MX2013002504A - Reduccion de metal pesado en plantas. - Google Patents

Reduccion de metal pesado en plantas.

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Abstract

Se describe una planta transgénica de existencia natural, mutante o célula de planta que comprende (a) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de: (i) un polinucleótido que comprende, que consiste de o que consiste esencialmente de una secuencia que tiene al menos 71% de secuencia de identidad de SEC ID NOs: 1, 2, 27, 28 o 29 o 51; o (ii) un polinucleótido que comprende, que consiste de o que consiste esencialmente de una secuencia que tiene al menos 65% de identidad de secuencia de SEC ID NOs: 3 a 23 o 30 a 50; o (iii) un polinucleótido que codifica un polipéptido NtMRP que comprende, que consiste de o que consiste esencialmente de una secuencia que tiene al menos 65% de identidad de secuencia a cualquiera de SEC ID NOs: 24 a 26 o 52, y en donde el polipéptido tiene actividad de transportador de metal pesado; o (b) una construcción de polinucleótido de al menos 15 nucleótidos contiguos en longitud que es al menos 65% idéntico a una región de cualquiera de SEC ID NOs: 1 a 23 o 27 a 51; o (c) un ARN de estructura de cadena doble que comprende al menos dos secuencias que son al menos parcialmente complementarias entre sí y en donde una estructura de cadena de sentido comprende una primera secuencia y una estructura de cadena antisentido comprende una segunda secuencia y en donde al menos una de las secuencias comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de NtMRP ARN; o (d) un vector de expresión que comprende el polinucleótido como se establece en (i), (ii) o (iii) o la construcción de polinucleótido como es establece en (b).

Description

REDUCCIÓN DE METAL PESADO EN PLANTAS Campo de la Invención La presente invención se dirige a polinucleótidos y polipéptidos que codifican transportadores ABC que están implicados en el transporte de metales pesados. La presente invención también se dirige a modificar la expresión de los polinucleótidos y polipéptidos en plantas. En particular, la presente invención se refiere a modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión o actividad de uno o más transportadores ABC implicados en el transporte de metales pesados s u bce lu I a res .
Antecedentes de la Invención Las plantas obtienen metales pesados esenciales - tal como zinc y cobre - absorbiendo substratos de ion de metal de su ambiente a través de diversos mecanismos de transporte transmitidos por transportadores de transmembrana expresados en la superficie de células de raíz y otros tejidos vasculares. Un mecanismo utiliza el transporte de toxinas fuera del citosol. Por ejemplo, la familia de la bomba de conjugado-glutationa S es una clase de transportadores de cartucho de enlace ATP (ABC) que es responsable de la eliminación/secuestro de compuestos en plantas, así como células de mamífero y levadura. La estructura molecular y la función de las bombas GS-X codificadas por genes de MRP, cMOAT (transportador de anión multiespecífico canalicular) y YCF1 (factores de cadmio de levadura de mamífero y plantas) parecen haberse conservado a través de la evolución molecular.
Las plantas se exponen a toxinas exógenas - tal como productos microbianos, aleloquímicos, agroquímicos y metales pesados - haciendo a la supervivencia celular dependiente de mecanismos para desintoxicar o reducir la acumulación de estos agentes. Los metales pesados - tal como plomo, cadmio, mercurio, etc. - son tóxicos ambientales importantes, que originan la generación de especies de oxidación reactivas, daño al ADN y desactivación de enzimas mediante el enlace a sitios activos de enzimas en células de organismos vivos. La contaminación ambiental con metales pesados ha incrementado drásticamente debido a la industrialización e incrementa en tamaño de población. Las tierras contaminadas con metales pesados, inhiben el crecimiento anormal de las plantas, y originan la contaminación de productos alimenticios. Muchos metales pesados son muy tóxicos para la salud de los humanos y carcinogénicos en concentraciones bajas.
La reducción en el contenido de metales pesados - tal como cadmio - de plantas o productos de plantas consumidos por animales y humanos, es altamente deseable y urgentemente requerida. Es un objeto de la presente invención satisfacer esta necesidad .
Breve Descripción de la Invención Los aspectos y modalidades de la presente invención, se establecen en las reivindicaciones adjuntas.
En un aspecto, se proporciona un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en: un polinucleótido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia que tiene al menos el 71% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:27 o SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 51; un polinucleótido aislado que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia que tiene al menos el 65% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOs: 3 a 23 o 30 a 50 o 53; un polinucleótido que codifica un polipéptido NtMRP que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia que tiene al menos el 65% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOs: 24 a 26 o 52, y preferentemente, en donde el polipéptido tiene actividad de transporte de metales pesados.
En un aspecto adicional, se proporciona una construcción de polinucleótido de al menos 15 nucleótidos contiguos de longitud, que es al menos el 15% idéntica a una región de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 a 23 o 27 a 51.
En un aspecto adicional, se proporciona un ribopolinucleótido de hebra doble que comprende al menos dos secuencias que son al menos parcialmente complementarias entre sí, y en donde una hebra de sentido comprende una primera secuencia, y una hebra antisentido comprende una segunda secuencia, y en donde al menos una de las secuencias comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de NtMRP ARN.
En forma adecuada, el ARN de hebra doble comprende una primera secuencia que tiene al menos el 65% de identidad de secuencia con al menos 10 nucleótidos de NtMRP ADN; una segunda secuencia; y una tercera secuencia que tiene una secuencia de complementariedad inversa de la primera secuencia, colocada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia se coloca entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia se enlaza en forma operable a la primera secuencia y a la tercera secuencia.
En forma adecuada, la primera secuencia tiene al menos el 65% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12. SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20. SEQ ID NO:21, SEQ ID NO.2 , SEQ ID NO:22, SEQ ID No. 23, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO.36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50 y SEQ ID NO:53.
En forma adecuada, la tercera secuencia tiene al menos el 65% de identidad de secuencia con el complemento inverso de la secuencia correspondiente para SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID No. 23, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50 y SEQ ID NO: 53.
En un aspecto adicional, se proporciona un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado o la construcción de polinucleótido.
En un aspecto adicional, se proporciona una célula de planta mutante, que no tiene origen natural o transgénica que comprende el polinucleótido aislado, la construcción de polinucleótido, el ribopolinucleótido de hebra doble o el vector de expresión.
En un aspecto adicional, se proporciona una planta mutante, que no tiene origen natural o transgénica que comprende la célula de planta mutante, que no tiene origen natural transgénica.
En un aspecto adicional, se proporciona un material de planta que incluye biomasa, semillas u hojas que comprenden células o tejido de la planta.
En un aspecto adicional, se proporciona un producto de tabaco que comprende una parte de la planta o célula de planta o el material de la planta.
En un aspecto adicional, se proporciona una planta mutante, que no tiene origen natural o transgénica, en donde la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta forma, o la actividad de la proteína codificada de esta forma se disminuye, y las hojas de la planta tienen una reducción en el contenido de cadmio de al menos el 5% en comparación con una planta de control en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP, y la actividad de la proteína codificada de esta forma o la actividad de la proteína codificada de esta forma, no ha disminuido.
En un aspecto adicional, se proporciona una biomasa, semilla u hojas que comprenden tejido de la planta.
En un aspecto adicional, se proporciona un método para reducir los niveles de cadmium en al menos una parte de una planta, en donde el método comprende el paso de reducir la expresión de polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta forma, o la actividad de la proteína codificada de esta forma en comparación con una planta de control, en donde la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta forma, o la actividad de la proteína codificada de esta forma no ha sido disminuida.
En un aspecto adicional, se proporciona una planta mutante, que no tiene origen natural o transgénica obtenida o que se puede a través del método aquí descrito, en donde existe una reducción en el contenido de cadmium de al menos aproximadamente el 5% en al menos una parte de la planta, en comparación con una planta de control en donde la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta forma, o la actividad de la proteína codificada de esta forma no ha disminuido.
En un aspecto adicional, se proporciona un polipéptido NtMRP expresado por la secuencia establecida en cualquiera de las SEQ ID NOs: 24 a 26 o SEQ ID NOs:52, preferentemente en donde el polipéptido tiene una actividad de transporte de metales pesados.
En un aspecto adicional, se proporciona un anticuerpo que enlaza específicamente al polipéptido aislado.
En un aspecto adicional, se proporciona un método para detectar un polinucleótido NtMRP en una muestra que comprende el paso de: (a) proporcionar una muestra que comprende un polinucleótido; (b) contactar la muestra con uno o más cebadores o una o más sondas para detectar en forma específica al menos una porción del polinucleótido NtMRP; y (c) detectar la presencia de un producto de amplificación, en donde la presencia de un producto de amplificación indica la presencia del polinucleótido NtMRP en la muestra.
Los aspectos adicionales de la presente invención se establecen a continuación.
Un gen quimérico que comprende el polinucleótido aislado enlazado en forma operable a una o más secuencias reguladoras.
Una construcción de polinucleótido o un ARN de hebra doble de acuerdo con la presente invención, en donde el polinucleótido comprende, consiste o consiste esencialmente en al menos 15 a 30 nucleótidos, 30 a 50 nucleótidos, 50 a 100 nucleótidos, 100 a 150 nucleótidos, 150 a 200 nucleótidos, 200 a 300 nucleótidos, 300 a 400 nucleótidos, 400 a 500 nucleótidos, 500 a 600 nucleótidos o 600 a 700 nucleótidos.
Un conjugado que comprende el polinucleótido aislado, el gen quimérico, la construcción de polinucleótido, o el ARN de hebra doble de acuerdo con la presente invención, y al menos una porción sin nucleótido o sin polinucleótido adherida en forma covalente al mismo.
Una célula de planta muíante, que no tiene origen natural o transgénica que comprende el polinucleótido aislado, el gen quimérico, la construcción de polinucleótido, el ARN de hebra doble, el conjugado o el vector de expresión de acuerdo con la presente invención.
Una planta muíante, que no tiene origen natural o transgénica que comprende la célula de planta mutante, que no tiene origen natural o transgénica de acuerdo con la presente invención.
En forma adecuada, la biomasa seca de las hojas recolectadas es aproximadamente la misma que la planta de control.
La biomasa, semillas u hojas que comprenden el tejido de la planta de la presente invención.
Un producto consumible que incorpora o utiliza biomasa, semilla u hojas de acuerdo con la presente invención.
Biomasa, semilla u hojas de acuerdo con la presente invención o un producto consumible de acuerdo con la presente invención, en donde existe una reducción en el contenido de cadmium de al menos aproximadamente el 5% en comparación con la biomasa, semilla u hojas de una planta de control en donde no ha disminuido la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta forma, o la actividad de la proteína codificada de esta forma.
Una línea celular que comprende el polinucleótido aislado, el gen quimérico, la construcción de polinucleótido, el ARN de hebra doble, el conjugado o el vector de expresión de acuerdo con la presente invención.
Un método para preparar una planta mutante, que no tiene origen natural o transgénica en donde el método comprende el paso de reducir la expresión del polinucleótido Nt RP y la actividad de la proteína codificada de esta forma o la actividad de la proteína codificada de esta forma en al menos una parte de la planta en comparación con una planta de control en la cual no se ha disminuido la expresión del polinucleótido NtMRP, y la actividad de la proteína codificada de esta forma o la actividad de la proteína codificada de esta forma.
Un método para reducir los niveles de cadmium en al menos una parte de una planta, en donde el método comprende el paso de reducir la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta forma o la actividad de la proteína codificada de esta forma, en comparación con una planta de control en donde la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta forma o la actividad de la proteína codificada de esta forma no ha sido disminuida.
En forma adecuada, el método comprende el primer paso de contactar la planta con la construcción de polinucleótido, el ARN de hebra doble, el conjugado, el vector de expresión, o la meganucleasa, o la proteína de dedo de zinc.
En forma adecuada, el método comprende el primer paso, o el paso adicional de contactar la planta con un mutagen.
Una planta mutante, que no tiene origen natural o transgénica obtenida o que se puede obtener a través de los métodos de la presente invención, en donde existe una reducción en el contenido de cadmium de al menos aproximadamente el 5% en al menos una parte de la planta, en comparación con una planta de control, en donde la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta forma o la actividad de la proteína codificada de esta forma no ha sido disminuida.
Un método para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión del polinucleótido NtMRP o la actividad de la proteína codificada de esta forma en una célula, en donde el método comprende administrar el gen quimérico, la construcción de polinucleótido, el ARN de hebra doble, el conjugado o el vector de expresión de acuerdo con la presente invención.
Un método para detectar, aislar, amplificar o analizar el polinucleótido NtMRP, en donde el método comprende el paso de proporcionar una muestra que comprende un polinucleótido e hibridar el polinucleótido a una molécula de polinucleótido que comprende una secuencia de secuencia de nucleótido de al menos 10 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótido aislada de acuerdo con la presente invención.
El uso de un agente que modula (por ejemplo, reduce o inhibe) la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta forma o la actividad de la proteína codificada de esta forma, para reducir el contenido de cadmium en al menos una parte de una planta en al menos el 5% en comparación con una planta de control en la cual no ha disminuido la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta forma o la actividad de la proteína codificada de esta forma.
El método o el uso de acuerdo con la presente invención, en donde el agente es o se deriva de un polinucleótido NtMRP, un gen NtMRP quimérico, una construcción de polinucleótido que comprende un polinucleótido NtMRP, un ARN antisentido, un ARN de hebra doble, un cADN, un conjugado que comprende un polinucleótido NtMRP y al menos una porción sin nucleótido o sin polinucleótido adherida en forma covalente al mismo, una ribozima, un mutagen, un dedo de zinc, una molécula pequeña o una meganucleasa.
En un aspecto adicional, se proporciona un método para producir un producto de tabaco que comprende los pasos de: (a) obtener una semilla de la planta de tabaco mutante, que no tiene origen natural o transgénica; (b) plantar y crecer la semilla en una planta; (c) recolectar la planta; y (d) preparar un producto de tabaco de la planta recolectada.
Las modalidades antes mencionadas se describen como modalidades de cada uno de los aspectos descritos anteriormente.
CIERTAS VENTAJAS La producción de plantas mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas (incluyendo biomasa, semillas y hojas obtenidas de las mismas) en donde están presentes cantidades menores de cadmium, proporciona una cantidad de ventajas.
A manera de ejemplo, las plantas, incluyendo plantas mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas, se pueden crecer en tierras que contienen concentraciones de cadmium variables, o en tierras que contienen menos de las concentraciones de cadmio deseables. Estas plantas y semillas derivadas, pueden proporcionar más opciones para cultivarlas en un mayor rango de ambientes de tierra, que pueden incrementar la cantidad de tierras cultivables disponibles para los practicantes (por ejemplo, granjeros).
A manera de ejemplo adicional, las plantas mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas (incluyendo biomasa, semilla y hojas obtenidas de las mismas) exhiben un contenido de cadmium reducido, en comparación con las contrapartes de control, y se pueden consumir directamente como productos comestibles.
El consumo de estos productos comestibles puede ser una opción más saludable. Las plantas adecuadas que pueden ser manipuladas de acuerdo con los métodos descritos, incluyen plantas que se pueden cultivar para uso agrícola, incluyendo tabaco, arroz, maíz, calabaza, fríjol de soya, lechuga, papas, betabel, hierbas, trigo, centeno y zanahorias, etc.
A manera de ejemplo adicional, la altura y/o peso de las plantas mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas es substancialmente la misma que las plantas de control. Por lo tanto, no se encuentran diferencias significativas en las hojas recolectadas secas de las plantas, en comparación con un control, lo que indica que la modulación de las transcripciones NtMRP no tiene un efecto estadísticamente relevante en la biomasa seca. Esto es conveniente debido a que las plantas se utilizan para la producción comercial de diversos productos incluyendo tabaco, en donde las alteraciones en apariencia visual pueden ya sea no ser aceptables para la industria, o pueden dar como resultado rendimientos de producción inaceptablemente reducidos.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1. La figura 1(a), es un diagrama esquemático del locus NtMRP4; la figura 1(b) muestra la secuencia de nucleótido de NtMRP4 en donde se subrayan las regiones UTR 5' y 3'; los exones se muestran en letras mayúsculas y negritas; los intrones se muestran en letras normales y minúsculas; y los codones de inicio y detención se muestran en color gris. Las secuencias de cebador 5' y 3' para la generación de una secuencia de ARNi NtMRP4 se indican en letras itálicas y normales.
La figura 2 ilustra la expresión del polinucleótido NtMRP4 durante el tratamiento de cadmium bajo condiciones hidropónicas durante 7 días. Se trataron sembradíos KY14 de tres semanas con 0, 0.05 y 0.5 CdCI2 (a) y se trataron plántulas N. rustica y N. tabacum (TN90) de 4 semanas con 0.5 micro. M CdCI2 durante una semana (b). Se aisló el ARN y se sometió a RT-PCR semi-cuantitativo.
La figura 3, ilustra la reducción de cadmium de la hoja en las líneas 1 y 2 de las líneas ARNi NtMRP4 en comparación con las plantas cultivadas de campo tipo natural.
La figura 4, muestra la reducción de cadmium en la hoja para dos líneas cultivadas de ARNi NtMRP4. En este experimento, se agregó un control de vector sin un inserto NtMRP4.
La figura 5, muestra la estructura intrón-exón y la ubicación de intrones y exones a lo largo de la secuencia del clon NtPM l-BAC-GOTOWE_5_gADN BAC genómico que abarca la región de codificación NtMRP4. La homología de la secuencia de cADN (hebra superior de 1-4,521 pares base) y la secuencia del clon BAC genómica que comprende la región de codificación MRP4 (hebra inferior de 61,781-69,748 pares base) es del 100%.
La figura 6, muestra la secuencia de nucleótido de NtMRP3 en donde las regiones UTR 5' y 3' están en letras; los exones se muestran en letras mayúsculas y negritas; los intrones se muestran en letras normales y minúsculas; y los codones de inicio y detención se muestran en letras mayúsculas, negritas e itálicas.
DEFINICIONES Los términos técnicos y expresiones utilizadas dentro del alcance de la presente solicitud, generalmente se proporcionan para el significado comúnmente aplicado a las mismas en la técnica pertinente de la biología de plantas y molecular. Las definiciones de términos que se encuentran a continuación, aplica a todo el contenido de la presente solicitud. La palabra "que comprende" no excluye otros elementos o pasos, y el artículo indefinido "un" o "uno, una" no excluye una pluralidad. Un paso simple puede cumplir con las funciones de diversas características mencionadas en las reivindicaciones. Los términos "esencialmente", "alrededor de", "aproximadamente" y similares, en relación con un atributo o un valor, también definen exactamente de manera particular el atributo o exactamente el valor, respectivamente. El término "aproximadamente" dentro del contexto de valor o rango de número determinado, se refiere a un valor o rango que está dentro del 20%, dentro del 10%, o dentro del 5%, 4%, 3%, 2% o 1% del valor o rango determinado.
Un "polinucleótido" se refiere a un polímero de nucleótidos que puede ser un desoxirribopolinucleótido (ADN) o ribopolinucleótido (ARN) no modificado o modificado. Por consiguiente, un polinucleótido, puede ser sin limitación, un ADN genómico, ADN complementario (cADN) (por ejemplo, SEQ ID No. 27), mARN, o ARN antisentido. Además, un polinucleótido puede ser un ADN de hebra simple o hebra doble, un ADN que sea una mezcla de regiones de hebra simple y hebra doble, una molécula híbrida que comprende ADN y ARN, o una molécula híbrida con una mezcla de regiones de hebra simple y hebra doble. Además, el polinucleótido puede estar compuesto de regiones de hebra triple que comprenden ADN, ARN, o ambas. Un polinucleótido puede contener una o más bases modificadas, tal como fosfotioatos, y puede ser un polinucleótido de péptido (PNA). Generalmente, los polinucleótidos aquí descritos pueden ensamblarse de fragmentos aislados o clonados de cADN, ADN genómico, oligonucleótidos, o nucleótidos individuales, o una combinación de los anteriores. Aunque las secuencias de polinucleótido aquí descritas se muestran como secuencias de ADN, las secuencias incluyen sus secuencias de ARN correspondientes, y sus secuencias de ADN o ARN complementarias (por ejemplo, completamente complementaria), incluyendo los complementos inversos de las mismas.
El término "polinucleótido NtMRP" comprende un polinucleótido en el cual un polímero de los nucleótidos comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia establecida en las SEQ ID NOs: 1, 2, 27, 28, 29 o 51. Este término también comprende una secuencia de polinucleótido con homología substancial (esto es similitud de secuencia) o identidad substancial con SEQ ID NOs: 1, 2, 27, 28, 29 o 51; fragmentos de las SEQ ID NOs: 1, 2, 27, 28, 29 o 51; y fragmentos de las SEQ ID NOs: 1, 2, 27, 28, 29 o 51 con homología substancial (esto es, similitud de secuencia) o identidad substancial con las mismas. La variante puede tener al menos el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%. 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia del gen NtMRP aislado - tal como el gen NtMRP3 o el gen NtMRP4. Aunque las secuencias de polinucleótido NtMRP aquí descritas se muestran como secuencias de ADN, las secuencias incluyen sus secuencias de ARN correspondientes, y sus secuencias de ADN o ARN complementarias (por ejemplo, completamente complementaria), incluyendo el complemento(s) inverso del mismo, y las secuencias de ADN o ARN antisentido. Los fragmentos de ejemplo establecidos en las SEQ ID NOs: 3 a 23 y 30 a 50 y 53.
El término "polinucleótido NtMRP3" se refiere a una modalidad en la cual un polímero de los nucleótidos comprende, consiste o consiste esencialmente en un polinucleótido aquí designado como la SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO. 29 o SEQ ID NO:51. El término comprende variantes de polinucleótido con homología substancial (esto es similitud de secuencia) o identidad substancial con SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29 o SEQ ID N0:51; fragmentos de SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO:51; y fragmentos de SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO:51 con homología substancial (esto es, similitud de secuencia) o identidad substancial con la misma. Tal como aquí se describe, la variante puede tener al menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia del gen NtMRP3 aislado. Los fragmentos de ejemplo establecidos en las SEQ ID NOs: 30 a 50.
El término "polin ucleótido NtMRP4" se refiere a una modalidad en la cual un polímero de nucleótidos comprende, consiste o consistente esencialmente en polinucleótido aquí designados como SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 27. El término comprende variantes de polinucleótido con homología substancial (esto es, similitud de secuencia) o identidad substancial con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO: 27; fragmentos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO: 27; y fragmentos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 27 con homología substancial (esto es similitud de secuencia) o identidad substancial con las mismas. La variante puede tener al menos el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia del gen NtMRP3 aislado. Los fragmentos de ejemplo establecidos en las SEQ ID NOs: 3 a 23 y 53. El término "polipéptido NtMRP" se refiere a un polipéptido que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácido que tiene homología substancial (esto es similitud de secuencia) o identidad substancial con SEQ ID NOs: 24 a 26 y 52; fragmentos de SEQ ID NOs: 24 a 26 y 52; y fragmentos de SEQ ID NOs: 24 a 26 y 52 con homología substancial (esto es similitud de secuencia) o identidad substancial con las mismas. Los polipéptidos NtMRP incluyen fragmentos y secuencias que comprenden un grado suficiente o substancial de identidad o similitud con SEQ ID NOs: 24 a 26 y 52 que pueden funcionar, mediante el trasporte de metales pesados (por ejemplo, cadmium) a través de membranas celulares. Los polipéptidos NtMRP también incluyen variantes o mutantes producidas introduciendo cualquier tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, eliminaciones o substituciones de aminoácidos; cambios en estados de glucosilación; cambios que afectan el plegado o isomerizaciones, estructuras tridimensionales o estados de autoasociación) que pueden ser diseñados en forma deliberada o aislados naturalmente. Los polipéptidos NtMRP pueden tener forma lineal o ser reciclados utilizando métodos conocidos. La variante puede tener al menos el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia del polipéptido NtMRP4.
El término "polipéptido NtMRP3" se refiere a una modalidad en la cual el polipéptido comprende, consiste o consiste esencialmente en las secuencias establecidas en las SEQ ID NOs: 52 o a un polipéptido que comprende, consiste o consistente esencialmente en una secuencia de aminoácido con homología substancial (esto es, similitud de secuencia) o identidad substancial con NOs:52; los fragmentos de la SEQ ID NO:52; y fragmentos de la SEQ ID NO: 52 con homología substancial (esto es similitud de secuencia) o identidad substancial con la misma. Los polipéptidos NtMRP3 incluyen fragmentos y secuencias que comprenden un grado de identidad suficiente o substancial o similitud con SEQ ID NO: 52 que puede funcionar mediante el transporte de metales pesados (por ejemplo, cadmium) a través de membranas celulares. Los polipéptidos NtMRP3 también incluyen variantes o mutantes producidas introduciendo cualquier tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, eliminaciones o substituciones de aminoácidos; cambios en estados de glucosilación ; cambios que afectan el plegado o isomerizaciones, estructuras tridimensionales o estados de autoasociación) que pueden ser diseñados en forma deliberada o aislados naturalmente. Los polipéptidos NtMRP3 pueden tener forma lineal o ser reciclados utilizando métodos conocidos. Tal como se describe en la presente invención, la variante puede tener al menos el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%) de identidad con la secuencia del polipéptido NtMRP3.
El término "polipéptido NtMRP4" se refiere a una modalidad en la cual el polipéptido comprende, consiste o consiste esencialmente en las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, o SEQ ID NO: 26 o a un polipéptido que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácido con homología substancial (esto es, similitud de secuencia) o identidad substancial con SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, o SEQ ID NO: 26; fragmentos de SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, o SEQ ID NO: 26; y fragmentos de SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, o SEQ ID NO: 26 con homología substancial (esto es, similitud de secuencia) o identidad substancial con la misma. Los polipéptidos NtMRP4 incluyen fragmentos y secuencias que comprenden un grado de identidad suficiente o substancial o similitud con las SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, o SEQ ID NO: 26 que pueden funcionar mediante el transporte de metales pesados (por ejemplo, cadmium) a través de las membranas celulares). Los polipéptidos NtMRP4 también incluyen variantes o mutantes producidos introduciendo cualquier tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, eliminaciones o substituciones de aminoácidos; cambios en estados de glucosilación, cambios que afectan el olegado o isomerizaciones, estructuras tridimensionales o estados de autoasociación), que pueden ser diseñados en forma deliberada o aislados naturalmente. Los polipéptidos NtMRP4 pueden estar en forma lineal o ser reciclados utilizando métodos conocidos. Tal como se describe en la presente invención, la variante puede tener al menos el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia del polipéptido NtMRP4.
