JP2017060499A - 植物中の重金属の削減 - Google Patents
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Abstract
Description
植物は、外因性毒素(例えば細菌生成物、アレロケミカル、除草剤及び重金属)に曝され、細胞の生存は、これら物質を解毒するか又は蓄積を低下させるメカニズムに依存する。重金属(例えば鉛、カドミウム、水銀など)は主要な環境毒性物質であり、反応性酸化種の生成、DNA損傷、及び生物の細胞で酵素の活性部位と結合することによる酵素の不活化を引き起こす。重金属による環境の汚染は、工業化及び居住集団サイズの増加により劇的に増加した。重金属で汚染された土壌は正常な植物の生育を阻害し、食物の汚染を引き起こす。多くの重金属がヒトの健康に非常に有害であり低濃度で発癌性である。
動物及びヒトが消費する植物又は植物生成物から重金属(例えばカドミウム)の含有量を低下させることは極めて望ましく、さらに緊急を要する。前記要求を満たすことが本発明の目的である。
本発明の特徴及び実施態様は付随の特許請求の範囲で示される。
ある特徴では、以下から成る群から選択される単離ポリヌクレオチドが提供される:配列番号:1又は配列番号:2又は配列番号:27又は配列番号:28、配列番号:29又は配列番号:51と少なくとも71%の配列同一性を有する配列を含むか、前記から成るか又は本質的に前記から成る単離ポリヌクレオチド;配列番号:3から23又は30から50又は53のいずれかと少なくとも65%の配列同一性を有する配列を含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成る単離ポリヌクレオチド;配列番号:24から26又は52のいずれかと少なくとも65%の配列同一性を有する配列を含むか、前記から成るか又は本質的に前記から成るNtMRPポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、好ましくは当該ポリペプチドが重金属輸送因子活性を有する前記ポリヌクレオチド。
さらに別の特徴では、配列番号:1から23又は27から51のいずれかの1つの領域と少なくとも65%同一である、連続する長さが少なくとも15ヌクレオチドのポリヌクレオチド構築物が提供される。
適切には、二本鎖RNAは、NtMRP DNAの少なくとも10ヌクレオチドと少なくとも65%の配列同一性を有する第一の配列;第二の配列;及び第一の配列の逆相補性配列を有し、第一の配列と同じ向きに配置された第三の配列を含み、ここで第二の配列は第一の配列及び第三の配列と作動できるように連結される。
適切には、第一の配列は、以下から成る群から選択される配列と少なくとも65%の配列同一性を有する:配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号:21、配列番号:22、配列番号:23、配列番号:30、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34、配列番号:35、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:39、配列番号:40、配列番号:41、配列番号:42、配列番号:43、配列番号:44、配列番号:45、配列番号:46、配列番号:47、配列番号:48、配列番号:49、配列番号:50及び配列番号:53。
さらに別の特徴では、当該単離ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド構築物を含む発現ベクターが提供される。
さらに別の特徴では、当該単離ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構築物、二本鎖リボポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む変異体の、天然に存在しない若しくはトランスジェニックな植物細胞が提供される。
さらに別の特徴では、当該変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックな植物細胞を含む変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックな植物が提供される。
さらに別の特徴では、前記植物由来の細胞若しくは組織を含むバイオマス、種子又は葉を含む植物材料が提供される。
さらに別の特徴では、前記植物の一部分又は植物細胞又は前記植物材料を含むタバコ製品が提供される。
さらに別の特徴では、当該植物に由来する組織を含むバイオマス、種子又は葉が提供される。
さらに別の特徴では、少なくとも植物の一部分でカドミウムレベルを低下させる方法が提供され、前記方法は、NtMRPポリヌクレオチドの発現及びそれによってコードされるタンパク質の活性、又はそれによってコードされるタンパク質の活性を、NtMRPポリヌクレオチドの発現及びそれによってコードされるタンパク質の活性、又はそれによってコードされるタンパク質の活性が低下していないコントロール植物と比較して低下させる工程を含む。
さらに別の特徴では、配列番号:24から26又は配列番号:52のいずれかに示される配列によって発現される単離NtMRPポリペプチドが提供され、好ましくはここで当該ポリペプチドは重金属輸送因子活性を有する。
さらに別の特徴では、当該単離ポリペプチドと特異的に結合する抗体が提供される。
さらに別の特徴では、サンプル中のNtMRPポリヌクレオチドを検出する方法が提供され、前記方法は、(a)ポリヌクレオチドを含むサンプルを提供する工程;(b)前記サンプルをNtMRPポリヌクレオチドの少なくとも一部分を特異的に検出する、1つ以上のプライマー又は1つ以上のプローブと接触させる工程;及び(c)増幅生成物の存在を検出する工程を含み、ここで増幅生成物の存在はサンプル中のNtMRPポリヌクレオチドの存在の指標である。
1つ以上の調節配列と作動できるように連結された当該単離ポリヌクレオチドを含むキメラ遺伝子。
本発明のポリヌクレオチド構築物又は二本鎖RNA、ここで当該ポリヌクレオチドは、少なくとも15−30ヌクレオチド、30−50ヌクレオチド、50−100ヌクレオチド、100−150ヌクレオチド、150−200ヌクレオチド、200−300ヌクレオチド、300−400ヌクレオチド、400−500ヌクレオチド、500−600ヌクレオチド又は600−700ヌクレオチドを含むか、前記から成るか又は本質的に前記から成る。
本発明の単離ポリヌクレオチド、キメラ遺伝子、ポリヌクレオチド構築物又は二本鎖RNA、及び前記に共有結合させた少なくとも1つの非ヌクレオチド又は非ポリヌクレオチド成分を含む複合物。
本発明の単離ポリヌクレオチド、キメラ遺伝子、ポリヌクレオチド構築物、二本鎖RNA、複合物又は発現ベクターを含む、変異体の、天然には存在しない又はトランスジェニックな植物細胞。
本発明の変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックな植物細胞を含む、変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックな植物。
適切には、収集された葉の乾燥バイオマスはコントロール植物とほぼ同じである。
本発明の植物に由来する組織を含むバイオマス、種子又は葉。
本発明のバイオマス、種子又は葉を取り入れた又は利用する消耗品。
本発明のバイオマス、種子若しくは葉又は本発明の消耗品、ここで、NtMRPポリヌクレオチドの発現及びそれによってコードされるタンパク質の活性、又はそれによってコードされるタンパク質の活性が低下していないコントロール植物に由来するバイオマス、種子又は葉と比較して、少なくとも約5%のカドミウム含有量の低下が存在する。
本発明の単離ポリヌクレオチド、キメラ遺伝子、ポリヌクレオチド構築物、二本鎖RNA、複合物又は発現ベクターを含む細胞株。
以下の工程を含む、カドミウムレベルを植物の少なくとも一部分で低下させる方法:NtMRPポリヌクレオチドの発現及びそれによってコードされるタンパク質の活性又はそれによってコードされるタンパク質の活性を、NtMRPポリヌクレオチドの発現及びそれによってコードされるタンパク質の活性又はそれによってコードされるタンパク質の活性が低下していないコントロール植物と比較して低下させる工程。
適切には、前記方法は、前記植物を当該ポリヌクレオチド構築物、二本鎖RNA、複合物、発現ベクター、メガヌクレアーゼ又はジンクフィンガータンパク質と接触させる第一の工程を含む。
本発明の方法によって入手した又は入手できる、変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックな植物、ここで、NtMRPポリヌクレオチドの発現及びそれによってコードされるタンパク質の活性又はそれによってコードされるタンパク質の活性が低下していないコントロール植物と比較して、当該植物の少なくとも一部分で少なくとも約5%のカドミウム含有量の低下が存在する。
以下の工程を含む、NtMRPポリヌクレオチドの発現及びそれによってコードされるタンパク質の活性を細胞で調節する(例えば低下又は阻害)方法:本発明のキメラ遺伝子、ポリヌクレオチド構築物、二本鎖RNA、複合物又は発現ベクターを投与する工程。
以下の工程を含む、NtMRPポリヌクレオチドを検出、単離、増幅又は解析する方法:ポリヌクレオチドを含むサンプルを提供し、前記ポリヌクレオチドを、本発明の単離ヌクレオチド配列由来の連続する少なくとも10ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド分子とハイブリダイズさせる工程。
本発明の方法又は使用、ここで、当該薬剤は、NtMRPポリヌクレオチド、キメラNtMRP遺伝子、NtMRPポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築物、アンチセンスRNA、二本鎖RNA、cDNA、NtMRPポリヌクレオチド及び前記と共有結合させた少なくとも1つの非ヌクレオチド又は非ポリヌクレオチド成分を含む複合物、リボザイム、変異原、ジンクフィンガー、小分子又はメガヌクレアーゼであるか、又は前記から誘導される。
さらに別の特徴では、以下の工程を含む、タバコ製品を製造する方法が提供される:(a)変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックなタバコの植物から種子を入手する工程;(b)施設で当該種子を播種し生育させる工程;(c)当該植物を採集する工程;及び(d)当該採集植物からタバコ製品を製造する工程。
上述の実施態様は、上記の特徴の各々の実施態様として開示される。
カドミウムがより低量で存在する、変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックな植物を生産することによって、多数の利点が提供される。
例示すれば、植物(変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックな植物を含む)は、種々の濃度のカドミウムを含む土壌で、又は望ましい濃度未満のカドミウムを含む土壌で生育させることができる。これらの植物及び派生する種子は、より広範囲の土壌環境でそれらを栽培するためにより多くの選択肢を提供することができ、このことは、業者(例えば農業者)が利用できる耕作可能な土壌の面積を増大させることができる。
さらに例示すれば、変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックな植物(それらから入手されるバイオマス、種子及び葉を含む)は、コントロールの対応物と比較してカドミウム含有量の低下を示し、食品として直接消費することができる。これらの食品の消費はより健康的な選択肢であり得る。本開示方法にしたがって操作できる適切な植物には、農業的利用のために栽培可能な植物(タバコ、コメ、トウモロコシ、カボチャ、ダイズ、レタス、ジャガイモ、サトウダイコン、ハーブ、コムギ及びニンジンなどを含む)が含まれる。
さらに例示すれば、変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックな植物の高さ及び/又は重量はコントロール植物と実質的に同じである。したがって、コントロールと比較したとき当該植物の収集乾燥葉において顕著な相違は見出されず、したがってNtMRP転写物の調節は乾燥バイオマスに対して実質的に関連する影響を与えないことを示している。これは有益である。なぜならば、植物は、視覚的外観の変化が当該産業にとって許容できないか、又は生産収量の受け入れ難い低下をもたらす可能性がある多様な製品(タバコを含む)の工業的生産に使用されるからである。
本出願の範囲内で用いられる技術用語及び表現には、植物及び分子生物学の関係分野でそれらに一般的に適用される意味が与えられるべきである。以下の用語の定義の全てが、本出願の全内容に当てはまる。“含む(comprising)”という語は、他の成分又は工程を排除せず、さらに不定冠詞の“a”又は“an”は複数を排除しない。ただ1つの工程が複数の請求項に列挙されたいくつかの特徴の複数の機能を満たすことができる。特性又は値の関係において“本質的に”、“約”、“おおよそ”などの用語はまた、当該特性を厳密に、当該値を厳密にそれぞれ規定する。ある数値又は範囲の関係で“約”という用語は、当該提供された値又は範囲の20%以内、10%以内、又は5%、4%、3%、2%、若しくは1%以内である値又は範囲を指す。
“ポリヌクレオチド”はヌクレオチドのポリマーを指し、前記は未改変又は改変デオキシリボポリヌクレオチド(DNA)又はリボポリヌクレオチド(RNA)であり得る。したがって、ポリヌクレオチドは、ゲノムDNA、相補性DNA(cDNA)(例えば配列番号:27)、m RNA又はアンチセンスRNAであり得るが、ただしこれらに限定されない。さらにまた、ポリヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖DNA、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるDNA、DNA及びRNAを含むハイブリッド分子、又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物を含むハイブリッド分子であり得る。さらにまた、ポリヌクレオチドは、DNA、RNA又はその両者を含む三本鎖領域を含むことができる。ポリヌクレオチドは、1つ以上の改変塩基(例えばホスホチオエート)を含むことができ、さらにペプチドポリヌクレオチド(PNA)であってもよい。一般的には、本明細書に記載するポリヌクレオチドは、cDNAの単離又はクローン化フラグメント、ゲノムDNA、オリゴヌクレオチド若しくは個々のヌクレオチド又は前述の組合せからアッセンブリングできる。本明細書に記載のポリヌクレオチド配列はDNA配列として示されているが、当該配列には、それらの対応するRNA配列及びそれらの相補性(例えば完全に相補性の)DNA又はRNA配列(その逆相補鎖を含む)が含まれる。
“遺伝子配列”は、ポリヌクレオチド分子又はポリペプチド若しくは生物学的に活性なRNAをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を指し、タンパク質のフラグメントをコードするだけの部分的コード配列のヌクレオチド配列を包含する。
