetatagatgcteataceggateccatetetteagtataa gtcectttcatatatatgctttattttcatgoettgatatattttacetagecacttgattgacceateo tttaattgcaggaatgtataatggggctattgaattcaaaaacagttttatatgttacacatcaagto gagtttttgcctgetgeggatttgatettaggtactetttecttteagtaattatagtttgettaatat catatatagacttaactcatttaactatgatatttctecttcaggtcatgaaagatggaaggatcagto aaactgggaaatacaatgatcttctcaaattaggtagtgacttcatggaacttgtgggtgctcaccaa gaagctttaacagcaattgacacagttaagggagaagcattgagaaagagtgaggaaatgactagtga taatacaaatgtacagaaggataaaaatatttcagatggccaaaatggtaaagtggatgatattgtto gaacaaagggacaaattgttcaggaggaggaaagagagaaaggtagtgttggtttttcagtttactog aaatatataacaactgcatatggaggtactettgtgccatttatgctgttagcacaagttagttttca getecttcaaattggaageaattattggatggegtaggcaactecegteteaaagagtgagecacete ctgttgggagttetacteteateattgtetatgttgoetttaggaattgcaagtgctttatgcatecctt gectagaaccatgtttcttgttacogetggatataagacagectetttgettttecataaaatgeatot ttgcattttcegtgctecaatgtecttettegatgccacacegagtgggeggattetaaacagagtaa gtgaatgattacattttetttatttageceettttttttecttattagtatcaatetttctattacat gactaatcaatgttttgtgaaaattagctagtaatttcagaattaactcaaatgtactttggtatgaa aacaggcategacagatcaaagtgcaattgatctgaatgttcccattcaagttagatectttgcctto acaataatacagcttttagggattattggagtaatgtcacaagttgcatagcaggtettcattgtett tattceggtcattgcagtttgcatetggttagaggttactacgaccacetttttegrgttetttgect * tcacaattattectactatatgctttttcacaaagtgagtcataactttagegacattcataaacgtga gttacatttaagtggtgagtttgattttoattacageaatattacataccatcagcacgagaactggca cggctaaatgggacatgcaaagctccagtaatacageactttgcogagacaatttcaggatcaageac f aattagaagtttcgatcaggaatctagattccaggacacaagtatgaaattgatagacaattattcte ggcetaagtttcacategetgetgcaatagagtagetttgtttgcgtttagatatgttatetetgate acttttgctttetetttaattttettgatetetoettectattagaacaattgacccaagtaagttete - tatcttcatgttttotttccttgaagrtigrtgtattgaataactettaagageacatttteteegtt tottgatttacaggtgttgctagettagetgttacatatgggcttaatctgaacataatacaageteg ggttgtttggaatctttgtatgatggaaaataaaattatttctgttgaaagaatacttcagtatacto ctettecaagtgaatetectettateatagaatecaacagaccagacectaactagecatettgtaga gaggttgattttagcaatettcaggtaaattaagttattetetagtgttaattatgcaggttaattto ttggtataggttggtatatetgaaaacttttaataggtcegatatgctecteacatgectetegtgtt gegaggecttacatgcactttetttggtagaaagaagactogaattgtceggtaggacaggcageggta aatctactctaatacagaccetettecgeatagttgaaccagetgctggacaaataaaaatagatogt atcagcatctecteaattggtttgcatagatetacggtetagattgagtatadttccacaggatecaac tatgtttgagggaacagttegcageaacetagaccegettgaagagtatteagatgaacaaatttggg aggtgacagettgortttacotatrtitagatttattttgttteagataggaaaalgacasaltllat trtattgagaaaclttygLttgatyttatgottcaggegetegataagtgtcagetaggagaagaagts aggaagaaagaaggcaaactttattctacaggtaacttcaagaaccacatcattttctgatgatiteo acttttagagctgtaataatcatettcattgegttgetgcagtatetgagaatggagagaactagagt gtaggccaaaggcagetggtetgcettagecgratgetactgaaaaagageaaggtectagtecettoa cgaggctacagcatetgtegacactacaactgataatcttattcageaaactetaaggetgcacttet ctgattccacggttataaccattgcteataggattacatctgtgcttgacagtgatatggtectacta ttagatcatggtaagaatcategtttatgttctggagcaageggagaaggaaattcttggtagttace LLLtttttatgctatgctgcagggetcattgetgaatacggcactecagecaggttgttagagaacga atceteattgtttgetaagetegtggragagtatagtatgaggtcaaattcaagttttgagaatgttt cagacatgtga