El término "aislado" significa una entidad que se toma de su medio natural, aunque el término no connota un grado de purificación .
La "secuencia de gen" se refiere a la secuencia de nucleótido de una molécula de polinucleótido o polinucleótido que codifica un polipéptido o un ARN biológicamente activo, y que comprende la secuencia de nucleótido de una secuencia de codificación parcial que únicamente codifica un fragmento de una proteína.
El término "vector" se refiere a un vehículo de polinucleótido que comprende una combinación de componentes de polinucleótido que permiten el transporte de polinucleótido, construcciones de polinucleótido y conjugados de polinucleótido y similares. Los vectores adecuados incluyen episomas con la capacidad de réplica extra cromosomal tal como plásmidos de nucleótidos circulares, de hebra doble; plásmidos de polinucleótido linealizados de hebra doble; y otros vectores de cualquier origen.
El término "vector de expresión" se refiere a un vehículo de polinucleótido que comprende una combinación de componentes de polinucleótido que permiten la expresión del polinucleótido, construcciones de polinucleótido y conjugados de polinucleótido y similares. Los vectores de expresión adecuados incluyen episomas con la capacidad de réplica extracromosomal tal como plásmidos de polinucleótido circulares de hebra doble; plásmidos de polinucleótido linealizados de hebra doble; y otros vectores de expresión funcionalmente equivalentes de cualquier origen. Un vector de expresión comprende al menos un promotor colocado en la corriente ascendente y enlazados en forma operable a un polinucleótido, construcción de polinucleótido o conjugado de polinucleótido, tal como se define más adelante.
Una "construcción" se refiere a un fragmento de polinucleótido recombinante de hebra doble que comprende uno o más polinucleótidos de NtMRP. La construcción comprende una "hebra de plantilla" con emparejamiento base con una "hebra de sentido o codificación" de complementariedad . Se puede insertar una construcción determinada en un vector en dos posibles orientaciones, ya sea en la misma orientación (o sentido) o en la orientación inversa (o antisentido) con respecto a la orientación de un promotor colocado dentro de un vector - tal como un vector de expresión.
El término "conjugado" se refiere a un compuesto formado mediante la adhesión covalente ("conjugación") de un polinucleótido con una o más porciones que por sí mismas no son polinucleótidos o monómeros ("porciones conjugadas").
La "hebra de plantilla" se refiere a la hebra que comprende una secuencia que complementa la de la "hebra de sentido o codificación" de un dúplex de polinucleótido, tal como un fragmento genómico NtMRP, cADN NtMRP o construcción NtMRP, o cualquier fragmento de polinucleótido que comprenda una secuencia de polinucleótido que pueda ser transcrita mediante polimerasa de ARN. Durante la transcripción, la polimerasa de ARN puede transubicarse a lo largo de la hebra de la plantilla en una dirección 3' a 5' durante la síntesis de ARN naciente. El término "hebra de sentido" se utiliza de manera intercambiable en la presente invención con el término "hebra de codificación" que se refiere a la hebra que comprende una secuencia que complementa la de una hebra de plantilla en un dúplex de ADN. Por ejemplo, la secuencia de la hebra de sentido ("secuencia de sentido") para el clon genómico NtMRP identificado, se designa como SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2. Por ejemplo, si la hebra de sentido comprende una secuencia hipotética 5'-TAATCCGGT-3', entonces la secuencia correspondiente substancialmente idéntica dentro de un mARN objetivo hipotético es 5'-UAAUCCGGU-3\ El término "secuencia de complementariedad inversa" se refiere a la secuencia que complementa la "secuencia de sentido" de interés (por ejemplo, secuencia de exón) colocada dentro de la misma hebra, en la misma orientación con respecto a la secuencia de sentido. Por ejemplo, si una hebra comprende una secuencia hipotética 5'-TAATCCGGT-3', entonces la secuencia de complementariedad inversa 5'-ACCGGATTA-3\ puede ser enlazada en forma operable a la secuencia de sentido, separada por una secuencia espadadora.
La "transcripción de ARN NtMRP, NtMRP3 o Nt RP4" incluye moléculas de polirribopolinucleótido producidas dentro de una célula de planta huésped de interés, que resulta de la transcripción del gen NtMRP3 o NtMRP4 endógeno o cADN tal como aquí se describe. Por lo tanto, este término incluye cualquier especie de ARN o variantes de ARN producidas como productos de transcripción de ARN de NtMRP3 o NtM RP4 o NtMRP3 o NtMRP4, incluyendo las especies de ARN o variantes de ARN que tienen suficiente similitud en los niveles estructurales/funcionales. Por ejemplo, las transcripciones de ARN Nt MRP3 o NtMRP3 incluyen, pero no se limitan a: (1) pre-mARNs y mARNs producidos de la transcripción del gen NtM RP3 o NtMRP3 aislado o cADN; (2) pre-mARNs y mARNs producidos de la transcripción de cualquiera genes que tienen al menos el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del gen NtMRP3 aislado (esto es, otros distintos genes substancialmente idénticos al gen NtMRP3 identificado y que codifican isoformas relacionadas de transportadores ABC); y (3) pre-mARNs y mARNs producidos de la transcripción de alelos del gen NtMRP3. Las transcripciones de ARN NtM RP3 incluyen variantes de ARN producidas como resultado de las reacciones de división de ARN alternativas de ARNs heteronucleares ("hnARNs") de un gen particular, variantes de mARN que resultan de las reacciones de división de ARN alternativas y cualesquiera variantes de ARN intermedias.
A manera de ejemplo adicional, las transcripciones de ARN NtMRP4 o NtMRP4 incluyen: (1) pre-mARNs y mARNs producidos de la transcripción del gen NtMRP4 o NtMRP4 aislado o cADN, tal como aquí se describe; (2) pre-mARNs y mARNs producidas de la transcripción de cualquiera genes que tienen al menos el 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% o más de identidad de secuencia con la secuencia del gen NtMRP4 aislado (esto es, otros distintos genes substancialmente idénticos al gen NtMRP4 identificado y que codifica isoformas relacionadas de los transportadores ABC); y (3) pre-mARNs y mARNs producidos de la transcripción de alelos del gen NtMRP o NtMRP4. Las transcripciones de ARN NtMRP y NtMRP4 incluyen variantes de ARN producidas como un resultado de las reacciones de división de ARN alternativas de ARNs heteronucleares ("hnARNs") de un gen particular, variantes de mARN que resultan de dichas reacciones de división ARN alternativa y cualesquiera variantes de ARN intermediarias.
Los términos "homología", "identidad" o "similitud" se refieren al grado de similitud de secuencia entre dos polipéptidos o entre dos moléculas de polinucleótido comparadas mediante alineación de secuencia. El grado de homología entre las dos secuencias de polinucleótido independientes que están siendo comparadas, es una función del número de nucleótidos idénticos, o correspondientes en posiciones comparables. El grado de similitud expresado en términos de porcentaje de identidad puede determinarse mediante inspección visual y cálculo matemático. Como alternativa, el porcentaje de identidad de dos secuencias de polinucleótido, puede ser determinado comparando la información de secuencia utilizando el programa de computadora GAP, versión 6.0 descrito por Devereux et al. (Nucí. Acids Res. 12:387, 1984) y disponible en el Grupo de Cómputo de Genéticas de la Universidad de Wisconsin (University of Wisconsin Genetics Computer Group) (UWGCG), ClustalW, BLAST, FASTA o Smith-Waterman . Los parámetros por omisión típicos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación uñaría (que contiene un valor de 1 para identidades y O para no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucí. Acids Res. 14:6745, 1986, tal como se describe en la Publicación de Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas de Secuencia y Estructura de Proteínas, Fundación Nacional de Investigación Biomédica, pp. 353-358, 1979; (2) una penalidad de 3.0 para cada salto y una penalidad de 0.10 adicional para cada símbolo en cada salto; y (3) sin penalidad para saltos de extremo. Se pueden utilizar en forma alternativa diversos programas conocidos para los expertos en la técnica de la comparación de secuencias.
El término "corriente ascendente" se refiere a una dirección/posición relativa con respecto a un elemento de referencia a lo largo de una secuencia de polinucleótido lineal, que indica una dirección/posición hacia el extremo 5' de la secuencia de polinucleótido. La "corriente ascendente" se puede utilizar de manera intercambiable con el extremo "5' de un elemento de referencia".
El término "enlazado en forma operable" se refiere a la unión de distintos elementos, fragmentos o secuencias de polinucleótido para producir una unidad de transcripción funcional o un vector de expresión funcional.
Un "promotor" se refiere a un elemento/secuencia de polinucleótido, normalmente colocado en la corriente ascendente y enlazado en forma operable a un fragmento de ADN de hebra doble - tal como una construcción de ARNi NtMRP. Por ejemplo, un promotor adecuado permite la activación de transcripción de una construcción de ARNi NtMRP, reclutando el complejo de transcripción, incluyendo la polimerasa de ARN y diversos factores, para iniciar la síntesis de ARN. Los promotores se pueden derivar completamente de regiones próximas a un gen nativo de interés, o pueden estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores nativos o segmentos de ADN sintéticos.
Un "incrementador" se refiere a una molécula de polinucleótido, o una secuencia de polinucleótido, que puede reclutar proteínas reguladoras de transcripción, tal como activadores de transcripción, para incrementar la activación de transcripción, incrementando la actividad promotora. Los incrementadores adecuados se pueden derivar de regiones próximas al promotor nativo de interés (fuentes homologas) o se puede derivar de contextos no nativos (fuentes heterólogas) o enlazarse en forma operable a cualquier promotor de interés dentro de las construcciones NtMRP - tal como los vectores de expresión ARNi - para incrementar la actividad o la especificidad de tejido de un promotor. Algunos incrementadores pueden operar en cualquier orientación con respecto a la orientación de una unidad de transcripción. Por ejemplo, los aumentadores pueden colocarse en la corriente ascendente o corriente descendente de una unidad de transcripción que comprende un promotor y una construcción NtMRP.
Tal como se utiliza en la presente invención, el término "planta" se refiere a cualquier planta en cualquier etapa de su ciclo de vida o desarrollo, y su progenie. En una modalidad, la planta es una planta de tabaco, que se refiere a una planta que pertenece al género Nicotiana. Las especies, cultivos, híbridos y variedades preferidas de la planta de tabaco se describen en la presente invención.
El término "célula de planta" se refiere a una unidad estructural y fisiológica de una planta. La célula de planta puede estar en forma de un protoplasto sin una pared celular, una célula simple aislada o una célula cultivada, o como parte de una unidad organizada superior, tal como pero sin limitarse a, tejido de planta, órgano de planta o planta completa.
El término "material de planta" se refiere a cualquier composición sólida, líquida o gaseosa, o una combinación de las mismas, que se puede obtener de una planta, incluyendo biomasa, hojas, lámina de hojas, nervadura central, tallos, raíces, flores o partes de la flor, frutos, polen, células de huevos, cigotos, semillas, cortes, secreciones, extractos, cultivos celulares o de tejido o cualquiera otra partes o productos de una planta. En una modalidad, el material de la planta comprende o consiste en biomasa, semilla u hojas. En otra modalidad, el material de la planta comprende o consiste en hojas.
El término "variedad" se refiere a una población de plantas que comparten características constantes que las separan de otras plantas de la misma especie. Aunque poseen uno o más rasgos distintivos, una variedad se caracteriza en forma adicional por una variación general muy pequeña entre individuos dentro de dicha variedad. Con frecuencia una variedad se vende comercialmente.
El término "línea" o "línea de reproducción", indica un grupo de plantas que se utilizan durante la reproducción. Una línea se puede distinguir de una variedad, ya que despliega una pequeña variación entre individuos para uno o más rasgos de interés, aunque puede hacer cierta variación entre individuos para otros rasgos. El término "reduce" o "reducido" se refiere a una reducción de desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 99%, o una reducción de al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, o al menos 100%, 200% o 300% o más de una cantidad o una actividad, tal como pero sin limitarse a actividad de polipéptido, actividad de transcripción y/o expresión de proteína.
El término "inhibe" o "inhibido" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a una reducción de aproximadamente 98% hasta aproximadamente 100%, o una reducción de al menos 98%, al menos 99%, aunque particularmente de 100%, de una cantidad o una actividad, tal como pero sin limitarse a una actividad de polipéptido, actividad de transcripción y/o expresión de proteína.
El término "incremento" o "incrementado" se refiere a un incremento de aproximadamente 10% hasta aproximadamente 99%, o un incremento de al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, o al menos 100%, 200% o 300% o más de una cantidad o actividad, tal como pero sin limitarse a una actividad de polipéptido, actividad de transcripción y/o expresión de proteína.
El término "control" dentro del contexto de una planta de control o células de planta de control, significa una planta o células de planta en donde la expresión o actividad de un gen o proteína particular - tal como NtMRP - no ha sido modificada (por ejemplo, incrementada o reducida) y por lo tanto puede proporcionar una comparación con una planta en la cual se ha modificado la expresión o actividad de un gen o proteína particular - tal como NtMRP. La planta de control puede comprender un vector vacío. La planta de control puede corresponder a una planta tipo silvestre.
Descripción Detallada de la Invención Los polin ucleótidos y polipéptidos NtMRP se describen en la presente invención incluyendo polinucleótidos y polipéptidos NtMRP3 y NtMRP4. Tal como se muestra en la figura 6, el clon genómico NtM RP3, designado como SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29 comprende: intrón 1 (SEQ ID NO:30), intrón 2 (SEQ ID NO:31), intrón 3 (SEQ ID NO:32), intrón 4 (SEQ ID NO:33), intrón 5 (SEQ ID NO:34), intrón 6 (SEQ ID NO:35), intrón 7 (SEQ ID NO:36), intrón 8 (SEQ ID NO.37), intrón 9 (SEQ ID NO:38), intrón 10 (SEQ ID NO:39), exón 1 (SEQ ID NO:40), exón 2 (SEQ ID NO:41), exón 3 (SEQ ID NO:42) exón 4 (SEQ ID NO:43), exón 5 (SEQ ID NO:44), exón 6 (SEQ ID NO:45) exón 7 (SEQ ID NO:46) exón 8 (SEQ ID NO:47), exón 9 (SEQ ID NO:48) exón 10 (SEQ ID NO:49) y exón 11 (SEQ ID NO:50).
Las diversas modalidades se dirigen a polinucleótidos aislados que representan fragmentos genómicos aislados en el locus NtMRP3, que comprenden SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29, fragmentos de SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29, o variantes de las mismas .
Las diversas modalidades se dirigen a polinucleótido aislados que representan las secuencias de cADN del locus NtMRP3, que comprende SEQ ID NO:51, fragmentos de SEQ ID NO:51, o variantes de las mismas. Las diversas modalidades se dirigen a variantes de polinucleótido NtMRP aislado que comprenden al menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29, o fragmentos de SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29. Varias modalidades se dirigen a polinucleótidos aislados que complementan las variantes de polinucleótido NtMRP que comprende al menos el 71%, 72%, 73%, 74% 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO: 51 o fragmentos de SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO: 51.
Se dirigen varias modalidades a polinucleótidos aislados que pueden hibridar específicamente, bajo condiciones altamente rigurosas, para polinucleótidos que comprenden SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO: 51, o fragmentos de la SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO: 51.
Tal como se muestra en la figura 1, el clon genómico NtMRP4, designado como SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 comprende: el intrón 1 (SEQ ID NO:3), intrón 2 (SEQ ID NO:4), intrón 3 (SEQ ID NO:5), intrón 4 (SEQ ID NO:6), intrón 5 (SEQ ID NO:7), intrón 6 (SEQ ID NO:8), intrón 7 (SEQ ID NO:9), intrón 8 (SEQ ID NO: 10), intrón 9 (SEQ ID NO: 11), intrón 10 (SEQ ID NO: 12), exón 1 (SEQ ID NO:13), exón 2 (SEQ ID NO:14), exón 3 (SEQ ID NO:15) exón 4 (SEQ ID NO:16), exón 5 (SEQ ID NO:17), exón 6 (SEQ ID NO:18) exón 7 (SEQ ID NO:19) exón 8 (SEQ ID NO:20), exón 9 (SEQ ID NO:21) exón 10 (SEQ ID NO:22) y exón 11 (SEQ ID NO:53) o SEQ ID No. 23.
Se dirigen varias modalidades a polinucleótido aislados que representan fragmentos genómicos aislados en el locus NtMRP4, que comprenden SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2, fragmentos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2, o variantes de las mismas.
Se dirigen varias modalidades a un ADN aislado que comprende SEQ ID NO:27, fragmentos de SEQ ID NO:27, o variantes de las mismas.
Las diversas modalidades se dirigen a variantes de polinucleótido NtMRP aisladas que comprenden al menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o SEQ ID No. 27, o fragmentos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o SEQ ID No. 27.
Se diversas modalidades se dirigen a poli n ucleótidos aislados que complementan las variantes de polinucleótido NtMRP que comprenden al menos 71%, 72%, 73%, 74% 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:27 o fragmentos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:27.
Se dirigen varias modalidades a polinucleótido aislados que pueden hibridar específicamente, bajo condiciones de moderadas a altamente estrictas, para polinucleótidos que comprenden la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:27, o fragmentos de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:27.
Un polinucleótido tal como aquí se describe, generalmente contendrá enlaces de fosfodiéster, aunque en algunos casos, se incluyen análogos de polinucleótido que pueden tener esqueletos alternativos, que comprenden, por ejemplo ligaduras de fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato o O-metilfosforoamidita; y esqueletos y ligaduras de polinucleótido de péptido. Otros polinucleótidos análogos incluyen los que tienen esqueletos positivos; esqueletos no iónicos y esqueletos sin ribosa. Las modificaciones del esqueleto de ribosa-fosfato se pueden llevar a cabo por una variedad de razones, por ejemplo, para incrementar la estabilidad y vida media de dichas moléculas en ambientes fisiológicos o como sondas en un biochip. Se pueden elaborar mezclas de polinucleótidos y análogos que ocurren naturalmente. Como alternativa, se pueden elaborar mezclas de diferentes análogos de polinucleótido, y mezclas de polinucleótidos y análogos que ocurren naturalmente.
Se conocen una variedad de análogos de polinucleótido, incluyendo por ejemplo, ligaduras de fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato, O-metilfosforoamidita y esqueletos y ligadura de polinucleótido de péptido. Otros polinucleótidos análogos incluyen los que tienen esqueletos positivos, esqueletos no iónicos y esqueletos sin ribosa. También se incluyen polinucleótidos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos.
Otros análogos incluyen polinucleótido de péptido (PNA) que son análogos de polinucleótido de péptido. Estos esqueletos son substancialmente no iónicos bajo condiciones neutrales, en contraste con el esqueleto de fosfodiéster altamente cargado de polinucleótidos que ocurren naturalmente. Esto puede dar como resultado ventajas. Primero, el esqueleto PNA puede exhibir cinéticas de hibridación mejoradas. El PNA tiene cambios más grandes en la temperatura de fusión (Tm) para pares base desacoplados versus perfectamente acoplados. ADN y ARN normalmente exhiben una caída de 2 a 4°C en Tm durante un desacoplamiento interno. Con el esqueleto PNA no iónico, la caída es cercana a 7 a 9°C. En forma similar, debido a su naturaleza no iónica, la hibridación de las bases adheridas a estos esqueletos es relativamente insensible a la concentración de sal. Además, los PNAs pueden no ser degradados o degradarse a un menor grado o ser degradados en un menor grado por enzimas celulares, y por lo tanto pueden ser más estables.
Entre los usos de los polinucleótidos NtMRP descritos y las combinaciones o fragmentos de los mismos, se encuentra el uso de fragmentos como sondas en ensayos de hibridación de polinucleótido o cebadores para utilizarse en ensayos de amplificación de polinucleótido, o el uso de fragmentos en el desarrollo de diversas construcciones de polinucleótido - tal como moléculas ARNi. Los fragmentos generalmente comprenden al menos aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. En otras modalidades, un fragmento de ADN que comprende al menos aproximadamente 10, 15, 20, 30, 40, 50 o 60 o más nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. Por lo tanto, en un aspecto adicional, también se proporciona un método para detectar polinucleótidos NtMRP, en donde el método comprende el uso de sondas y/o cebadores aquí descritos.
Los parámetros básicos que afectan la elección de las condiciones de hibridización y la guía para considerar condiciones adecuadas, se establecen en las Publicaciones de Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis (1989, Clonación Molecular: Clonación Molecular: Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Utilizando el conocimiento del código genético en combinación con las secuencias de aminoácido establecidas anteriormente, se pueden preparar conjuntos de oligonucleótidos de degeneración. Dichos oligonucleótidos son útiles como cebadores, por ejemplo, en reacciones de cadena de polimerasa (PCR), en donde los fragmentos de polinucleótido se aislan y amplifican. En ciertas modalidades, se pueden utilizar cebadores de degeneración como sondas para bibliotecas genéticas no humanas. Dichas bibliotecas pueden incluir pero no se limitan a bibliotecas de cADN, bibliotecas genómicas e incluso bibliotecas EST o de ADN electrónicas (etiqueta de secuencia express). Las secuencias homólogas identificadas a través de este método, posteriormente se pueden utilizar como sondas para identificar homólogos no humanos de las secuencias NtMRP ahí identificadas.
También de uso potencial son los polinucleótidos y oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores o sondas) que hibridan bajo condiciones de rigurosidad reducida, normalmente condiciones de rigurosidad moderada, y comúnmente condiciones de alta rigurosidad, para un polinucleótido NtMRP aquí descrito. Los parámetros básicos que afectan la elección de las condiciones de hibridización y la guía para considerar condiciones adecuadas se describen en las Publicación de Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis (1989, Clonación Molecular: Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) y se pueden determinar fácilmente a través de los que tienen experiencia en la técnica basados, por ejemplo, en la longitud o composición base del polinucleótido.
Una forma de lograr condiciones moderadamente rigurosas, implica el uso de una solución de prelavado que contiene Citrato de Sodio Estándar 5x, Sulfato Dodecilo de Sodio, ácido etilenodiaminotetraacético (pH 8.0), amortiguador de hibridación de aproximadamente 50% de formamida, Citrato de Sodio Estándar 6x, y una temperatura de hibridación de aproximadamente 55°C (u otras soluciones de hibridación similares, tal como una que contiene aproximadamente 50% de formamida, con una temperatura de hibridación de aproximadamente 42°C), y condiciones de lavado de aproximadamente 60°C, en Citrato de Sodio Estándar 0.5x, Sulfato Dodecilo de Sodio 0.1%. Generalmente, se definen condiciones altamente rigurosas como las condiciones de hibridación anteriores, pero con un lavado a temperatura de aproximadamente 68°C, Citrato de Sodio Estándar 0.2x, Sulfato Dodecilo de Sodio 0.1%. Se puede sustituir SSPE (1x SSPE es cloruro de sodio 0.15M, fosfato de sodio 10 mM y ácido etilenodiaminotetraacético 1.25 mM, pH 7.4) por Citrato de Sodio Estándar (Citrato de Sodio Estándar 1x es cloruro de sodio 0.15M y citrato de sodio 15 mM) en los amortiguadores de hibridación y lavado; los lavados se llevan a cabo durante 15 minutos después de que se completa la hibridación. Deberá quedar entendido que la temperatura de lavado y la concentración de la sal de lavado se pueden ajusfar según sea necesario para lograr un grado deseado de rigurosidad, aplicando los principios básicos que gobiernan las reacciones de hibridación y la estabilidad dúplex, tal como lo saben los expertos en la técnica y se describe en forma adicional más adelante (ver, por ejemplo, la Publicación de Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis (1989, Clonación Molecular: Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Cuando se híbrida un polinucleótído para un polinucleótido objetivo de una secuencia desconocida, la longitud del híbrido se asume que será la del polinucleótido de hibridación. Cuando los polinucleótidos de una secuencia conocida se hibridan, se puede determinar la longitud de híbrido alineando la secuencia de los polinucleótidos e identificando la región o regiones de complementanedad de secuencia óptima. La temperatura de hibridación para los híbridos anticipada menor a 50 pares bases de longitud, debe ser de 5 a 10°C menos que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, en donde Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos con menos de 18 pares base de longitud, Tm (°C) = 2(número de bases A + T) + 4(número de bases G + C). Para híbridos arriba de 18 pares base de longitud, Tm (°C) = 81.5+16.6(log 10 [Na + ]) + 0.41 (% G + C)-(600/N), en donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na + ] es la concentración de iones de sodio en el amortiguador de hibridación ([Na + ] para Citrato de Sodio Estándar 1x = 0.165M). Normalmente, cada uno de dichos polinucleótidos de hibridación, tienen una longitud que es al menos el 25% (comúnmente al menos 50%, 60%, o 70%, y más comúnmente al menos 80%) de la longitud de un polinucleótido al cual híbrida, y tiene al menos el 60% de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, o al menos 99%) con un polinucleótido para el cual híbrida.
Tal como lo comprenden los expertos en la técnica, un ADN lineal tiene dos posibles orientaciones: la dirección 5'- a -3' y la dirección 3'- a -5'. Por ejemplo, si una secuencia de referencia se coloca en la orientación 5'- a -3', y si una segunda secuencia se coloca en la dirección 5'- a -3" dentro de la misma molécula/hebra de polinucleótido, entonces la secuencia de referencia y la secuencia se orientan en la misma dirección, o tienen la misma orientación. Normalmente, se colocan en la misma dirección una segunda promotora y un gen de interés bajo la regulación de un promotor determinado. Sin embargo, con respecto a la secuencia de referencia colocada en la dirección 5'- a -3', si se coloca una segunda secuencia en la dirección 3'- a -5' dentro de la misma molécula/hebra de polinucleótido, entonces la secuencia de referencia y la segunda secuencia se orientan en la dirección antisentido, o tienen orientación antisentido. Dos secuencias que tienen orientaciones antisentido con respecto una de la otra, pueden ser descritas alternativamente como teniendo la misma orientación, si la secuencia de referencia (dirección 5'- a -3') y la secuencia de complementariedad inversa de la secuencia de referencia (secuencia de colocada en la 5'- a -3') se colocan dentro de la misma molécula/hebra de polinucleótido. Las secuencias establecidas en la presente invención se muestran en la dirección 5'- a -3'.