“ベクター”という用語は、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構築物及びポリヌクレオチド複合物などの輸送を可能にするポリヌクレオチド成分の結合物を含むポリヌクレオチドベヒクルを指す。適切なベクターには、染色体外複製能力を有するエピソーム、例えば環状二本鎖ポリヌクレオチドプラスミド;線状化二本鎖ポリヌクレオチドプラスミド;及び任意の起源の他のベクターが含まれる。
“発現ベクター”は、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構築物及びポリヌクレオチド複合物などの発現を可能にするポリヌクレオチド成分の結合物を含むポリヌクレオチドベヒクルを指す。適切な発現ベクターには、染色体外複製能力を有するエピソーム、例えば環状二本鎖ポリヌクレオチドプラスミド;線状化二本鎖ポリヌクレオチドプラスミド;及び任意の起源の他の機能的に等価の発現ベクターが含まれる。発現ベクターは、下記に規定するように、上流に位置し、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構築物又はポリヌクレオチド複合物と作動できるように連結された少なくとも1つのプロモーターを含む。
“複合物”という用語は、ポリヌクレオチドとそれ自体はポリヌクレオチド又はモノマーではない1つ以上の成分(“複合物成分”)との共有結合(“複合物形成”)によって生成された化合物を指す。
“鋳型鎖”は、ポリヌクレオチドデュープレックス(例えば、NtMRPゲノムフラグメント、NtMRP cDNA、又はNtMRP構築物、又はRNAポリメラーゼによって転写され得るポリヌクレオチド配列を含む任意のポリヌクレオチドフラグメント)の“センス又はコード鎖”の配列を補完する配列を含む鎖を指す。転写時に、RNAポリメラーゼは、3’から5’方向に鋳型鎖に沿って初期RNA合成の間移動することができる。
“センス鎖”は本明細書では“コード鎖”という用語と互換的に用いられ、DNAデュープレックス中の鋳型鎖の配列を補完する配列を含む鎖を指す。例えば、同定されたNtMRPゲノムクローンのセンス鎖の配列(“センス配列”)は、配列番号:1又は配列番号:2と称される。例えば、センス鎖が仮定的配列5’-TAATCCGGT-3’を含む場合、仮定的標的mRNA内の実質的に同一の一致する配列は5’-UAAUCCGGGU-3’である。
“NtMRP”、“NtMRP3”又は“NtMRP4 RNA転写物”は、問題の宿主植物細胞内で生成されたポリリボヌクレオチド分子を含む(前記は内因性NtMRP3又はNtMRP4遺伝子又は本明細書に記載するcDNAの転写から生じる)。したがって、この用語は、NtMRP3又はNtNRP4又はNtMRP3若しくはNtMRP4RNAから転写生成物として生成された任意のRNA種又はRNA変種(構造的/機能的レベルで十分な類似性を有するRNA種又はRNA変種を含む)を含む。例えば、NtMRP3又はNtMRP3 RNA転写物には以下が含まれる(ただしこれらに限定されない):(1)単離されたNtMRP3又はNtMRP3遺伝子又はcDNAの転写から生成されるプレ-mRNA及びmRNA;(2)単離されたNtMRP3遺伝子の配列に対して少なくとも61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有する任意の遺伝子(すなわち同定されたNtMRP3遺伝子と実質的に同一で、さらにABC輸送因子の関連するアイソフォームをコードする他の別個の遺伝子)の転写から生成されるプレ-mRNA及びmRNA;(3)NtMRP3遺伝子の対立遺伝子座の転写から生成されるプレ-mRNA及びmRNA。NtMRP3 RNA転写物は、個々の遺伝子の異型核内RNA(“hnRNA”)のまた別のRNAスプライシング反応の結果として生成されるRNA変種、そのようなまた別のRNAスプライシング反応から生じるmRNA変種及び任意の中間体RNA変種を含む。
“作動できるように連結された”とは、機能的転写ユニット又は機能的発現ベクターを生じる別個のポリヌクレオチドエレメント、フラグメント又は配列の結合を指す。
“プロモーター”はポリヌクレオチドエレメント/配列を指し、前記は典型的には上流に配置され、二本鎖DNAフラグメント(例えばNtMRP RNAi構築物)と作動できるように連結される。例えば。適切なプロモーターは、転写複合体(RNAポリメラーゼ及び種々の因子を含む)を補給することによってNtMRP RNAi構築物の転写活性化を可能にしてRNA合成を開始させる。プロモーターは、本来の状態にある問題の遺伝子の近位領域からそっくりそのまま誘導するか、又は本来の状態にある別個のプロモーターから誘導した種々のエレメント又は合成DNAセグメントを含むことができる。
“エンハンサー”は、転写調節タンパク質(例えば転写アクチベーター)を補給し、プロモーター活性を高めることによって転写活性化を強化することができるポリヌクレオチド分子又はポリヌクレオチド配列を指す。
適切なエンハンサーは、本来の状態にある問題のプロモーターの近位領域から誘導するか(同種起源)、又は本来の状態ではない環境から誘導して(異種起源)、NtMRP構築物(例えばRNAi発現ベクター)内の問題の任意のプロモーターと作動できるように連結して、プロモーターの活性又は組織特異性を強化することができる。いくつかのエンハンサーは、転写ユニットの向きに対して任意の向きで作動することができる。例えば、エンハンサーは、プロモーター及びNtMRP構築物を含む転写ユニットの上流又は下流に配置することができる。
“植物細胞”という用語は、植物の構造的及び生理学的単位を指す。植物細胞は、細胞壁の無いプロトプラスト、単離された単一細胞又は培養細胞の形態として、又はより大きな組織化された単位(例えば植物組織、植物器官又は全植物であるが、ただしこれらに限定されない)の部分として存在し得る。
“植物材料”は、植物から入手できる任意の固体、液体若しくは気体状組成物又は前記の組合せを指し、例えばバイオマス、葉、葉片、中央脈、茎、根、花若しくは花の部分、果実、花粉、卵細胞、接合子、種子、挿穂、分泌物、抽出物、細胞若しくは組織培養、又は植物の任意の他の部分若しくは生成物が含まれる。ある実施態様では、植物材料はバイオマス、種子又は葉を含むか又は前記から成る。別の実施態様では、植物材料は葉を含むか又は葉から成る。
“系統”又は“育種系統”という用語は、植物育種時に用いられる植物のグループを指す。系統は品種と区別できる。なぜならば、系統は、対象の1つ以上の特質について個体間でほとんど変動を示さないからである(ただし、別の特質については個体間である程度の変動が存在することもある)。
“低下する”又は“低下させる”という用語は、量又は活性(例えばポリペプチド活性、転写活性及び/又はタンパク質発現であるが、ただしこれらに限定されない)の約10%から約99%の低下、又は少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は少なくとも100%、200%若しくは300%又はそれより大きな低下を指す。
“増加する”又は“増加した”という用語は、量又は活性(例えばポリペプチド活性、転写活性及び/又はタンパク質発現であるが、ただしこれらに限定されない)の約10%から約99%の増加、又は少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は少なくとも100%、200%若しくは300%又はそれより大きな増加を指す。
コントロール植物又はコントロール植物細胞の関係での“コントロール”という用語は、具体的な遺伝子又はタンパク質(例えばNtMRP)の発現又は活性が改変されていない(例えば増加又は低下していない)植物又は植物細胞を意味し、したがって前記は、具体的な遺伝子又はタンパク質(例えばNtMRP)の発現又は活性が改変されている植物との比較を提供できる。コントロール植物は空ベクターを含むことができる。コントロール植物は野生型植物と一致してもよい。
NtMRPポリヌクレオチド及びポリペプチド(NtMRP3及びNtMRP4ポリヌクレオチド及びポリペプチドを含む)は本明細書に記載されている。図6に示すように、NtMRP3ゲノムクローン(配列番号:28及び配列番号:29と称される)は以下を含む:イントロン1(配列番号:30)、イントロン2(配列番号:31)、イントロン3(配列番号:32)、イントロン4(配列番号:33)、イントロン5(配列番号:34)、イントロン6(配列番号:35)、イントロン7(配列番号:36)、イントロン8(配列番号:37)、イントロン9(配列番号:38)、イントロン10(配列番号:39)、エクソン1(配列番号:40)、エクソン2(配列番号:41)、エクソン3(配列番号:42)、エクソン4(配列番号:43)、エクソン5(配列番号:44)、エクソン6(配列番号:45)、エクソン7(配列番号:46)、エクソン8(配列番号:47)、エクソン9(配列番号:48)、エクソン10(配列番号:49)及びエクソン11(配列番号:50)。
多様な実施態様が、NtMRP3遺伝子座から単離されたゲノムフラグメントである単離ポリヌクレオチドに向けられる。前記は、配列番号:28若しくは配列番号:29、配列番号:28若しくは配列番号:29のフラグメント、又は前記の変種を含む。
多様な実施態様が、NtMRP3遺伝子座のcDNA配列である単離ポリヌクレオチドに向けられる。前記は、配列番号:51、配列番号:51のフラグメント、又はその変種を含む。
多様な実施態様が、単離NtMRPポリヌクレオチド変種(配列番号:28又は配列番号:29と少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、及び99%の配列同一性を含む)、又は配列番号:28若しくは配列番号:29のフラグメントに向けられる。
多様な実施態様が、NtMRPポリヌクレオチド変種のポリヌクレオチドを補完する単離ポリヌクレオチドに向けられる。前記変種は、配列番号:28若しくは配列番号:29若しくは配列番号:51、又は配列番号:28若しくは配列番号:29若しくは配列番号:51のフラグメントと少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、及び99%の配列同一性を含む。
多様な実施態様が、配列番号:28若しくは配列番号:29若しくは配列番号:51、又は配列番号:28若しくは配列番号:29若しくは配列番号:51のフラグメントを含むポリヌクレオチドと、適度から高度にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズできる単離ポリヌクレオチドに向けられる。
多様な実施態様が、NtMRP4遺伝子座から単離されたゲノムフラグメントである単離ポリヌクレオチドに向けられる。前記は、配列番号:1若しくは配列番号:2、配列番号:1若しくは配列番号:2のフラグメント、又は前記の変種を含む。
多様な実施態様が、配列番号:27、配列番号:27のフラグメント、又はその変種を含む単離cDNAに向けられる。
多様な実施態様が、配列番号:1若しくは配列番号:2若しくは配列番号:27、又は配列番号:1若しくは配列番号:2若しくは配列番号:27のフラグメントと少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、及び99%の配列同一性を含む、単離NtMRPポリヌクレオチド変種に向けられる。
多様な実施態様が、配列番号:1若しくは配列番号:2若しくは配列番号:27又は配列番号:1若しくは配列番号:2若しくは配列番号:27のフラグメントと少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、及び99%の配列同一性を含む、NtMRPポリヌクレオチド変種を補完する単離ポリヌクレオチドに向けられる。
多様な実施態様が、配列番号:1若しくは配列番号:2若しくは配列番号:27又は配列番号:1若しくは配列番号:2若しくは配列番号:27のフラグメントを含むポリヌクレオチドと、適度から高度にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズできる単離ポリヌクレオチドに向けられる。
多様なポリヌクレオチドアナローグが公知である。前記は、例えばホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、O-メチルホスホロアミダイト結合並びにペプチドポリヌクレオチド骨格及び結合を含む。他のアナローグポリヌクレオチドは、陽性の骨格;非イオン性骨格及び非リボース骨格を有するものを含む。1つ以上の炭素環式糖を含むポリヌクレオチドもまた含まれる。
開示したNtMRPポリヌクレオチド及びそのフラグメントの組合せの使用では、特に、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブ若しくはポリヌクレオチド増幅アッセイで使用するプライマーとしてのフラグメントの使用、又は種々のポリヌクレオチド構築物(例えばRNAi分子)の開発におけるフラグメントの使用が存在する。そのようなフラグメントは一般的には、DNA配列の少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 若しくは20又はそれより大きい連続したヌクレオチドを含む。他の実施態様では、DNAフラグメントは、DNA配列の少なくとも約10、15、20、30、40、50若しくは60又はそれより大きい連続したヌクレオチドを含む。したがって、さらに別の特徴では、本明細書に記載するプローブ及び/又はプライマーの使用を含む、NtMRPポリヌクレオチドを検出する方法が提供される。
さらにまた潜在的な使用は、本明細書に記載のNtMRPポリヌクレオチドと緩和されたストリンジェンシー条件、典型的には適度にストリンジェントな条件、一般的には高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの使用である(例えばプライマー又はプローブ)。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響する基礎的なパラメーター及び適切な条件を考案するための手引きは以下に記載されてあり(Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)、さらに、当業者は当該ポリヌクレオチドの長さ及び塩基組成を基準にして容易に決定することができる。
洗浄温度及び洗浄塩濃度は、当業者に公知でありさらに下記の文献に記載されているように、ハイブリダイゼーション反応及びデュープレックスの安定性を支配する基礎的原理を適用することによって、必要に応じて調整して所望のストリンジェンシーの程度を達成できる(例えば以下を参照されたい:Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。ポリヌクレオチドを標的の未知配列のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせるとき、ハイブリッドの長さはハイブリダイズするポリヌクレオチドの長さと仮定される。既知の配列をもつポリヌクレオチドをハイブリダイズさせるとき、ハイブリッドの長さは、ヌクレオチドの配列をアラインメントさせ、最適な配列相補性を有する領域を同定することによって決定できる。50塩基対未満と予想されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、当該ハイブリッドの融解温度(Tm)より5から10℃低くあるべきである。ここでTmは以下の等式にしたがって決定される。長さが18塩基対未満のハイブリッドの場合、Tm(℃)=2(A+T塩基数)+4(G+C塩基数)。