SEQ ID NO: 30 (Íntron 1 de NtMRP3) gtatgrrggcgttoatgaatocotccgaaaceccatetecrracgegecattagrtgtrertegeacergggattgetecrt Graactoregagtrgtgcegetagaatacaatoag SEQ ID NO: 31 (Íntron 2 de NtMRP3) ; gtaagtcecttrtcoatatatatgetttattttoatgcttgatatattttacctagecacttgattgacceatocttraa tegeas - SEG ID NO: 32 (Íntron 3 de NIMRP3) gtactetttectrtoagtaattatggrregottaatatcatatatagaçcttaactcatttaactatgatatttctet teag SEQ ID NO: 33 (Íntron 4 de NtMRP3) gtaagtgaatgattacattttetttatttageccettttttttocttattagtgteaatettretgtracatgacta atcaatgtrtegegaaaatragetagraatttcagaattaacteaaatgtactteggratgaaaacag SEQ ID NO: 34 (Íntron 5 de NIMRP3) gtrgotacgaccacettretogrgtttrtgecrtcacaatrattctactatatgctretrcacaaagegagtcata acrtragegacattcataaacgrgagrtacatrraagrggrgagrttgrtrtoatrgoag SEQ ID NO: 35 (Íntron 6 de NIMRP3) gtaagtretetatetteatgretecretecrtgaagtttgetgegregeataactettaagagcacatrttorcegt ttcrrgatttacag SEQ ID NO: 36 (Íntron 7 de NIMRP3) graaatraagrtattctotggegetaatratgcaggeraatrtgrtggtatoggtrgatatatotgaaaactttraa tag SEQ ID NO: 37 (Íntron 8 de NIMRP3) n gtgacagettagttttgcotatttteggatttatttegrrreagataggaaaatgacaaacttratrtratigagaa acteegetrgargrtatgottcas : SEQ ID NO: 38 (Íntron 9 de NIMRP3) gtaacttcaagaaccacatcattrtetgargatttecacttrtagagetgtaataatcatettcattgegetgctge ag : SEQ ID NO: 39 (Íntron 10 de NtMRP3) gtaagaatcategtttatgttctggageaageggagaaggaaattocttggtagttacetretrrttatgctatgctg cag SEQ ID NO: 40 (Éxon 1 de NtMRP3) Atggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatetttgag SEQ ID NO: 41 (Éxon 2 de NtMRP3) Gagggacaataatgctggccacaaacagagtagtactaggaatgctaggttettgtactacaaatcaa cettgttttgttcaataggtctagecatetttagetttgtattatatttgttageteatttttattog tatagaaatggttggtcagaagaaaaaattataaccettttaggattttgcattaaagttactagetto gttgtcaatetetgttttettgeacacecagttecettaattettgtgaaacecaaataccetettogttt taagagtttggtgggggettttettetttatttettgttattgecettattatagaccttgtttataga gaaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacetgatgttgttttcactettatagagttatt cttctgttttgttgggtttattgttaaaacagagagtgaggagaatatgcttcaggaacceoctettaa atggtagtgttgccaatggcatggactcaaagaagtctactggggatcaaactgtcacccottatagce aatgctaacatttttagtctetttactttetettggataggtocectaatttoctgttggcaacaagaa accattagaccttgaggatattceteagetteactttgatgatagtgteaaagggagttttectattt ttagagaaaaactgaatctatgggtgggggaaatagtaacegtgtgactacettcatgetagtgaagg ctttggrtttcacageacggaaggagatagtgttateggetetettegtgettetttacgetotageg tettttgttggccegtaceteattgataccttagttcagtatctgaatggaaaacgagactttgataa tgaaggttatgtcttagtggctgcattettegrtgcaaagttggtggagtatttagegcaaaggeatt ggtttttcaaggtgcageagggagggtategggeacgggeageactggtttccaaaatctacaacaag ggtttaaccetetectgteagteaaageaaagecacactagtggagagatcatcaattttatgacagt tgatgcegagaggattggtgactteggttggtatatgcatgatcettggatggtaatcatacaagtto ctetggeattggtgatactctataaaaatcttggcotagetgetategeegegtttgttgetacaata atagtgatgttggcaaacatcccetttagggagtttgcaggagãêagtt tcaggagaaactcatggaate gaaagatagaaggatgaaggctacatctgaagtcttaaggaatatgagaatactcaagecttcaagett gggagatgaagtttetgtetaggatettggaceteaggactacagaggcaggatggttgatgaaatat gtgtacacatcagctatgactacttttgtcttctgggttgetcetacatttgtttctgtgacgacett