Los polipéptidos NtMRP incluyen variantes producidas introduciendo cualquier tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, eliminaciones o substituciones de aminoácidos; cambios en los estados de glucosilación ; cambios que afectan el plegado o isomerizaciones, estructuras tridimensionales o estrados de auto-asociación) que pueden ser diseñados en forma deliberada o aislados naturalmente. Los polipéptidos NtMRP3 o NtMRP4 pueden tener forma lineal o ser reciclados utilizando métodos conocidos. Los polipéptidos NtMRP4 comprenden al menos 10, al menos 20, al menos 30, o al menos 40 aminoácidos contiguos.
Se dirigen varias modalidades a polipéptidos NtMRP3 aislados codificados por una secuencia de polinucleótido que comprenden, consisten o consisten esencialmente en SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:51 y fragmentos de SEQ ID NO.28 o SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO: 51, o variantes de las mismas.
Se dirigen diversas modalidades a polipéptidos NIMRP4 aislados codificados por una secuencia de polinucleótido que comprende, consiste o consiste esencialmente en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:27, fragmentos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:27, o variantes de las mismas.
Se dirigen varias modalidades a las variantes de polipéptido NtMRP aisladas que comprenden al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:27 o SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:51 o fragmentos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:27 o SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:51.
Las variantes de polipéptido muíante de NtMRP, NtMRP3 y NtMRP4 también están comprendidas en las reivindicaciones, y se describen en la presente invención como plantas mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas (por ejemplo, plantas de tabaco mutante, que no tiene origen natural o transgénica) que comprenden las variantes de polipéptido mutantes de NtMRP y/o MtMRP3 y/o NtM RP4.
El término "no ocurre naturalmente" tal como aquí se utiliza, describe una entidad (por ejemplo, un polinucleótido, una mutación genética, un polipéptido, una planta, una célula de planta y un material de planta) que no se forma en la naturaleza o que no existe en la naturaleza. Dichas entidades que no tienen origen natural o entidades artificiales se pueden elaborar, sintetizar, iniciar, modificar, intervenir o manipular a través de los métodos aquí descritos o que son conocidos en la técnica. Por lo tanto, a manera de ejemplo, una planta que no tiene origen natural, una célula de planta que no tiene origen natural o un material de planta que no tiene origen natural se puede elaborar utilizando técnicas de reproducción - tal como retrocruzamiento o mediante tecnologías de manipulación genética - tal como ARN antisentido, ARN de interferencia, mega nucleasa y similares. A manera de ejemplo adicional, se puede elaborar una planta que no tiene origen natural, una célula de planta que no tiene origen natural o un material de planta que no tiene origen natural mediante introgresión de, o mediante transferencia de una o más mutaciones genéticas (por ejemplo, uno o más polimorfismos) de una primera planta o célula de planta en una segunda planta o célula de planta (que por sí misma puede ocurrir naturalmente), de modo que la planta, célula de planta o material de la planta resultante o la progenie de las mismas comprende una constitución genética (por ejemplo, un genoma, un cromosoma o un segmento del mismo) que no se forma en la naturaleza o que no existe en la naturaleza. La planta, célula de planta o material de la planta resultante, por lo tanto es artificial o no ocurre naturalmente. Por consiguiente, se puede elaborar una planta o célula de planta artificial o que no tiene origen natural modificando una secuencia genética en una primera planta o célula de planta que ocurre naturalmente, incluso si la secuencia genética resultante ocurre naturalmente en una segunda planta o célula de planta que comprende un diferente antecedente genético al de la primera planta o célula de planta. Las diferencias en antecedentes genéticos se pueden detectar mediante diferencias fenotípicas o mediante técnicas de biología molecular conocidas en la técnica - tal como secuenciación de polinucleótido, presencia o ausencia de marcadores genéticos (por ejemplo, marcadores de ARN de micro satélite).
Un polipéptido se puede preparar cultivando células huésped transformadas o recombinantes bajo condiciones de cultivo adecuadas para expresar un polipéptido. El polipéptido expresado resultante posteriormente se puede purificar de dicho cultivo utilizando procesos de purificación conocidos. La purificación del polipéptido también puede incluir una columna de afinidad que contiene agentes que enlazarán al polipéptido; uno o más pasos de columna en dichas resinas de afinidad tal como A-agarosa de concavalina, heparina-toyopearl® o azul Cibacrom 3GA Sepharose®; uno o más pasos que implican cromatografía de interacción hidrofóbica utilizando resinas tales como éter fenílico, éter butílico o éter propílico; o cromatografía por ¡nmunoafinidad. Como alternativa, el polipéptido también se puede expresar en una forma que facilitará la purificación. Por ejemplo, se puede expresar como un polipéptido de fusión, tal como el polipéptido de enlace de maltosa (MBP), glutationa-5-transferasa (GST) o tiorredoxina (TRX). Los equipos para la expresión y purificación de los polipéptidos de fusión están comercialmente disponibles en England BioLab (Beverly, Mass.), Pharmacia (Piscataway, N.J.), y InVitrogen, respectivamente. El polipéptido también se puede etiquetar con un epítope y purificarse subsecuentemente utilizando un anticuerpo específico dirigido a dicho epítope. Finalmente, uno o más pasos de cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa (RP-HPLC) que emplean un medio RP-HPLC hidrofóbico, por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos de metilo pendientes u otros grupos alifáticos, se pueden emplear para purificar en forma adicional el polipéptido. Algunos o todos los pasos de purificación anteriores, en varias combinaciones, también se pueden emplear para proporcionar un polipéptido recombinante substancialmente homogéneo. El polipéptido purificado de esta forma está substancialmente libre de otros polipéptidos , y es tal como se define en la presente invención como un "polipéptido substancialmente purificado"; los polipéptidos purificados incluyen polipéptido, fragmento, variante NtMRP, y similares. La expresión, aislamiento y purificación de los polipéptidos y fragmentos se puede lograr a través de cualquier técnica adecuada, incluyendo pero sin limitarse a métodos aquí descritos.
También es posible utilizar una columna de afinidad, tal como un anticuerpo monoclonal generado contra polipéptidos, para polipéptidos expresados mediante afinidad-purificación. Estos polipéptidos se pueden eliminar de una columna de afinidad, utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, en un amortiguador de elución con alto contenido de sal y posteriormente dializarse en un amortiguador de sal inferior, para utilizarse o cambiando el pH u otros componentes que dependen de la matriz de afinidad utilizada, o pueden ser eliminados en forma competitiva utilizando el substrato que ocurre naturalmente de la porción de afinidad, tal como un polipéptido derivado de la descripción.
También se puede producir un polipéptido a través de síntesis química convencional conocida. Los métodos para construir los polipéptidos o fragmentos de los mismos mediante medios sintéticos, son conocidos para los expertos en la técnica. Las secuencias de polipéptido construidas en forma sintética, en virtud de las características estructurales o conformacionales que comparten primarias, secundarias o terciarias con un polipéptido nativo, pueden poseer propiedades biológicas en común con las mismas, incluyendo actividad biológica.
Las modalidades se dirigen a composiciones y métodos para producir plantas mutantes, que no tienen origen natural transgénicas que han sido modificadas para reducir o impedir el transporte de metales pesados (por ejemplo, cadmium) hacia la lámina de hoja, reduciendo los niveles de expresión del polinucleótido NtMRP, o reduciendo la actividad de la proteína codificada de esta forma. El nivel de estado constante de las transcripciones de ARN NtMRP, se puede disminuir en comparación con una planta de control. En consecuencia, se puede disminuir el número de transportadores NtMRP fu ncionalmente activo disponibles para transportar metales pesados (por ejemplo, cadmium) a través de membranas celulares, de modo que también se pueda disminuir el nivel de cadmio en la planta.
La reducción en la expresión del polinucleótido NtMRP puede ser de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 100%, o una reducción de al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o hasta el 100%, que incluye una reducción en la actividad de transcripción o expresión de proteína.
La reducción en la actividad de proteína NtMRP puede ser de aproximadamente 5% hasta aproximadamente 100%, o una reducción de al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o hasta 100%.
La inhibición se refiere a una reducción de aproximadamente 98% hasta aproximadamente 100%, o una reducción de al menos 98%, al menos 99%, pero particularmente 100%.
Los polinucleótidos y construcciones recombinantes aquí descritas se pueden utilizar para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión de un polipéptido NtMRP en una especie de planta de interés. Se conoce una cantidad de métodos a base de polinucleótidos, incluyendo ARN antisentido, disociación de ARN dirigida por ribozima, silenciación de gen post-transcripción (PTGS), por ejemplo, interferencia de ARN (ARNi), y silenciación de gen de transcripción (TGS), para inhibir la expresión genética en plantas. Los polinucleótidos adecuados incluyen polinucleótidos de longitud total que codifican polipéptidos NtMRP o fragmentos de dichos polinucleótidos de longitud total. En algunas modalidades, se puede utilizar un complemento del polinucleótido de longitud total o un fragmento del mismo. Normalmente, un fragmento tiene al menos 10 nucleótidos contiguos, por ejemplo, al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 35, 40, 50, 80, 100, 200, 500 nucleótidos contiguos o más. Generalmente, se puede utilizar homología superior para compensar el uso de una secuencia más corta.
Por lo tanto, las composiciones que pueden modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión o la actividad de NtMRP incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la transcripción de uno o más gen(s) NtMRP endógeno; polinucleótidos específicos de secuencia pueden interferir con la traducción de transcripciones de ARN NtMRP (por ejemplo ARNs de hebra doble, siARNs, ribozimas); polipéptidos específicos de secuencia que pueden interferir con la estabilidad de proteínas NtMRP; polinucleótidos específico de secuencia que pueden interferir con la actividad enzimática de la proteína NtMRP o la actividad de enlace de la proteína NtMRP con respecto a substratos o proteínas reguladoras; anticuerpos que exhiben especificidad para la proteína NtMRP; compuestos de molécula pequeña que pueden interferir con la estabilidad de la proteína NtMRP o la actividad enzimática de la proteína NtMRP o la actividad de enlace de la proteína NtMRP; proteínas de dedo de zinc que enlazan al polinucleótido NtMRP; y meganucleasas que tienen actividad hacia el polinucleótido NtMRP. La tecnología antisentido es un método bien conocido que puede utilizarse para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión de un polipéptido NtMRP. Un polinucleótido de un gen que será reprimido, se clona y enlaza en forma operable a una región reguladora y una secuencia de terminación de transcripción, de modo que se transcriba la hebra antisentido de ARN. La construcción recombinante posteriormente se transforma en plantas, tal como aquí se describe, y se produce la hebra antisentido de ARN. El polinucleótido no necesita ser toda la secuencia del gen que será definido, aunque normalmente será substancialmente complementaria para al menos una parte de la hebra de sentido del gen que será reprimido.
Se puede transcribir un polinucleótido en una ribozima, o ARN catalítico, que afecte la expresión de un mARN. Las ribozimas se pueden diseñar para emparejarse específicamente virtualmente con cualquier ARN objetivo y desasociar el esqueleto de fosfodiéster en una ubicación específica, para desactivar funcionalmente de esta forma el ARN objetivo. Los polinucleótidos heterólogos pueden codificar ribozimas diseñadas para disociar transcripciones de mARNs particulares, evitando de esta forma la expresión de un polipéptido. Las ribozimas cabeza de martillo son útiles para destruir los mARNs particulares, aunque se pueden utilizar varias ribozimas que disocian el mARN en las secuencias de reconocimiento específicas del sitio. Las ribozimas cabeza de martillo disocian mARN en ubicaciones dirigidas por regiones de flanqueo que forman pares base complementarios con el mARN objetivo. El único requerimiento es que el ARN objetivo contenga una secuencia de nucleótidos 5'-UG-3'. La construcción y producción de ribozimas de cabeza de martillo es conocida en la técnica. Las secuencias de ribozima de cabeza de martillo se pueden incrustar en un ARN estable tal como ARN de transferencia (tARN) para incrementar la eficiencia de disociación in vivo.
Por ejemplo, se puede preparar una construcción que incluye una secuencia que se transcribe en un ARN que puede endurecerse por sí mismo, por ejemplo, un ARN de hebra doble que tiene una estructura de lazo-tallo. En algunas modalidades, una hebra de la parte del tallo de un ARN de hebra doble comprende una secuencia que es similar o idéntica a la secuencia de codificación de sentido o un fragmento de la misma de un polinucleótido NtMRP, y que tiene de aproximadamente 10 nucleótidos hasta aproximadamente 2,500 nucleótidos contiguos de longitud. La longitud de la secuencia que es similar o idéntica a la secuencia de codificación de sentido puede ser de 10 nucleótidos contiguos a 500 nucleótidos contiguos, de 15 nucleótidos contiguos a 300 nucleótidos contiguos, de 20 nucleótidos contiguos a 100 nucleótidos contiguos, o de 25 nucleótidos contiguos a 100 nucleótidos contiguos. La otra hebra de la parte del tallo de un ARN de hebra doble comprende una secuencia que es similar o idéntica a la hebra antisentido o un fragmento de la misma de la secuencia de codificación del polinucleótido NtMRP, y puede tener una longitud que es más corta, igual a o más larga que la longitud correspondiente de la secuencia de sentido. En algunos casos, una hebra de la parte del tallo de un ARN de hebra doble comprende una secuencia que es similar o idéntica a la región no traducida 3' o 5', o un fragmento de la misma, de un mARN que codifica un polipéptido NtMRP, y la otra hebra de la parte del tallo de un ARN de hebra doble que comprende una secuencia que es similar o idéntica a la secuencia que es complementaria a la región no traducida 3' o 5', respectivamente, o un fragmento de la misma, del mARN que codifica NtMRP. En otras modalidades, una hebra de la parte del tallo de un ARN de hebra doble comprende una secuencia que es similar o idéntica a la secuencia de un intrón, o un fragmento del mismo, en el pre-mARN que codifica un polipéptido NtMRP, y la otra hebra de la parte del tallo que comprende una secuencia que es similar o idéntica a la secuencia que es complementaria a la secuencia del intrón, o un fragmento del mismo, en el pre-mARN.
La parte de lazo de un ARN de hebra doble, puede tener de aproximadamente 3 nucleótidos hasta aproximadamente 5,000 nucleótidos - tal como de aproximadamente 15 nucleótidos hasta aproximadamente 1000 nucleótidos, de aproximadamente 20 nucleótidos hasta aproximadamente 500 nucleótidos, de aproximadamente 25 nucleótidos hasta 250 nucleótidos. La porción de lazo del ARN puede incluir un intrón o un fragmento del mismo. Un ARN de hebra doble puede tener cero, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más estructuras de lazo-tallo.
Una construcción que incluye una secuencia que está enlazada en forma operable a una región reguladora o una secuencia de terminación de transcripción, y que se transcribe en un ARN que puede formar un ARN de hebra doble, se puede transformar en plantas tal como aquí se describe. Los métodos para utilizar el ARNi para inhibir la expresión de un gen son conocidos para los expertos en la técnica.
Las construcciones que comprenden regiones reguladoras enlazadas en forma operable a moléculas de polinucleótido en la orientación de sentido, también se pueden utilizar para inhibir la expresión de un gen. El producto de transcripción puede ser similar o idéntico a la secuencia de codificación de sentido, o un fragmento de la misma de un polipéptido NtMRP. El producto de transcripción también puede ser no poliadenilado, carecer de una estructura de tapa 5' o contener un intrón que no se puede dividir. Los métodos para inhibir la expresión del gen utilizando el cADN de longitud total, así como una secuencia de cADN parcial, son conocidos en la técnica.
En algunas modalidades, se utiliza una construcción que comprende un polinucleótido que tiene al menos una hebra que es una plantilla para secuencias tanto de sentido como antisentido que son complementarias entre sí, para inhibir la expresión de un gen. Las secuencias sentido y antisentido puede ser parte de una molécula de polinucleótido más grande, o pueden ser parte de moléculas de polinucleótido separadas que tienen secuencias que no son complementarias. Las secuencias de sentido o antisentido puede ser una secuencia que es idéntica o complementaria a la secuencia de un mARN, la región no traducida 3' o 5' de un mARN, o un intrón en un pre-mARN que codifica un polipéptido NtMRP, o un fragmento de dichas secuencias. En algunas modalidades, la secuencia de sentido o antisentido es idéntica o complementaria a una secuencia de la región reguladora que conduce la transcripción del gen que codifica un polipéptido NtMRP. En cada caso, la secuencia de sentido es la secuencia que es complementaria a la secuencia antisentido.
Las secuencias sentido y antisentido pueden tener una longitud mayor a aproximadamente 10 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, o más nucleótidos). Por ejemplo, una secuencia antisentido puede ser de aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleótidos de longitud. Normalmente, las secuencias de sentido y antisentido fluctúan en longitud de aproximadamente 15 nucleótidos hasta aproximadamente 30 nucleótidos, por ejemplo, de aproximadamente 18 nucleótidos hasta aproximadamente 28 nucleótidos, o de aproximadamente 21 nucleótidos hasta aproximadamente 25 nucleótidos, o de aproximadamente 23 nucleótidos hasta aproximadamente 25 nucleótidos.
En algunas modalidades, la secuencia antisentido es una secuencia complementaria a una secuencia de mARN, o un fragmento de la misma, que codifica un polipéptido NtMRP aquí descrito. La complementariedad de la secuencia de sentido para la secuencia de antisentido, puede ser una secuencia presente dentro del mARN del polipéptido NtMRP. Normalmente, las secuencias de sentido y antisentido están diseñadas para corresponder a una secuencia de 15 a 30 nucleótidos del mARN objetivo, de modo que se reduzca el nivel del mARN objetivo.
En algunas modalidades, se puede utilizar una construcción que comprende un polinucleótido que tiene al menos una hebra que es una plantilla para más de una secuencia de sentido (por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más secuencias de sentido) para inhibir la expresión de un gen. De igual manera, se puede utilizar una construcción que comprende un polinucleótido que tiene al menos una hebra que es una plantilla para más de una secuencia antisentido (por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más secuencias antisentido), para inhibir la expresión de un gen. Por ejemplo, una construcción puede contener un polinucleótido que tiene al menos una hebra que es una plantilla para dos secuencias de sentido y dos secuencias antisentido. Las secuencias de sentido múltiple pueden ser idénticas o diferentes. Las secuencias antisentido múltiples pueden ser idénticas o diferentes. Por ejemplo, una construcción puede comprender un polinucleótido que tiene una hebra que es una plantilla para dos secuencias de sentido idénticas y dos secuencias antisentido idénticas que son complementarias a las dos secuencias de sentido idénticas. Como alternativa, un polinucleótido aislado puede comprender una hebra que es una plantilla para (1) dos secuencias de sentido idénticas de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 o más nucleótidos de longitud, (2) una secuencia antisentido que es complementaria para las dos secuencias de sentido idénticas de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o más nucleótidos de longitud; (3) una secuencia de sentido de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o más nucleótidos de longitud, y (4) tres secuencias antisentido idénticas que son complementarias para la secuencia de sentido de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o más nucleótidos de longitud. Las construcciones ahí proporcionadas se pueden diseñar para tener cualquier ajuste de secuencias de sentido y antisentido. Por ejemplo, dos secuencias de sentido idénticas pueden estar seguidas de dos secuencias antisentido idénticas o pueden colocarse entre dos secuencias antisentido idénticas.
Un polinucleótido que comprende al menos una hebra que es una plantilla para una o más secuencias sentido o antisentido, se puede enlazar en forma operable a una región reguladora para conducir la transcripción de una molécula de ARN que comprende la secuencia(s) de sentido o antisentido. Además, el polinucleótido puede ser enlazado en forma operable a una secuencia terminadora de transcripción, tal como el terminador del gen de sintasa de nopalina (nos). En algunos casos, dos regiones reguladoras pueden dirigir la transcripción de dos transcripciones; una de la hebra superior, y una de la hebra inferior. Las dos regiones reguladoras pueden ser las mismas o diferentes. Las dos transcripciones pueden formar moléculas de ARN de hebra doble que inducen la degradación del ARN objetivo. En algunos casos, se puede colocar un polinucleótido con un T-ADN o ADN de transferencia derivado de plantas (P-ADN), de modo que las secuencias de límite del T-ADN izquierdas y derechas, o las secuencias tipo límite derechas e izquierdas del P-ADN, flanqueen o estén en cualquier lado del polinucleótido. La secuencia de polinucleótido entre las dos regiones reguladoras puede ser de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 15 hasta aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 18 hasta aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 18 hasta aproximadamente 40 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 18 hasta aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, o de aproximadamente 18 hasta aproximadamente 25 nucleótidos de longitud.
Por consiguiente, las composiciones que pueden modular (por ejemplo, desregular) la expresión o la actividad de la proteína NtMRP, incluyen polinucleótidos específicos de la secuencia que pueden interferir con la transcripción de uno o más genes NtMRP endógenos; polinucleótidos específicos de secuencia que pueden interferir con la traducción de las transcripciones de ARN NtMRP (por ejemplo, ARNs de hebra doble, siARNs y ribozimas); polipéptidos específicos de secuencia que pueden interferir con la estabilidad de las proteínas NtMRP; polinucleótidos específicos de la secuencia que pueden interferir con la actividad enzimática de la proteína NtMRP o la actividad de enlace de la proteína NtMRP con respecto a substratos o proteínas reguladoras; y anticuerpos que exhiben especificidad para proteína NtMRP; compuestos de molécula pequeña que pueden interferir con la estabilidad de la proteína NtMRP o la actividad enzimática de la proteína NtMRP o la actividad de enlace de la proteína NtMRP; proteínas de dedo de zinc que enlazan al polinucleótido NtMRP; y meganucleasas que tienen actividad hacia el polinucleótido NtMRP.
Un antagonista efectivo puede reducir el transporte de metales pesados (por ejemplo, cadmium) en la hoja (por ejemplo, estructuras de lámina de hoja) en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 0 100%. En una modalidad, los polinucleótidos específicos de la secuencia que pueden interferir con la traducción de la transcripción(s) de ARNi es NtMRP.
La interferencia de ARN ("ARNi") o silenciación de ARN es un proceso conservado de manera evolutiva a través del cual los mARNs específicos pueden ser dirigidos para degradación enzimática. Se debe introducir un ARN de hebra doble (ARN de hebra doble) o producirse a través de una célula (por ejemplo, virus de ARN de hebra doble, o polín ucleótidos de ARNi NtMRP) para iniciar la trayectoria de ARNi. El ARN de hebra doble se puede convertir en múltiples dúplex siARN de 21 a 23 pares bases de longitud ("siARNs") mediante RNases III, las cuales son endon ucleasas específicas de ARN de hebra doble ("Dicer"). Las siARNs pueden ser reconocidas subsecuentemente por complejos de silenciación inducidos por ARN ("RISC") que promueven el no desenrollado de siARN a través de un proceso dependiente de ATP. La hebra antisentido no enrollada del siARN guía el RISC activado al mARN objetivo (por ejemplo, variantes de ARN NtMRP) que comprende una secuencia complementaria para la hebra antisentido siARN. El mARN dirigido y la hebra antisentido pueden formar una hélice de forma-A, y la onda mayor de la hélice de forma-A puede ser reconocida por el RISC activado. El mARN objetivo puede ser disociado mediante RISC activado en un solo sitio definido por el sitio de enlace del extremo 5' de la hebra siARN. El RISC activado puede ser reciclado para catalizar otro evento de disociación.
Los vectores de expresión de ARNi NtMRP que comprenden construcciones de ARNi NtMRP que codifican polinucleótidos de ARNi NtMRP, exhiben actividad de interferencia de ARN reduciendo el nivel de expresión de mARNs NtMRP, pre-mARNs NtMRP, o variantes de ARN NtMRP relacionadas. Los vectores de expresión pueden comprender un promotor colocado en la corriente ascendente y enlazados en forma operable a la construcción de ARNi NtMRP, tal como se describe más adelante. Los vectores de expresión de ARNi NtMRP pueden comprender un promotor de centro mínimo adecuado, una construcción de ARNi NtMRP de interés, una región reguladora de corriente ascendente (5'), una región reguladora de corriente descendente (3'), incluyendo señales de poliadenilación y terminación de transcripción, y otras secuencias conocidas para los expertos en la técnica, tal como diversos marcadores de selección.
Los polinucleótidos NtMRP pueden ser producidos en varias formas, incluyendo como estructuras de hebra doble (esto es, la molécula de ARN de hebra doble que comprende una hebra antisentido y una hebra de sentido complementario), estructuras tipo horquilla de hebra doble ("dsARNi"), estructuras de hebra simple (esto es, una molécula de ssARN que comprende sólo una hebra antisentido). Las estructuras pueden comprender un dúplex, dúplex asimétrico, horquilla o estructura secundaria de horquilla asimétrica, que tiene hebras de sentido y antisentido autocomplementarias. El dsARNi NtMRP puede ser convertido en forma enzimática a dsARNi NtMRP de hebra doble. Una de las hebras del dúplex de siARN NtMRP puede endurecerse a una secuencia complementaria dentro de un mARN NtMRP objetivo, y variantes de ARN NtMRP relacionadas. Los dúplex de siARN/mARN son reconocidos por RISC que puede disociar ARNs NtMRP en múltiples sitios en una forma dependiente de la secuencia, dando como resultado la degradación y el mARN NtMRP objetivo y las variantes de ARN NtMRP relacionadas.
Las moléculas de ARN de hebra doble pueden incluir moléculas de siARN ensambladas de un oligonucleótido simple en una estructura de lazo-tallo, en donde las regiones de sentido y antisentido autocomplementario de la molécula siARN se enlazan por medio de un enlazador(s) a base de polinucleótido o sin base de polinucleótido, así como ARN de hebra simple circular que tiene dos o más estructuras de lazo, y un tallo que comprende hebras de sentido y antisentido autocomplementarias, en donde el ARN circular puede ser procesado ya sea ¡n vivo o in vitro para generar una molécula de siARN activa con la capacidad de transmitir ARNi.