長さが18塩基対を超えるハイブリッドの場合、
Tm(℃)=81.5+16.6(log10 [Na+])+0.41(%G+C)−(600/N)、
式中、Nはハイブリッド中の塩基数であり、[Na+]はハイブリッド緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である(1x標準クエン酸ナトリウムの[Na+]=0.165M)。典型的には、そのようなハイブリダイズさせるポリヌクレオチドの各々は、それがハイブリダイズするポリヌクレオチドの長さの少なくとも25%(一般的には少なくとも50%、60%又は70%及びもっとも一般的には少なくとも80%)であり、さらにそれがハイブリダイズするポリヌクレオチドに関して少なくとも60%(例えば少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、又は少なくとも99%)の配列同一性を有する。
NtMRPポリペプチドは、任意のタイプの変異を導入することによって生成された変種を含み、前記は意図的に操作されても又は天然から単離されてもよい(任意の変異は、例えばアミノ酸の挿入、欠失又は置換;グリコシル化状態の変化;再折畳み若しくは異性化、三次元構造又は自己結合状態に影響を与える変化である)。NtMRP3又はNtMRP4ポリペプチドは線形であっても公知の方法を用いて環化されてもよい。NtMRP4ポリペプチドは、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40の連続するアミノ酸を含む、
多様な実施態様が、配列番号:1若しくは配列番号:2若しくは配列番号:27及び配列番号:1若しくは配列番号:2若しくは配列番号:27のフラグメント、又は前記の変種を含む、前記から成る、又は本質的に前記から成るポリヌクレオチド配列によってコードされる単離NtMRP4ポリペプチドに向けられる。
多様な実施態様が、配列番号:1若しくは配列番号:2若しくは配列番号:27若しくは配列番号:28若しくは配列番号:29若しくは配列番号:51、又は配列番号:1若しくは配列番号:2若しくは配列番号:27若しくは配列番号:28若しくは配列番号:29若しくは配列番号:51のフラグメントと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、及び99%の配列同一性を含む、単離NtMRPポリペプチド変種に向けられる。
NtMRP、NtMRP3及びNtMRP4の変異ポリペプチド変種もまた特許請求の範囲に包含され、NtMRP及び/又はNtMRP3及び/又はNtMRP4の変異ポリペプチド変種を含む、変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックな植物(例えば、変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックなタバコの植物)として本明細書に開示される。
ポリペプチドはまた公知の通常的な化学合成によって製造してもよい。合成手段によってポリペプチド又はそのフラグメントを構築する方法は当業者には公知である。合成により構築されたポリペプチド配列は、一次、二次若しくは三次構造における又は配座における特徴を本来の状態のポリペプチドと共有するために、共通の生物学的特性(生物学的活性を含む)を保有し得る。
NtMRPタンパク質の活性の低下は、約5%から約100%、又は少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は100%までの低下であり得る。
阻害は、約98%から約100%の低下、又は少なくとも98%、少なくとも99%の低下を指すが、特に100%の低下を指す。
センスの向きでポリヌクレオチド分子と作動できるように連結された調節領域を含む構築物はまた遺伝子発現の阻害に用いことができる。転写生成物は、NtMRPポリペプチドのセンスコード配列又はそのフラグメントと類似又は同一であり得る。転写生成物はまた、ポリアデニル化されてなくても、5'キャップ構造を欠いていても、又はスプライスできないイントロンを含んでいてもよい。部分的cDNA配列と同様に完全長のcDNAを用いて遺伝子発現を阻害する方法は当業界で公知である。
いくつかの実施態様では、互いに相補的なセンス及びアンチセンス配列の両方に対する鋳型である少なくとも1つの鎖を有するポリヌクレオチドを含む構築物を用いて遺伝子の発現が阻害される。前記センス及びアンチセンス配列はより大きなポリヌクレオチド分子の部分であってもよく、又は相補的ではない配列を有する分離されたポリヌクレオチド分子の部分であってもよい。センス又はアンチセンス配列は、mRNAの配列、mRNAの3’若しくは5'非翻訳領域、又はNtMRPポリペプチドをコードするプレ-mRNA中のイントロン、又はそのような配列のフラグメントと同一又は相補的な配列であり得る。いくつかの実施態様では、センス又はアンチセンス配列は、NtMRPポリペプチドをコードする遺伝子の転写を誘導する調節領域の配列と同一又は相補的である。いくつかの事例では、センス配列は、アンチセンス配列と相補的な配列である。
いくつかの実施態様では、アンチセンス配列は、本明細書に記載のNtMRPポリペプチドをコードするmRNA配列又はそのフラグメントと相補的な配列である。アンチセンス配列と相補的なセンス配列は、NtMRPポリペプチドのmRNA内に存在する配列であり得る。典型的には、センス及びアンチセンス配列は、標的mRNAレベルが低下するように、標的mRNAの15−30ヌクレオチド配列と一致するべく設計される。
有効なアンタゴニストは、葉(例えば葉身構造)への重金属(例えばカドミウム)の輸送を少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%低下させることができる。ある実施態様では、NtMRP RNA転写物の翻訳に干渉できる配列特異的ポリヌクレオチドはRNAiである。
NtMRPポリヌクレオチドは多様な形態で生成することができ、前記には、二本鎖構造(すなわち、アンチセンス鎖及び相補的なセンス鎖を含む二本鎖RNA分子)、二本鎖ヘアピン様構造(“dsRNAi”)、一本鎖構造(すなわち、アンチセンス鎖の身を含むssRNA分子)が含まれる。前記構造は、デュープレックス、非対称デュープレックス、ヘアピン又は非対称ヘアピン二次構造を含むことができ、自己相補性センス及びアンチセンス鎖を有する。NtMRP dsRNAiは、酵素により二本鎖NtMRP siRNAに変換することができる。NtMRP siRNAデュープレックスの鎖の一方を標的NtMRP mRNA及び関連NtMRP RNA変種内の相補性配列にアニールさせることができる。siRNA/mRNAデュープレックスは、NtMRP RNAをマルチ部位で配列依存態様で切断できるRISCによって認識され、標的NtMRP mRNA及び関連NtMRP RNA変種の分解をもたらす。
小ヘアピンRNA(shRNA)分子もまた本明細書で開示される。前記は、逆相補性(センス)配列に加えて固有のアンチセンス配列を含み、典型的にはそれらはスペーサー又はループ配列によって分離されている。スペーサー又はループの切断は、一本鎖RNA分子及びその逆相補鎖を提供し、したがってそれらはアニールして二本鎖RNA分子を提供することができる(場合によって、一方の鎖または両方の鎖の3’末端又は5’末端の1、2、3、又は4以上のヌクレオチドの付加又は除去を生じ得る更なるプロセッシング工程による)。スペーサーは、当該スペーサーの切断前に(及び場合によって、一方の鎖または両方の鎖の3’末端又は5’末端の1、2、3、、4又は5以上のヌクレオチドの付加又は除去をもたらすことができるその後のプロセッシング工程の前に)アンチセンス及びセンス配列がアニールして二本鎖構造(又はステム)を形成することができるように十分な長さであり得る。2つの相補性ヌクレオチド配列領域間に配置されるスペーサー配列は、典型的には無関係のヌクレオチド配列であり、前記2つの相補性ヌクレオチド配列領域は、アニールして二本鎖ポリヌクレオチドを形成するときshRNAを含む。スペーサー配列は一般的には約3から約100ヌクレオチドを含む。
別の実施態様では、siRNA分子は、天然に存在する標的遺伝子又は標的mRNAの部分と、ストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズできる固有のアンチセンス配列を含む。適切なストリンジェントな条件には、例えば通常のハイブリダイゼーション方法にしたがうハイブリダイゼーション及び1−3回の洗浄条件が含まれる。標準クエン酸ナトリウム、0.1−1%ドデシル硫酸ナトリウム、50−70℃で約5−30分後の洗浄溶液の交換。当業者には理解されるところであるが、ハイブリダイゼーション条件におけるストリンジェンシーの多様性は、ハイブリダイゼーションに用いられる時間、温度又は溶液の濃度及び洗浄工程を変更することによって達成できる。適切な条件はまた、用いられる個別のヌクレオチド(例えば標的mRNA又は遺伝子の配列)に部分的に左右され得る。
RNAi分子が分子の一方の末端に3’オーバーハングを含むとき、他方の末端は平滑末端であっても、オーバーハング(5’又は3’)を有していてもよい。RNAi分子が分子の両末端にオーバーハングを含むとき、オーバーハングの長さは同じでも異なっていてもよい。ある実施態様では、本明細書に記載のRNAi分子は、分子の両末端に約1から約3ヌクレオチドの3’オーバーハングを含む。さらに別の実施態様では、RNAi分子は、分子の両末端に2ヌクレオチドの3’オーバーハングを有する二本鎖RNAである。さらに別の実施態様では、RNAiのオーバーハングを含むヌクレオチドはTTジヌクレオチド又はUUジヌクレオチドである。
RNAi分子は1つ以上の5’又は3’キャップ構造を含むことができる。RNAi分子は、RNAi分子のセンス鎖、アンチセンス鎖又はセンス及びアンチセンス鎖の両方の3’末端に;又はセンス鎖、アンチセンス鎖又はセンス及びアンチセンス鎖の両方の5’末端にキャップ構造を含むことができる。また別には、RNAi分子は当該分子の3’末端及び5’末端の両方にキャップ構造を含むことができる。“キャップ構造”という用語は、オリゴヌクレオチドのどちらかの末端に取り込まれた化学的改変を指す(例えば米国特許5,998,203号を参照されたい)。前記構造はエキソヌクレアーゼ分解から当該分子を保護し、さらにまた細胞内デリバリー又は局在を促進できる。
RNAi分子に適用できる別の改変は、RNAi分子の活性、細胞内分布、細胞内取り込み、生体利用性又は安定性を高める1つ以上の成分又は複合物のRNAi分子との化学的結合である。ポリヌクレオチドは当業界でしっかりと確立された方法によって合成又は改変できる。化学的改変には、2’改変、非天然塩基の導入、リガンドと共有結合、及びリン酸結合のチオリン酸結合による置換が含まれるが、ただしこれらに限定されない。この実施態様では、デュープレックス構造の完全性は、少なくとも1つの及び典型的には2つの化学的結合によって強化される。化学的結合は、周知の任意の多様な技術のいずれかによって、例えば共有結合、イオン結合又は水素結合;疎水性相互作用、ファンデルワールス力又は積み重ね相互作用の導入によって;金属-イオン配位の手段によって又はプリンアナローグの使用を介して達成できる。
リガンドは、例えば細胞の吸収を強化するためにRNAi分子に結合させることができる。ある種の実施態様では、疎水性リガンドが、細胞膜の直接透過を容易にするために分子に結合される。これらのアプローチを用いて、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞透過が促進される。ある種の事例では、陽イオン性リガンドとオリゴヌクレオチドとの結合はしばしばヌクレアーゼに対する耐性の改善をもたらす。陽イオン性リガンドの代表例は、プロピルアンモニウム及びジメチルプロピルアンモニウムである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、陽イオン性リガンドが当該オリゴヌクレオチド全体に分散されているときmRNAに対するそれらの高い結合親和性を維持することができる。
本明細書に記載する分子及びヌクレオチドは、固相合成の周知の技術を用いて調製することができる。そのような合成について当業界で公知の他の任意の手段を、前記に加えて又は代替として用いることができる。
開示の配列は、ヘアピン構造を形成しない多様なNtMRPポリヌクレオチドの構築に利用できる。例えば、NtMRP二本鎖RNAは、(1)第一のプロモーターに作動できるように連結することによって、NtMRP cDNAの第一の鎖を転写する工程、及び(2)第二のプロモーターに作動できるように連結することによって、NtMRP cDNAフラグメントの第一の鎖の逆相補性配列を転写する工程によって生成するすることができる。NtMRPポリヌクレオチドの各鎖は、同じ発現ベクターから又は異なる発現ベクターから転写することができる。RNA干渉活性を有するNtMRP RNAデュープレックスを酵素的にsiRNAに変換してNtMRP RNAレベルを低下させることができる。
他の実施態様は、自己アニーリングできるNtMRPポリヌクレオチド又はNtMRP RNAiポリヌクレオチドをコードするNtMRP RNAi構築物を含むNtMRP発現ベクター(例えばNtMRP4ポリヌクレオチド又はNtMRP4 RNAiポリヌクレオチドをコードするNtMRP4 RNAi構築物を含むNtMRP4発現ベクター)に向けられる。ここで前記構築物は以下の(a)及び(b)を含む:(a)配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号:21、配列番号:22、配列番号:23、配列番号:27及び配列番号:53並びにそのフラグメント及びその変種、又はその2つ以上の組合せから成る群から選択される配列と少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有する第一の配列;及び(b)第一の配列と同じ向きで配置された、第一の配列の相補性(例えば逆相補性)配列を含む第二の配列。本明細書に記載するように、固有の配列という呼称はまたその相補鎖又は逆相補鎖を含む。
多様な実施態様が、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:28、配列番号:29、若しくは配列番号:51又はそのフラグメント(例えば配列番号:3から23又は30から50のいずれか)と認定されるNtMRPポリヌクレオチド、又は前記と少なくとも約65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するその変種のマルチコピーを組み込むことによって、NtMRPポリヌクレオチドの発現レベルを調節する(例えば低下させるか又は阻害する)方法に向けられる。前記方法は、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:28、配列番号:29、若しくは配列番号:51又はそのフラグメント(例えば配列番号:3から23又は30から50のいずれか)、又は前記と少なくとも約65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するその変種に作動できるように連結されたプロモーターを含む発現ベクターで植物細胞宿主を形質転換する工程を含む。