. tggegetgcaatgcttatgggaatcccacttgaatetgggaagatat tgtetgcacttgegacattta gaattcttcaagagcccatctacaatetecccagatacaatttcaatgattgcteaaaccaaagtttet cttgatcgtattgcatetttcctttetettgatgacttgcagectgatgtcatagagaagettccaaa aggtagttctgatgaagcaattgagattgtaggtaggaacttegettaggatgcatccacetegacte cacttctaaaggatgtaaatcttagagtgcttaatageatgagagttgccatttgtagracagttagt tcaggaaaatcaagcttactatctagcattttaggagagatgcccaaattatcagggactattaaact tagtggaacgaaggcttatgttgcacagtegocotggatacagagtggaaagatagaggagaacatat tatttggtaaagagatgcagagggagaagtatgataaagttcttgaagegtgctecttaaagaaagac ctggáaattctctcttttggegatcaaacagaaataggggagaggggeattaatttgageggtggaca gaagcagagaatacagattgctegtgetetttaccaagatgctgatgtttacctatttgatgatcegt tecagtgctgtggatgctcataceggateccatetetteagt SEQ ID NO: 42 (Éxon 3 de NIMRP3) Gaatgtataatggggctattgaattcaaaaacagttttatatgttacacatcaagtggagtttttgce tgctgcggatttgatetta SEQ ID NO: 43 (Exon 4 de NtIMRP3) gtcatgaaagatggaaggatcagtgaaactgggaaatacaatgatcttetcaaattaggtagtgactt catggaacttgtgggtgctcaccaagaagetttaacagcaattgacacagttaagggagaageattga gaaagagtgaggaaatgactagtgataatacaaatgtacagaaggataaaaatatttcagatggccaa aatggtaaagtggatgatattgttggaacaaagggacaaattgttcaggaggaggaaagagagaaago tagtgttggtttttcagtttactagaaatatataacaactgcatatggaggtgctettgtgccattta tgctgttggcacaagttagttttcagetecttcaaattggaageaattattogatggegtgggcaact cecegtctcaaagagtgagecacetcctattgagagttetacteteateattatetatgttgctttagg

' aattgcaagtgctttatgcatccttgetagaaccatgtttocttgttacegetggatataagacagect etttgcttttccataaaatgcáatctttgcattttcogrgetecaatgtecttottegatgccacaceg agtgggeggattoctaaacaga SEQ ID NO: 44 (Exon 5 de NtMRP3) Gcategacagatcaaagtgcaattgatctgaatgttcccattcaagttggatcctttgcottcacaat

. aatacagcttttagggattattggagtaatgtcacaagttgcatageaggtetteattgtetttatte cggtcattgcagtttgcatetagttagag SEQ ID NO: 45 (Éxon 6 de NtIMRP3)