En la presente invención también se describen moléculas de ARN de horquilla pequeñas (shARN), que comprenden una secuencia antisentido específica además de la secuencia de complemento inverso (sentido), normalmente separada por una secuencia espaciadora o de lazo. La disociación del espaciador o lazo proporciona una molécula de ARN de hebra simple y su complemento inverso, de modo que se pueda endurecer para formar una molécula de ARN de hebra doble (opcionalmente con pasos de procesamiento adicionales que pueden dar como resultado la adición o eliminación de uno, dos, tres o más nucleótidos desde el extremo 3' o el extremo 5' de cualquiera o ambas de las hebras). El espaciador puede tener longitud suficiente para permitir que las secuencias antisentido y sentido se endurezcan y formen una estructura de hebra doble (o tallo) antes de la disociación del espaciador (y opcionalmente, pasos de procesamiento subsecuentes que pueden dar como resultado la adición o eliminación de uno, dos, tres, cuatro o más nucleótidos desde el extremo 3' o el extremo 5' de cualquiera o ambas de las hebras). La secuencia espadadora normalmente es una secuencia de nucleótido no relacionada que está situada entre dos regiones de secuencia de nucleótido complementarias, las cuales cuando se endurecen en un polinucleótido de hebra doble, comprenden un shARN. La secuencia espadadora generalmente comprende entre aproximadamente 3 y aproximadamente 100 nucleótidos.
Se puede seleccionar cualquier polinucleótido ARN NtMRP de interés, seleccionando una composición de secuencia adecuada, tamaño de lazo y longitud de tallo para producir el dúplex de horquilla NtMRP. Un rango adecuado para diseñar longitudes de tallo de un dúplex de horquilla, incluye longitudes de tallo de al menos aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos - tal como aproximadamente 14 a 30 nucleótidos, aproximadamente 30 a 50 nucleótidos, aproximadamente 50 a 100 nucleótidos, aproximadamente 100 a 150 nucleótidos, aproximadamente 150 a 200 nucleótidos, aproximadamente 200 a 300 nucleótidos, aproximadamente 300 a 400 nucleótidos, aproximadamente 400 a 500 nucleótidos, aproximadamente 500 a 600 nucleótidos y aproximadamente 600 a 700 nucleótidos. Un rango adecuado para diseñar longitudes de lazo de un dúplex de horquilla incluye longitudes de lazo de aproximadamente 4 a 25 nucleótidos, aproximadamente 25 a 50 nucleótidos, o mayores, si la longitud del tallo del dúplex de horquilla es substancial. En ciertas modalidades, una molécula de ARN de hebra doble o ssARN, tienen de aproximadamente 15 y aproximadamente 40 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, la molécula de siARN es una molécula ARN de hebra doble o ssARN de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 35 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, la molécula de siARN es una molécula de ARN de hebra doble o ssARN de entre aproximadamente 17 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, la molécula de siARN es una molécula de ARN de hebra doble o ssARN de entre aproximadamente 19 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. En otra modalidad, la molécula de siARN es una molécula de ARN de hebra doble o ssARN de entre aproximadamente 21 hasta aproximadamente 23 nucleótidos de longitud. En ciertas modalidades, las estructuras de horquilla con regiones de dúplex más largas a 21 nucleótidos, pueden promover una silenciación efectiva dirigida por siARN, sin importar la secuencia y la longitud del lazo.
La secuencia de mARN objetivo normalmente tiene entre aproximadamente 14 hasta aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. La mARN objetivo, por consiguiente, puede ser escaneada para regiones entre aproximadamente 14 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud que cumplen preferentemente con uno o más de los siguientes criterios para una secuencia objetivo: una proporción A + T/G + C de entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:2; un dinucleótido AA o un dinucleótido CA en el extremo 5' de la secuencia objetivo; una secuencia de al menos 10 nucleótidos consecutivos únicos para el mARN objetivo; y sin "corridas" de más de tres nucleótidos de guanina (G) consecutivos o más de tres nucleótidos de citosina (C) consecutivos. Estos criterios pueden ser evaluados utilizando diversas técnicas conocidas en el arte, por ejemplo, se pueden utilizar programas de cómputo tal como BLAST para buscar en bases de datos públicamente disponibles, para determinar si la secuencia objetivo seleccionada es única para el mARN objetivo. Como alternativa, la secuencia objetivo se puede seleccionar (y una secuencia siARN diseñada) utilizando un software de computadora disponible comercialmente (por ejemplo, OligoEngine.TM. (Seattle, Wash.); Dharmacon, Inc. (Lafayette, Coló.); Target Finder de Ambion Inc. (Austin, Tex.) y siARN Design Tool de Q I AGEN , Inc. (Valencia, Calif.)).
En una modalidad, las secuencias de mARN objetivo se seleccionan para que sean de entre aproximadamente 14 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, de modo que cumplan con uno o más de los criterios anteriores. En otra modalidad, las secuencias objetivo se seleccionan de modo que tengan entre aproximadamente 16 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, de modo que cumplan con uno o más de los criterios anteriores. En una modalidad adicional, las secuencias objetivo se seleccionan de modo que tengan entre aproximadamente 19 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, de modo que cumplan con uno o más de los criterios anteriores. En una modalidad adicional, las secuencias objetivo se seleccionan de modo que tengan entre aproximadamente 19 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, de modo que cumplan con uno o más de los criterios anteriores. En una modalidad de ejemplo, las moléculas de siARN comprenden una secuencia antisentido específica que es complementaria al menos a 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, o más nucleótidos contiguos de cualquiera de las secuencias establecidas en las SEQ ID NOs:1-23.
La secuencia antisentido específica comprendida por la molécula siARN, puede ser idéntica o substancialmente idéntica al complemento de la secuencia objetivo. En una modalidad, la secuencia antisentido específica comprendida en la molécula siARN tiene al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con el complemento de la secuencia mARN objetivo. Los métodos para determinar la identidad de secuencia son conocidos en la técnica y se pueden determinar, por ejemplo, utilizando el programa BLASTN del software del Grupo de Cómputo de la Universidad de Wisconsin (University of Wisconsin Computer Group) (GCG), o proporcionado por el sitio web NCBI.
La secuencia antisentido específica de las moléculas de siARNs aquí descritas pueden exhibir variabilidad mediante diferenciación (por ejemplo, mediante sustitución de nucleótido, incluyendo transición o transversión) en uno, dos, tres, cuatro o más nucleótidos de la secuencia del mARN objetivo. Cuando dichas substituciones de nucleótido están presentes en la hebra antisentido de una molécula de ARN de hebra doble, el nucleótido de complementariedad en la hebra de sentido, con la cual el nucleótido substituto normalmente puede formar emparejamiento base de enlace de hidrógeno, puede o no ser sustituido en forma correspondiente. Las moléculas de ARN de hebra doble en las cuales ocurren una o más substituciones del nucleótido en la secuencia de sentido, pero no en la hebra antisentido, también están contempladas. Cuando la secuencia antisentido de una molécula siARN comprende uno o más desacoplamientos entre la secuencia de nucleótido del siARN y la secuencia de nucleótido objetivo tal como se describió anteriormente, los desacoplamientos pueden encontrarse en el término 3', el término 5' o en la parte central de la secuencia antisentido.
En otra modalidad, las moléculas siARN comprenden una secuencia antisentido específica que tiene la capacidad de hibridar en forma selectiva bajo condiciones estrictas para una parte de un gen objetivo o mARN objetivo que ocurre naturalmente. Las condiciones estrictas adecuadas incluyen, por ejemplo, hibridación de acuerdo con procedimientos de hibridación convencionales, y condiciones de lavado de 1 a 3 veces. Citrato de Sodio Estándar, Sulfato Dodecilo de Sodio 0.1 a 1%, 50 a 70 grados centígrados con un cambio de la solución de lavado después de aproximadamente 5 a 30 minutos. Tal como lo saben los expertos en la técnica, se pueden lograr variaciones en las rigurosidad de las condiciones de hibridación, alterando el tiempo, temperatura o concentración de las soluciones utilizadas para los pasos de hibridación y lavado. Las condiciones adecuadas también pueden depender en parte de las secuencias de nucleótido particulares utilizadas, por ejemplo, las secuencias del mARN o gen objetivo.
Las moléculas ARNi que tienen una estructura dúplex o de hebra doble, por ejemplo ARN de hebra doble o shARN, también pueden tener extremos romos, o pueden tener salientes de 3' o 5'. Tal como se utiliza en la presente invención, "saliente" se refieren al nucleótido o nucleótidos no emparejados que sobresalen de una estructura dúplex cuando un término 3' de una hebra de ARN, se extiende más allá del término 5' de la otra hebra (saliente 3') o viceversa (saliente 5"). Los nucleótidos que comprenden la saliente pueden ser ribonucleótidos, desoxiribonucleótidos, o versiones modificadas de los mismos. En una modalidad, al menos una hebra de la molécula ARNi tiene una saliente 3' de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 6 nucleótidos de longitud. En otras modalidades, la saliente 3* tiene de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 nucleótidos, de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 nucleótidos y de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4 nucleótidos de longitud.
Cuando la molécula ARNi comprende una saliente 3' en un extremo de la molécula, el otro extremo puede ser de extremo romo o también tener una saliente (5' o 3'). Cuando la molécula ARNi comprende una saliente en ambos extremos de la molécula, la longitud de las salientes puede ser la misma o diferente. En una modalidad, la molécula de ARNi aquí descrita comprende salientes 3' de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 nucleótidos en ambos extremos de la molécula. En una modalidad adicional, la molécula de ARNi es un ARN de hebra doble que tiene una saliente 3' de 2 nucleótidos en ambos extremos de la molécula. En otra modalidad, los nucleótidos que comprenden la saliente de ARNi son dinucleótidos TT o dinucleótidos UU.
Cuando se determina el porcentaje de identidad de la molécula de ARNi que comprenden una o más salientes de la secuencia mARN objetivo, la saliente(s) puede o no tomarse en cuenta. Por ejemplo, los nucleótidos de una saliente 3' y de hasta 2 nucleótidos del término 5' o 3' de la hebra doble, se pueden modificar sin pérdida significativa de la actividad de la molécula de siARN.
Las moléculas de ARNi pueden comprender una o más estructuras de tapa 5' o 3". La molécula de ARNi puede comprender una estructura de tapas en el extremo 3' de la hebra de sentido, la hebra antisentido o tanto las hebras de sentido como antisentido; o en el extremo 5' de la hebra sentido, la hebra antisentido o las hebras tanto de sentido como antisentido de la molécula de ARNi. Como alternativa, la molécula de ARNi puede comprender una estructura de tapa tanto en el extremo 3' como en el extremo 5' de la molécula de ARNi. El término "estructura de tapa" se refiere a una modificación química incorporada en cualquier término de un oligon ucleótido (ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,998,203), que protege a la molécula de la degradación de exonucleasa, y también puede facilitar el suministro o localización dentro de una célula.
Otra modificación aplicable a las moléculas de ARNi, es la ligadura química a la molécula de ARNi de una o más porciones o conjugados que incrementan la actividad, distribución celular, captación celular, biodisponibilidad o estabilidad de la molécula de ARNi. Los polinucleótidos pueden ser sintetizados o modificados a través de métodos bien establecidos en la técnica. Las modificaciones químicas pueden incluir, pero no se limitan a modificaciones 2', introducción de bases no naturales, adhesión covalente a un ligando y reemplazo de ligaduras de fosfato con ligaduras de tiofosfato. En esta modalidad, la integridad de la estructura dúplex se refuerza a través de al menos una, y normalmente dos ligaduras químicas. La ligadura química puede lograrse a través de cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas, por ejemplo, introducción de enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno; interacciones hidrofóbicas, interacciones de van der Waals o de apilamiento; por medio de coordinación de ión-metal o a través del uso de análogos de purina.
Aún en otra modalidad, los nucleótidos en una o ambas de las dos hebras simples se puede modificar para modificar para evitar o inhibir la activación de las enzimas celulares, tales como, por ejemplo, sin limitación, ciertas nucleasas. Las técnicas para inhibir la activación de enzimas celulares son conocidas en la técnica e incluyen pero no se limitan a modificaciones 2'-amino, modificaciones 2'-fluoro, modificaciones 2'-a Iq u i lo , modificaciones de esqueleto no cargadas, modificaciones morfolino, modificaciones 2'-0-metilo y fosforamidato. Por lo tanto, al menos un grupo 2'-hidroxilo de los nucleótidos en el ARN de hebra doble, se reemplaza a través de un grupo químico. Asimismo, al menos un nucleótido puede modificarse para formar un nucleótido con cerrojo. Los nucleótidos con cerrojo contienen un puente de metileno o etileno que conecta el 2'-oxígeno de ribosa con el 4'-carbono de ribosa. La introducción de un nucleótido con cerrojo en un oligonucleótido, mejora la afinidad para las secuencias complementarias e incrementa la temperatura de fusión en diversos grados.
Los ligandos se pueden conjugar para una molécula de ARNi, por ejemplo, para incrementar su absorción celular. En cierta modalidad, se conjuga un ligando hidrofóbico para la molécula para facilitar la permeabilidad directa de la membrana celular. Estos métodos han sido utilizados para facilitar la permeabilidad celular de oligonucleótidos antisentido. En ciertos casos, la conjugación de un ligando catiónico para los oligonucleótidos con frecuencia da como resultado resistencia mejorada a las nucleasas. Los ejemplos representativos de ligandos catiónicos son propilamonio y dimetilpropilamonio. Los oligonucleótidos antisentido pueden retener su alta afinidad de enlace a mARN, cuando el ligando catiónico se dispersa a lo largo del oligonucleótido.
Las moléculas y nucleótidos aquí descritos se pueden preparar utilizando técnicas bien conocidas de síntesis de fase sólida. Cualquier otro medio para la síntesis conocida en la técnica puede ser empleada en forma adicional o alternativa.
Se dirigen diversas modalidades a vectores de expresión NtMRP (por ejemplo, vectores de expresión NtMRP3) que comprenden el polinucleótido NtMRP o las construcciones de ARNi NtMRP que comprenden una o más de: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 51, intrón 1 (SEQ ID NO:30), intrón 2 (SEQ ID NO:31), intrón 3 (SEQ ID NO:32), intrón 4 (SEQ ID NO:33), intrón 5 (SEQ ID NO:34), intrón 6 (SEQ ID NO:35), intrón 7 (SEQ ID NO:36), intrón 8 (SEQ ID NO:37), intrón 9 (SEQ ID NO:38), intrón 10 (SEQ ID NO:39), exón 1 (SEQ ID NO:40), exón 2 (SEQ ID NO:41), exón 3 (SEQ ID NO:42) exón 4 (SEQ ID NO:43), exón 5 (SEQ ID NO:44), exón 6 (SEQ ID NO:45) exón 7 (SEQ ID NO:46) exón 8 (SEQ ID NO:47), exón 9 (SEQ ID NO:48) exón 10 (SEQ ID NO:49) o exón 11 (SEQ ID NO:50) y fragmentos de las mismas, y variantes de las mismas. Tal como se describe en la presente invención, la referencia a las secuencias especificas también incluye el complemento o complemento inverso de las mismas.
Se dirigen varias modalidades a los vectores de expresión NtMRP (por ejemplo, vectores de expresión NtMRP4) que comprenden el polinucleótido NtMRP o las construcciones ARNi NtMRP que comprenden una o más de: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:27, intrón 1 (SEQ ID NO:3), intrón 2 (SEQ ID NO:4), intrón 3 (SEQ ID NO:5), intrón 4 (SEQ ID NO:6), intrón 5 (SEQ ID NO:7), intrón 6 (SEQ ID NO:8), intrón 7 (SEQ ID NO:9), intrón 8 (SEQ ID NO:10), intrón 9 (SEQ ID NO:11), ¡ntrón 10 (SEQ ID NO:12), exón 1 (SEQ ID NO:13), exón 2 (SEQ ID NO:14), exón 3 (SEQ ID NO:15) exón 4 (SEQ ID NO:16), exón 5 (SEQ ID NO:17), exón 6 (SEQ ID NO:18) exón 7 (SEQ ID NO:19) exón 8 (SEQ ID NO:20), exón 9 (SEQ ID NO:21) exón 10 (SEQ ID NO:22), exón 11 (SEQ ID NO:53) o SEQ ID No. 23 y fragmentos de las mismas y variantes de las mismas. Tal como se describe en la presente invención, la referencia a las secuencias específicas también incluyen el complemento o complemento inverso de las mismas.
Se dirigen varias modalidades a vectores de expresión que comprenden: uno o más polinucleótido(s) NtMRP o construcciones ARNi NtMRP (por ejemplo, polinucleótido NtMRP3 o construcciones de ARNi NtMRP3) que tienen al menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, intrón 1 (SEQ ID NO:30), intrón 2 (SEQ ID NO:31), intrón 3 (SEQ ID NO:32), intrón 4 (SEQ ID NO:33), intrón 5 (SEQ ID NO:34), intrón 6 (SEQ ID NO:35), intrón 7 (SEQ ID NO:36), intrón 8 (SEQ ID NO:37), intrón 9 (SEQ ID NO:38), intrón 10 (SEQ ID NO:39), exón 1 (SEQ ID NO:40), exón 2 (SEQ ID NO:41), exón 3 (SEQ ID NO:42) exón 4 (SEQ ID NO:43), exón 5 (SEQ ID NO:44), exón 6 (SEQ ID NO:45) exón 7 (SEQ ID NO:46) exón 8 (SEQ ID NO:47), exón 9 (SEQ ID NO:48), exón 10 (SEQ ID NO:49), exón 11 (SEQ ID NO:50) o SEQ ID NO;51 y fragmentos de las mismas y variantes de las mismas, o una combinación de dos o más de las mismas. Tal como aquí se describe, la referencia a las secuencias específicas también incluyen el complemento o complemento inverso de las mismas.
Se dirigen varias modalidades a los vectores de expresión que comprenden: el polinucleótido NtMRP o construcciones de ARNi NtMRP (por ejemplo, polinucleótido NtMRP4 o construcciones de ARNi NtMRP4) que tienen al menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, intrón 1 (SEQ ID NO:3), intrón 2 (SEQ ID NO:4), intrón 3 (SEQ ID NO:5), intrón 4 (SEQ ID NO:6), intrón 5 (SEQ ID NO:7), intrón 6 (SEQ ID NO:8), intrón 7 (SEQ ID NO:9), intrón 8 (SEQ ID NO:10), intrón 9 (SEQ ID NO:11), intrón 10 (SEQ ID NO:12), exón 1 (SEQ ID NO:13), exón 2 (SEQ ID NO:14), exón 3 (SEQ ID NO:15) exón 4 (SEQ ID NO:16), exón 5 (SEQ ID NO:17), exón 6 (SEQ ID NO:18) exón 7 (SEQ ID NO:19) exón 8 (SEQ ID NO:20), exón 9 (SEQ ID NO:21) exón 10 (SEQ ID NO:21), exón 11 (SEQ ID NO:22) o SEQ ID No. 23 y fragmentos de las mismas y variantes de las mismas o una combinación de dos o más de las mismas. Tal como se describe en la presente invención, la referencia a las secuencias específicas también incluye el complemento o complemento inverso de las mismas.
Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión que comprenden: el polinucleótido NtMRP o una construcción ARNi NtMRP que codifica el polinucleótido de ARNi NtMRP (por ejemplo, polinucleótido NtMRP3 o construcciones de ARNi NtMRP3 que codifican los polinucleótidos de ARNi NtMRP3) con la capacidad de autoendurecimiento para formar una estructura de horquilla, en donde la construcción comprende (a) una primera secuencia que tiene al menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, intrón 1 (SEQ ID NO:30), intrón 2 (SEQ ID NO:31), intrón 3 (SEQ ID NO:32), intrón 4 (SEQ ID NO:33), intrón 5 (SEQ ID NO:34), intrón 6 (SEQ ID NO:35), intrón 7 (SEQ ID NO:36), intrón 8 (SEQ ID NO:37), intrón 9 (SEQ ID NO:38), intrón 10 (SEQ ID NO:39), exón 1 (SEQ ID NO:40), exón 2 (SEQ ID NO:41), exón 3 (SEQ ID NO:42) exón 4 (SEQ ID NO:43), exón 5 (SEQ ID NO:44), exón 6 (SEQ ID NO:45) exón 7 (SEQ ID NO:46), exón 8 (SEQ ID NO:47), exón 9 (SEQ ID NO:48), exón 10 (SEQ ID NO:49), exón 11 (SEQ ID NO:50) o SEQ ID NO:51 y fragmentos de las mismas, y variantes de las mismas, o una combinación de dos o más de las mismas; (b) una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador de la misma que forma un lazo de la estructura de horquilla; y (c) una tercera secuencia que comprende una secuencia de complementariedad inversa de la primera secuencia, colocada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia está colocada entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia está enlazada en forma operable a la primera secuencia y a la tercera secuencia. Tal como aquí se describe, la referencia a las secuencias específicas también incluye el complemento o complemento inverso de las mismas.
Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión que comprenden: el polin ucleótido NtMRP o la construcción de ARNi NtMRP que codifica los polinucleótidos de ARNi NtMRP (por ejemplo, polinucleótido NtMRP4 o construcciones de ARNi NtMRP4 que codifican los polinucleótidos de ARNi NtMRP4) con la capacidad de autoendurecimiento para formar una estructura de horquilla, en donde la construcción comprende (a) una primera secuencia que tiene al menos el 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, intrón 1 (SEQ ID NO:3), intrón 2 (SEQ ID NO:4), intrón 3 (SEQ ID NO:5), intrón 4 (SEQ ID NO:6), intrón 5 (SEQ ID NO:7), intrón 6 (SEQ ID NO:8), intrón 7 (SEQ ID NO:9), intrón 8 (SEQ ID NO:10), intrón 9 (SEQ ID NO:11), intrón 10 (SEQ ID NO:12), exón 1 (SEQ ID NO:13), exón 2 (SEQ ID NO:14), exón 3 (SEQ ID NO:15) exón 4 (SEQ ID NO:16), exón 5 (SEQ ID NO:17), exón 6 (SEQ ID NO:18) exón 7 (SEQ ID NO:19) exón 8 (SEQ ID NO:20), exón 9 (SEQ ID NO:21) exón 10 (SEQ ID NO:22), exón 11 (SEQ ID NO:53), SEQ ID No. 23 o SEQ ID NO:51 y fragmentos de las mismas, y variantes de las mismas, o una combinación de dos o más de las mismas, (b) una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador de la misma, que forma un lazo de la estructura de horquilla; y (c) una tercera secuencia que comprende una secuencia de complementariedad inversa de la primera secuencia, colocada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia se coloca entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia se enlaza en forma operable a la primera secuencia y a la tercera secuencia. Tal como aquí se describe, la referencia a las secuencias específicas también incluye el complemento o complemento inverso de las mismas.
Las secuencias descritas se pueden utilizar para construir diversos polinucleótidos NtMRP que no forman estructuras de horquilla. Por ejemplo, se puede formar un ARN de hebra doble NtMRP mediante (1) transcripción de una primera hebra del cADN NtMRP mediante ligadura operable a un primer promotor, y (2) transcripción de la secuencia complementaria inversa de la primera hebra del fragmento de cADN NtMRP mediante ligadura operable a un segundo promotor. Cada hebra del polinucleótido NtMRP se puede transcribir del mismo vector de expresión, o de diferentes vectores de expresión. El dúplex de ARN NtMRP que tiene la actividad de interferencia ARN, puede ser convertida en forma enzimática a siARNs para reducir los niveles ARN NtMRP.
Varias modalidades se dirigen a vectores de expresión de NtMRP que comprenden el polinucleótido NtMRP o una construcción de ARNi NtMRP que codifica los polinucleótidos de ARNi NtMRP (por ejemplo, vectores de expresión de NtMRP3 que comprenden el polinucleótido NtMRP3 o construcciones de ARNi NtMRP3 que codifican los polinucleótidos de ARNi NtMRP3) con la capacidad de autoendurecimiento, en donde la construcción comprende (a) una primera secuencia que tiene al menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50 y SEQ ID NO:51, y fragmentos de las mismas, y variantes de las mismas, o una combinación de dos o más de las mismas; y (b) una segunda secuencia que comprende una secuencia complementaria (por ejemplo, complementariedad inversa) de la primera secuencia, colocada en la misma orientación que la primera secuencia. Tal como aquí se describe, la referencia a las secuencias específicas también incluye el complemento o complemento inverso de las mismas.
Otras modalidades se dirigen a los vectores de expresión NtMRP que comprenden el polinucleótido NtMRP o una construcción de ARNi NtMRP que codifica los polinucleótidos de ARNi NtMRP (por ejemplo, vectores de expresión NtMRP4 que comprenden el polinucleótido NtMRP4 o las construcciones de ARNi NtMRP4 que codifican los polinucleótidos de ARNi NtMRP4) con la capacidad de autoendurecimiento, en donde la construcción comprende (a) una primera secuencia que tiene al menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID No. 23, SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO: 53 y fragmentos de las mismas, y variantes de las mismas, o una combinación de dos o más de las mismas; y (b) una segunda secuencia que comprende una secuencia complementaria (por ejemplo, complementariedad inversa) de la primera secuencia, colocada en la misma orientación que la primera secuencia. Tal como aquí se describe, la referencia a las secuencias específicas también incluye el complemento o complemento inverso de las mismas.
Se proporcionan varias composiciones y métodos para modular (por ejemplo, reducir) los niveles de expresión endógena para miembros de la familia de gen NtMRP, promoviendo la cosupresión de la expresión de gen NtMRP. El fenómeno de la cosupresión ocurre como el resultado de introducir múltiples copias de un transgen en un huésped de célula de planta. La integración de múltiples copias de un transgen puede dar como resultado la expresión reducida del transgen y el gen endógeno dirigido. El grado de co-supresión depende del grado de identidad de secuencia entre el transgen y el gen endógeno dirigido. La silenciación tanto del gen endógeno como del transgen, puede ocurrir mediante la metilación extensa del lugar silenciado (esto es, el promotor endógeno y el gen endógeno de interés) que puede excluir la transcripción. Como alternativa, en algunos casos, la cosupresión del gen endógeno y el transgen puede ocurrir mediante silenciación del gen post-transcripción ("PTGS"), en donde las transcripciones pueden ser producidas, aunque los rangos de degradación incrementados excluyen la acumulación de transcripciones. El mecanismo para co-supresión mediante PTGS, se considera que se asemeja a la interferencia de ARN, ya que ARN parece ser tanto un iniciador importante como un objetivo en estos procesos, y puede transmitirse al menos en parte por la misma maquinaria molecular, posiblemente a través de la degradación de mARNs guiada por ARN.