NtMRT mRNAの翻訳を阻害する多様な発現ベクターは、配列番号:1又は配列番号:2又は配列番号:27又は配列番号:28又は配列番号:29又は配列番号:51又はそのフラグメント(例えば配列番号:3から23又は30から50又は53のいずれか)と認定されるNtMRP(例えばNtMRP cDNA)、又は前記と少なくとも約65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するその変種に作動できるように連結されたプロモーターを含むことができ、ここで前記NtMRP配列はプロモーターに対してアンチセンスの向きで配置される。アンチセンスNtMRP RNAポリヌクレオチドの長さは変動可能で、約15−20ヌクレオチド、約20−30ヌクレオチド、約30−50ヌクレオチド、約50−75ヌクレオチド、約75−100ヌクレオチド、約100−150ヌクレオチド、約150−200ヌクレオチド、及び約200−300ヌクレオチドであり得る。
また別には、NtMRP遺伝子は、問題の植物のゲノムにトランスポゾン(例えばISエレメント)を導入することによって不活化の標的とすることができる。これらの移動性遺伝的エレメントは有性交雑受精によって導入することができ、挿入変異体は、NtMRPタンパク質活性の低下(例えばカドミウム輸送低下)についてスクリーニングできる。親植物の破壊されたNtMRP遺伝子は、親植物とトランスポゾン誘導突然変異導入に付されなかった植物との交雑(例えば有性交雑受精)によって他の植物に導入できる。当業者に公知の任意の標準的な育種技術を利用できる。ある実施態様では、1つ以上のNtMRP関連遺伝子を1つ以上のトランスポゾンによって不活化できる。変異は、1つ以上のNtMRP遺伝子のホモ接合体性破壊、1つ以上のNtMRP遺伝子のヘテロ接合体性破壊、又は2つ以上のNtMRP遺伝子が破壊された場合ホモ接合体性及びヘテロ接合体性破壊の両方の組合せを生じることができる。適切な転移因子は2つの大きなクラス(クラスI及びクラスIIと称される)から選択できる。適切なクラスI転移因子には、レトロトランスポゾン、レトロポゾン及びSINE様エレメントが含まれる。そのような方法は当業者には公知である。
いくつかの実施態様では、NtMRPポリペプチドの発現は、非トランスジェニックな手段、例えばNtMRP遺伝子(NtMRP3及び/又はNtMRP4遺伝子)に変異を発生させることによって調節、低下又は阻害される。遺伝子配列内にランダムに変異を導入する方法には、化学的変異導入、EMS変異導入及び放射線変異導入が含まれ得る。細胞に1つ以上の照準変異を導入する方法には、ゲノム編集技術、特にジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入、チリング(tilling, targeting induced local lesions in genome)、相同組換え、オリゴヌクレオチド指定変異導入、及びメガヌクレアーゼ媒介変異導入が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
天然に存在しない、変異体の植物は、NrMRPポリペプチドレベルの低下をもたらす1つ以上の変異の任意の組合せを有することができる。例えば、当該植物は、単一NtMRP遺伝子内に1つの単一変異を有するか、又は単一NtMRP遺伝子内に多数の変異を有することができる。したがって、NtMRPの変異ポリペプチド変種、NtMRP3及びNtMRP4を含む変異体の、又は天然に存在しない植物(例えば本明細書に記載する、変異体の、天然に存在しない、又はトランスジェニックなタバコの植物など)が開示される。
ポリヌクレオチドサンプルを場合によってプールした後、それらをNtMRPポリヌクレオチド特異的増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応に付すことができる。NtMRP遺伝子又はNtMRP遺伝子の直ぐ近傍の配列に特異的な任意の1つ以上のプライマー又はプローブを利用して、プールしたポリヌクレオチドサンプル中のNtMRP配列を増幅させることができる。好ましくは、1つ以上のプライマー及びプローブは、有用な変異が生じる蓋然性がもっとも高いNtMRP遺伝子座領域を増幅するために設計される。もっとも好ましくは、1つ以上のプライマー及びプローブは、NtMRPポリヌクレオチドのエクソン領域内の変異を検出するために設計される。さらにまた、点変異のスクリーニングを容易にするために、1つ以上のプライマー及びプローブは既知の多形性部位を回避することが好ましい。増幅生成物の検出を促進するために、任意の通常的な標識方法を用いて、1つ以上のプライマー及びプローブを標識することができる。1つ以上のプライマー及びプローブは、本明細書に記載したNtMRP配列を土台にして当業界で周知の方法を用い設計することができる。多形性は当業界で公知の手段によって同定できる。
さらに別の特徴では、NtMRPをコードする遺伝子に変異を含む植物、植物細胞又は植物材料を同定する方法が提供される。前記方法は、(a)植物、植物細胞又は植物材料を変異導入に付す工程;(b)前記植物、植物細胞若しくは植物材料又はその子孫からポリヌクレオチドサンプルを入手する工程;及び(c)NtMRP又はその変種若しくはフラグメントをコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列を決定する工程を含み、ここで前記配列における相違は配列内の1つ以上の変異の指標である。
有用なジンクフィンガータンパク質は、少なくとも1つの第二のDNA結合ドメイン(前記は場合によって第二のジンクフィンガーポリペプチドである)とリンカー(好ましくは可撓性リンカー)を介して連結された少なくとも1つのジンクフィンガーポリペプチドを含むことができる。ジンクフィンガータンパク質は、1つ以上のレギュレータードメインと同様に3つ以上のDNA結合ドメインを含むことができる。ジンクフィンガーポリペプチドは、選択した遺伝子内の選択した標的部位を認識させるために操作することができる。 ある実施態様では、ジンクフィンガータンパク質は、天然に存在するジンクフィンガータンパク質から誘導されるフレームワーク(又は骨格)を含む。天然に存在する任意のジンクフィンガータンパク質から誘導されるフレームワーク(又は骨格)を用いることができる。例えば、C2H2モチーフを含むジンクフィンガータンパク質から誘導されるフレームワーク(又は骨格)を用いることができる。
ジンクフィンガータンパク質は、当業界で公知の任意の適切な方法により植物に提供できる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は外因的に植物細胞に添加することができ、前記植物細胞は、前記ジンクフィンガータンパク質が標的ヌクレオチド配列に結合して植物細胞中の標的遺伝子の発現を調節する条件下で維持される。また別には、ジンクフィンガータンパク質をコードするヌクレオチド配列を植物細胞で発現させ、前記植物細胞は、発現したジンクフィンガータンパク質が標的ヌクレオチド配列と結合して植物細胞中の標的遺伝子の発現を調節する条件下で維持される。
ジンクフィンガー遺伝子は、任意の適切な植物発現ベクターを用いて植物で発現され得る。高等植物での遺伝子の発現に有用な典型的なベクターは当業界で周知である。調節ドメインに加えて、しばしばジンクフィンガータンパク質は、精製、発現のモニタリング、又は細胞内及び細胞小器官内局在のモニタリングを容易にするために、マルトース結合タンパク質(“MBP”)、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、ヘキサヒスチジン、c-myc、又はFLAGエピトープとの融合タンパク質として発現され得る。
本明細書で用いられる二本鎖ブレーク(DSB)は、DNA又はRNAの両方の鎖のブレークを指す。二本鎖ブレークは、標的部位の1つから5塩基対から1500塩基対を超えない、特に5塩基対から200塩基対を超えない、特に5塩基対から20塩基対を超えない位置でゲノムDNA配列上で生じ得る。二本鎖ブレークは、非相同性末端結合を促進し、ゲノムDNA配列内の標的部位又はその近傍での変異をもたらすことができる。本明細書で用いられる“非相同性末端結合(NHEJ)”は、相同な鋳型を必要としない直接連結によって二本鎖ブレークを修復する修復メカニズムを指し、したがって、二本鎖ブレークが生じる前の配列と比較して変異原性であり得る。
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、NtMRPポリヌクレオチドと結合するジンクフィンガータンパク質をコードする第一のポリヌクレオチド、及び非特異的エンドヌクレアーゼ(例えばIIS型エンドヌクレアーゼであるが、ただし前記に限定されない)をコードする第二のポリヌクレオチドを融合させることによって構築できる。IIS型エンドヌクレアーゼは、別々の認識ドメイン及びエンドヌクレアーゼ切断ドメインを有する制限酵素で、この酵素は認識部位から離れた部位でDNAを切断する。IIS型エンドヌクレアーゼの非限定的な例は、AarI、BaeI、CdiI、DrdII、EciI、FokI、FauI、GdiII、HgaI、Ksp632I、MboII、Pfl1108I、Rle108I、RleAI、SapI、TspDTI又はUbaPIであり得る(ただしこれらに限定されない)。
さらに別の実施態様では、本開示は、ジンクフィンガータンパク質及び遺伝子リプレッサーを含む融合タンパク質(ジンクフィンガーリプレッサーを生じる)を提供する。ジンクフィンガーリプレッサーを用いて、NtMRPポリヌクレオチドの転写をダウンレギュレート又は抑制することができ、前記は以下の工程を含む:(i)NtMRPポリヌクレオチドと機能的に連結されているプロモーター又は配列内の領域と結合するジンクフィンガータンパク質を操作する工程;(ii)ジンクフィンガータンパク質と転写リプレッサーとの融合タンパク質を作製する工程;(iii)細胞(例えば植物細胞)内で活性を有するプロモーターの制御下で前記ジンクフィンガーリプレッサーをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を作り上げる工程;(iv)細胞に前記遺伝子構築物を導入する工程;(v)ジンクフィンガーリプレッサーの発現を提供する工程;及び(vi)NtMRPポリヌクレオチドの転写の低下を示す細胞の性状を決定する工程。
多様な実施態様では、ジンクフィンガータンパク質は本明細書に記載の方法にしたがって選択し、NtMRPポリヌクレオチドの調節配列と結合させることができる。より具体的には、調節配列は、転写開始部位、開始コドン、エクソン領域、エクソン-イントロン境界部、ターミネーター又は停止コドンを含むことができる。ジンクフィンガータンパク質は、ヌクレアーゼ、アクチベーター又はリプレッサータンパク質と融合させることができる。
多様な実施態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、NtMRPポリヌクレオチドのゲノムDNA配列の調節領域、コード領域又は非コード領域に二本鎖ブレークを導入し、NtMRPポリヌクレオチドの発現レベルの低下、阻害、若しくは実質的阻害、又はそれによってコードされるタンパク質の活性の低下、阻害若しくは実質的阻害をもたらす。
本開示の複数の特徴では、植物細胞又は植物でNtMRPポリヌクレオチドを不活化するためにメガヌクレアーゼが使用される。特徴はまた、メガヌクレアーゼを用いて植物のNtMRPポリヌクレオチドを不活化する方法に関し、前記方法は以下の工程を含む:(a)NtMRPポリヌクレオチドを含む植物細胞を提供する工程;(b)メガヌクレアーゼ又はメガヌクレアーゼをコードする構築物を前記植物細胞に導入する工程;及び(c)メガヌクレアーゼでNtMRPポリヌクレオチドを不活化する工程。
ある種の応用のためには、NtMRPポリヌクレオチドを植物ゲノムから厳密に除去することが所望され得る。そのような応用は、1対の操作されたメガヌクレアーゼ(その各々が意図する欠失のどちらかの部位でメガヌクレアーゼ認識部位を切断する)を用いることで可能になる。本明細書で提供する組換え構築物を用いて植物又は植物細胞を形質転換し、NtMRPタンパク質の発現レベルを調節する(例えば低下させ又は阻害する)ことができる。組換えポリヌクレオチド構築物は、植物又は細胞中のNtMRPポリペプチドの発現に適切な調節領域に作動できるように連結された、本明細書に記載のNtMRPポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。したがって、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のNtMRPポリペプチド又はその変種をコードするコード配列を含むことができる。
組換えポリヌクレオチド構築物を収納するベクター(例えば本明細書に記載されるもの)もまた提供される。適切なベクター骨格には、例えば当業界で日常的に用いられるもの、例えばプラスミド、ウイルス、人工染色体(BAC、YAC又はPAC)が含まれる。適切な発現ベクターには、プラスミド及びウイルスベクター(例えばバクテリオファージ、バキュロウイルス及びレトロウイルスから誘導される)が含まれるが、ただしこれらに限定されない。多数のベクター及び発現系が市場で入手できる。
ベクターはまた、例えば複製起点、足場結合領域(SAR)又はマーカーを含むことができる。マーカー遺伝子は植物細胞に選別可能表現型を付与することできる。例えば、マーカーは生物有毒物質耐性、例えば抗生物質(例えばカナマイシン、G418、ブレオマイシン又はヒグロマイシン)又は除草剤(例えばグリホセート、クロルスルフロン又はホスフィノスリシン)に対する耐性を付与することができる。さらにまた、発現ベクターは、発現されたポリペプチドの操作又は検出(例えば精製又は局在化)を促進するために設計されたタグ配列を含むことができる。タグ配列、例えばルシフェラーゼ、ベータ-グルクロニダーゼ(GUS)、緑色蛍光タンパク質(GFT)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、ポリヒスチジン、c-myc又はヘマグルチニン配列は、典型的には、コードされるポリペプチドとの融合物として発現される。そのようなタグはポリペプチド内のいずれの場所にも(カルボキシ末端及びアミノ末端のどちらかを含む)挿入できる。
遺伝的改変での使用に適切な植物には単子葉及び双子葉植物並びに植物細胞系が含まれ、以下の科の1つに由来する種が含まれる:アカンタ科(Acanthaceae)、アリア科(Alliaceae)、アルストロエメリア科(Alstroemeriaceae)、アマリリダ科(Amaryllidaceae)、アポシナ科(Apocynaceae)、アレカ科(Arecaceae)、アステラ科(Asteraceae)、ベルベリダ科(Berberidaceae)、ビキサ科(Bixaceae)、ブラシッカ科(Brassicaceae)、ブロメリア科(Bromeliaceae)、カンナバ科(Cannabaceae)、カリオフィラ科(Caryophyllaceae)、セファロタキサ科(Cephalotaxaceae)、ケノポジア科(Chenopodiaceae)、コルキカ科(Colchicaceae)、ククルビタ科(Cucurbitaceae)、ジオスコレア科(Dioscoreaceae)、エフェドラ科(Ephedraceae)、エリスロキシラ科(Erythroxylaceae)、ユーフォビア科(Euphorbiaceae)、ファバ科(Fabaceae)、ラミア科(Lamiaceae)、リナ科(Linaceae)、リコポジア科(Lycopodiaceae)、マルバ科(Malvaceae)、メランシア科(Melanthiaceae)、ムサ科(Musaceae)、ミルタ科(Myrtaceae)、ニッサ科(Nyssaceae)、パパベラ科(Papaveraceae)、ピナ科(Pinaceae)、プランタギナ科(Plantaginaceae)、ポア科(Poaceae)、ロサ科(Rosaceae)、ルビア科(Rubiaceae)、サリカ科(Salicaceae)、サピンダ科(Sapindaceae)、ソラナ科(Solanaceae)、タキサ科(Taxaceae)、テア科(Theaceae)又はビタ科(Vitaceae)。