& Caatattacataccatcagcacgagaactggcacggctaaatgggacatgcaaagetecagtaataca geactttgcegagacaatttcaggatcaagcacaattagaagtttegatcaggaatctagattccagg acacaagtatgaaattgatagacaattattcteggoctaagtttcacategetgetgeaatagagtog ctttgtttgegtttagatatgttatetotgateacttttgoetttotetttaattttottgatetetet tecctgttggaacaattgacccaa SEQ ID NO: 46 (Exon 7 de NtIMRP3) Gtgttgctggcttagetgttacatatgggcttaatetgaacataatacaagetegggttgtttaguat ctttgtatgatggaaaataaaattatttctgttgaaagaatacttcagtatactgctettccaagtoa atectcctettatcatagaatccaacagaccagacecectaactagecatettgtagagaggttgatttta gcaatettcag SEQ ID NO: 47 (Exon 8 de NIMRP3) Gtcegatatgctecteacatgeetetegrgttaegaggecttacatgcactttctttggtggaaagaa gactggaattgteggtaggacaggcageggtaaatetactetaatacagaccetoetteegcatagtto aaccagectgctggacaaataaaaatagatggtatcageatetecteaattggtttgcatgatetacag tectagattgagtataattccacaggatccaactatgtttgagggaacagttegeageaacetagacec gcttgaagagtattcagatgaacaaatttgggag

SEQ ID NO: 48 (Éxon 9 de NtMRP3) Gegectegataagtgtcagetaggagaagáagtgaggaagaaagaaggcaaactttattctacam SEQ ID NO: 49 (Exon 10 de NtMRP3) tatctgagaatggagagaactggagtgtaggecaaaggeagetggtctgecttggeegtgtgctacta É aaaaagagcaaggtcctagtecttgacgaggetacagcatetgtegacactagcaactgataatottat tcagcaaactctaaggetgeacttetetgattecacggttataaccattgctcataggattacateta tgcttgacagtgatatggtcetactattagatcato SEQ ID NO: 50 (Exon 11 de NtMRP3) ggctcattgctgaatacggcactecagecaggttgttagagaacgaatccteattgtttgctaagete gtggcagagtatagtatgaggtcaaattcaagttttgagaatgtttcagacatgtga SEQ ID NO: 51 (sequência de CDNA de NtIMRP3 como prognosticado a par- tir da sequência de clone BAC) atggaaattgcaaagggcatgtotgrgtttcoaatetttgaggagggacaataatgetage cacaaacagagtagtactaggaatgctaggttottgractacaaatcaacertgttttgt tcaataggtetagecatetttagetttatagttatatttgttagetoeatttttattagtat agaaatggttggtcagaagaaaaaattataacccttttggattttgcattaaagttgcta gettggttgteaatetetgrreceregeacacecagttecrtaatrettotgaaaceaaa taccctetrgrrtraagagtttggrgggggetteterterttagtttettgttategecte grrtatagaccttgrrttatggggaaaagaaccaatoetttaccaactceaattttgtatacct gatgttgtttreactettatggaggrrattettotgtrrttgtegggrreattgrtaaaaca gagagtgaggagaatatgcttcaggaacccctcttaaatogragtgttgccaatggcatg gactcaaagaagtctactggggatcaaactgtcaccccttatgccaatogetaacattter agtctetttactttetettagatgggececoetaatrtctgttggcaacaagaaacçatra gaccttgaggatgttccteagetteactttgatgatagtgtcaaagggagetttocratt

7 trtagagaaaaactagaatctgtggagtggaggaaatagtaaccgtgtgactacctteato ctggtgaaggetttggrettcacagcacggaaggagatagtgttateggetetettegtg crtetttacgetetggegtertttattggecegtaceteatrgataccttagttcagtat

. crgaatggaaaacgagactttgataatgaaggttatgtottagtggetgcattettegtt gcaaagttggragagtgtttggegcaaaggcattggtttttoaaggtgcageagggaggs tatcgggcacgggcagcactggrtrocaaaatoetacaacaagggtttaaccctetectgt cagtcaaagçaaagccacactagtggagagatcatcaattttatgacagttgatgccegag aggattggtgactteggttagtatatgacatgatectrggatggtaateatacaagetgct ctggcattggtgatactetataaaaatettggoctagetgcrtategecegegtttgtrgot