La cosupresión del polinucleótido NtMRP se puede lograr integrando múltiples copias del cADN NtMRP o fragmentos de las mismas, como transgenes, en el genoma de la planta de interés. La planta huésped puede ser transformada con un vector de expresión que comprende un promotor ligado en forma operable al cADN NtMRP o fragmentos del mismo. Se dirigen varias modalidades a vectores de expresión para promover la cosupresión de genes endógenos de NtMRP que comprenden: un promotor enlazado en forma operable a NtMRP (por ejemplo, cADN NtMRP) identificado como SEQ ID NO: 1 , SEO. ID NO:2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 51 o un fragmento de las mismas - tal como cualquiera de las SEQ ID NOs 3 a 23 o 30 a 50 - o una variante de las mismas que tiene al menos aproximadamente 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con las mismas.
Se dirigen varias modalidades a métodos para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) el nivel de expresión del polinucleótido NtMRP integrando múltiples copias de polinucleótido NtMRP (por ejemplo, cADN NtMRP) identificadas como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID No. 28 o SEQ ID No. 29 o SEQ ID NO: 51 o un fragmento de las mismas - tal como cualquiera de las SEQ ID NOs 3 a 23 o 30 a 50 o 53 - o una variante de las mismas que tiene al menos aproximadamente 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%. 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con las mismas en un genoma de planta, en donde los métodos comprenden: transformar un huésped de célula de planta con un vector de expresión que comprende un promotor ligado en forma operable a SEQ ID NO:1 , SEQ ID N0.2, SEQ ID No. 28 o SEQ ID No. 29 o SEQ ID NO: 51 o un fragmento de las mismas - tal como cualquiera de las SEQ ID NOs 3 a 23 o 30 a 50 - o una variante de las mismas que tienen al menos aproximadamente 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con las mismas.
Se proporcionan varias composiciones y métodos para reducir el nivel de expresión de gen endógeno de NtMRP, inhibiendo la traducción del mARN NtMRP. La célula planta huésped puede ser transformada con un vector de expresión que comprende: un promotor ligado en forma operable al polinucleótido NtMRP o una variante o fragmento del mismo, colocado en una orientación antisentido con respecto al promotor para permitir la expresión de los polinucleótidos ARN que tiene una secuencia complementaria para una parte del mARN NtMRP.
Diversos vectores de expresión para inhibir la traducción del mARN NtMRP pueden comprender: un promotor ligado en forma operable a NtMRP (por ejemplo, cADN NtMRP) identificado como SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:27 o SEQ ID No, 28 o SEQ ID No. 29 o SEQ ID NO.51 o un fragmento de las mismas - tal como cualquiera de las SEQ ID NOs 3 a 23 o 30 a 50 o 53 - o variante de las mismas que tienen al menos aproximadamente 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con las mismas, en donde la secuencia se coloca en una orientación antisentido con respecto al promotor. La longitud de los polinucleótidos de ARN NtMRP antisentido, pueden variar, y pueden ser de aproximadamente 15 a 20 nucleótidos, de aproximadamente 20 a 30 nucleótidos, de aproximadamente 30 a 50 nucleótidos, de aproximadamente 50 a 75 nucleótidos, de aproximadamente 75 a 100 nucleótidos, de aproximadamente 100 a 150 nucleótidos, de aproximadamente 150 a 200 nucleótidos, y de aproximadamente 200 a 300 nucleótidos.
También se proporcionan métodos para obtener polinucleótidos y polipéptidos NtMRP mutantes. Cualquier planta de interés, incluyendo una célula de planta o material de planta, se pueden modificar en forma genética a través de varios métodos conocidos para inducir mutagénesis, incluyendo mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis dirigida a oligonucleótido, mutagénesis inducida químicamente, mutagénesis inducida por irradiación, mutagénesis que utiliza bases modificadas, mutagénesis que utiliza ADN dúplex con salto, mutagénesis de descomposición de hebra doble, mutagénesis que utiliza cepas huésped con deficiencia de reparación, mutagénesis mediante síntesis de gen total, revoltura de ADN y otros métodos equivalentes.
Como alternativa, se pueden dirigir genes NtMRP para desactivación, introduciendo transposones (por ejemplo, elementos IS) en los genomas de la planta de interés. Estos elementos genéticos móviles se pueden introducir mediante fertilización cruzada y los mutantes de inserción se pueden clasificar para pérdida de actividad de proteína NtMRP, tal como un transporte de cadmio reducido. El gen NtMRP interrumpido en una planta de origen, se puede introducir en otras plantas cruzando la planta de origen con una planta no sometida a mutagénesis inducida por transposón, por ejemplo, mediante fertilización sexual cruzada. Se pueden utilizar cualquiera técnicas de reproducción estándar conocidas para los expertos en la técnica. En una modalidad, se pueden desactivar uno o más genes relacionados con NtMRP mediante la inserción de uno o más transposones. Las mutaciones pueden dar como resultado la interrupción homocigótica de uno o más genes NtMRP, en una interrupción heterocigosa de uno o más genes NtMRP, o una combinación de interrupciones tanto homocigosas como heterocigosas, si se interrumpe más de un gen NtMRP. Los elementos que tienen la capacidad de transponer adecuados se pueden seleccionar de dos amplias clases, designadas como Clase I y Clase II. Los elementos que tienen la capacidad de transponer Clase I adecuados incluyen retrotransposones, retroposones, y elementos tipo SINE. Dichos métodos son conocidos para los expertos en la técnica.
Como alternativa, los genes NtMRP se pueden dirigir para desactivación introduciendo ribozimas derivadas de un número de ARNs circulares pequeños que tienen la capacidad de autodisociación y réplica en plantas. Estos ARNs se pueden replicar ya sea solos (ARNs viroide) o con virus auxiliares (ARNs satelitales). Los ejemplos de ARNs adecuados incluyen los derivados de viroide de veteado marrón rojizo de aguacate y ARNs satelitales derivados de virus de mancha anular de tabaco, virus de rayado temporal de lucerna, virus con motas de tabaco aterciopelado, virus con motas de solanum y virus con motas de clavel subterráneo. Varias ribozimas específicas de ARN objetivo son conocidas por los expertos en la técnica.
En algunas modalidades, la expresión de un polipéptido NtMRP, se modula, reduce o inhibe a través de un medio no transgénico, tal como a través de la creación de una mutación en un gen NtMRP, incluyendo un gen NtMRP3 y/o NtMRP4. Los métodos que introducen una mutación en forma aleatoria en una secuencia de gen, pueden incluir mutagénesis química, mutagénesis EMS y mutagénesis por radiación. Los métodos que introducen una o más mutaciones dirigidas en una célula, incluyen pero no se limitan a tecnología de edición de genoma, particularmente mutagénesis transmitida por nucleasa de dedo de zinc, arado (dirección de lesiones locales inducidas en genoma), recombinación homologa, mutagénesis dirigida por oligonucleótido y mutagénesis transmitida por meganucleasa.
Algunos ejemplos de mutaciones son eliminaciones, inserciones y mutaciones de sentido erróneo de al menos un nucleótido, polimorfismo de nucleótido simple (SNPs), una repetición de secuencia simple. Después de la mutación, la clasificación se puede llevar a cabo para identificar eliminaciones que crean codones de detención prematuros o genes NtMRP de otra manera no funcionales. La clasificación de mutantes se puede llevar a cabo mediante secuenciación , o a través del uso de una o más sondas o cebadores específicos del gen o proteína NtMRP. Las mutaciones específicas en los polinucleótidos NtMRP también se pueden crear de modo que den como resultado una expresión de gen NtMRP disminuida, estabilidad disminuida de mARN NtMRP, o estabilidad disminuida de la proteína NtMRP. Las plantas son referidas en la presente invención como plantas o plantas mutadas que "no ocurren naturalmente".
Las plantas mutantes y que no tienen origen natural pueden tener cualquier combinación de una o más mutaciones que den como resultado niveles de polipéptido NtMRP reducidos. Por ejemplo, las plantas pueden tener una mutación simple en un gen NtMRP simple o mutaciones múltiples en un gen NtMRP simple. Por lo tanto se describen, las plantas mutantes o que no tienen origen natural (por ejemplo, plantas de tabaco mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas y similares, tal como aquí se describen) que comprenden las variantes de polipéptido mutante de NtMRP, NtM RP3 y NtMRP4.
En una modalidad, se mutagenizan semillas de plantas y posteriormente se crecen en las plantas mutantes de primera generación. Posteriormente las plantas de primera generación se dejan autopolinar y las semillas de la planta de primera generación se crecen en plantas de segunda generación, las cuales posteriormente se clasifican para mutaciones en su lugar NtMRP. Aunque el material de la planta mutagenizada puede ser clasificado para mutaciones, una ventaja de clasificar las plantas de segunda generación es que todas las mutaciones somáticas corresponden a mutaciones de línea germinal. Un experto en la técnica podrá comprender que se pueden mutagenizar una variedad de materiales de planta, incluyendo pero sin limitarse a semillas, polen, tejido de planta o células de planta, con el objeto de crear plantas mutadas mediante NtMRP. Sin embargo, el tipo de material de planta mutagenizado puede afectarse cuando el polinucleótido de la planta se clasifica para mutaciones. Por ejemplo, cuando se somete el polen a mutágenesis antes de la polinización de una planta no mutagenizada, las semillas que resultan de dicha polinización, se crecen en plantas de primera generación. Cada célula de las plantas de primera generación contendrán mutaciones creadas en el polen; por lo tanto están plantas de primera generación posteriormente pueden ser clasificadas para mutaciones NtMRP en lugar de esperar hasta la segunda generación .
Los mutagenes que crean principalmente mutaciones de punta y eliminaciones, inserciones, transversiones y/o transiciones cortas, incluyendo mutagénesis o radiación química, se pueden utilizar para crear las mutaciones. Los mutagenes incluyen, pero no se limitan a metanosulfonato de etilo, (EMS), sulfonato de metilmetano (MMS), N-etil-N-nitrosurea (ENU), trietilmelamina (TEM), N-metil-N-nitrosourea (MNU), procarbazina, clorambucil, ciclofosfamida, sulfato de dietilo, monómero de acrilamida, melfalan, mostaza de nitrógeno, vincristina, dimetilnitrosamina, N-metil-N'-nitro-Nitrosoguanidina (MNNG), nitrosoguanidina, 2-aminopurina, 7,12 dimetil-benz(a)antraceno (DMBA), óxido de etileno, hexametilfosforamida, bisulfan, diepoxialcanos (diepoxioctano (DEO), diepoxibutano (BEB), y similares), diclorhidrato de 2-metoxi-6-cloro-9[3-(etil-2-cloro-etil)aminopropilamino]acridina (ICR-170), y formaldehído. Las mutaciones espontáneas en el locus NtMRP que no pueden haber sido causadas directamente por el mutagen, también están contempladas siempre que den como resultado el fenotipo deseado aquí descrito. Los agentes mutagénicos adecuados también incluyen, por ejemplo, radiación por ionización - tal como rayos X, rayos gamma, radiación de neutrón rápida y radiación UV.
Cualquier método de preparación de polinucleótido de plantas conocidos por los expertos en la técnica, se puede utilizar para preparar el polinucleótido de planta para clasificación de mutación NtMRP.
El polinucleótido preparado de plantas individuales puede ser reunido opcionalmente con el objeto de acelerar la clasificación para mutaciones en el gen NtMRP de toda la población de plantas que se originan desde el tejido de planta mutageneizado. Una o más generaciones de plantas, células de plantas o material de planta subsecuentes pueden ser clasificadas. El tamaño del grupo opcionalmente recolectado, depende de la sensibilidad del método de clasificación utilizado.
Después de que las muestras de polinucleótido se reúnen opcionalmente, se pueden someter a técnicas de amplificación específica de polinucleótido NtMRP, tal como Reacción de Cadena de Polimerasa (PCR). Cualquiera de uno o más cebadores o sondas específicos del gen NtMRP o las secuencias inmediatamente adyacentes al gen NtMRP, se pueden utilizar para amplificar las secuencias NtMRP dentro de la muestra de polinucleótido reunida. Preferentemente, el uno o más cebadores o sondas se diseñan para amplificar las regiones del locus NtMRP, en donde lo más probable es que surjan mutaciones útiles. Más preferentemente, el uno o más cebadores o sondas se diseñan para detectar mutaciones dentro de las regiones exónicas del polinucleótido NtMRP. Además, es preferible que el uno o más cebadores o sondas eviten sitios polimórficos conocidos, con el objeto de facilitar la clasificación de las mutaciones de punta. Para facilitar la detección de productos de amplificación, la una o más cebadores o sondas se pueden etiquetar utilizando cualquier método de etiquetado convencional. Uno o más cebadores o sondas se pueden diseñar con base en las secuencias NtMRP aquí descritas, utilizando métodos que son bien comprendidos en la técnica. Los polimorfismos se pueden identificar por medios conocidos en la técnica.
En un aspecto adicional se proporciona un método para preparar una planta mutante. El método implica proporcionar al menos una célula de una planta que comprende un gen que codifica el polipéptido NtMRP funcional. Posteriormente, la al menos una célula de la planta se trata bajo condiciones efectivas para modular la actividad del gen NtMRP. La al menos una célula de planta mutante posteriormente se propaga en una planta mutante, en donde la planta mutante tiene un nivel modulado de polipéptido NtMRP en comparación con el de una planta de control. En una modalidad de este método para elaborar una planta mutante, el paso de tratamiento implica someter al menos una célula a un agente de mutagenización químico tal como se describió anteriormente y bajo condiciones efectivas para producir al menos una célula de planta mutante. En otra modalidad de este método, el paso de tratamiento implica someter al menos una célula a una fuente de radiación bajo condiciones efectivas para producir al menos una célula de planta mutante. El término "planta mutante" incluye plantas mutantes en las cuales el genotipo se modifica en comparación con una planta de control, en forma adecuada por medio de otra modificación genética o diseño genético.
En ciertas modalidades, la planta mutante, célula de planta mutante o material de planta mutante puede comprender una o más mutaciones que han ocurrido naturalmente en otra planta, célula de planta o material de planta y confiere en un rasgo deseado. Esta mutación se puede incorporar (por ejemplo, introgresar) en otra planta, célula de planta o material de la planta (por ejemplo, una planta, célula de planta, material de planta con un diferente antecedente genético a la planta de la cual se derivó la mutación) para conferir el rasgo a la misma. Por lo tanto, a manera de ejemplo, una mutación que ocurrió naturalmente en una primera planta puede ser introducida en una segunda planta - tal como una segunda planta con un diferente antecedente genético a la primera planta. Los expertos en la técnica por consiguiente tienen la capacidad de buscar e identificar una planta que lleva naturalmente en su genoma uno o más alelos mutantes del gen NtMRP que confiere un rasgo deseado. El alelo(s) mutante que ocurre naturalmente puede ser transferido a la segunda planta a través de métodos que incluyen reproducción, retrocruce e introgresión para producir líneas, variedades o híbridos que tienen una o más mutaciones en el gen NtMRP. Las plantas que muestran un rasgo deseado pueden ser clasificadas de un conjunto de plantas mutantes. En forma adecuada, la selección se lleva a cabo utilizando el conocimiento de las secuencias de nucleótido NtMRP tal como aquí se describen. En consecuencia, es posible clasificar un rasgo genético que es indicativo de niveles modulados (por ejemplo disminuido) de cadmio en comparación con un control. Dicho método de clasificación puede implicar la aplicación de técnicas convencionales de amplificación y/o hibridación de polinucleótido, tal como aquí se describen. Por lo tanto, un aspecto adicional se refiere a un método para identificar una planta mutante que comprende los pasos de: (a) proporcionar una muestra que comprende un polinucleótido NtMRP de una planta; y (b) determinar la secuencia de polinucleótido del polinucleótido NtMRP, en donde una diferencia en la secuencia del polinucleótido NtMRP en comparación con el polinucleótido NtMRP de una planta de control, indica que la planta es una planta mutante NtMRP. En otro aspecto, se proporciona un método para identificar una planta mutante que acumula niveles modulados (por ejemplo disminuido) de cadmio en comparación con una planta de control, en donde el método comprende los pasos de: (a) proporcionar una muestra de una planta que será clasificada; (b) determinar si la muestra comprende una o más mutaciones en el polinucleótido NtMRP; y (c) determinar el contenido de cadmio en al menos una parte de la planta; en donde si la muestra comprende una o más mutaciones en el polinucleótido NtMRP que modula (por ejemplo disminuido) la expresión o la actividad de la proteína codificada, en comparación con una planta de control y al menos una parte de la planta tiene un contenido de cadmio modulado (por ejemplo disminuido) en comparación con una planta de control en la cual la expresión o la actividad de NtMRP no ha sido modulada (por ejemplo disminuido) es indicativa de una planta mutante que ocurre naturalmente, que acumula niveles modulados (por ejemplo disminuido) de cadmio. En otro aspecto, se proporciona un método para preparar una planta mutante que acumula niveles modulados (por ejemplo disminuido) de cadmio en comparación con una planta de control, en donde el método comprende los pasos de: (a) proporcionar una muestra de una primera planta; (b) determinar si la muestra comprende una o más mutaciones en el polinucleótido NtMRP que da como resultado niveles modulados (por ejemplo disminuido) de cadmio en la misma; y (c) transferir la una o más mutaciones en una segunda planta. La mutación(s) puede ser transferida en la segunda planta utilizando varios métodos que son conocidos en la técnica - tal como mediante diseño genético, manipulación genética, introgresión, reproducción de plantas, retrocruce y similares. En una modalidad, la primera planta es una planta que ocurre naturalmente. En una modalidad, la segunda planta tiene un diferente antecedente genético a la primera planta. En otro aspecto, se proporciona un método para preparar una planta mutante que acumula niveles modulados (por ejemplo disminuido) de cadmio en comparación con una planta de control, en donde el método comprende los pasos de: (a) proporcionar una muestra de una primera planta; (b) determinar si la muestra comprende una o más mutaciones en el polinucleótido NtMRP que dan como resultado niveles modulados (por ejemplo disminuido) de cadmio en la misma; y (c) introgresar la una o más mutaciones de la primera planta en una segunda planta. En una modalidad, el paso de introgresión comprende reproducción de la planta, incluyendo opcionalmente retrocruce y similares. En una modalidad, la primera planta es una planta que ocurre naturalmente. En una modalidad, la segunda planta tiene un diferente antecedente genético a la primera planta. En una modalidad, la primera planta no es un cultivo o un cultivo élite. En una modalidad, la segunda planta es un cultivo o cultivo élite. Un aspecto adicional se refiere a una planta mutante (incluyendo una planta mutante de cultivo o cultivo élite) obtenida o que se puede obtener a través de los métodos aquí descritos. En ciertas modalidades, las plantas mutantes pueden tener una o más mutaciones localizadas únicamente en una región específica de la planta - tal como dentro de la secuencia del polinucleótido Nt RP. De acuerdo con esta modalidad, la secuencia genómica restante de la planta mutante, será la misma o sustancialmente la misma a la planta antes de la mutagénesis.
En ciertas modalidades, las plantas mutantes pueden tener una o más mutaciones localizadas en más de una región de la planta - tal como dentro de la secuencia del polinucleótido NtMRP y en una o más regiones adicionales del genoma. De acuerdo con esta modalidad, la secuencia genómica restante de la planta mutante no será la misma, o no será sustancialmente la misma que la planta antes de la mutagénesis. En ciertas modalidades, las plantas mutantes pueden no tener una o más mutaciones en uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más exones del polinucleótido NtMRP; o pueden no tener una o más mutaciones en uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más o cinco o más intrones del polinucleótido NtMRP; o pueden o no tener una o más mutaciones en un promotor del polinucleótido NtMRP; o pueden o no tener una o más mutaciones en la región no traducida 3' del polinucleótido NtMRP; o pueden o no tener una o más mutaciones en la región no traducida 5' del polinucleótido NtMRP; o pueden o no tener una o más mutaciones en la región de codificación del polinucleótido NtMRP; o pueden o no tener una o más mutaciones en la región sin codificación del polinucleótido de NtMRP; o cualquier combinación de dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más o seis o más partes de las mismas.
En un aspecto adicional, se proporciona un método para identificar una planta, una célula de planta o un material de planta que comprende una mutación en el gen que codifica NtMRP, en donde el método comprende: (a) someter una planta, una célula de planta o un material de planta a mutagénesis; (b) obtener una muestra de polinucleótido de la planta, célula de planta o material de planta o descendentes de la misma; y (c) determinar la secuencia de polinucleótido del gen que codifica NtMRP o una variante o fragmento de la misma, en donde una diferencia en la secuencia es indicativa de una o más mutaciones en la misma.
Se pueden utilizar proteínas de dedo de zinc para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión o actividad de NtMRP. En varias modalidades, la secuencia de polinucleótido genómica, comprende una parte o toda la secuencia de codificación de un polinucleótido NtMRP que se modifica mediante mutagénesis transmitida por nucleasa de dedo de zinc. La secuencia de polinucleótido genómica se busca en un sitio único para enlace de proteína de dedo de zinc. Como alternativa, la secuencia de polinucleótido genómica se busca para dos sitios únicos para el enlace de proteína de dedo de zinc, en donde ambos sitios están en hebras opuestas y casi juntas, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más pares base de separación. Por consiguiente, se proporcionan proteínas de dedo de zinc que enlazan a polinucleótidos NtMRP. Un dominio o motivo de enlace de ADN de dedo de zinc consiste en aproximadamente 30 aminoácidos que se doblan en una estructura beta-beta-alfa de la cual la hélice alfa (a-hélice) se inserta en la hélice doble de ADN. Una "hélice alfa" se refiere a un motivo en la estructura secundaria de una proteína que está embobinado ya sea hacia el lado derecho o izquierdo, en donde el hidrógeno de cada grupo N-H de un aminoácido, está enlazado al grupo C = 0 de un aminoácido en la posición -4 relativa al primer aminoácido. Tal como se utiliza en la presente invención, un "barril beta" (ß-barril) se refiere a un motivo en la estructura secundaria en la proteína que comprende dos hebras beta (ß-hebras) en las cuales la primera hebra es hidrógeno enlazado a una segunda hebra, para formar una estructura cerrada. El término "una estructura beta-beta-alfa" tal como aquí se utiliza, se refiere a una estructura en una proteína que consiste en un barril ß que comprende dos hebras ß antiparalelas y una a-hélice. El término "dominio de enlace de ADN de dedo de zinc" se refiere a un dominio de proteína que comprende un ión de zinc y que tiene la capacidad de enlazar a una secuencia de ADN de tres pares base específicos. El término "dominio de enlace ADN de dedo de zinc no natural" se refiere a un dominio de enlace de ADN de dedo de zinc quen o tiene origen en la célula u organismo que comprende el ADN para el cual se puede modificar.
Los aminoácidos clave dentro de un dominio de enlace de ADN de dedo de zinc o motivo que enlaza la secuencia de tres pares base dentro del área no objetivo, son los aminoácidos -1, + 1, + 2, +3, +4, +5 y +6 relativos al comienzo de la hélice alfa (a-hélice). Los aminoácidos en la posición -1, +1, +2, +3, +4, +5 y +6 relativa al comienzo de la a-hélice de un dominio o motivo de enlace de ADN de dedo de zinc, puede modificarse manteniendo al mismo tiempo la estructura del barril beta (ß-barril) para generar nuevos dominios o motivos de enlace de enlace de ADN que enlazan a diferentes secuencias de tres pares base. Dicho dominio de enlace de ADN nuevo, puede ser un dominio de enlace de ADN de dedo de zinc no natural. Además del reconocimiento de la secuencia de tres pares base mediante los aminoácidos en las posiciones -1, +1, +2, +3, +4, + 5 y +6 relativas al inicio de la a-hélice, algunos de estos aminoácidos, también pueden interactuar con un par base fuera del sitio de reconocimiento de la secuencia de tres pares base. Al combinar, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más dominios o motivos de enlace de ADN de dedo de zinc, se puede generar una proteína de dedo de zinc que enlaza específicamente a una secuencia de ADN más larga. Por ejemplo, la proteína de dedo de zinc que comprende dos dominios o motivos de enlace de ADN de dedo de zinc pueden reconocer una secuencia de seis pares base específica, y una proteína de dedo de zinc que comprende cuatro dominios o motivos de enlace de ADN de dedo de zinc que puede reconocer una secuencia de doce pares base específica. Una proteína de dedo de zinc puede comprender dos o más dominios o motivos de enlace de ADN de dedo de zinc naturales, o dos o más dominios o motivos de enlace de ADN de dedo de zinc no naturales derivados de una proteína de dedo de zinc natural o tipo silvestre, mediante truncado o expansión o un proceso de mutagénesis dirigida al sitio acoplada a un método de selección tal como, pero sin limitarse a, selección de despliegue de fago, selección de dos híbrido bacterianos o selección de un híbrido bacteriano o cualquier combinación de dominios de enlace de ADN de dedo de zinc naturales o no naturales. El término "truncado" tal como se utiliza dentro de este contexto, se refiere a una proteína de dedo de zinc que contiene menos de un número completo de dominios o motivos de enlace de ADN de dedo de zinc encontrados en la proteína de dedo de zinc natural. El término "expansión" tal como se utiliza dentro de este contexto, se refiere a una proteína de dedo de zinc que contiene más de un número completo de dominios o motivos de enlace de ADN de dedo de zinc encontrados en la proteína de dedo de zinc natural. Las técnicas para seleccionar una secuencia de polinucleótido dentro de una secuencia genómica para el enlace de proteína de dedo de zinc, son conocidas en la técnica.
Los métodos para diseñar los dominios de proteína de dedo de zinc que enlazan secuencias de nucleótido específicas que son únicas para un gen objetivo, son conocidos en la técnica. Se ha calculado que una secuencia que comprende 18 nucleótidos, es suficiente para especificar una ubicación única en el genoma de organismos superiores. Normalmente, por consiguiente los dominios de proteína de dedo de zinc que contienen 6 dedos de zinc, cada uno con su hélice alfa diseñada en forma específica para interacción con un triplete particular. Sin embargo, en algunos casos puede ser deseable una secuencia objetivo de nucleótido más corta o más larga. Por lo tanto, los dominios de dedo de zinc en las proteínas pueden contener de 2 a 12 dedos - tal como de 3 a 8 dedos, 5 a 7 dedos, o 6 dedos.