適切な種には以下の属のメンバーが含まれる:アベルモスクス(Abelmoschus)、アビエス(Abies)、アセル(Acer)、アグロスチス(Agrostis)、アリウム(Allium)、アルストロエメリア(Alstroemeria)、アナナス(Ananas)、アンドログラフィス(Andrographis)、アンドロポゴン(Andropogon)、アルテミシア(Artemisia)、アルンド(Arundo)、アトロパ(Atropa)、ベルベリス(Berberis)、ベタ(Beta)、ビキサ(Bixa)、ブラシッカ(Brassica)、カレンデュラ(Calendula)、カメリア(Camellia)、カンプトテカ(Camptotheca)、カンナビス(Cannabis)、カプシクム(Capsicum)、カルサムス(Carthamus)、カタランタス(Catharanthus)、セファロタクス(Cephalotaxus)、クリサンテマム(Chrysanthemum)、シンコナ(Cinchona)、シトルルス(Citrullus)、コフェア(Coffea)、コルキクム(Colchicum)、コレウス(Coleus)、ククミス(Cucumis)、ククルビタ(Cucurbita)、シノドン(Cynodon)、ダツラ(Datura)、ジアンタス(Dianthus)、ジギタリス(Digitalis)、ジオスコレア(Dioscorea)、エラエイス(Elaeis)、エフェドラ(Ephedra)、エリアンタス(Erianthus)、エリスロキシルム(Erythroxylum)、ユーカリプツス(Eucalyptus)、フェスツカ(Festuca)、フラガリア(Fragaria)、ガランタス(Galanthus)、グリシン(Glycine)、ゴッシピウム(Gossypium)、ヘリアンタス(Helianthus)、ヘベア(Hevea)、ホルデウム(Hordeum)、ヒオシアムス(Hyoscyamus)、ジャトロファ(Jatropha)、ラクツカ(Lactuca)、リヌム(Linum)、ロリウム(Lolium)、ルピヌス(Lupinus)、リコペルシコン(Lycopersicon)、リコポジウム(Lycopodium)、マニホト(Manihot)、メジカゴ(Medicago)、メンタ(Mentha)、ミスカンタス(Miscanthus)、ムサ(Musa)、ニコチアナ(Nicotiana)、オリザ(Oryza)、パニクム(Panicum)、パパベル(Papaver)、パルテニウム(Parthenium)、ペンニセツム(Pennisetum)、ペツニア(Petuni a)、ファラリス(Phalaris)、フレウム(Phleum)、ピヌス(Pinus)、ポア(Poa)、ポインセチア(Poinsettia)、ポプルス(Populus)、ラウウォリフィア(Rauwolfia)、リシヌス(Ricinus)、ロサ(Rosa)、サッカルム(Saccharum)、サリクス(Salix)、サンギナリア(Sanguinaria)、スコポリア(Scopolia)、セカレ(Secale)、ソラヌム(Solanum)、ソルグム(Sorghum)、スパチナ(Spartina)、スピナセア(Spinacea)、タナセツム(Tanacetum)、タクス(Taxus)、テオブロマ(Theobroma)、トリチコセカレ(Triticosecale)、トリチクム(Triticum)、ウニオラ(Uniola)、ベラトルム(Veratrum)、ビンカ(Vinca)、ビチス(Vitis)及びゼア(Zea)。
適切な種には以下が含まれる:パニクム、ソルグム、ミスカンタス、サッカルム、エリアンタス、ポプルス、アンソロポゴン・ゲランジー(Andropogon gerardii)(ビッグブルーステム)、ペニセツム・プルプレウム(Pennisetum purpureum)(アフリカチカラシバ)、ファラリス・アルンジナセア(Phalaris arundinacea)(リードカナリアグラス)、シノドン・ダクチロン(Cynodon dactylon)(バミューダグラス)、フェスツカ・アルンジナセア(Festuca arundinacea)(ウシノケグサ)、スパルチナ・ペクチナタ(Spartina pectinata)(プレーリーコードグラス)、メジカゴ・サチバ(Medicago sativa)(アルファルファ)、アルンド・ドナクス(Arundo donax)(ジャイアントリード)、セカレ・セレアレ(Secale cereale)(ライムギ)、サリクス(ヤナギ)、ユーカリプツス(ユーカリ)、トリコセカレ(トリチクムフィートタイムスライ)、タケ、ヘリアンタス・アンヌース(Helianthus annuus)(ヒマワリ)、カルサンムス・チンクトリウス(Carthamus tinctorius)(ベニバナ)、ジャトロファ・クルカス(Jatropha curcas)(ジャトロファ)リシヌス・コムニス(Ricinus communis)(ヒマ)、エラエイス・ギネンシス(Elaeis guineensis)(ヤシ)、リヌム・ウシタチシウム(Linum usitatissimum)(アマ)、ブラシッカ・ジュンセア(Brassica juncea)、ベタ・ブルガリス(Beta vulgaris)(テンサイ)、マニホト・エスクレンタ(Manihot esculenta)(カッサヤ)、リコペルシコン・エスクレンタム(Lycopersicon esculentum)(トマト)、レクツカ・サチバ(Lactuca sativa)(レタス)、ムスカ・パラヂシアカ(Musa paradisiaca)(バナナ)、ソラヌム・ツベロスム(Solanum tuberosum)(ジャガイモ)、ブラシッカ・オレラセア(Brassica oleracea)(ブロッコリー、カリフラワー、コモチカンラン)、カメリア・シネンシス(Camellia sinensis)(茶)、フラガリア・アナナッサ(Fragaria ananassa)(イチゴ)、テオブロモ・カカオ(Theobroma cacao)(ココア)、コフェア・アラビカ(Coffea arabica)(コーヒー)、ビチス・ビニフェラ(Vitis vinifera)(ブドウ)、アナナス・コモサス(Ananas comosus)(パイナップル)、カプシクム・アヌム(Capsicum annum)(トウガラシ及びピーマン)、アリウム・セパ(Allium cepa)(タマネギ)、ククミス・メロ(Cucumis melo)(メロン)、ククミス・サチブス(Cucumis sativus)(キュウリ)、ククルビタ・マキシマ(Cucurbita maxima)(カボチャ)、ククルビタ・モシャタ(Cucurbita moschata)(カボチャ)、スピナセア・オレラセア(Spinacea oleracea)(ホウレンソウ)、シトロルス・ラナツス(Citrullus lanatus)(スイカ)、アベルモスクス・エスクレンツス(Abelmoschus esculentus)(オクラ)、ソラヌム・メロンゲナ(Solanum melongena)(ナス)、ロサ(バラ)、ジアンタス・カリオフィルス(Dianthus caryophyllus)(カーネーション)、ペツニア(ペチュニア)、ポインセチア・プルケリマ(Poinsettia pulcherrima)(ポインセチア)、ルピヌス・アルブス(Lupinus albus)(ルピナス)、ユニオラ・パニクラタ(Uniola paniculata)(エンバク)、コヌカグサ(アグロスチス種(Agrostis spp.))、ポプルス・トレムロイデス(Populus tremuloides)(ハコヤナギ)、ピヌス種(Pinus spp.)(マツ)、アビエス種(Abies spp.)(モミ)、アセル種(Acer spp.)(カエデ)、ホルデウム・ブルガレ(Hordeum vulgare)(オオムギ)、ポア・プラテンシス(Poa pratensis)(ブルーグラス)、ロリウム種(Lolium spp.)(ライグラス)、及びフェレウム・プラテンス(Phleum pratense)(チモシー)、パニクム・ビルガツム(Panicum virgatum)(スイッチグラス)、ソルグム・ビコロル(Sorghum bicolor)(ソルガム、スーダングラス)、ミスカンタス・ギガンテウス(Miscanthus giganteus)(ミスカンタス)、サッカルム種(Saccharum sp.)(エネルギーケイン)、ポプルス・バルサミフェラ(Populus balsamifera)(ポプラ)、ジー・マイス(Zea mays)(トウモロコシ)、グリシン・マクス(Glycine max)(ダイズ)、ブラシッカ・ナプス(Brassica napus)(キャノーラ)、トリチクム・アエスチブム(Triticum aestivum)(コムギ)、ゴッシピウム・ヒルスツム(Gossypium hirsutum)(ワタ)、オリザ・サチバ(Oryza sativa)(コメ)、ヘリアンタス・アンヌース(Helianthus annuus)(ヒマワリ)、メジカゴ・サチバ(アルファルファ)、ベタ・ブルガリス(テンサイ)又はペンニセツム・グラウクム(Pennisetum glaucum)(トンジンビエ)。
特に有用なニコチアナ・タバクムの品種には、バーリー(Burley)タイプ、フルキュアード(flue-cured)タイプ及びオリエンタルタイプのタバコが含まれる。品種又は栽培変種の非限定的な例は以下である:BD 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371 Gold、Coker 48、 CD 263、DF911、DT 538 LC ガルパーオタバコ(Galpao tobacco)、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB 04P、HB 04P LC、HB3307PLC、ハイブリッド403LC、ハイブリッド404LC、ハイブリッド501 LC、ハイブリッドK 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14xL8 LC、リトルクリッテンデン(Little Crittenden)、マクネア(McNair)373、マクネア(McNair)944、msKY 14xL8、ナロウリーフマドール(Narrow Leaf Madole)、ナロウリーフマドールLC、NBH 98, N-126、N-777LC、N-7371LC、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、ニールスミスマドール(Neal Smith Madole)、OXFORD 207、PD 7302 LC、PD 7309 LC、PD 7312 LC、パリーク('Perique' )タバコ、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、スペイト(Speight)168、スペイト172、スペイト179、スペイト210、スペイト220、スペイト225、スペイト227、スペイト234、スペイトG-28、スペイトG-70、スペイトH-6、スペイトH20、スペイトNF3、TI 1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR (トムロッソン(Tom Rosson))マドール、VA 309、VA359、AA 37-1、B 13P、キサンティ(ミッチェル−モール)(Xanthi(Mitchell-Mor))、Bel-W3、79-65、サムスンホームズ(Samsun Holmes)NN、KTRDCナンバー2ハイブリッド49、バーリー(Burley)21、KY 8959、KY 9、MD 609、PG 01、PG 04、PO1、PO2、PO3、RG 11、RG 8、VA 509、AS44、バンケット(Banket)A1、バスマドラマ(Basma Drama)B84/31、バスマ(Basma)Iジクナ(Zichna)ZP4/B、バスマキサンティ(Basma Xanthi)BX 2A、バテク(Batek)、ベスキジェンバー(Besuki Jember)、C104、Coker 347、クリオロミシオネロ(Criollo Misionero)、デルクレスト(Delcrest)、ジェベル(Djebel)81、DVH 405、ガルパーオコマム(Galpao Comum)、HB04P、ヒックスブロードリーフ(Hicks Broadleaf)、カバクラックエラッソーナ(Kabakulak Elassona)、カットセージ(Kutsage)E1、LA BU 21、NC 2326、NC 297、PVH 2110、レッドラッシアン(Red Russian)、サムスン(Samsun)、サプラック(Saplak)、シンマバ(Simmaba)、タルガー(Talgar)28、ウィスリカ(Wislica)、ヤヤルダグ(Yayaldag)、プリレプ(Prilep)HC-72、プリレプ(Prilep)P23、プリレプ(Prilep)PB 156/1、プリレプ(Prilep)P12-2/1、ヤカ(Yaka)JK-48、ヤカ(Yaka)JB 125/3、TI-1068、KDH-960、TI-1070、TW136、バスマ(Basma)、TKF 4028、L8、TKF 2002、GR141、バスマキサンティ(Basma xanthi)、GR149、GR153、プチハバナ(Petit Havana)。上記の低コンバーター亜品種もまた、本明細書に具体的に特定されていなくても意図される。
複数の実施態様がまた、コントロールと比較してより低い量のカドミウムを蓄積するように改変を実施してNtMRP発現又は活性が調節(例えば低下又は阻害)されてある、変異体植物、天然に存在しない植物、ハイブリッド植物又はトランスジェニックな植物を作出するための組成物及び方法に向けられる。ある種の実施態様では、得られる植物は、全体的外観(例えば表現型)がコントロール植物と類似しているか、又は実質的に同じである。種々の表現型の特徴(例えば成熟度、植物当たりの葉の数、茎高、葉の挿入角度、葉のサイズ(幅及び長さ)、節間距離、葉身-中肋比)は野外観察によって判定できる。好ましい実施態様では、植物の高さ又は重量、又は高さ及び重量はコントロール植物と実質的に同じである。別の好ましい実施態様では、コントロールと比較して植物の収集乾燥葉で有意な相違は見出されず、NtMRP転写物の調節は乾燥バイオマスに対して統計的に相関する影響を与えないことを示唆している。