: acaataatagtgatgttggcaaacatccetttagggagtttrgcaggagaagtttcaggag aaactcatggaatcgaaagatagaaggatgaaggetacatetgaagtettaaggaatato agaatactcaagcttcaagettgggagatgaagtettetgtcetaggatettggaccteagg actacagaggcaggatggttgatgaaatatgrgracacatcagetatgactacttttgre ttetgggregetectacatttgttretgrgacgacctttggegetgcaatgctrtatggga atcccactrgaatetgggaagatattgretgcacttgegacatttagaatteortcaagag cccatctacaaterccecagatacaattteaatgattgcteaaaccaaagtettetettgat cgtattgcatetttectttetertgatgacttgceagectgatgreatagagaagerteca aaaggtagttergatgaageaattgagat tgtaggtaggaacttecgettgggatgcatec acctegactecacttctaaaggatgraaatetrtagagtgettaatggcatgagagetgco atrttgtggtacagrtggttoaggaaaateaagettactgterageattttaggagagatg ceccaaattatcagggactatraaacttagtggaacgaaggcttatgttgcacagtegeco tggatacagagtggaaagatagaggagaacatattatttggraaagagatgcagagggag aagtatgataaagttcttgaagegtgcteettaaagaaagacetggaaattotetettre ggcgatcaaacagaaataggggagaggggcatraatttgageggtggacagaageagaga atacagattgctegtgetetttaceaagatgctgatgtttacctatttgatgatecegtto agtgctgtggatgcteataccggateccatetetteagrgaatatataatagggctatto aattcaaaaacagttttatatgrracacatoaagtogagttrtrgectgetocggatres atcttggtcatgaaagatggaaggarcagtgaaactgggaaatacaatgatettctcaaa ttaggtagtgactrtcatggaacttotgggtgctraccaagaagetttaacagcaattgac acagttaagggagaagcattgagaaagagtgaggaaatgactagtgataatacaaatgta à. cagaaggataaaaatatttcagatogccaaaatggtaaagtggatgatattgttoagaaca aagggacaaarttgttcaggaggaggaaagagagaaaggtagtgrtggetrttcagtttac tggaaatatataacaactgcatatogaggtgetertgegecatttatgctgttggcoacaa

" gttggttttceagetccttcaaattoggaageaattattggatggegtgggcaactecegto tcaaagagtgagecacctectgtrgggagttetactoetcateattgretatattgettta ggaattgcaagtgetttatgcatocttgetagaacçatgtrtcttgtracegetogatar aagacagcetetttgettttccataaaatgcatetrtgcarttteegtgoetecaatgtec ttettegatgccacacegagtgggeggattctaaaçagageategacagatcaaagtgca attgatctgaatgttcccattcaagetggatectttgocrrcacaataatacagetttta gggattattggagraatgtcacaagrtgratgygcaggtettoattgretetattocggte atrtgcagrttrgcatctggrrggagcaatattacataccateageacgagaactggracog ctaaatgggacatgcaaagetccagtaatacagcactttacegagacaatttcaggatea agcacaattagaagtttcgatcaggaatctagattccaggacacaagtatgaaattgata gacaattatteteggcetaagttteacategetgetgeaatggageggetttgttegegt ttggatatgtratetetgarcacttregertecrettraatrttctegatotatrertect gttggaacaattgacceaagtgttgctggetrtagetygrtacatatagggctraaretgaas ataatacaagctegggrtgrtrggaatetrtgtatgatggaaaataaaattatttorgte gaaagaatacttcagtatactgctettccaagtgaatoetcctettatcoatagaatecaalo agaccagaccetaactggecatetratogagaggrtgattttageaatettcaggtecga tatgctecteacatgectetegtgttgegaggecrrtacatgcactttetrtggrggaaag aagactggaattgtoeggtaggacaggcageggraaatctactetaatacagacectette cgcatagtrgaaccagetgcrggacaaataaaaatagatggratcageatotectoaate : ggtttgcatgatctacggrctagattgagtataattecacaggatecaactatgtttgag ggaacagttcgcagcaacctagaceegetrgaagagtattcagatgaacaaatttaggag gegetegataagtgtceagetaggagaagaagtgaggaagaaagaaggcaaactttatret acagtatctgagaatggagagaactggagtgraggccaaaggeagetggroetgccttgge cgtgtgctactgaaaaagagcaaggtcerggrccrtgacgaggetacagcatctgtegac actgcaactgataatottattcagcasactetaaggetygcacttetetgattecacggtt ataaccattgctcataggattacatctgrtgcttgacagtogatatggrocractattagat