Las proteínas de dedo de zinc de uso para comprender al menos un polipéptido dedo de zinc enlazado a través de un enlazador, preferentemente un enlazador flexible, al menos a un segundo dominio de enlace de ADN, que opcionalmente es un segundo polipéptido de dedo de zinc. La proteína de dedo de zinc puede contener más de dos dominios de enlace de ADN, así como uno o más dominios reguladores. Los polipéptidos de dedo de zinc pueden ser diseñados para reconocer un sitio objetivo seleccionado en el gen de elección.
En una modalidad, la proteína de dedo de zinc comprende una estructura (o esqueleto) derivada de una proteína de dedo de zinc que ocurre naturalmente. La estructura (o esqueleto) derivada de cualquier proteína de dedo de zinc que ocurre naturalmente puede ser utilizada. Por ejemplo, se puede utilizar la proteína de dedo de zinc que comprende una estructura (o esqueleto) derivada de una proteína de dedo de zinc que comprende un motivo C2H2.
En una modalidad específica, la proteína de dedo de zinc comprende una estructura (o esqueleto) derivada de una proteína de dedo de zinc que es naturalmente funcional en células de planta. Por ejemplo, la proteína de dedo de zinc puede comprender un dedo de zinc C3H, un motivo QALGGH, un motivo de dedo de zinc RING-H2, un motivo C2H2 de 9 aminoácidos, un motivo de dedo de zinc de Arabidopsis LSD1 y un motivo de dedo de zinc de proteínas de dominio BBF/Dof.
La proteína de dedo de zinc puede proporcionarse a células de plantas a través de cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, la proteína de dedo de zinc puede ser agregada en forma exógena a las células de planta y las células de planta se mantienen bajo condiciones de modo que la proteína de dedo de zinc enlace a la secuencia de nucleótido objetivo y regule la expresión del gen objetivo en las células de planta. Como alternativa, se puede expresar una secuencia de nucleótido que codifica la proteína de dedo de zinc en las células de planta, y las células de planta se mantienen bajo condiciones tales que la proteína de dedo de zinc expresada enlaza a la secuencia de nucleótido objetivo y regula la expresión del gen objetivo en las células de planta.
El gen de dedo de zinc puede ser expresado en una planta utilizando cualesquiera vectores de expresión de planta. Los vectores típicos útiles para expresión de genes en plantas superiores, son bien conocidos en la técnica. Además de los dominios reguladores, con frecuencia la proteína de dedo de zinc se puede expresar como una proteína de fusión con proteína de enlace de maltosa ("MBP"), transferasa de glutationa S (GST), hexahistidina, c-myc, o epítope FLAG, para facilidad de purificación, monitoreo de expresión o monitoreo de localización celular y subcelular.
En una modalidad, una planta mutada o que no tiene origen natural, o una célula de planta mutada o que no tiene origen natural se produce a través de mutagénesis transmitida por nucleasa de dedo de zinc.
En una modalidad específica, una secuencia de ADN genómica que comprende una parte o toda la secuencia de codificación de polinucleótido NtMRP se modifica mediante mutagénesis transmitida por nucleasa de dedo de zinc. La secuencia de ADN genómica se busca para un sitio único para enlace de proteína de dedo de zinc. Como alternativa, la secuencia de ADN genómica se busca para dos sitios únicos para enlace de proteína de dedo, en donde ambos sitios están en hebras opuestas o casi juntos. Los dos sitios objetivo de proteína de dedo de zinc pueden tener 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más pares base de separación. El sitio de enlace de proteína de dedo de zinc puede estar en la secuencia de codificación de la secuencia de gen NtMRP o un elemento regulador que controla la expresión del gen NtMRP, tal como pero sin limitarse a la región promotora del gen. Particularmente, una o ambas proteínas de dedo de zinc son proteínas de dedo de zinc no naturales.
Por consiguiente, la descripción proporciona proteínas de dedo de zinc que enlazan al polinucleótido NtMRP. Se contempla que un método para mutar una secuencia de gen, tal como una secuencia de ADN genómica, que codifica el gen NtMRP mediante mutagénesis transmitida por nucleasa de dedo de zinc, comprende opcionalmente uno o más de los siguientes pasos: (i) proporciona al menos dos proteínas de dedo de zinc que enlazan en forma selectiva diferentes sitios objetivo en la secuencia de gen; (ii) construir dos construcciones de expresión que codifican cada una una diferente nucleasa de dedo de zinc que comprende una de las dos diferentes proteínas de dedo de zinc no naturales del paso (i) y una nucleasa, enlazadas en forma operable a las secuencias de control de expresión operables en una célula de planta; (iii) introducir las dos construcciones de expresión en una célula de planta, en donde se producen las dos de diferentes nucleasas de dedo de zinc, de modo que se introduce una descomposición de hebra doble en la secuencia de ADN genómica en el genoma de la célula de planta, en o cerca de al menos uno de los sitios objetivos. La introducción de las dos construcciones de expresión en la célula de planta se puede lograr en forma simultánea o en secuencias, incluyendo opcionalmente la selección de células que tomaron la primera construcción.
La descomposición de hebra doble (DSB) tal como aquí se utiliza, se refiere a una descomposición en ambas hebras del ADN o ARN. La descomposición de hebra doble puede ocurrir en la secuencia de ADN genómica en un sitio que no es más de entre 5 pares base y 1500 pares base, particularmente no más a entre 5 pares base y 200 pares base, particularmente no más a entre 5 pares base y 20 pares base eliminados de uno de los sitios objetivo. La descomposición de hebra doble puede facilitar la unión de extremo no homóloga que conduce a una mutación en la secuencia de ADN genómica en o cerca del sitio objetivo. La frase "unión de extremo no homóloga (NHEJ)" tal como aquí se utiliza, se refiere a un mecanismo de reparación que repara una descomposición de hebra doble mediante ligadura directa sin la necesidad de una plantilla homóloga, y de esta forma puede ser mutagénica relativa a la secuencia antes de que ocurra la descomposición de hebra doble.
El método puede comprender opcionalmente en forma adicional el paso (¡v) de introducir en la célula de planta un polinucleótido que comprende al menos una primera región de homología con una corriente ascendente de la secuencia de nucleótido día descomposición de hebra doble, y una segunda región de homología con una corriente descendente de secuencia de nucleótido día descomposición de hebra doble. El polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótido que corresponde a la secuencia de polinucleótido NtMRP que contiene una eliminación o una inserción de las secuencias de nucleótido heterólogas. El polinucleótido de esta forma puede facilitar la recombinación homologa en o cerca del sitio objetivo que da como resultado la inserción de la secuencia heteróloga en el genoma, o la eliminación de la secuencia de ADN genómica del genoma. La secuencia de ADN genómica resultante en la célula de planta, puede comprender una mutación que interrumpe la actividad enzimática de una proteína NtMRP mutante expresada, un codón de detención de traducción temprano o un motivo de secuencia que interfiere con el procesamiento adecuado de pre-mARN en un mARN que da como resultado la expresión o desactivación reducida del gen. Los métodos para interrumpir la síntesis de proteína mediante mutación de una secuencia de gen que codifica para una proteína, son conocidos para los expertos en la técnica.
Se puede construir una nucleasa de dedo de zinc, elaborando una fusión de un primer polinucleótido que codifica para una proteína de dedo de zinc que enlaza al polinucleótido NtMRP, y un segundo polinucleótido que codifica para una endonucleasa no específica, tal como, pero sin limitarse a, la endonucleasa Tipo US. Una endonucleasa Tipo IIS es una enzima de restricción que tiene un dominio de reconocimiento separado y un dominio de disociación de endonucleasa en donde la enzima disocia ADN en sitios que se eliminan del sitio de reconocimiento. Los ejemplos no limitantes de endonucleasas Tipo IIS pueden ser, pero no se limitan a, Aarl, Bael, Cdil, Drdll, Ecil, Fokl, Faul, Gdill, Hgal , Ksp632l, Mboll, Pfi 11081, Rle108l , RleAl, Sapl, TspDTI o UbaPI.
Los métodos para diseñar y construir proteínas de fusión, los métodos para la selección y separación del dominio de endonucleasa del dominio de reconocimiento de secuencia de la endonucleasa Tipo IIS, los métodos para el diseño y construcción de una nucleasa de dedo de zinc que comprenden una proteína de fusión de una proteína de dedo de zinc y una endonucleasa, son conocidos en la técnica. En una modalidad específica, el dominio en una nucleasa de dedo de zinc es Fokl. Una proteína de fusión entre una proteína de dedo de zinc y la nucleasa de Fokl, puede comprender un espaciador que consiste en dos pares base, o como alternativa, el espaciador puede consistir en tres, cuatro, cinco, seis o más pares base. En una modalidad, se describe una proteína de fusión con un espaciador de siete pares base, de modo que la endonucleasa de una primera nucleasa de dedo de zinc, puede dimerizar al momento del contacto con una segunda nucleasa de dedo de zinc, en donde las dos proteínas de dedo de zinc que elaboran las nucleasas de dedo de zinc, pueden enlazar en la corriente ascendente y corriente descendente de la secuencia de ADN objetivo. Al momento de la dimerización, una nucleasa de dedo de zinc puede introducir una descomposición de hebra doble en una secuencia de ADN objetivo que puede estar seguida de unión de extremo no homologa o recombinación homologa con una secuencia de nucleótido exógena que tiene homología con las regiones que flanquean ambos lados día descomposición de hebra doble.
Aún en otra modalidad, se proporciona una proteína de fusión que comprende una proteína de dedo de zinc y una proteína incrementadora que da como resultado un activador de dedo de zinc. Un activador de dedo de zinc se puede utilizar para activar o regular la transcripción del gen NtMRP, en donde el activador comprende los pasos de (i) diseñar una proteína de dedo de zinc que enlaza una región dentro de un promotor o una secuencia enlazada en forma operativa a una secuencia de codificación del gen NtMRP, (ii) elaborar una proteína de fusión entre la proteína de dedo de zinc y un activador de transcripción, (iii) elaborar una construcción de expresión que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica el activador de dedo de zinc bajo el control de un promotor activo en una célula, tal como una célula de planta, (iv) introduciendo la construcción de gen en la célula, y (v) cultivando la célula y permitiendo la expresión del activador de dedo de zinc, y (vi) caracterizando la célula que tiene una expresión incrementada de la proteína NtMRP.
Aún en otra modalidad, la presente descripción proporciona una proteína de fusión que comprende una proteína de dedo de zinc, y un represor de gen que da como resultado un represor de dedo de zinc. Un represor de dedo de zinc se puede utilizar para desactivar o reprimir la transcripción del polinucleótido NtMRP, que comprende los pasos de (i) diseñar una proteína de dedo de zinc que enlaza a una región con un promotor o una secuencia enlazada en forma operativa al polinucleótido NtMRP, y (ii) elaborar una proteína de fusión entre la proteína de dedo de zinc y un represor de transcripción, y (Mi) desarrollar una construcción de gen que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para el represor de dedo de zinc bajo el control de un promotor activo en una célula, tal como una célula de planta, y (iv) introducir la construcción de gen en la célula, y (v) proporcionar la expresión del represor de dedo de zinc, y (vi) caracterizar la célula que tiene transcripción reducida del polinucleótido NtMRP.
Aún en otra modalidad, la presente descripción proporciona una proteína de fusión que comprende una proteína de dedo de zinc y una metilasa que da como resultado una metilasa de dedo de zinc. La metilasa de dedo de zinc puede utilizarse para desactivar o inhibir la expresión del polinucleótido NtMRP en una célula, de modo que la célula, mediante la metilación de una región dentro de la región promotora del polinucleótido NtMRP, que comprende los pasos de (i) diseñar una proteína de dedo de zinc que enlaza a una región dentro de un promotor de polinucleótido NtMRP, y (ii) elaborar una proteína de fusión entre la proteína de dedo de zinc y una metilasa, y (iii) desarrollar una construcción de gen que contiene un polinucleótido que codifica para la metilasa de dedo de zinc bajo el control de un promotor activo en la célula, y (iv) introducir la construcción de gen en la célula, y (v) permitir la expresión de la metilasa de dedo de zinc, y (vi) caracterizar la célula que tiene expresión reducida, o esencialmente no expresión de proteína NtMRP en la célula. En varias modalidades, una proteína de dedo de zinc puede seleccionarse de acuerdo con los métodos aquí descritos para enlazar a una secuencia reguladora del polinucleótido NtMRP. Más específicamente, la secuencia reguladora puede comprender un sitio de inicio de transcripción, un codón de inicio, una región de un exón, un límite de un exón-intrón, un terminador o un codón de detención. La proteína de dedo de zinc se puede fusionar a una nucleasa, un activador o una proteína represora.
En varias modalidades, la nucleasa de dedo de zinc introduce una descomposición de hebra doble en una región reguladora, una región de codificación, o una región sin codificación de una secuencia de ADN genómica del polinucleótido NtMRP, y conduce a una reducción, una inhibición o una inhibición sustancial del nivel de expresión de polinucleótido NtMRP, o una reducción, una inhibición o una inhibición sustancial de la actividad de la proteína codificada de esta forma.
La presente descripción también proporciona un método para modificar una célula, tal como una célula de planta, en donde el genoma de la célula de planta se modifica mediante mutagénesis transmitida por nucleasa de dedo de zinc, en donde el método comprende (a) identificar y elaborar al menos dos proteínas de dedo de zinc no naturales que enlazan selectivamente a diferentes sitios objetivo para la modificación en la secuencia de nucleótido genómica; (b) expresión de al menos dos proteínas de fusión, que comprenden cada una una nucleasa y una de al menos dos proteínas de dedo de zinc no naturales en la célula, de modo que se introduce una descomposición de hebra doble en la secuencia de nucleótido genómica en la secuencia de genoma de planta, particularmente en o cerca de un sitio objetivo en la secuencia de nucleótido genómica; y opcionalmente (c) introducir en la célula un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido que comprende una primera región de homología con una secuencia en la corriente ascendente día descomposición de hebra doble, y una segunda región de homología en una región de la corriente descendente día descomposición de hebra doble, de modo que el polín ucleótido se recombina con el ADN en el genoma. También se describen células que comprenden una o más construcciones de expresión que comprenden secuencias de nucleótido que codifican una o más de las proteínas de fusión .
En otro aspecto, la presente descripción proporciona métodos para producir plantas mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas o plantas genéticamente modificadas de otra manera, utilizando meganucleasas - tal como l-Crel. Las meganucleasas que ocurren naturalmente, así como las meganucleasas recombinantes, se pueden utilizar específicamente para originar una descomposición de hebra doble en un sitio simple o en relativamente pocos sitios en el ADN genómico de una planta para permitir la interrupción de un gen NtMRP. La meganucleasa puede ser una mega nucleasa diseñada con propiedades de reconocimiento de ADN alteradas. Las proteínas de meganucleasa pueden suministrarse en células de planta a través de una variedad de diferentes mecanismos conocidos en la técnica. La meganucleasa puede ser una meganucleasa diseñada con propiedades de reconocimiento de ADN alteradas. Esta mención describe métodos para el diseño a base de estructura de meganucleasas derivadas de la meganucleasa que ocurre naturalmente l-Crel. Estas meganucleasas diseñadas se pueden elaborar para reconocer secuencias de ADN de 22 pares base de corte predeterminadas encontradas en los genomas de las plantas. Las proteínas de meganucleasa se pueden proporcionar en células de planta a través de una variedad de diferentes mecanismos conocidos en la técnica.
Los aspectos de la presente descripción permiten el uso de meganucleasas para desactivar el polinucleótido NtMRP en una célula de planta o planta. Los aspectos también se refieren a un método para desactivar el polinucleótido NtMRP en una planta utilizando una meganucleasa que comprende: (a) proporcionar una célula de planta que comprende el polinucleótido NtMRP; (b) introducir una meganucleasa o una construcción que codifica una meganucleasa en la célula de la planta; y (c) permitir a la meganucleasa desactivar el polinucleótido NtMRP.
Las meganucleasas se pueden utilizar para disociar sitios de reconocimiento de meganucleasa dentro de las regiones de codificación del polinucleótido NtMRP. La disociación da como resultado frecuentemente la eliminación de ADN en el sitio de reconocimiento de meganucleasa después de la reparación de ADN mutagénico mediante unión de extremo no homóloga. Las mutaciones en la secuencia de codificación de gen normalmente son suficientes para desactivar el gen. Este método implica, primero, el suministro de un cartucho de expresión de meganucleasa para una célula de planta que utiliza un método de transformación adecuado. Para la mayor eficiencia, es deseable enlazar el cartucho de expresión de meganucleasa a un marcador selecciónatele, y seleccionar células transformadas con éxito en la presencia de un agente de selección. Este método dará como resultado la integración del cartucho de expresión de meganucleasa en el genoma, sin embargo, lo cual puede ser no deseable, si es probable que la planta requiere aprobación reguladora. En dichos casos, el cartucho de expresión de meganucleasa (y el gen marcador seleccionable enlazado) puede ser segregado fuera en generaciones de plantas subsecuentes utilizando técnicas de reproducción convencionales. Como alternativa, las células de planta pueden ser transformadas inicialmente con un cartucho de expresión de meganucleasa que carece de un marcador seleccionable y pueden crecer en un medio que carece de un agente de selección. Bajo dichas condiciones, una fracción de las células tratadas adquirirá el cartucho de expresión de meganucleasa y expresará la meganucleasa diseñada temporalmente sin integrar el cartucho de expresión de meganucleasa en el genoma. Debido a que no abarca la eficiencia de transformación, este procedimiento de transformación posterior requiere que se clasifique un mayor número de células tratadas para obtener la modificación de genoma deseada.
Después del suministro del cartucho de expresión de meganucleasa, las células de planta se crecen, inicialmente, bajo condiciones que son típicas para el procedimiento de transformación particular que se utilizó. Esto puede significar crecer células transformadas en un medio en temperaturas debajo de 26 grados C, frecuentemente en la oscuridad. Las condiciones estándar se pueden utilizar durante un período de tiempo, preferentemente 1 a 4 días, para permitir que la célula de planta se recupere del proceso de transformación. En cualquier punto después de este período de recuperación final, se puede elevar la temperatura de crecimiento para estimular la actividad de la meganucleasa diseñada, para disociar y mutar el sitio de reconocimiento de meganucleasa.
Para ciertas aplicaciones, puede ser deseable eliminar en forma precisa el polinucleótido NtMRP del genoma de una planta. Las aplicaciones son posibles utilizando un par de meganucleasas diseñadas, cada una de las cuales disocia un sitio de reconocimiento de meganucleasa en cualquier lado de la eliminación proyectada.
Las construcciones recombinantes aquí proporcionadas se pueden utilizar para transformar plantas o células de planta, con el objeto de modular (reducir o inhibir) los niveles de expresión de proteína NtMRP. En una construcción de polinucleótido recombinante puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido NtMRP tal como aquí se describe, enlazado en forma operable a una región reguladora adecuada para expresar el polipéptido NtMRP en la planta o célula. Por lo tanto, un polinucleótido puede comprender una secuencia de codificación que codifica el polipéptido NtMRP tal como aquí se describe o una variante del mismo.
El polipéptido NtMRP codificado a través de un polinucleótido recombinante puede ser un polipéptido NtMRP nativo, o puede ser heterólogo para la célula. En algunos casos, la construcción recombinante contiene un polinucleótido que reduce o inhibe la expresión de un polipéptido(s) de modulación NtMRP, enlazado en forma operable a una región reguladora. Los ejemplos de regiones reguladoras adecuadas son como aquí se describen.
Los vectores que contienen construcciones de polinucleótido recombinantes, tal como las aquí descritas también se proporcionan. Los esqueletos de vector incluyen por ejemplo, los utilizados rutinariamente en la técnica tal como plásmidos, virus, cromosomas artificiales, BACs, YACs, o PACs. Los vectores de expresión adecuados incluyen, sin limitación, plásmidos y vectores virales derivados, por ejemplo, de bacteriófago, baculovirus, y retrovirus. Los numerosos vectores y sistemas de expresión están comercialmente disponibles.
Los vectores también pueden incluir, por ejemplo, orígenes de réplica, regiones de adhesión de andamio (SARs) o marcadores. Un gen marcador puede conferir un fenotipo seleccionable en una célula de planta. Por ejemplo, un marcador puede conferir resistencia biocida, tal como resistencia a un antibiótico (por ejemplo, canamicina, G418, bleomicina, o higromicina) , o un herbicida (por ejemplo, glifosato, clorsulfuron o fosfinotricina). Además, un vector de expresión puede incluir una secuencia de etiqueta diseñada para facilitar la manipulación o detección (por ejemplo, purificación o localización) del polipéptido expresado. Las secuencias de etiqueta Tag, tal como las secuencias de luciferasa, .beta.-glucuronidasa (GUS), proteína fluorescente verde (GFP), S-transferasa de glutationa (GST), polih istidina, c-myc o hemaglutinina, normalmente se expresan con una fusión con el polipéptido codificado. Dichas etiquetas se pueden insertar en cualquier parte dentro del polipéptido, incluyendo ya sea en el término carboxilo o amino.
Se dirigen varias modalidades a plantas mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas que se modifican para reducir el nivel de expresión de gen NtMRP a través de diversos métodos que se pueden utilizar para reducción o silenciación de la expresión de gen NtMRP, y de esta forma, producir plantas en las cuales el nivel de expresión de transportadores, se puede reducir dentro de tejidos de planta de interés. Los rangos de transporte de metal pesado y patrones de distribución del transporte de metal pesado, en particular, el transporte de NtMRP, se pueden alterar en plantas producidas de acuerdo con los métodos y composiciones descritos.
Las plantas adecuadas para utilizarse en modificación genética incluyen plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas y sistemas de células de planta, incluyendo especies de una de las siguientes familias: Acantaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amarillidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryofillaceae, Cefalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Efedraceae, Erytroxilaceae, Euforbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopod iaceae , Malvaceae, Melantiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae, o Vitaceae.
Las especies adecuadas pueden incluir miembros del género Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria , Ananas, Andrografis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberís, Beta, Bixa, Brassica, Caléndula, Camellia, Camptoteca, Cannabis, Capsicum, Cartamus, Catarantus, Cefalotaxus, Chrysantemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucúrbita, Cynodon, Datura, Diantus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Efedra, Eriantus, Erytroxilum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galantus, Glycine, Gossypium, Heliantus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatrofa, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Menta, Miscantus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Partenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Sécale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale , Triticum, Unióla, Veratrum, Vinca, Vitis, y Zea.
Las especies adecuadas pueden incluir Panicum spp., Sorghum spp., Miscantus spp., Saccharum spp., Eriantus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (Big Bluestem), Pennisetum purpureum (pasto elefante), Phalaris arundinacea (hierba cinta), Cynodon dactilon (Pastizal de Bermuda), Festuca arundinacea (festuca alta), Spartina pectinata (pasto de pradera), Medicago sativa (alfalfa), Arundo donax (Carrizo gigante), Sécale cereale (centeno), Salix spp. (sauce), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale (centeno de trigo Triticum), bamboo, Heliantus annuus (girasol), Cartamus tinctorius (cártamo), Jatrofa curcas (jatrofa), Ricinus communis (castor), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (lino), Brassica júncea, Beta vulgaris (remolacha), anihot esculenta (cassaya), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca sativa (lechuga), Musa paradisiaca (plátano), Solanum tuberosum (papa), Brassica olerácea (brócoli, coliflor, col de Brusselas), Camellia sinensis (té), Fragaria ananassa (fresa), Theobroma cacao (cocoa), Coffea arábica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (piña), Capsicum annum (chile picoso y dulce), Allium cepa (cebolla), Cucumis meló (melón), Cucumis sativus (pepino), Cucúrbita máxima (calabaza), Cucúrbita moschata (calabaza), Spinacea olerácea (espinaca), Citrullus lanatus (sandía), Abelmoschus esculentus (okra), Solanum melongena (berengena), Rosa spp. (rosa), Diantus caryofillus (clavel), Petunia spp. (petunia), Poinsettia pulcherrima (flor de pascua), Lupinus albus (altramuz), Unióla paniculata (avenas), bentgrass (Agrostis spp.), Populus tremuloides (avenas), Pinus spp. (pino), Abies spp. (abeto), Acer spp. (maple), Hordeum vulgare (cebada), Poa pratensis (hierba azul para forraje), Lolium spp. (césped ingles) y Phleum pratense (fleo), Panicum virgatum (hierba demijo), Sorghum bicolor (sorgo, césped de sudán), Miscantus giganteus (miscantus), Saccharum sp. (caña), Populus balsamifera (álamo), Zea mays (maíz), Glycine max (frijol de soya), Brassica napus (cañóla), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodón), Oryza sativa (arroz), Heliantus annuus (girasol), Medicago sativa (alfalfa), Beta vulgaris (remolacha), o Pennisetum glaucum (mijo perla).
Se dirigen varias modalidades a plantas mutantes, plantas que no tienen origen natural o plantas transgénicas modificadas para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) niveles de expresión de gen NtMRP de esta forma, para producir plantas -tal como plantas de tabaco - en las cuales el nivel de expresión de NtMRP se reduce dentro de los tejidos de planta de interés en comparación con una planta de control. Las composiciones y métodos descritos se pueden aplicar a cualquier especie del género Nicotians, incluyendo N. rustica y N. tabacum (por ejemplo, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1, y Petico). Otras especies incluyen N. acaulis, N. acuminata, N. acuminata var. multiflora, N. africana, N. alata, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. benavidesii, N. bentamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. marítima, N. megalosifon, N. miersii, N. noctíflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otofora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. silvestris, N. tyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonofilla, N. umbrática, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides, y N. x sanderae.
El uso de cultivos de tabaco y cultivos de tabaco élite también está contemplado en la presente invención. La planta transgénica, que no tiene origen natural o mutante por consiguiente puede ser una variedad de tabaco o cultivo de tabaco élite que comprende uno o más transgenes, o una más mutaciones genéticas o una combinación de las mismas. La mutación(s) genética (por ejemplo, uno o más polimorfismos) pueden ser mutaciones que no existen naturalmente en la variedad de tabaco o cultivo de tabaco individual (por ejemplo, cultivo de tabaco élite) o pueden ser una mutación(s) genética que ocurre naturalmente, siempre que la mutación no ocurra naturalmente en la variedad de tabaco o cultivo de tabaco individual (por ejemplo, cultivo de tabaco élite).