本開示はまた、変異体植物、天然に存在しない植物、ハイブリッド植物若しくはトランスジェニック植物又は前記の部分に由来する再生可能細胞の組織培養を提供し、前記培養は、親の形態学的及び生理学的特徴の全てを発現できる植物を再生する。前記再生可能細胞には、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、根、根端、葯、花及びその部分、胚珠、シュート、茎、軸、髄及びさく果、又は前記に由来するカルス若しくはプロトプラストが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
いくつかの実施態様では、NtMRPポリヌクレオチドの発現が調節される(例えば低下又は阻害される)植物では、重金属(例えばカドミウム)の特に葉におけるレベルが低下し得る。カドミウムレベルは、NtMRPポリヌクレオチドの発現が調節されていない(例えば低下していないか又は阻害されていない)対応するコントロール植物のカドミウムレベルと比較して、少なくとも約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%又はそれより多く、例えば100%、125%、150%若しくは200%又はそれより多く低下し得る。いくつかの実施態様では、NtMRPポリヌクレオチドの発現が調節(例えば低下又は阻害)される植物では、根のカドミウムレベルが増加又は低下し得る。いくつかの実施態様では、NtMRPポリヌクレオチドの発現が調節(例えば低下又は阻害)される植物では、根のカドミウムレベルは増加又は低下し、葉のカドミウムレベルは低下し得る。いくつかの実施態様では、NtMRPポリヌクレオチドの発現が調節(例えば低下又は阻害)される植物では、収穫できるバイオマスのカドミウムレベルは低下し得る。
変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックな植物の集団を、所望の特質を有する集団のメンバーについてスクリーニング又は選別できる。例えば、単一の形質転換事象を有する子孫の集団を、所望レベルのNtMRPポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現を有する植物についてスクリーニングできる。物理的及び生化学的方法を用いて、発現レベルを同定することができる。これらの方法には以下が含まれる:ポリヌクレオチドの検出にはサザン分析又はPCR増幅;RNA転写物の検出にはノザンブロット、S1 RNase保護、プライマー伸長又はRT-PCR増幅ポリペプチド及びポリヌクレオチドの;酵素又はリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ;並びにポリペプチドを検出するためのタンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット、免疫沈澱及び酵素結合免疫アッセイ。他の技術(例えばin situハイブリダイゼーション、酵素染色及び免疫染色)もまた、ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの存在又は発現の検出に用いることができる。
細胞又は培養組織が形質転換のレシピエント組織として用いられる場合は、所望するならば当業者に公知の技術によって形質転換細胞から植物を再生できる。
適切なプロモーターには、種々の組織又は細胞タイプに存在するか(例えば根特異的プロモーター、シュート特異的プロモーター、木部特異的プロモーター)、又は種々の発育段階で存在するか、又は種々の環境条件に応答して存在する組織特異的因子によって認識される組織特異的プロモーターが含まれる。適切なプロモーターには、特異的な誘導剤を要求することなくほとんどの細胞タイプで活性化され得る構造性プロモーターが含まれる。NtMRP RNAiポリペプチド生成の制御に適切なプロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス35S(CaMV/35S)、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos又はユビキチン-若しくはファセオリン-プロモーターが含まれる。当業者は極めて多様な組換えプロモーターを作製できる。
適切な葉特異的プロモーターには、C4植物(トウモロコシ)由来のピルベート、オルトホスフェートジキナーゼ(PPDK)プロモーター、トウモロコシのcab-m1Ca+2プロモーター、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のmyb関連遺伝子プロモーター(Atmyb5)、リブロースビホスフェートカルボキシラーゼ(RBCS)プロモーター(例えば、葉及び光の下で生育させた苗で発現されるトマトのRBCS1、RBCS2及びRBCS3A、生育中のトマトの果実で発現されるRBCS1及びRBCS2、又は高レベルで葉身及び葉鞘の葉肉細胞でもっぱら発現されるリブロースビホスフェートカルボキシラーゼプロモーター)が含まれる。
誘導性プロモーターの例には、病原体の攻撃、嫌気性条件、温度上昇、光、乾燥、低温又は高塩濃度に応答するプロモーターが含まれる。病原体誘導プロモーターには、病原体による感染に続いて誘導される発病関連タンパク質(PRタンパク質)(例えばPRタンパク質、SARタンパク質、β-1,3-グルカナーゼ、キチナーゼ)に由来するものが含まれる。
植物プロモーターに加えて、他の適切なプロモーターは細菌起源から誘導され得るか(例えばオクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター及びTiプラスミド由来の他のプロモーター)、又はウイルスプロモーターから誘導され得る(例えばカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35S及び19S RNAプロモーター、タバコモザイクウイルスの構造性プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)19S及び35Sプロモーター、又はゴマモザイクウイルス35Sプロモーター)。
非限定的な成分の例には以下が含まれる(ただしこれらに限定されない):抗体、ポリペプチド、脂質成分、例えばコレステロール成分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル-s-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロール又はトリエチルアンモニウム1-ジ-o-ヘキサデシル-rac-グリセロ-S-h-ホスホネート、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル成分、オクタデシルアミン又はヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール成分。
成分は、陽性荷電ポリマー、例えば陽性荷電ペプチド(すなわち例えば長さが約1から50アミノ酸残基)又はポリアルキレンオキシド(例えばポリエチレングリコール(PEG)又はポリプロピレングリコール)であり得る。適切には、陽性荷電ポリマー、例えばポリアルキレンオキシドは、リンカー(例えば離脱可能リンカー)を介してオリゴマーに結合させることができる。
別の実施態様では、ポリペプチドと免疫反応する抗体が本明細書で提供される。本明細書に示されるNtMRPポリペプチド、フラグメント、変種、融合ポリペプチドなどを、それらと免疫反応する抗体の作製に“免疫原”として利用することができる。そのような抗体は、抗体の抗原結合部位を介して当該ポリペプチドと特異的に結合する。特異的に結合する抗体は、NtMRPファミリーポリペプチド、ホモローグ及び変種を特異的に認識しこれと結合するが、他の分子とは結合しないものである。ある実施態様では、抗体は、本明細書に示されるNtMRPアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的であり、他のポリペプチドと交差反応しない。
より具体的には、前記ポリペプチド、フラグメント、変種、融合ポリペプチドなどは、抗体の形成を誘引する抗原決定基又はエピトープを含む。これらの抗原決定基又はエピトープは線状又は構造性(不連続性)のどちらかであり得る。線状エピトープはポリペプチドのアミノ酸のただ1つの断片を含み、一方、構造性又は不連続性エピトープは、ポリペプチドの折り畳みに際して近接するようになったポリペプチド鎖の別個の領域のアミノ酸断片を含む。エピトープは当業界で公知の任意の方法によって同定できる。さらにまた、当該ポリペプチドのエピトープをアッセイにおいて研究用試薬として用い、ポリクローナル血清又は培養ハイブリドーマの上清のような物質から特異的な結合抗体を精製できる。ポリペプチドのそのようなエピトープ又は変種は、当業界で公知の方法、例えば固相合成、ポリペプチドの化学的若しくは酵素的切断、又は組換えDNA技術を用いて作製できる。
抗体はまた、ポリペプチド又はそのフラグメントの存在を検出するアッセイでin vitro又はin vivoで用いることができる。抗体はまた、免疫親和性クロマトグラフィーによるポリペプチド又はフラグメントの精製で利用することができる。
植物の重金属含有量は当業界で公知の多様な方法を用いて測定できる。好ましい方法は、誘導結合プラズマ質量分析法(inductively coupled plasma-mass spectrophotometry,“ICP-MS”)(Agilent 7500A, Agilent Technologies, Palo Alto, CA)の使用を含む。
本明細書に記載する、変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックな植物は、他の使用、例えば農業における使用を有することができる。例えば、変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックな植物を用いて、動物の飼料及び人の食品を製造できる。本明細書に記載の植物の種子を条件付けし、当業界で公知の手段によって包装材中に袋詰めして、製品にすることができる。包装材(例えば紙又は布)は当業界で周知である。種子の包装物は、包装物中の種子の性質を記載したラベル、例えば、包装材にしっかりと固定された付箋又はラベル、包装材に印刷されたラベル又は包装物内に挿入されたラベルを有することができる。
DNAフィンガープリント、一ヌクレオチド多形性、ミクロサテライトマーカー又は類似の技術をマーカー支援選別(MAS)育種プログラムで用いて、本明細書に記載するようにNtMRP遺伝子の変異対立遺伝子を他のタバコに移転させるか又は育種を実施する。例えば、育種者は、農業的に所望される遺伝子型を有する変異対立遺伝子を含む遺伝子型のハイブリダイゼーションから形質分離集団を作出できる。F2又は戻し交雑世代の植物を、NtMRPゲノム配列又はそのフラグメントから開発したマーカーを本明細書に列挙した技術の1つで用いてスクリーニングできる。変異対立遺伝子を所有すると認定された植物を戻し交雑して、スクリーニングするべき第二の集団を作出する。予想される遺伝パターン又は用いられるMAS技術に応じて、所望される個々の植物の認定を支援するために、戻し交雑の各サイクルの前に選択植物を自家受粉させることが必要であるかもしれない。戻し交雑又は他の育種方法は、反復親の所望の表現型が回復するまで繰り返すことができる。
第一の品種の雌性親植物(すなわち種子の親)の自家受粉を防いで第二の品種の雄性親植物の花粉を受け入れ、F1ハイブリッドの種子を前記雌性植物上で形成させることによってハイブリッド品種を作出することができる。雌性植物の自家受粉は、花の発育の初期に花を除雄することによって予防できる。また別には、雄性不稔の1つの型を用いて雌性親植物で花粉形成を妨げてもよい。例えば、雄性不稔は、細胞質雄性不稔(CMS)、又はトランスジェニック雄性不稔(トランスジーンが小胞子形成及び/又は花粉形成を阻害する)、又は自家不和合性によって生じ得る。CMSを含む雌性親植物は特に有用である。雌性親植物がCMSである実施態様では、繁殖能力を有する雄性親から花粉を採集してCMS雌性親植物の柱頭に手で塗布し、生じたF1種子を採集する。
変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックな植物の集団を、所望の特質又は表現型を有する集団メンバーについてスクリーニング又は選別することができる。例えば、単一の形質転換事象からの子孫集団を、NtMRPポリペプチド又はポリヌクレオチドの所望の発現レベルを有する植物についてスクリーニングできる。物理的及び生化学的方法を用いて発現レベルを同定できる。これらの方法には以下が含まれる:ポリヌクレオチドの検出にはサザン分析又はPCR増幅;RNA転写物の検出にはノザンブロット、S1 RNase保護、プライマー伸長又はRT-PCR増幅;ポリペプチド及びポリヌクレオチドの酵素又はリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ;並びにポリペプチドを検出するためのタンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット、免疫沈澱及び酵素結合免疫アッセイ。他の技術(例えばin situハイブリダイゼーション、酵素染色及び免疫染色)もまた、ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの存在又は発現の検出に用いることができる。
NtMRPの発現は、RT-PCR、ノザンブロット、RNase保護、プライマー伸長、ウェスタンブロット、タンパク質のゲル電気泳動、免疫沈澱、酵素結合免疫アッセイ、チップアッセイ及び質量分析法を含む方法を用いて評価できる。あるポリペプチドが組織優先性プロモーター又は広範囲に発現されるプロモーターの制御下で発現される場合には、発現は全植物又は選択組織で評価できることは特記されるべきでである。同様に、ポリペプチドが特定の期間、例えば発育の特定時期に又は誘導に際して発現される場合は、発現は所望の期間に選択的に評価できる。
最後の戻し交雑世代を自殖させ、移転させるポリヌクレオチドのために純粋な育種子孫を提供することができる。生じた植物は、一般的には、移転される特質(例えば1つ以上の単一遺伝子の特質)に加えて、変異体の天然に存在しない又はトランスジェニックな植物の形態学的及び生理学的性状の本質的に全てを有する。正確な戻し交雑プロトコルは変異させる特質に左右され、適切な試験プロトコルが決定されるであろう。移転させる特質が優性対立遺伝子であるとき戻し交雑の方法は単純化されるが、劣性対立遺伝子もまた移転させることができる。この場合には、子孫の試験を導入して、所望の特質の移転が成功したか否かを決定する必要があるかもしれない。