Í catgggctcattgctgaatacggcactccagecaggttgttagagaacgaatcetcatto tttgctaagetegrggacagagtatagtatgaggtcaaatrcaagetttgagaatgrttca gacatgtga

SEQ ID NO: 52 (sequência de proteina de NtMRP3; 5'-3'; - denota códon de parada putativo)

MEIJARGMSYFOSLRRDHNAGHKOGSTENARELY YKSTLFCSIGLAIFSFVLCLLABEYWi

RMNGWHSEEKIITLLDFALKLLAWLSISVELATOFLNSCETKYPLYLRVRWGLFEFVSCYCL ViIDLVYGEKNOSLPTQFLIPDVYFTIMGLFECEVGPIVKTESEENMEÇEPLLNGS/ANGM

DSKKSTGDOTYTPYANANIFSLETESWMGPLISVGNKKPLDLEDVPOLHFIDSVYKGSFPI FREKLESVGGONSNRYTTEHLYKALYETARKEIVLSALEVLLYIALASSVGPYLIDTLVOY " LIGKRDEDNEGY VLVARFPVAKLVECLAQRHWF FKVOOGGYTRARAALVSKIYNKGLTLSC QSKGSHTSGETINFMTVUDAER IGDFGWYMHDPWMYIIQVALALVILYKNLGLANIARFVA TIIVMLANIPLGSLOEKEGENLMESKDRRHMKATSEVLENMRILKLGANWEMKFLSEILDLR TTEAGWLMKYTVYTSAMTTEFY FHVAPTEYSVTT FGAAMLIMSI PLESGKI LSALATFRILOE PIYNLPDTISMIAQTKVSLDRIASFLSLDDLOPLVIEKLPKGSSDERI E IVGGNFAWDAS 'TSTPLLKDYHLEVLNGMRVA ICGTVGSGKSSLLSSILGEMPKLSGTIKLSGTKAYVAQSP WICSGKIEENILFGKEMQREXT DKVLEARCSLKKDLEILSFGDOTETGERGINLSAGGOKOP. IQIARALYQODADV LFEDDPFSAVDAHTGSHLFSECIMGLLINSKTVLYIVIHBQVEFLPAADEL

LLYMKDGREISETGKYNDLLKLGSDFMELVGARQERLTAIDYVKGEARLRKSEEMTGDNTNV QKDKNISDEGNGKYDDIVGTKCDIVOEEEREKGEYVGPSVYWKT1TTAYGGALVEEMLLAO

YGFOLIQIGSNTWMANATEVSKSEPREPVGSSTLIIVYVALGIASALCILARTHELYTAGY

KTASLLFHKMHLCI FRAFPMSPFDATPSGRILNRASTUQSAIDULNVPICVGSFAFTIIQOLL GLIGVMSQUARQV FIVPIPVIAVCIWLEOYY | PSARELAPRLNGTCKAPVIQHFAETISSS

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REDPNWPSCGEVDESNLOVRYAPHMPLYLRGLTCTFFGGKKTGIVGRTGSGKSTLIQOTLF RIVEPAAGQIKIDGISISSIGLHDLRSRLSIIPODPTMFEGTVRSNLDPLEEYSDEQINWE ALDKCQOLGEEVRKKEGKLY STVSENGENWSVGORQLVCLGRVLLKKSKVLVLDEATASVD