Las variedades de Nicotiana tabacum particularmente útiles, incluyen tabacos tipo Burley, tipo oscuridad, tipo curado con humo y tipo Oriental. Los ejemplos sin limitación de variedades o cultivos son: BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301 , CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, DT538 LC tabaco Galpao, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, Híbrido 403LC, Híbrido 404LC, Híbrido 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371 LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smit Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, tabaco de 'Perique', PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B 13P, Xanti (Mitchell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC número 2 Híbrido 49, Burley 21, KY 8959, KY 9, MD 609, PG 01, PG 04, PO 1, P02, PO 3, RG 11, RG 8, VA 509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanti BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpao Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1 , Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanti, GR149, GR153, Petit Havana. También están contempladas subvariedades de convertidor inferior de las anteriores, incluso si no se identifican en forma específica en la presente descripción.
En un aspecto adicional, se proporciona una planta muíante, que no tiene origen natural o transgénica, tal como aquí se describe que ha sido modificada en forma adicional, de modo que la expresión de los transportadores NtHMA también sea reducida, lo cual puede reducir en forma adicional el contenido de cadmio en la planta. El uso de transportadores NtHMA para reducir el contenido de cadmio en la planta se describe en la Publicación Internacional WO2009074325. Esto de acuerdo con una modalidad proporciona una célula de planta mutante, que no tiene origen natural o transgénica que comprende un polinucleótido NtMRP aislado, un gen quimérico NtMRP, una construcción de polinucleótido NtMRP, un ARN de hebra doble NtMRP, un conjugado NtMRP y/o un vector de expresión NtMRP junto con un polinucleótido NtHMA aislado, un gen quimérico NtHMA, una construcción de polinucleótido NtHMA, un ARN de hebra doble NtHMA, un conjugado NtHMA y/o un vector de expresión NtHMA.
Las modalidades también se dirigen a composiciones y métodos para producir plantas mutantes, plantas que no tienen origen natural, plantas híbridas o plantas transgénicas que han sido modificadas para modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la expresión o actividad NtMRP, de modo que se acumulen en la misma menores cantidades de cadmio, en comparación con un control. En ciertas modalidades, las plantas que se obtienen son similares o sustancialmente iguales en apariencia general (por ejemplo, fenotipo) a plantas de control. Se pueden evaluar mediante observaciones de campo diversas características fenotípicas tal como grado de madurez, número de hojas por planta, altura de vara, ángulo de inserción de hoja, tamaño de hoja (ancho y largo), distancia internodo y proporción de lámina-nervadura central. En una modalidad preferida, la altura o peso, o altura y peso de las plantas, es sustancialmente la misma que las plantas de control. En otra modalidad preferida, no se encuentran diferencias significativas en hojas recolectadas secas de las plantas en comparación con un control, lo que indica que la modulación de las transcripciones NtMRP no ha sido un efecto estadísticamente relevante en la biomasa seca .
Un aspecto es una semilla de la planta mutante, la planta que no tiene origen natural, la planta híbrida o la planta transgénica. Preferentemente, la semilla es una semilla de tabaco. Un aspecto adicional es polen o un óvulo de la planta mutante, la planta que no tiene origen natural, la planta híbrida o la planta transgénica. Además, se describe una planta mutante, una planta que no tiene origen natural, una planta híbrida, una planta transgénica, que comprende además un polinucleótido que confiere esterilidad masculina.
La descripción también proporciona un cultivo de tejido de células regenerables de la planta mutante, una planta que no tiene origen natural, una planta híbrida, una planta transgénica o una parte de la misma, en donde el cultivo regenera plantas con la capacidad de expresar todas las características morfológicas y fisiológicas del origen. Las células regenerables incluyen pero no se limitan a células limitadas de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledones, raíces, puntas de raíz, anteras, flores y una parte de las mismas, óvulos, botones, tallos, varas, hoyo y cápsulas o callos o protoplastos derivados de los mismos.
En algunas modalidades, se modula una planta en la cual el polinucleótido NtMRP es modulado (por ejemplo, reducido o inhibido) puede tener niveles disminuidos de metal pesado - tal como cadmio - especialmente en las hojas.
El nivel de cadmio puede ser disminuido en al menos aproximadamente 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más - tal como 100%, 125%, 150% o 200% o más en comparación con el nivel de cadmio en una planta de control correspondiente en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP no ha sido modulada (por ejemplo, reducida o inhibida). En algunas modalidades, una planta en la cual se modula la expresión del polinucleótido NtMRP (por ejemplo, se reduce o inhibe) puede tener niveles incrementados o disminuidos de cadmio en las raíces. En algunas modalidades, una planta en la cual la expresión del polinucleótido NtMRP se modula (por ejemplo, reduce o inhibe) puede tener niveles disminuidos o incrementados de cadmio en las raíces y niveles disminuidos de cadmio en las hojas. En algunas modalidades, una planta en la cual se modula la expresión del polinucleótido Nt RP (por ejemplo, se reduce o inhibe) puede tener niveles disminuidos de cadmio en biomasa recolectable.
La expresión se puede evaluar utilizando métodos que incluyen por ejemplo, RT-PCR, manchados Northern, protección de RNasa, extensiones de cebador, manchados Western, electroforesis de gel de proteína, inmunoprecipitación, inmunoensayos enlazados por enzima, ensayos de chip y espectrometría de masa. Deberá observarse que si un polipéptido se expresa bajo el control de un promotor de expresión amplia o con preferencia de tejido, la expresión se puede evaluar en toda la planta o en un tejido seleccionado. En forma similar, si un polipéptido se expresa en un momento particular, por ejemplo, en un momento particular de desarrollo o al momento de la inducción, la expresión se puede evaluar selectivamente en un período de tiempo deseado.
Una población de plantas mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas pueden ser clasificadas o seleccionadas de los miembros de la población que tienen un rasgo o fenotipo deseado. Por ejemplo, una población de progenie de un evento de transformación simple se puede clasificar para las plantas que tienen un nivel de expresión deseado del polipéptido o polinucleótido NtMRP. Se pueden utilizar métodos físicos o bioquímicos para identificar niveles de expresión. Éstos incluyen análisis Southern o amplificación PCR para la detección de un polinucleótido; manchados Northern, protección de RNasa S1 , una extensión de cebador, o amplificación RT-PCR para detección de transcripciones ARN; ensayos enzimáticos para detección de actividad de enzimas o ribozimas de polipéptidos y polinucleótidos; y electroforesis de gel de proteína, manchados Western, inmunoprecipitación e inmunoensayos enlazados por enzimas para detectar polipéptidos. También se pueden utilizar otras técnicas tales como hibridación in situ, manchados de enzima e inmunomanchado para detectar la presencia o expresión de polipéptidos o polinucleótidos.
Se puede clasificar una población de plantas, para las plantas que tengan un rasgo deseado, tal como un nivel de cadmio modulado (por ejemplo, reducido o inhibido). La selección o clasificación se puede llevar a cabo en una o más generaciones, o en más de una ubicación geográfica. En algunos casos, las plantas mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas se pueden crecer y seleccionar bajo condiciones que inducen un fenotipo deseado o que de otra forma son necesarias para producir un fenotipo deseado en una planta muíante, que no tienen origen natural, o transgénica. Además, se puede aplicar la selección o clasificación durante una etapa de desarrollo particular, en la cual el fenotipo se espera que sea exhibido por la planta. La selección o clasificación se puede llevar a cabo para elegir las plantas mutantes, que no tienen origen natural, o transgénicas que tienen una diferencia estadísticamente significativa en su contenido de cadmio en forma relativa a una planta de control en la cual no se ha modulado (por ejemplo, reducido o inhibido) la expresión o actividad del polinucleótido NtMRP o proteína.
Las células de planta y las plantas mutantes, que no tienen origen natural, o transgénicas se describen en la presente invención comprendiendo uno o más polinucleótidos recombinantes - tal como el polinucleótido aislado, el gen quimérico, la construcción de polinucleótido, el ARN de hebra doble, el conjugado o el vector de expresión. Una planta o célula de planta puede ser transformada, teniendo el polinucleótido recombinante integrado en su genoma para volverse transformado en forma estable. Las células transformadas en forma estable normalmente retienen el polinucleótido introducido dentro de cada división celular. Una planta o célula de planta también puede ser transformada temporalmente, de modo que el polinucleótido recombinante no sea integrado en su genoma. Las células transformadas temporalmente normalmente pierden toda o alguna parte del polinucleótido recombinante introducido, con cada división celular de modo que el polinucleótido recombinante introducido no pueda ser detectado en células hijas después de un número suficiente de divisiones celulares.
Las técnicas para introducir polinucleótidos en plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas son conocidas en la técnica, e incluyen, por ejemplo, transformación transmitida por Agrobacterium, transformación transmitida por vector viral, electroporación y transformación de pistola de partículas. El sistema Agrobacterium para la integración del polinucleótido extraño en los cromosomas de planta, ha sido extensamente estudiado, modificado y explotado para diseño genético de plantas. Las moléculas de polinucleótido recombinantes desprotegidas que comprenden secuencias de polinucleótido que corresponden a la proteína purificada en cuestión enlazada en forma operable en la orientación sentido o antisentido, a secuencias reguladoras, se unen a secuencias T-ADN adecuadas a través de métodos convencionales. Estos se introducen en protoplastos de tabaco mediante técnicas de polietilenglicol o mediante técnicas de electroporación, ambas de las cuales son estándar. Como alternativa, los vectores que comprenden moléculas de polinucleótido recombinantes que codifican la proteína purificada en cuestión, se introducen en células Agrobacterium vivas, las cuales posteriormente transfieren el polinucleótido en las células de plantas. La transformación mediante polinucleótido desprotegido sin secuencias de vector T-ADN acompañantes, se puede lograr mediante fusión de protoplastos con liposomas que contienen polinucleótido o mediante electroporación . El polín ucleótido desprotegido, no acompañado por la secuencias de vector T-ADN, también se puede utilizar para transformar células mediante micro proyectiles de alta velocidad, inertes.
Si una célula o tejido cultivado se utiliza como el tejido receptor para transformación, las plantas pueden ser regeneradas de cultivos transformados si se desea, mediante técnicas conocidas para los expertos en el arte.
La elección de regiones reguladoras que serán incluidas en una construcción recombinante depende de diversos factores, incluyendo pero sin limitarse a eficiencia, selectividad, inducibilidad, nivel de expresión deseado y expresión preferente de célula o tejido. Es un asunto rutinario para un experto en la técnica, modular la expresión de una secuencia de codificación mediante selección y colocación adecuada de regiones reguladoras relativas a la secuencia de codificación. La transcripción de un polinucleótido puede ser modulada en una forma similar. Algunas regiones reguladoras adecuadas inician la transcripción únicamente, o en forma predominante, en ciertos tipos celulares. Los métodos para identificar y caracterizar regiones reguladoras en polinucleótido genómico de planta, son conocidos en la técnica.
Los promotores adecuados incluyen promotores específicos de tejido reconocidos por factores específicos de tejido presentes en diferentes tipos de tejidos o células (por ejemplo, promotores específicos de raíz, promotores específicos de brote, promotores específicos de xilema), o presentes durante etapas de desarrollo diferentes, o presentes en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los promotores adecuados incluyen promotores consecutivos que pueden ser activados en la mayor parte de tipos celulares sin requerir inductores específicos. Los ejemplos de promotores adecuados para controlar la producción del polipéptido ARNi NtMRP, incluyen virus de mosaico de coliflor 35S (Ca V/35S), SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos o ubiquitin- o promotores - faseolina. Los expertos en la técnica tienen la capacidad de generar múltiples variantes de promotores recombinantes.
Los promotores específicos de tejidos son elementos de control de transcripción que únicamente son activos en células o tejidos particulares en momentos específicos durante el desarrollo de la planta, tal como en tejidos vegetativos o tejidos reproductores. La expresión específica de tejido puede ser conveniente, por ejemplo, cuando se prefiere la expresión de polinucleótidos en ciertos tejidos. Los ejemplos de promotores específicos de tejido bajo control de desarrollo incluyen promotores que pueden iniciar únicamente la transcripción (o principalmente de manera única) en ciertos tejidos, tal como tejidos vegetativos, por ejemplo, raíces u hojas o tejidos reproductivos, tal como fruto, óvulos, semillas, polen, pistilos, flores o cualquier tejido embriónico. Los promotores específicos de tejido reproductores pueden ser, por ejemplo, específicos de antera, específicos de óvulo, específicos de embrión, específicos de endosperma, específicos de integumento, específicos de semilla y recubrimiento de semilla, específicos de polen, específicos de pétalos, específicos de sépalo, o combinaciones de los mismos.
Los promotores específicos de hoja adecuados incluyen piruvato, promotor de diquinasa de ortofosfato (PPDK) de la planta C4 (maíz), promotor de cab-m1Ca + 2 de maíz, promotor del gen relacionado con myb Arabidopsis taliana (Atmyb5), los promotores de carboxilasa de bifosfato de ribulosa (RBCS) (por ejemplo, los genes de tomate RBCS 1 , RBCS2 y RBCS3A expresados en hojas y sembradíos de crecimiento con luz, RBCS1 y RBCS2 expresados en frutos de tomate en desarrollo y el promotor de carboxilasa de bisfosfato de ribulosa expresado casi exclusivamente en células de mesófilo en cuchillas de hoja y forros de hojas en altos niveles).
Los promotores específicos de senescencia adecuados incluyen un promotor de tomate activo durante maduración de frutos, senescencia y abscisión de hojas, un promotor de maíz de un gen que codifica una proteasa de cisteína. Se pueden utilizar promotores específicos de antera. Se pueden seleccionar promotores con preferencia de raíz conocidos para los expertos en la técnica. Los promotores con preferencia de semilla adecuados incluyen tanto promotores específicos de semilla (los promotores activos durante el desarrollo de semilla, tal como promotores de proteínas de almacenamiento de semilla) y promotores de germinación de semilla (los promotores activos durante germinación de semilla). Los promotores preferidos de semilla incluyen pero no se limitan a, Cim1 (mensaje inducido por citocinina); cZ19B1 (zein 19 kDa de maíz); milpas (sintasa de myo-inositol-1 -fosfato); mZE40-2, también conocido como Zm-40; nuclc; y celA (sintasa de celulosa). La gama-zein es un promotor específico de endosperma. Glob-1 es un promotor específico de un embrión. Para dicotiledóneos, los promotores específicos de semilla incluyen pero no se limitan frijol beta.-faseolina, napina, ß-conglicinina, lecitina de frijol soya, cruciferina, y similares. Para monocotiledóneos, los promotores específicos de semilla incluyen pero no se limitan a, promotor zein 15 kDa de maíz, promotor zein 22 kDa, promotor zein 27 kDa, promotor g-zein, promotor ?-zein 27 kDa (tal como promotor gzw64A, ver Acceso Genbank número S78780), un promotor ceroso, promotor de reducción 1, promotor de reducción 2, promotor de globulina 1 (ver Acceso Genbank número L22344), promotor Itp2, promotor cim1, promotores de extremol y extremo2 de maíz, promotor nud, promotor Zm40, eepl y eep2; led, promotor de tioredoxina H, promotor mlip15, promotorPCNA2, y promotor shrunken-2.
Los ejemplos de promotores inducibles incluyen promotores de ataque patogénico, condiciones anaeróbicas, temperatura elevada, luz, sequía, temperatura fría, alta concentración de sal. Los promotores inducibles mediante patógenos incluyen los de proteínas relacionadas con patogénesis (proteínas PR) las cuales son inducidas después de infección a través de un patógeno (por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1 ,3-glucanasa, quitinasa).
Además de los promotores de planta, se pueden derivar otros promotores adecuados de origen bacteriano por ejemplo, promotores de sintasa de octopina, promotor de sintasa de nopalina y otros promotores derivados de plásmidos Ti) o se pueden derivar de promotores virales (por ejemplo, promotores de ARN 35S y 19S de virus de mosaico de coliflor (CaMV), promotores constitutivos de virus de mosaico de tabaco, promotores de virus de mosaico de coliflor (CaMV) 19S y 35S, o promotor 35S de virus de mosaico de escrofularia).
Los ejemplos de porciones conjugadas incluyen compuestos macromoleculares tales como proteínas (por ejemplo, anticuerpos), cadenas de ácido graso, residuos de azúcar, glucoproteínas, polímeros (por ejemplo, polietilenglicol), o combinaciones de los mismos. Se puede conjugar un oligonucleótido para una porción que incrementa la captación celular del oligonucleótido.
Los ejemplos no limitantes de porciones, incluyen pero no se limitan a, anticuerpos, polipéptidos, porciones de lípidos tales como porción de colesterol, ácido cólico, tioéter, por ejemplo Hexil-s-tritiltiol , un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecilo, un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-g licerol o 1 -di-o-hexadecil-rac-glicero-S-h-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o cadena de polietilenglicol, un ácido acético de adamantano, una porción de palmitilo, una octadecilamina o porción de hexilamino-carbonil-oxicolesterol.
La porción puede ser un polímero cargado en forma positiva - tal como un péptido cargado en forma positiva, esto es, por ejemplo de aproximadamente 1 a 50 residuos de aminoácidos de longitud u óxido de polialquileno, tal como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol. En forma adecuada, el polímero cargado en forma positiva, tal como óxido de polialquileno puede adherirse al oligómero a través de un enlazador tal como un enlazador liberable.
Cuando se está midiendo la expresión de polipéptido NtMRP, se puede cuantificar la detección de la cantidad de mARN que codifica un polipéptido NtMRP, por ejemplo, mediante PCR o manchado Northern. Cuando se está midiendo un cambio en la cantidad en la muestra de un polipéptido NtMRP en la muestra, se puede utilizar detección de NtMRP mediante el uso de anticuerpos anti-NtMRP para cuantificar la cantidad de polipéptido NtMRP en la célula utilizando técnicas conocidas. Como alternativa, se puede medir la actividad biológica (por ejemplo, transporte de metal pesado - tal como cadmio) antes y después del contacto con el agente de prueba.
En otra modalidad, los anticuerpos que son inmunoreactivos con los polipéptidos se proporcionan en la presente invención. Se pueden emplear polipéptidos NtMRP, fragmentos, variantes, polipéptidos de fusión, y similares, tal como aquí se establece, como "inmunogenos" en la producción de anticuerpos inmunoreactivos con los mismos. Los anticuerpos se enlazan específicamente a los mismos a través de sitios de enlace de antígeno del anticuerpo. Específicamente los anticuerpos de enlace son los que reconocerán en forma específica y enlazaran con los polipéptidos de la familia NtMRP, homólogos y variantes, pero no con otras moléculas. En una modalidad, los anticuerpos son específicos para polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido NtMRP, tal como aquí se establece, y no reaccionan en forma cruzada con otros polipéptidos.
Más específicamente, los polipéptidos, fragmentos, variantes, polipéptidos de fusión, y similares contienen determinantes antigénicas o epítopes que provocan la formación de anticuerpos. Estos determinantes antigénicos o epítopes pueden ser ya sea lineales o conformacionales (discontinuos). Los epítopes lineales están compuestos de una sección simple de aminoácidos del polipéptido, mientras que los epítopes conformacionales o discontinuos están compuestos de secciones de aminoácidos de diferentes regiones de de la cadena polipéptido que se llevan en proximidad cercana al momento del doblez de polipéptido. Los epítopes pueden ser identificados a través de cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Además, los epítopes de los polipéptidos se pueden utilizar como reactivos de investigación, en ensayos y para purificar anticuerpos de enlace específicos de sustancias tales como sueros policlonales o sobrenadantes de hibridomas cultivados. Los epítopes o variantes de los mismos se pueden producir utilizando técnicas conocidas en el arte, tal como síntesis de fase sólida, disociación química o enzimática de polipéptido o utilizando tecnología de ADN recombinante.
Los anticuerpos tanto policlonales como monoclonales para los polipéptidos, se pueden preparar mediante técnicas convencionales. Las líneas de célula de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos para los polipéptidos, también se contemplan en la presente invención. Los hibridomas pueden ser producidos e identificados mediante técnicas convencionales. Para la producción de anticuerpos, se pueden inmunizar varios animales huésped mediante inyección con un polipéptido NtMRP, fragmento, variante, o mutantes de los mismos. Los animales huésped pueden incluir pero no se limitan a conejos, ratones y ratas, por nombrar algunos. Varios adyuvantes pueden ser utilizados para incrementar la respuesta inmunológica. Dependiendo de la especie huésped, los adyuvantes incluyen pero no se limitan a, adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias de superficie activa tales como I isolecitina , polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de penetración magnética, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos monoclonales pueden ser recuperados mediante técnicas convencionales. Los anticuerpos monoclonales pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, Ig , IgE, IgA, IgD, y cualquier subclase de los mismos.
Los anticuerpos también se pueden utilizar en ensayos para detectar la presencia de los polipéptidos o fragmentos, ya sea in vitro o ¡n vivo. Los anticuerpos también se pueden emplear en purificación de polipéptidos o fragmentos mediante cromatografía de inmunoafinidad.
Varias modalidades proporcionan plantas mutantes, así como biomasa o semillas en las cuales el nivel de expresión del polinucleótido NtMRP se reduce sustancialmente para cortar o impedir el transporte de cadmio en la lámina de hoja. La lámina de hoja puede incorporarse en varios productos consumibles -tal como varios artículos que se pueden fumar, tal como cigarros, cigarrillos y productos de tabaco sin humo (esto es, no combustibles) .
El % de reducción de cadmio en estos artículos con humo y productos sin humo pueden tener un valor de al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100%, 200% o 300% inferior, cuando se compara con productos consumibles derivados de contrapartes no mutantes, que no tienen origen natural o no transgénicas. En algunas modalidades, el contenido de cadmio de estos artículos que se pueden fumar y productos sin humo tiene un valor desde un rango de aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 0.05 partes por millón (ppm), de aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 0.1 ppm, de aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 0.5 ppm, de aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 1.0 ppm, o de aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 5 ppm. En algunas modalidades, el contenido de cadmio de estos artículos que se pueden fumar y productos sin humo es de aproximadamente 0.001 ppm o menos, aproximadamente 0.01 ppm o menos o aproximadamente 0.05 ppm o menos, o aproximadamente 0.49 ppm o menos o aproximadamente 0.5 ppm o menos. El grado de acumulación de cadmio en plantas puede ser sustancialmente variable dependiendo de diversos parámetros atribuidos a la complejidad del genotipo y el ambiente de crecimiento. Por ejemplo, las concentraciones de cadmio en las hojas de tabaco que crecen en campo, puede ser extremadamente variable dependiendo de factores tales como clima de agricultura, calidad de la tierra, cultivos y tipo y origen de fertilizante utilizado. Además, los patrones de distribución de cadmio relativos dentro de diferentes partes de una planta de tabaco, pueden variar de acuerdo con las especies, el órgano/tejido y las condiciones de crecimiento (esto es, crecimiento en campo versus crecimiento hidropónico). En promedio, las concentraciones de cadmio medidas en hojas de tabaco crecidas en campo (incluyendo nervaduras centrales y venas) pueden estar dentro del rango de aproximadamente 0.5 a 5 ppm (partes por millón, o microgramo/gramo de peso seco de hojas de tabaco). Sin embargo, muchos niveles de cadmio publicados normalmente no definen la etapa de madurez del tabaco, la variedad del tabaco o las partes de la hoja particulares (esto es, eliminación de la posición de la vara de hoja) recolectadas para análisis. En algunas variedades, las hojas inferiores pueden acumular mayores niveles de cadmio que los niveles medios y superiores. En el nivel intracelular, el cadmio puede encontrarse en diversos componentes de la célula de una célula de planta, incluyendo pared celular, citoplasma, cloroplasto, núcleo y vacuolo.
Además, el contenido de cadmio medido en hojas de tabaco puede variar sustancialmente dependiendo de los niveles de cadmio en el ambiente de tierra, en donde se crecen las plantas de tabaco. Las hojas de tabaco crecidas en áreas contaminadas con cadmio, pueden acumular cadmio de aproximadamente 35 ppm o mayor, en comparación con las hojas de las contrapartes genéticamente idénticas crecidas en áreas no contaminadas, que pueden acumular cadmio en un rango de aproximadamente 0.4 hasta aproximadamente 8 ppm. Los vacuolos dentro de las hojas de plantas crecidas en áreas contaminadas con cadmio, pueden acumular concentraciones muy altas de cadmio. Los métodos para aplicar las composiciones descritas que sean adecuadas para una especie de planta determinada de interés, son conocidos para los expertos en la técnica.
El contenido de metal pesado en plantas se puede medir utilizando diversos métodos conocidos en la técnica. Un método preferido comprende el uso de espectrofotometría de masa de plasma acoplado en forma inductiva ("ICP-MS," Agilent 7500A; Agilent Technologies, Palo Alto, CA).
Las plantas mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas que se describen en la presente invención pueden tener otros usos, por ejemplo, en agricultura. Por ejemplo, las plantas mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas se pueden utilizar para elaborar alimento para animales y productos alimenticios para humanos. Las semillas de plantas aquí descritas, pueden acondicionarse y embolsarse en material de empaque a través de métodos conocidos en la técnica, para formar un artículo para fabricación. El material de empaque, tal como papel y tela, son bien conocidos en la técnica. Un paquete de semilla puede tener una etiqueta, por ejemplo, una etiqueta o marca asegurada al material de empaque, una etiqueta impresa en el material de empaque, o una etiqueta insertada dentro del empaque, que describe la naturaleza de las semillas ahí contenidas.
La planta que lleva un alelo NtMRP mutante se puede utilizar en un programa de reproducción de planta para crear líneas, variedades e híbridos útiles. En particular, el alelo NtMRP mutante es introgresado en las variedades comercialmente importantes descritas anteriormente. Por lo tanto, se proporcionan métodos para reproducción plantas, que comprenden cruzar una planta mutante, una planta que no tiene origen natural o una planta transgénica tal como aquí se describe, con una planta que comprende una identidad genética diferente. El método puede comprender además cruzar la planta de progenie con otra planta, y repetir opcionalmente el cruce hasta que se obtiene una progenie con los rasgos genéticos o antecedentes genéticos deseables. Un propósito cumplido por los métodos de reproducción, es introducir un rasgo genético deseable en otras variedades, líneas de reproducción, híbridos o cultivos, particularmente los que son de interés comercial. Otro propósito, es facilitar el apilamiento de modificaciones genéticas de diferentes genes en una sola variedad de planta, líneas, híbridos o cultivos. Los cruces intraespecíficos, así como interespecíficos están contemplados. Las plantas de progenie que surgen de dichos cruces, también son referidas como líneas de reproducción, y son ejemplos de plantas que no tienen origen natural.