そのような植物(特にタバコの植物)の部分、より具体的にはタバコの植物の葉身及び中肋は、多様な消耗品の製造に取り込まれるか又は使用され得る。前記消耗品には、エーロゾル形成物質、エーロゾル形成装置、喫煙物品、喫煙系物品、無煙製品及びタバコ製品が含まれるが、ただしこれらに限定されない。エーロゾル形成物質には、タバコ組成物、タバコ、タバコ抽出物、カットフィラー、養生タバコ、エキスパンドタバコ、ホモジェネートタバコ、再構成タバコ及びパイプタバコが含まれるが、ただしこれらに限定されない。喫煙物品及び喫煙系物品はエーロゾル形成装置タイプである。喫煙物品又は喫煙系物品には、紙巻きタバコ、細葉巻及び葉巻が含まれるが、ただしこれらに限定されない。無煙製品の例はかみタバコ及びかぎタバコを含む。燃焼させるのではない、ある種のエーロゾル形成装置では、タバコ組成物又は別のエーロゾル形成物質が1つ以上の電気的加熱エレメントによって加熱されエーロゾルを生じる。別のタイプの加熱エーロゾル形成装置では、エーロゾルは、燃焼性燃料エレメント又は熱源から物理的に分離されてあるエーロゾル形成物質へと熱を移転させることによって生じ、前記は熱源内、熱源周囲又は熱源の下流に局在し得る。無煙タバコ製品及び多様なタバコ含有エーロゾル形成物質は任意の形態でタバコを含むことができる。前記形態には、乾燥粒子、細片、顆粒、粉末又はスラリーが含まれ、それらは任意の形式で、例えばフレーク、フィルム、タブ、フォーム又はビーズ上に沈積されるか、その中に混合されるか、それらによって取り巻かれてあるか、或いは他の成分と一緒に結合されてある。本明細書で用いられるように、“煙”という用語は、喫煙物品(例えば紙巻きタバコ)によって、又はエーロゾル形成物質を燃焼させることによって生じるエーロゾルタイプを言う。
別の実施態様では、タバコ含有エーロゾル形成物質を含むタバコ製品が記載され、前記エーロゾル形成物質は、好ましくは本明細書に記載の変異体のタバコの植物、トランスジェニックなタバコの植物又は天然に存在しないタバコの植物に由来する葉(好ましくは養生された葉)を含む。本明細書に記載のタバコ製品は、未改変タバコをさらに含むブレンドタバコ製品でもよい。
変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックな植物は他の使用(例えば農業における使用)を有する。例えば、本明細書に記載の変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックな植物を用いて動物の飼料又は人の食品を製造できる。
同定、選別又は育種のために植物を遺伝型に分類するための組成物、方法及びキットは本開示に包含され、前記は、ポリヌクレオチドサンプル中のNtMRPポリヌクレオチドの存在を検出する手段を含むことができる。したがって、NtMRPポリヌクレオチドの少なくとも一部分を特異的に増幅させるための1つ以上のプライマー、及び場合によって増幅又は検出を実施するための1つ以上のプローブ又は1つ以上の試薬を含む組成物が記載される。
本発明はさらに以下の実施例で説明されるであろう(前記実施例は、特許請求の範囲に開示する本発明の範囲を制限しようとするものではない)。
実施例
以下の実施例は例示として提供され限定として提供されるものではない。特段の指示がなければ、分子生物学、植物生物学、バイオインフォーマティクス及び植物育種の通常的技術並びに方法が用いられる。
タバコBACライブラリー
細菌人工染色体(BAC)ライブラリーを以下のように調製する:ニコチアナ・タバクムの品種ヒックスブロードリーフ(Hicks Broad Leaf)の温室生育植物の葉から核を単離する。標準的方法にしたがって前記核から高分子量DNAを単離し、BamHI及びHindIIIで部分的に消化し、BACベクターpINDIGO5のBamHI又はHindIII部位でクローニングする。タバコのゲノムの約9.7倍をカバーする135メガ塩基対の平均挿入物長を含む320,000を超えるクローンを入手する。
タバコゲノム配列のアッセンブリー
ランダムに採取した多数のBACクローンをサンガーの方法を用いて塩基配列決定に付し、平均の長さが550塩基対の1,780,000を超える未加工配列が得られる。メチルフィルタリングは、形質転換に大腸菌Mcr+株を用い低メチル化DNAを単離することによって適用される。CELERAゲノムアッセンブラーを用いて全ての配列をアッセンブリングして、200,000を超えるコンティーグ及び596,970の単一配列を含む800,000を超える配列を得る。コンティーグのサイズは120から15,300塩基対で、平均の長さは1,100塩基対である。NtMRP3 DNAのゲノム配列は、NtMRP3 DNAを含むゲノムの部分を含むBACの塩基配列決定によって同定される。
タバコの種子を滅菌し、5mL/Lの植物保存混合物(plant preservative mixture, PPM)を補充したMS基礎培地を含むペトリ皿で発芽させる。苗(発芽後7から10日後)を種々のNtMRP3 RNAi発現ベクターによる形質転換のために選別する。アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404の単一コロニーを、50mg/Lのカナマイシン(カナマイシンモノスルフェート)を含むLB液体培地に接種し、28℃で48時間レシプロカル振盪(150回/分)によりインキュベートする。遠心分離(6000xg、10分)によって培養細胞を収集し、20g/Lのシュクロースを含む20mLのMS液体培地に最終密度0.4−0.7 OD600で懸濁させる。7−10日の苗のエクスプラントを細菌懸濁物に5分間浸漬し、無菌ろ紙上で液体を吸い取る。50のエクスプラントを100mmx20mmのペトリ皿中の40mLアリコットのREG寒天培地(0.1mg/Lの1-ナフタレン酢酸(NAA)及び1mg/Lのベンジルアミノプリン(BAP)を補充したMS基礎培地)に置く。前記エクスプラントをアグロバクテリウムと一緒に25℃で共培養する。共培養の3日後、エクスプラントを洗浄し、RCRK培地(100mg/Lのカナマイシン、500mg/Lのカルベニシリン及び5mLのPPMを含むREG培地)に移して形質転換体を選別する。エクスプラントは2週間毎に継代培養する。選択的条件下で生育させて8−12週間後、生存植物(NtMRP3 RNAi発現構築物をそのゲノムに組み込まれた形質転換体を表す)を発根培地(100mg/Lのカナマイシンを補充したMS基礎培地)に移す。発根植物を鉢に移し更なる生育を促す。
NtMRP3ポリヌクレオチドの発現を決定するために、全細胞RNAを植物の多様な部分から単離する。全RNAは、TRI(商標)試薬(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を用いて単離する。DNA不純物を除去するために、精製RNAをRNaseフリーDNase(TURBO DNA-free, Ambion, Austin TX)で処理する。第一のcDNA鎖を合成するために、ハイキャパシティcDNAアーカイブキット(High Capacity cDNA Archive Kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて、約10μgの全RNAを逆転写する。サンプル中のNtMRP3転写物レベルを測定するために、定量的2-工程RT-PCRをタックマンMGBプローブ依存化学反応にしたがって実施する。RT混合物は以下を含む:4μM dNTPミックス、1xランダムプライマー、1xRT緩衝液、10g cDNA、500Uマルチスクライブ(Multiscribe)逆転写酵素(Applied Biosystems)、2U Superase-In RNase阻害剤(Ambion)及びヌクレアーゼフリー水。PCR混合物は以下を含む:1xタックマン(Taqman)ユニバーサルマスターミックス(Applied Biosystems, Foster City, CA)、400nMフォワードプライマー、400nMリバースプライマー、250nMタックマンMGBプローブ、2ngのcDNA及びヌクレアーゼフリー水。RT-PCRは、ABI7500リアルタイムシステム(Applied Biosystems, Foster City, CA)を用い、以下の増幅条件下で実施する:50℃で2分、95℃で10分、95℃で15秒の40サイクル、及び60℃で1分。
仮定的NtMRP3転写物をコードする第一の部分的配列がタバコゲノムイニシアチブ(Tobacco Genome Initiative, TGI)の注釈を用いて見出される。この具体的配列から、プライマーを作製し、RNAiのアプローチを用いてタバコにおけるNtMRP3ポリヌクレオチドをサイレンシングする。対応するNtMRP3 RNAi配列をcDNAからRT-PCRにより増幅させ、続いてゲートウェーベクターpB7GWIWG2(II)に、製造業者(Invitrogen)の説明にしたがって正確に挿入する。このベクターは、植物の全組織でのトランスジーンの構造的発現のためのプロモーター(カリフラワーモザイクウイルスCaMV 35Sプロモーター)及び寒天プレートでのBasta(30mg/mL)による農薬選別のためのbar遺伝子を含んでいる。続いて古典的リーフディスク方法を用い、この構築物をアグロバクテリウム・ツメファシエンスによりバーリータバコKY14のゲノムに挿入する。カルスから、個々の系統を再生し、Basta上で選別する。続いてRNAiサイレンシング系統をRT-PCRによってモニターし、種子の産出のために生育させる。T1種子を収集し、選別のためにBasta含有寒天プレートで再度生育させ、野外で栽培する前に耐性植物を浮遊トレイで増殖させる。
約500mgの植物を量り分け、マイクロウェーブ加速反応系5消化系(CEM corporation, Mathews, NC)によって10mLの濃縮HNO3中で消化する。重金属濃度は、誘導結合プラズマ質量分析法(“ICP-MS”)(Agilent 7500A, Agilent Technologies, Palo Alto, CA)を用いて分析する。非トランスジェニックタバココントロールとして、品質保証(polish-certified)バージニアタバコの葉、CTA-VTL-2から成るサンプルを類似の条件下で調製する。
NtMRP4 DNAのゲノム配列は、NtMRP4 DNAを含むゲノムの部分を含むBACの塩基配列決定によって同定される。配列は図1に示される。
タバコの種子を滅菌し、5mL/Lの植物保存混合物(PPM)を補充したMS基礎培地を含むペトリ皿で発芽させる。苗(発芽後7から10日後)を種々のNtMRP4 RNAi発現ベクターによる形質転換のために選別する。アグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404の単一コロニーを、50mg/Lのカナマイシン(カナマイシンモノスルフェート)を含むLB液体培地に接種し、28℃で48時間レシプロカル振盪(150回/分)によりインキュベートする。遠心分離(6000xg、10分)によって培養細胞を収集し、20g/Lのシュクロースを含む20mLのMS液体培地に最終密度0.4−0.7 OD600で懸濁させる。7−10日の苗のエクスプラントを細菌懸濁物に5分間浸漬し、無菌ろ紙上で液体を吸い取る。50のエクスプラントを100mmx20mmのペトリ皿中の40mLアリコットのREG寒天培地(0.1mg/Lの1-ナフタレン酢酸(NAA)及び1mg/Lのベンジルアミノプリン(BAP)を補充したMS基礎培地)に置く。前記エクスプラントをアグロバクテリウムと一緒に25℃で共培養する。共培養の3日後、エクスプラントを洗浄し、RCPK培地(100mg/Lのカナマイシン、500mg/Lのカルベニシリン及び5mLのPPMを含むREG培地)に移して形質転換体を選別する。エクスプラントは2週間毎に継代培養する。選択的条件下で生育させて8−12週間後、生存植物(NtMRP4 RNAi発現構築物をそのゲノムに組み込まれた形質転換体を表す)を発根培地(100mg/Lのカナマイシンを補充したMS基礎培地)に移す。発根植物を鉢に移し更なる生育を促す。
NtMRP4ポリヌクレオチドの発現を決定するために、全細胞RNAを植物の多様な部分から単離する。全RNAは、TRI(商標)試薬(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を用いて単離する。DNA不純物を除去するために、精製RNAをRNaseフリーDNase(TURBO DNA-free, Ambion, Austin TX)で処理する。第一のcDNA鎖を合成するために、ハイキャパシティcDNAアーカイブキット(Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて、約10μgの全RNAを逆転写する。サンプル中のNtMRP4転写物レベルを測定するために、定量的2-工程RT-PCRをタックマンMGBプローブ依存化学反応にしたがって実施する。RT混合物は以下を含む:4μM dNTPミックス、1xランダムプライマー、1xRT緩衝液、10g cDNA、500Uマルチスクライブ逆転写酵素(Applied Biosystems)、2U Superase-In RNase阻害剤(Ambion)及びヌクレアーゼフリー水。PCR混合物は以下を含む:1xタックマンユニバーサルマスターミックス(Applied Biosystems, Foster City, CA)、400nMフォワードプライマー、400nMリバースプライマー、250nMタックマンMGBプローブ、2ngのcDNA及びヌクレアーゼフリー水。RT-PCRは、ABI7500リアルタイムシステム(Applied Biosystems, Foster City, CA)を用い、以下の増幅条件下で実施する:50℃で2分、95℃で10分、95℃で15秒の40サイクル、及び60℃で1分。
NtMRP4ポリヌクレオチドは、花弁、雄しべ、雌しべ、萼片、さく果、茎、葉及び根由来のcDNAを用いたRT-PCRで決定したとき、タバコの組織で発現される。タバコの植物を水耕栽培溶液で栽培するとき、NtMRP4ポリヌクレオチドの発現は、N.タバクムの根及び葉の両幼植物体でカドミウムによってわずかにアップレギュレートされる(TN90、図2参照)。しかしながら、NtMRP4ポリヌクレオチドはN.ルスチカの葉でも誘導されることが見出されたが、N.タバクムと比較して反対のデータ(ダウンレギュレーション)がN.ルスチカの根で観察され、したがってNtMRPポリヌクレオチドは、N.ルスチカにおける根のカドミウム蓄積及び高いカドミウム寛容に役割を果たす可能性が示唆される。
仮定的NtMRP4転写物をコードする第一の部分的配列(CHO_SL022xb24f1.ab1)がタバコゲノムイニシアチブ(TGI)の注釈を用いて見出される。この具体的配列から、プライマーを作製し、RNAiのアプローチを用いてタバコにおけるNtMRP4ポリヌクレオチドをサイレンシングする(図1)。対応するNtMRP4 RNAi配列をcDNAからRT-PCRにより増幅させ、続いてゲートウェーベクターpB7GWIWG2(II)に、製造業者(Invitrogen)の説明にしたがって正確に挿入する。このベクターは、植物の全組織でのトランスジーンの構造的発現のためのプロモーター(カリフラワーモザイクウイルスCaMV 35Sプロモーター)及び寒天プレートでのBasta(30mg/mL)による農薬選別のためのbar遺伝子を含んでいる。続いて古典的リーフディスク方法を用い、この構築物をアグロバクテリウム・ツメファシエンスによりバーリータバコKY14のゲノムに挿入する。カルスから、個々の系統を再生し、Basta上で選別する。続いてRNAiサイレンシング系統をRT-PCRによってモニターし、種子の産出のために生育させる。図3は、NtMRP4サイレンシングはトランスジェニック系統(系統1及び2を含む)で有効であることを示す。T1種子を収集し、選別のためにBasta含有寒天プレートで再度生育させ、野外で栽培する前に耐性植物を浮遊トレイで増殖させる。