TATUNLIQQTLRLHFSDSTVITIAHRITSVLDSDMVLLLDHGLIAEYGTPARLLENESSL FAKLYAETSMRSNSSFENVSDM- SEQ ID NO: 53 (Éxon 11 de NIMRP4) ttgttgataacggagataactggagtgteggacagaggcagettetttgcrtgggaaga gtgatgctaaaacgtagcagacttctatttatggatgaggcaactgccetetgttgattca " cagacagatgcagtgattcagaaaatcatcegegaggactttgeggectgtactataate agcattgcccacagaataccaacagtcatggactgtgatagagttcttgttatagatgca ggtgctgattteteteettttactttgtaccttattttgaatetggtaaatgattattta é tctgtatgtgatggtttcecaaccaatceatagtcagtacctttatgaagaaattgcctaat gtragccaagtagtagtaaatgcatga

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Planta ou célula vegetal mutante, que não ocorre naturalmen- à te ou transgênica compreendendo (a) um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em: - 5 () um polinucleotíideo compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência tendo pelo menos 71% de identidade de sequência às SEQ ID NOs: 1, 2, 27, 28 ou 29 ou 51; ou (i) um polinucleotíideo compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência tendo pelo menos 65% de identidade de sequência a qualguer uma das SEQ ID NOs: 3 a 23 ou 30 a 50 ou 53; ou (ii) um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo de NtMRP compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma sequência tendo pelo menos 65% de identidade de se- t quência a qualquer uma das SEQ ID NOs. 24 a 26 ou 52, e em que o polipeptídeo tem atividade de transportador de metal pe- Ú sado; ou É (b) um constructo de polinucleotídeo de pelo menos 15 nucleotídeos con- tíguos em comprimento que é pelo menos 65% idêntica a uma região : de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 23 ou 27 a 51 ou 53; ou (c) um RNA de filamento duplo compreendendo pelo menos duas se- quências que são pelo menos parcialmente complementares entre si e em que um filamento de sentido compreende uma primeira sequên- cia e um filamento de antissentido compreende uma segunda se- quência e em que pelo menos uma das sequências compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de RNA de NtMRP; ou (d) um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo como apre- sentado em (1), (ii) ou (iii) ou o constructo de polinucleotideo como a- presentado em (b).

2. Planta mutante, que não ocorre naturalmente ou transgênica, em que a expressão do polinucleotídeo de NtMRP e a atividade da proteína codificada desse modo ou a atividade da proteína codificada desse modo são diminuídas e as folhas da dita planta têm uma redução em teor de cád- . mio de pelo menos 5% quando comparado a uma planta de controle em que a expressão de NtMRP e a atividade da proteina codificada desse modo ou - 5 a atividade da proteína codificada desse modo não diminuíram.

3. Material vegetal incluindo biomassa, semente ou folhas com- preendendo células ou tecido da planta como definida na reivindicação 1 ou reivindicação 2.

4. Produto de tabaco compreendendo uma parte da planta como definida na reivindicação 1 ou reivindicação 2 ou material vegetal como defi- nido na reivindicação 3.

5. Método para reduzir níveis de cádmio em pelo menos uma parte de uma planta, compreendendo a etapa de reduzir a expressão de um polinucleotídeo de NtMRP e a atividade da proteína codificada desse modo oua atividade da proteína codificada desse modo quando comparado a uma " planta de controle em que a expressão do polinucleotídeo de NIMRP e a atividade da proteína codificada desse modo ou a atividade da proteína codi- : ficada desse modo não diminuíram. .

6. Planta mutante, que não ocorre naturalmente ou transgênica obtida ou obtenível pelo método como definido na reivindicação 5, em que - existe uma redução no teor de cádmio de pelo menos cerca de 5% em pelo menos uma parte da planta quando comparado a uma planta de controle em que a expressão de polinucleotíideo de NtMRP e a atividade da proteína co- dificada desse modo ou a atividade da proteína codificada desse modo não diminuíram.

7. Polipeptídeo de NtMRP isolado expressado por um polinu- cleotídeo selecionado do grupo consistindo em: (i) um polinucleotídeo compreendendo, consistindo ou consistin- do essencialmente em uma sequência tendo pelo menos 71% de identidade de sequência às SEQ ID NOs: 1, 2, 27, 28 ou 29 ou 51; ou (ii) um polinucleotideo compreendendo, consistindo ou consis- tindo essencialmente em uma sequência tendo pelo menos 65% de identi-

dade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 3 a 23 ou 30 a 50 ou 53; ou um polipeptídeo de NtMRP isolado compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente na sequência apresentada em qualquer uma ' 5 dasSEQID Nos. 24 a26 ou 52, em que o polipeptídeo tem atividade de transportador de metal pesado.

8. Anticorpo que especificamente liga-se ao polipeptídeo isolado como definido na reivindicação 7.

9. Método de detectar um polinucleotídeo de NtIMRP em uma amostracompreendendo a etapa de: (a) fornecer uma amostra compreendendo um polinucleotídeo; (b) contatar a dita amostra com um ou mais iniciadores ou uma ou mais sondas para detector especificamente pelo menos uma porção do polinucleotídeo de NtMRP; e (c) detectar a presença de um produto de amplificação, em que a presença de um produto de amplificação é indicativa da presença do poli- nucleotídeo de NtIMRP na amostra. .

10. Polinucleotídeo isolado selecionado do grupo consistindo e em: um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo ou con- - sistindo essencialmente em uma sequência tendo pelo menos 71% de iden- tidade de sequência às SEQ ID NOs: 1, 2, 27, 28 ou 29 ou 51; um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo ou con- sistindo essencialmente em uma sequência tendo pelo menos 65% de iden- tidadede sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 3 a 23 ou 30 a 50 ou 53; um polinucleotídeo que codifica um polipeptíideo de NtMRP compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em uma se- quência tendo pelo menos 65% de identidade de sequência a qualquer uma dasSEQIDNOs. 24 a 26 ou 52, e em que o polipeptídeo tem atividade de transportador de metal pesado.

11. Constructo de polinucleotídeo de pelo menos 15 nucleoti-

Aa14 deos contíguos em comprimento que é pelo menos 65% idêntica a uma re- gião de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 23 ou 27 a 51 ou 53. . 12. RNA de filamento duplo compreendendo pelo menos duas sequências que são pelo menos parcialmente complementares entre si e em que um filamento de sentido compreende uma primeira sequência e um fila- mento de antissentido compreende uma segunda sequência e em que pelo menos uma das sequências compreende pelo menos 10 nucleotídeos contí- guos de RNA de NtMRP.

13. RNA de filamento duplo de acordo com a reivindicação 12, compreendendo uma primeira sequência tendo pelo menos 65% de identidade de sequência a pelo menos 10 nucleotídeos de NtIMRP3 ou NtMRP4; uma segunda sequência; e uma terceira sequência tendo uma sequência complementar re- versa da primeira sequência, posicionada na mesma orientação como a pri- meira sequência, em que a segunda sequência é posicionada entre a primeira se- : quência e a terceira sequência, e a segunda sequência é ligada de maneira : operável à primeira sequência e à terceira sequência.

14. RNA de filamento duplo de acordo com a reivindicação 12 ou - reivindicação 13, em que a primeira sequência tem pelo menos 65% de iden- tidade de sequência a uma sequência selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 3 a 23 e 30 a 50 e 53 e/ou em que a terceira sequência tem pelo menos 65% de identidade de sequência ao complemento reverso da — sequência correspondente às SEQ ID NOs: 3 a 23 e 30 a 50 e 53.

15. Vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo isola- do como definido na reivindicação 10 ou o constructo de polinucleotídeo co- mo definido na reivindicação 11.

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