約500mgの植物を量り分け、マイクロウェーブ加速反応系5消化系(CEM corporation, Mathews, NC)によって10mLの濃縮HNO3中で消化する。重金属濃度は、誘導結合プラズマ質量分析法(“ICP-MS”)(Agilent 7500A, Agilent Technologies, Palo Alto, CA)を用いて分析する。非トランスジェニックタバココントロールとして、品質保証(polish-certified)バージニアタバコの葉、CTA-VTL-2から成るサンプルを類似の条件下で調製する。
図4は、2年連続の2つの連続野外実験で試験した2つのNtMRP4 RNAi系統(系統1及び2)における20%近い葉のカドミウム低下を示す。各事例で、実験ユニットは、ブロック内で任意抽出した、4つの収集植物(2年目の野外実験における野生型、系統1及び2、並びにベクターコントロール植物)のそれぞれ独立した4組から成る。さらにまた、空間的傾向を管理するためにコントロールサンプルがブロックに加えられる。NtMRP4 RNAi系統の解析によって、平均カドミウムレベルの低下における強力で統計的に有意な影響が明示される。
NtMRP4サイレンシング系統の高さ及び重量は、コントロール植物と比較してわずかに影響を受ける。しかしながら、NtMRP4 RNAi植物と野生型又はベクターコントロールとの間で有意な相違は乾燥収集葉では見出されず、したがって、NtMRP4転写物の分解は乾燥バイオマスに関して統計的に影響を与えないことを示している。これらのデータは、同じタバコのバックグラウンド(KY14)のATMRP4(NtMRP4ポリヌクレオチドと相同)の過剰発現は葉の10−30%高いカドミウム蓄積をもたらす(トランスジェニック系統に左右される)ことを示す別の野外実験によって確認される。NtMRP4タンパク質をコードするmRNAの分解はタバコの葉のカドミウムレベルを顕著に低下させることは明白である。
エチルメタンスルホネートに(EMS)に曝露したニコチアナ・タバクムの植物からDNAライブラリーを作製し、NtMRP4ポリヌクレオチドのエクソン1及びエクソン2の変異体について、個々の植物のNtMRP4遺伝子の関連する部分の塩基配列決定によってスクリーニングする。
エクソン1については、
NtMRP4Exon1FW(5’-CATCTCCTTACGAAGGATACTACC-3’)及び
NtMRP4Exon1REV(5’-GCTGCAAGCTCTCCTTTTCTAA-3’)を塩基配列決定のために用い、
エクソン2については、
NtMRP4Exon2FW(5’-GTGCAATCTGGCAAATATAGTGAG-3’)及び
NtMRP4Exon2REV(5’-AAAATGACATAGGAGCATGCAGTA-3’)を塩基配列決定のために用いる。
NtMRP4ポリヌクレオチドのエクソン1及びエクソン2について見出された全ての変異体の概要は表1に提示される。最初のコドン(元コドン)及び変異コドン(変コドン)が最初のアミノ酸(元AS)及びアミノ酸置換(変AS)又は停止コドンとともに示される。
本実施例は、ある遺伝子配列内の固有の標的部位の存在をあるゲノムデータベースと比較してスクリーニングし遺伝子の発現を改変するツールを開発するために、NtMRP4遺伝子の検索の仕方を示す。本開示の方法(下記に開示する方法を含む)によって同定された標的部位、配列モチーフ、及び植物(例えばタバコ)中の対応する遺伝子の改変における部位又はモチーフの任意の使用が本開示に包含される。
検索アルゴリズム
あるスペーサーサイズによって分離されている2つの固定長のサブストリングDNAモチーフの存在について入力クェリー(標的)ヌクレオチド配列(例えば実施例1のタバコゲノム配列アッセンブリー)をDNAデータベース内の付加配列を用いてスクリーニングすることを可能にするコンピュータープログラムを開発する。付加配列の構築及び検索は、公開libdivsufsortライブラリー2.0.0(http://code.google.com/p/libdivsufsort/)を使用する(前記は任意の入力ストリングをBurrow-Wheeler転換ストリングに直接変換する)。このプログラムは、全入力(標的)ヌクレオチド配列をスキャンし、選択した回数より少ない回数で選択データベースにおいて発生する全てのサブストリングの組合せを答える。
クェリー配列のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入標的部位の選別
ジンクフィンガーDNA結合ドメインは3塩基対のヌクレオチド配列を認識する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、1、2、3、4、5、6、又は7つ以上のジンクフィンガーDNA結合ドメインを含むジンクフィンガータンパク質及びIIS型制限酵素の非特異的ヌクレアーゼを含む。ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、二本鎖ブレークを標的配列に導入できる。二本鎖ブレークの導入のために、1対のジンクフィンガーヌクレアーゼ(そのうちの1つは標的配列のプラス(上方)鎖と結合し、他方は同じ標的配列のマイナス(下方)鎖(0、1、2、3、4、5、6、6、又は7以上のヌクレオチドによって分離されてある)と結合する)が要求される。2つの固定長のサブストリングDNAモチーフの各々について3つのうちの2つ以上を用いることによって、このプログラムをあるスペーサーの長さによって分離された2つのジンクフィンガータンパク質標的部位の同定に用いることができる。
プログラム入力
1.標的クェリーDNA配列
2.検索するべきDNAデータベース
3.第一のサブストリングDNAモチーフの固定サイズ
4.スペーサーの固定サイズ
5.第二のサブストリングDNAモチーフの固定サイズ
6.プログラム入力2の選択データベースにおけるプログラム入力4によって分離されたプログラム入力3及び5の組合せの存在の閾数
プログラム出力
1.各配列について、当該配列が最大でプログラム入力6の閾値でDNAデータベースに出現する回数を含むヌクレオチド配列リスト
タバコのエクソンアレイの開発及び解析:実施例1に記載したように入手したBACクローンを用いて、1,272,342のエクソンをタバコのESTデータ及びBAC塩基配列決定により入手したメチルフィルタリング実施配列を組合せ比較することによって同定する。これらのエクソンの各々について、4つの25-merオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてタバコのエクソンアレイを構築する。エクソンアレイは、標準的プロトコルを用いてアフィメトリクス(Affymetrix, Santa Clara, USA)によって作製する。
タバコにおけるNtMRP3及びNtMRP4の発現:Cd+(Cd汚染)及びCd-(Cd欠乏)土壌で生育させたニコチアナ種からRNAを単離し、標準的ハイブリダイゼーションプロトコル及び解析ツールを用いて解析する。Cd蓄積関連遺伝子を同定し、さらにNtMRP3及びNtMRP4転写物の多様性における土壌のCdの影響を決定するために、発現プロフィールを決定する。用いたNtMRP3及びNtMRP4プローブは、3’UTR領域とともに最初と最後のエクソンに局在する。
表2に示した結果は、Cd汚染土壌で生育させたN.タバクム植物の葉は、同じ土壌で生育させたN.ルスチカよりも多くのCdを蓄積することを示す。N.タバクム植物の根はN.ルスチカの根より少ないCd蓄積を示す。興味深いことには、NtMRP3及びNtMRP4はともにCdによって調節されるわけではないが、それらの発現は2つのニコチアナ種で異なり、両方の遺伝子は、ニコチアナ取得物におけるCd取り込み、移転及び蓄積を様々に駆動することを示唆している(データは3つの生物学的複製の平均に対応するlog2で示される)。コントロールとして、3つのハウスキーピング遺伝子(UBP12、エクソン1及び2)、α-チューブリン及びリボソームタンパク質S16の発現が示される。
本明細書に引用または記載した刊行物はいずれも本出願の出願日前に開示された関連情報を提供する。本明細書における記載は、本発明者らがそのような開示に先行する資格がないことを容認するものと解されるべきではない。上記明細書に記載した全ての刊行物は参照により本明細書に含まれる。本発明の範囲を逸脱しない本開示の多様な改変及び変型は当業者には明白であろう。本発明は特定の好ましい実施態様に関連して記載してきたが、特許請求の範囲で請求される本発明は、そのような特定の実施態様に全く制限されないことは理解されるべきである。実際、本発明を実施するために記載した態様の多様な改変(それらは細胞生物学、分子生物学及び植物生物学又は関連分野の業者にとって明白である)は特許請求の範囲内であることが意図されている。
Claims (15)
- 以下を含む、変異体の、天然に存在しない若しくはトランスジェニックな植物又は植物細胞:
(a)以下から成る群から選択されるポリヌクレオチド:
(i)配列番号:1、2、27、28若しくは29又は51と少なくとも71%の配列同一性を有する配列を含むか、前記から成るか又は本質的に前記から成るポリヌクレオチド;又は
(ii)配列番号:3から23又は30から50又は53のいずれかと少なくとも65%の配列同一性を有する配列を含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成るポリヌクレオチド;又は
(iii)配列番号:24から26又は52のいずれかと少なくとも65%の配列同一性を有する配列を含むか、前記から成るか又は本質的に前記から成るNtMRPポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、当該ポリペプチドが重金属輸送因子活性を有する前記ポリヌクレオチド;又は
(b)配列番号:1から23又は27から51又は53のいずれかの1つの領域と少なくとも65%同一である、連続する長さが少なくとも15ヌクレオチドのポリヌクレオチド構築物
(c)互いに少なくとも部分的に相補性である少なくとも2つの配列を含む二本鎖RNAであって、センス鎖が第一の配列を含み、アンチセンス鎖が第二の配列を含み、さらに当該配列の少なくとも1つがNtMRP RNAの連続する少なくとも10ヌクレオチドを含む、前記二本鎖RNA;又は
(d)(i)、(ii)又は(iii)に示すポリヌクレオチド又は(b)に示すポリヌクレオチド構築物を含む発現ベクター。 - 変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックな植物であって、NtMRPポリヌクレオチドの発現及びそれによってコードされるタンパク質の活性、又はそれによってコードされるタンパク質の活性が低下し、さらに前記植物の葉が、NtMRPの発現及びそれによってコードされるタンパク質の活性、又はそれによってコードされるタンパク質の活性が低下していないコントロール植物と比較して少なくとも5%のカドミウム含有量の低下を有する、前記植物。
- 請求項1又は2に記載の植物に由来する細胞又は組織を含むバイオマス、種子又は葉を含む植物材料。
- 請求項1又は2に記載の植物の一部分又は請求項3に記載の植物材料を含むタバコ製品。
- NtMRPポリヌクレオチドの発現及びそれによってコードされるタンパク質の活性、又はそれによってコードされるタンパク質の活性を、NtMRPポリヌクレオチドの発現及びそれによってコードされるタンパク質の活性、又はそれによってコードされるタンパク質の活性が低下していないコントロール植物と比較して低下させる工程を含む、少なくとも植物の一部分でカドミウムレベルを低下させる方法。
- 請求項5に記載の方法によって入手された又は入手できる変異体の、天然に存在しない又はトランスジェニックな植物であって、NtMRPポリヌクレオチドの発現及びそれによってコードされるタンパク質の活性、又はそれによってコードされるタンパク質の活性が低下していないコントロール植物と比較して、当該植物の少なくとも一部分で少なくとも約5%のカドミウム含有量の低下が存在する、前記植物。
- (i)配列番号:1、2、27、28若しくは29又は51と少なくとも71%の配列同一性を有する配列を含むか、前記から成るか又は本質的に前記から成るポリヌクレオチド;又は
(ii)配列番号:3から23又は30から50又は53のいずれかと少なくとも65%の配列同一性を有する配列を含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成るポリヌクレオチドから成る群から選択されるポリヌクレオチドによって発現される単離NtMRPポリペプチド、又は
配列番号:24から26又は52のいずれかに示す配列を含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成る単離NtMRPポリペプチドであって、当該ポリペプチドが重金属輸送因子活性を有する、前記ポリペプチド。 - 請求項7に記載の単離ポリペプチドと特異的に結合する抗体。
- 以下の工程を含む、サンプル中のNtMRPポリヌクレオチドを検出する方法:
(a)ポリヌクレオチドを含むサンプルを提供する工程;
(b)NtMRPポリヌクレオチドの少なくとも一部分を特異的に検出する、1つ以上のプライマー又は1つ以上のプローブと前記サンプルを接触させる工程;及び
(c)増幅生成物の存在を検出する工程、ここで増幅生成物の存在はサンプル中のNtMRPポリヌクレオチドの存在の指標である。 - 以下から成る群から選択される単離ポリヌクレオチド:
配列番号:1、2、27、28若しくは29又は51と少なくとも71%の配列同一性を有する配列を含むか、前記から成るか又は本質的に前記から成る単離ポリヌクレオチド;
配列番号:3から23又は30から50又は53のいずれかと少なくとも65%の配列同一性を有する配列を含むか、前記から成るか、又は本質的に前記から成る単離ポリヌクレオチド;
配列番号:24から26又は52のいずれかと少なくとも65%の配列同一性を有する配列を含むか、前記から成るか又は本質的に前記から成るNtMRPポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、当該ポリペプチドが重金属輸送因子活性を有する前記ポリヌクレオチド。 - 配列番号:1から23又は27から51又は53のいずれかの1つの領域と少なくとも65%同一である、連続する長さが少なくとも15ヌクレオチドのポリヌクレオチド構築物。
- 少なくとも部分的に互いに相補性である少なくとも2つの配列を含む二本鎖RNAであって、センス鎖が第一の配列を含み、アンチセンス鎖が第二の配列を含み、さらに当該配列の少なくとも1つがNtMRP RNAの連続する少なくとも10ヌクレオチドを含む前記二本鎖RNA。
- NtMRP3又はNtMRP4の少なくとも10ヌクレオチドと少なくとも65%の配列同一性を有する第一の配列;第二の配列;及び第一の配列の逆相補性配列を有し、第一の配列と同じ向きに配置された第三の配列を含む、請求項12に記載の二本鎖RNAであって、第二の配列が第一の配列と第三の配列との間に配置され、さらに第二の配列が、第一の配列及び第三の配列と作動できるように連結される、前記二本鎖RNA。
- 第一の配列が、配列番号:3から23及び30から50及び53から成る群から選択される配列と少なくとも65%の配列同一性を有し、及び/又は第三の配列が、配列番号:3から23及び30から50及び53と一致する配列の逆相補鎖と少なくとも65%の配列同一性を有する、請求項12又は13に記載の二本鎖RNA。
- 請求項10に記載の単離ポリヌクレオチド又は請求項11に記載のポリヌクレオチド構築物を含む発現ベクター。
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