En una modalidad, se proporciona un método para producir una planta que no tiene origen natural, en donde el método comprende: (a) cruzar una planta mutante o transgénica con una segunda planta para producir una semilla de progenie; (b) crecer la semilla de progenie, bajo condiciones de crecimiento de plantas, para producir la planta que no tiene origen natural. El método puede comprender además: (c) cruzar consigo misma u otra planta la generación previa de la planta que no tiene origen natural para producir la semilla de progenie; (d) crecer la semilla de progenie de paso (c) bajo condiciones de crecimiento de plantas, para producir plantas adicionales que no tienen origen natural; y (e) repetir los pasos de cruce y crecimiento de (c) y (d) múltiples veces, para generar generaciones adicionales de plantas que no tienen origen natural. El método puede comprender opcionalmente antes del paso (a), un paso para proporcionar una planta de origen que comprenda una identidad genética que está caracterizada, y que no sea idéntica a la planta mutante o transgénica. En algunas modalidades, dependiendo del programa de reproducción, los pasos de cruce y crecimiento se repiten de 0 a 2 veces, de 0 a 3 veces, de 0 a 4 veces, de 0 a 5 veces, de 0 a 6 veces, de 0 a 7 veces, de 0 a 8 veces, de 0 a 9 veces o de 0 a 10 veces, con el objeto de generar generaciones de plantas que no ocurren naturalmente. El retrocruce es un ejemplo de dicho método, en donde la progenie se cruza con uno de sus orígenes u otra planta genéticamente similar a su origen, con el objeto de obtener una planta de progenie en la siguiente generación, que tenga una identidad genética que se acerque más a la de uno de los orígenes. Las técnicas para reproducción de planta, particularmente reproducción de planta de tabaco, son bien conocidas y se vuelven a utilizar en los métodos aquí descritos. La descripción proporciona además plantas que no tienen origen natural producidas a través de estos métodos.
En algunas modalidades, los métodos aquí descritos, las líneas que resultan de la reproducción y clasificación de genes Nt RP variantes, se evalúan en el campo utilizando procedimientos de campo estándar. Los genotipos de control que incluyen el origen no mutagenizado original, se incluyen y se distribuyen las entradas en el campo en un diseño de bloque completo aleatorizado u otro diseño de campo adecuado. Para tabaco, se utilizan prácticas agrónomas estándar, por ejemplo, el tabaco se recolecta, se pesa y se muestrea para pruebas químicas y otras pruebas comunes antes y durante la curación. Se llevan a cabo análisis estadísticos de los datos, para confirmar la similitud de las líneas seleccionadas con la línea de origen. Los análisis citogenéticos de las plantas seleccionadas se llevan a cabo opcionalmente para confirmar las relaciones de complemento de cromosoma y emparejamiento de cromosoma.
Se puede utilizar huella de ADN, polimorfismo de nucleótido simple, marcadores de microsatélite o tecnologías similares en un programa de reproducción de selección auxiliada por marcador (MAS) para transferir o reproducir alelos mutantes del gen(s) NtMRP en otros tabacos, tal como aquí se describe. Por ejemplo, un reproductor puede crear poblaciones de segregación a partir de hibridaciones de un genotipo que contiene un alelo muíante con un genotipo agrónomamente deseable. Las plantas en las generaciones F2 o de retrocruce pueden ser clasificadas utilizando un marcador desarrollado a partir de una secuencia(s) genómica NtMRP o fragmento(s) de la misma, utilizando una de las técnicas aquí descritas. Las plantas identificadas como poseyendo el alelo mutante, pueden ser retrocruzadas o autopolinadas para crear una segunda población que será clasificada. Dependiendo del patrón de herencia esperado o la tecnología MAS utilizada, puede ser necesario autopolinar las plantas seleccionadas antes de cada ciclo de retrocruce para ayudar a la identificación de las plantas individuales deseadas. El retrocruce u otro procedimiento de reproducción se puede repetir hasta que el fenotipo deseado del origen recurrente sea recuperado.
De acuerdo con la descripción, en un programa de reproducción, los cruces exitosos producen plantas F1 que son fértiles. Las plantas F1 seleccionadas pueden ser cruzadas con uno de los orígenes, y las plantas de primera generación de retrocruce son autopolinizadas para producir una población que nuevamente es clasificada para expresión de gen Nt RP variante (por ejemplo, la versión nula del gen NtMRP). El proceso de retrocruce, autopolinización y clasificación se repiten, por ejemplo, al menos 4 veces hasta que la clasificación final produce una planta que es fértil y razonablemente similar al origen recurrente. Esta planta, si se desea, es autopolinizada, y la progenie es subsecuentemente clasificada otra vez para confirmar que la planta exhibe una expresión de gen NtMRP variante. En algunas modalidades, se clasifica una población de plantas en la generación F2 para la expresión de gen NtMRP variante, por ejemplo, se identifica una planta que falla para expresar NtMRP debido a la ausencia de un gen NtMRP de acuerdo con métodos estándar, por ejemplo, utilizando un método PCR con cebadores basados en la información de la secuencia de nucleótido del NtMRP aquí descrito.
Se pueden producir variedades híbridas evitando la autopolinización de plantas de origen femeninas (esto es, orígenes de semilla) de una primera variedad, permitiendo que el polen de las plantas de origen masculinas de una segunda variedad, fertilice las plantas de origen femeninas, y permitiendo que las semillas híbridas F1 se formen en las plantas femeninas. Se pued evitar la autopolinización de plantas femeninas, mutilando las flores en una etapa temprana de desarrollo de flor. Como alternativa, se puede evitar la formación de polen en las plantas de origen femeninas utilizando una forma de esterilidad masculina. Por ejemplo, la esterilidad masculina se puede producir mediante esterilidad masculina citoplásmica (CMS), o esterilidad masculina transgénica, en donde un transgen inhibe la microesporogénesis y/o formación de polen, o autoincompatibilidad. Las plantas de origen femeninas que contienen CMS son particularmente útiles. En modalidades, en donde las plantas de origen femeninas son CMS, el polen se recolecta de plantas fértiles masculinas y se aplican manualmente a los estigmas de las plantas de origen femenino CMS, y se recolecta la semilla F1 resultante.
Las variedades y líneas aquí descritas se pueden utilizar para formar híbridos F1 de un solo cruce. En dichas modalidades, las plantas de las variedades de origen pueden crecerse como poblaciones adjuntas sustancialmente homogéneas para facilitar la polinización cruzada natural de las plantas de origen masculinas a las plantas de origen femeninas. La semilla F1 formada en las plantas de origen femenina se recolectan selectivamente a través de medios convencionales. También se pueden crecer las dos variedades de planta de origen en volumen, y recolectar una combinación de semilla híbrida F1 formada en el origen femenino y la semilla formada en el origen masculino como resultado de la autopolinización. Como alternativa, se pueden llevar a cabo cruces de tres vías en donde se utiliza un híbrido F1 de un solo cruce como un origen femenino, y se cruza con un diferente origen masculino. Como otra alternativa, se pueden crear híbridos de cruce doble en donde la progenie F1 de dos cruces simples diferentes, se cruzan en sí mismas.
Se puede clasificar una población de plantas mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas, o seleccionarse para los miembros de la población que tienen un rasgo o fenotipo deseado. Por ejemplo, se puede clasificar una población de progenie de un solo evento de transformación para las plantas que tienen un nivel deseado de expresión del polipéptido o polinucleótido NtMRP. Se pueden utilizar métodos físicos y bioquímicos para identificar niveles de expresión. Éstos incluyen análisis Southern, o amplificación PCR para detección de un polinucleótido; manchados Northern, protección S1 RNasa, extensión de cebador o amplificación RT-PCR para detectar transcripciones ARN; ensayos enzimáticos para detectar actividad de enzima o ribozima de polipéptidos y polinucleótidos; y electroforesis de gel de proteína, manchados Western, inmunoprecipitación e inmunoensayos enlazados por enzima para detectar polipéptidos. También se pueden utilizar otras técnicas tales como hibridación in situ, manchado de enzimas e inmunomanchado, para detectar la presencia o expresión de polipéptidos o polinucleótidos.
Los células de planta y las plantas mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas se describen en la presente invención comprendiendo uno o más polinucleótidos recombinantes - tal como uno o más polinucleótidos NtMRP aislados, o una más o más construcciones de polinucleótido, uno o más más ARN de hebra doble, uno o más conjugados o uno o más vectores/vectores de expresión.
La expresión de NtMRP se puede evaluar utilizando métodos que incluyen por ejemplo, RT-PCR, manchados Northern, protección RNasa, extensiones de cebador, manchados Western, electroforesis de gel de proteína, inmunoprecipitación, inmunoensayos enlazados por enzimas, ensayos de chip y espectrometría de masa. Deberá observarse que si un polipéptido se expresa bajo el control de un promotor con preferencia de tejido o de expresión amplia, se puede evaluar la expresión en toda la planta o en un tejido seleccionado. En forma similar, si se expresa un polipéptido en un momento en particular, por ejemplo, en un momento en particular en el desarrollo o al momento de la inducción se puede evaluar la expresión en forma selectiva en un período de tiempo deseado.
Sin limitación, las plantas aquí descritas pueden ser modificadas para otros propósitos, ya sea antes o después de que se ha modulado (por ejemplo, reducido o inhibido) la expresión o actividad de NtMRP. Pueden estar presentes una o más de las siguientes modificaciones genéticas en las plantas mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas. En una modalidad, uno o más de los genes adicionales que están implicados en la captación de metal pesado o en el transporte de metal pesado, se modifican para dar como resultado plantas o partes de las plantas (tal como hojas) que tienen un contenido de metal pesado menor que las plantas de control o las partes de las mismas sin la modificación(s). Los ejemplos no limitantes incluyen genes en la familia de facilitadores de difusión de catión (CDF), la familia de Zrt-, proteínas tipo Irt (ZIP), la familia de intercambiadores de catión (CAX), la familia de transportadores de cobre (COPT), la familia de ATPases tipo P de metal pesado (HMAs, tal como se describe en WO2009074325), la familia de homólogos de proteínas de macrófago asociada con resistencia natural (NRAMP), y otros miembros de la familia de los transportadores de cartucho de enlace ATP (ABC), que participan en el transporte de metales pesados, tal como cadmio. El término metal pesado, tal como aquí se utiliza, incluye metales de transición. En otra modalidad, uno o más genes que están implicados en la conversión de intermediarios metabólicos de nitrógeno, se modifican para dar como resultado plantas o partes de las plantas (tal como hojas) que cuando se calientan, producen niveles inferiores de al menos una nitrosamina específica de tabaco (por ejemplo, 4-(metilnitrosam¡no)- -(3-piridil)-1 -butanona, N-nitrosonorni'cotina, N-nitrosoanatabina y N-nitrosoanabasirta) que las plantas de control o partes de las mismas. Los ejemplos sin limitación de genes que se pueden modificar incluyen genes que codifican demetilasa de nicotina, tal como CYP82E4, CYP82E5 y CYP82E10 que se precipitan en la conversión de nicotina a nornicotina y se describen en las Publicaciones de Patente WO2006091194, WO2008070274, WO2009064771 y PCT/US2011 /021088.
Los ejemplos de otras modificaciones incluyen tolerancia a herbicida, por ejemplo, el glifosato es un ingrediente activo de muchos herbicidas de amplio espectro. Se han desarrollado plantas transgénicas resistentes a glifosato, transfiriendo el gen aroA (una sintetasa de glifosato EPSP de Salmonella typhimurium y E. coli). Las plantas resistentes a sulfonilurea han sido producidas transformando el gen ALS mutante (sintetasa de acetolactato) de Arabidopsis. La proteína 08 del fotosistema II de Amaranthus hybridus mutante, ha sido transferida en plantas para producir plantas transgénicas resistentes a atrazina; y se han producido plantas transgénicas resistentes a bromoxinil incorporando el gen bkn de la bacteria Klebsiella pneumoniae. Otra modificación de ejemplo da como resultado plantas que son resistentes a insectos. Las toxinas Bacillus thuringiensis (Bt) pueden proporcionar una forma efectiva de retardar el surgimiento de pestes resistentes a Bt, tal como se ¡lustra recientemente en brócoli, en donde los genes Bt en pirámide cryIAc y cryIC controlaron las polillas con marcas de diamante (Plutella xylostella) resistentes a cualquier proteína simple, y retardaron en forma significativa la evolución de insectos resistentes. Otra modificación de ejemplo se obtiene como resultado en plantas que son resistentes a enfermedades originadas por patógenos (por ejemplo, virus, bacterias, hongos). Las plantas que expresan el gen Xa21 (resistente a plaga bacteriana) con plantas que expresan tanto un gen de fusión Bt como un gen de quitinasa (resistente al gusano de tallo amarillo y tolerante al forro) han sido diseñadas. Otra modificación de ejemplo da como resultado una capacidad reproductiva alterada, tal como esterilidad masculina. Otra modificación de ejemplo da como resultado plantas que son tolerantes a tensión abiótica (por ejemplo, sequía, temperatura, salinidad) y se han producido plantas transgénicas tolerantes transfiriendo la enzima de fosfato de glicerol de acilo de Arabidopsis; los genes que codifican la deshidrogenasa de manitol y la deshidrogenasa de sorbitol que están implicados en síntesis de manitol y sorbitol, mejoran la resistencia a sequía. Otra modificación de ejemplo da como resultado plantas que producen proteínas que tienen propiedades inmunogénicas favorables para utilizarse en humanos. Por ejemplo, las plantas con la capacidad de proteínas que carecen sustancialmente de residuos de fucosa enlazados por alfa-1,3, residuos de xilosa enlazados por beta-1,2, o ambos, en su N-glicano pueden ser utilizadas. Otras modificaciones de ejemplo pueden dar como resultado plantas con proteínas y aceites de almacenamiento mejorados, plantas con eficiencia fotosintética mejorada, plantas con vida en anaquel prolongada, plantas con contenido de carbohidratos mejorado y plantas resistentes a hongos; las plantas que codifican una enzima están implicadas en la biosíntesis de alcaloides. También están contempladas plantas transgénicas en las cuales se ha modulado la expresión de S-adenosil-L-metionina (SAM) y/o gamma-sintasa de cistationina (CGS).
Sin limitación, las plantas aquí descritas pueden ser modificadas en forma adicional. Los ejemplos de dichas modificaciones incluyen pero no se limitan a: (a) Plantas que pueden tolerar herbicidas. Por ejemplo, el glifosato es un ingrediente activo de muchos herbicidas de amplio espectro. Las plantas transgénicas resistentes a glifosato han sido desarrolladas transfiriendo el gen aroA (una sintetasa EPSP de glifosato de Salmonella typhimurium y E. coli); las plantas resistentes a sulfonilurea han sido producidas transformando el gen ALS mutante (sintetasa acetolactato) de Arabidopsis; la proteína OB de fotosistema II del mutante Amaranthus hybridus, ha sido transferida en plantas para producir plantas transgénicas resistentes a atrazina; y se han producido plantas transgénicas resistentes a bromoxinilo incorporando el gen bxn de la bacteria Klebsiella pneumoniae; (b) Las plantas son resistentes a insectos. Las toxinas Bacillus thuringiensis (Bt) pueden proporcionar una forma efectiva de retardar el surgimiento de pestes resistentes a Bt, tal como se ilustra recientemente en brócoli, en donde los genes Bt en pirámide cryIAc y cryIC controlaron polillas con marcas de diamante (Plutella xylostella) resistentes a cualquier proteína simple, y retardaron en forma significativa la evolución de insectos resistentes; (c) Plantas que son resistentes a virus. Se han producido plantas de Virus de Mosaico de Tabaco introduciendo proteínas de recubrimiento viral. Otras plantas transgénicas resistentes virales incluyen plantas de papa resistentes a virus de papa, arroz resistente a RSV y leguminosa negra y leguminosa resistentes a YMV; (d) Plantas que son resistentes a bacterias. Las plantas que expresan el gen Xa21 (resistentes a plaga bacteriana) con plantas que expresan tanto un gen de fusión Bt como un gen de quitinasa (resistencia a gusano de tallo amarillo y tolerancia a forro) han sido diseñadas; (e) Plantas transgénicas tolerantes a la tensión: Se han producido plantas transgénicas frías y tolerantes transfiriendo la enzima de fosfato de glicerol de acilo de Arabidopsis; los genes que codifican la deshidrogenasa de manitol y la deshidrogenasa de sorbitol que están implicados en la síntesis de manitol y sorbitol mejoran la resistencia a la sequía; (f) Las plantas que producen proteínas que tienen propiedades inmunogénicas favorables para utilizarse en humanos. Por ejemplo, las plantas con la capacidad de producir proteínas que carecen sustancialmente de residuos de fucosa enlazados por alfa-1,3, residuos de xilosa enlazados por beta-1,2 o ambos, en su N-glicano pueden ser utilizadas; y (g) Otros ejemplos de plantas transgénicas, son plantas con proteínas y aceites de almacenamiento mejorados, plantas con eficiencia fotosintética mejorada, plantas con vida en anaquel prolongada, plantas con contenido de carbohidrato mejorado y plantas resistentes a hongos; plantas que codifican una enzima implicada en la biosíntesis de alcaloides; se combinaron genes para una trayectoria de desintoxicación de mercurio orgánico bacteriano (reductasa mercúrica, merA) y liasa de organomercurio, merB cruzándose en Arabidopsis , y las plantas que expresan ambos genes tuvieron la capacidad de crecer en concentraciones de metilmercurío 50 veces mayores que las plantas tipo silvestre.
Se pueden introgresar uno o más de dichos rasgos en las plantas de tabaco mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas de otros cultivos de tabaco, o se pueden transformar directamente en las mismas. La introgresión del rasgo(s) en las plantas de tabaco mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas se puede lograr a través de cualquier método de reproducción de la planta conocido en la técnica, por ejemplo, reproducción de pedigrí, retrocruce, reproducción de haploide duplicado, y similares (ver la Publicación de Wernsman, E. A, y Rufty, R. C. 1987. Capítulo Diecisiete. Tobacco. Páginas 669-698 En: Desarrollo de Cultivo. Especies de Cosecha. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co, Inc., Nueva York, N.Y 761 pp.). Se pueden utilizar técnicas basadas en biología molecular descritos anteriormente, en particular RFLP y marcadores microsatelitales en los retrocruces, para identificar las progenies que tienen el mayor grado de identidad genética con el origen recurrente. Esto permite acelerar la producción de variedades que tienen al menos el 98%, preferentemente al menos 95%, más preferentemente al menos 99% de identidad genética con el origen recurrente, aún más preferentemente genéticamente idénticas al origen recurrente, y que comprenden en forma adicional el rasgo(s) introgresado de origen donador. Dicha determinación de identidad genética puede estar basada en marcadores moleculares conocidos en la técnica.
La última generación de retrocruce puede ser autosembradas para proporcionar una progenie de reproducción pura para el polinucleótido(s) que será transferido. Las plantas resultantes generalmente tienen esencialmente todas las características morfológicas y fisiológicas de las plantas mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas, además del rasgo(s) transferido (por ejemplo, uno o más rasgos de gen simple). El protocolo de retrocruce exacto dependerá del rasgo que esté siendo alterado para determinar un protocolo de pruebas adecuado. Aunque los métodos de retrocruce son simplificados cuando el rasgo que está siendo transferido es un alelo dominante, también se puede transferir un alelo recesivo. En este caso, puede ser necesario introducir al menos una progenie para determinar si el rasgo deseado ha sido transferido en forma exitosa.
Varias modalidades proporcionan plantas mutantes, plantas que no tienen origen natural o plantas transgénicas, así como biomasa, en donde el nivel de expresión del polinucleótido NtMRP se reduce de modo que se acumulen en las mismas cantidades menores de cadmio.
Las partes de dichas plantas, particularmente plantas de tabaco, y más particularmente láminas de hoja y nervadura central de plantas de tabaco, se pueden incorporar en o utilizarse para elaborar diversos productos consumibles incluyendo pero sin limitarse a materiales que forman aerosol, dispositivos que forman aerosol, artículos para fumar, artículos que se pueden fumar, productos sin humo y productos de tabaco. Los ejemplos de materiales que forman aerosol, incluyen pero no se limitan a composiciones tabaco, tabaco, extracto de tabaco, tabaco de corte, rellenador de corte, tabaco curado, tabaco expandido, tabaco homogenizado, tabaco reconstituido y tabacos de pipa. Los artículos para fumar y los artículos que se pueden fumar son tipos de dispositivos que forman aerosol. Los ejemplos de artículos para fumar o artículos que se pueden fumar incluyen pero no se limitan a cigarros y cigarrillos. Los ejemplos de productos sin humo comprenden tabacos masticables, e inhalaciones. En ciertos dispositivos que forman aerosol, en lugar de combustión, se calienta una composición de tabaco u otro material que forma aerosol a través de uno o más elementos de calentamiento eléctrico para producir un aerosol. En otro tipo de dispositivo que forma aerosol calentado, se produce un aerosol mediante la transferencia de calor desde un elemento de combustible o fuente de calor hasta un material que forma aerosol físicamente separado, que puede estar localizado dentro, alrededor o en la corriente descendente de la fuente de calor. Los productos de tabaco sin humo y varios materiales que forman aerosol que contienen tabaco, pueden contener tabaco en cualquier forma, incluyendo como partículas secas, trituraciones, gránulos, polvos o una pasta, depositados en, mezclados en, rodeados por o combinados de otra manera con otros ingredientes y en cualquier formato, tal como hojuelas, películas, barras, espumas o gránulos. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "fumar" se utiliza para describir un tipo de aerosol que se produce mediante artículos para fumar, tal como cigarros, o mediante la combustión de un material que forma aerosol .
En una modalidad, también se proporciona material curado de las plantas de tabaco mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas aquí descritas. Los procesos para curar hojas de tabaco verde son conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen sin limitación curación con aire, curación con fuego, curación con humo y curación con sol. Los procesos de curación de hojas de tabaco verde dependen del tipo de tabaco recolectado. Por ejemplo, el tabaco de humo de Virginia (brillante) normalmente se cura con humo, Burley y algunas cepas oscuras normalmente se curan con aire, y el tabaco de pipa, tabaco para masticar y de inhalación normalmente se curan con fuego.
En otra modalidad, se describen productos de tabaco que incluyen materiales que forman aerosol que contienen tabaco que comprenden hojas, preferentemente hojas curadas, de las plantas de tabaco mutantes, plantas de tabaco transgénicas o plantas de tabaco que no tienen origen natural aquí descritas. Los productos de tabaco aquí descritos pueden ser un producto de tabaco combinado que puede comprender adicionalmente tabaco no modificado.
Las plantas mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas pueden tener otros usos, por ejemplo, en agricultura. Por ejemplo, las plantas mutantes, que no tienen origen natural o transgénicas aquí descritas pueden ser utilizadas para elaborar alimentos para animales y productos de alimentos para humanos.
La presente descripción también proporciona métodos para producir semillas, en donde los métodos comprenden cultivar la planta mutante, la planta que no tiene origen natural o la planta transgénica aquí descrita, y recolectar las semillas de las plantas cultivadas. Las semillas de las plantas aquí descritas pueden ser acondicionadas y embolsadas en material de empaque por medios conocidos en la técnica para formar un artículo de fabricación. El material de empaque tal como papel y tela, es bien conocido en la técnica. Un paquete de semillas puede tener una etiqueta, por ejemplo, una etiqueta o marca asegurada al material de empaque, una etiqueta impresa en el material de empaque o una etiqueta insertada dentro del paquete, que describe la naturaleza de las semillas ahf contenidas.
Las composiciones, métodos y equipos para genotipificar plantas para identificación, selección o reproducción están comprendidas en la presente descripción, y pueden comprender un medio para detectar la presencia de un polinucleótido NtMRP en una muestra de polinucleótido. Por consiguiente, se describe una composición que comprende uno o más cebadores para amplificar en forma específica al menos una parte del polinucleótido NtRMP, y opcionalmente una o más sondas, y opcionalmente uno o más reactivos para llevar a cabo la amplificación o detección.
Por consiguiente, se describen cebadores o sondas de oligonucleótido específicos de gen que comprenden aproximadamente 10 o más polinucleótidos contiguos que corresponden al polinucleótido NtMRP. Los cebadores o sondas pueden comprender o consistir en aproximadamente 15, 20, 25, 30, 40, 45 o 50 más polinucleótidos contiguos que hibridan (por ejemplo, hibridan específicamente) al polinucleótido NtMRP. En algunas modalidades, las sondas o cebadores pueden comprender o consistir en aproximadamente 10 a 50 nucleótidos contiguos, aproximadamente 10 a 40 nucleótidos contiguos, aproximadamente 10 a 30 nucleótidos contiguos o aproximadamente 15 a 30 nucleótidos contiguos que pueden ser utilizados en métodos de identificación de gen dependientes de secuencia (por ejemplo, hibridación Southern) o aislamiento (por ejemplo, hibridación in situ de colonias bacterianas o placas de bacteriófago) o detección genética (por ejemplo, como uno o más cebadores de amplificación en amplificación o detección de polinucleótido). El uno o más cebadores o sondas específicos pueden ser diseñados y utilizados para amplificar o detectar una parte, o todo el polinucleótido NtMRP. A manera de ejemplo específico, se pueden utilizar dos cebadores en un protocolo de reacción de cadena de polimerasa para amplificar un fragmento de polinucleótido que codifica el polinucleótido NtMRP - tal como ADN o ARN. La reacción de cadena de polimerasa también se puede llevar a cabo utilizando un cebador que se deriva de la secuencia de polinucleótido NtMRP, y un segundo cebador que híbrida para una secuencia en la corriente ascendente o corriente descendente de la secuencia de polinucleótido NtMRP - tal como una secuencia promotora NtMRP, el extremo 3' del precursor mARN o la secuencia derivada de un vector. Los ejemplos de técnicas térmicas o isotérmicas útiles para amplificación in vitro de polinucleótidos, son bien conocidos en la técnica. La muestra puede ser o puede derivarse de una planta, célula de planta o material de planta, o un producto elaborado o derivado de la planta, la célula de la planta o el material de la planta tal como aquí se describe.
Por lo tanto, en un aspecto adicional, también se proporciona un método para detectar un polinucleótido NtMRP en una muestra, en donde el método comprende los pasos de: (a) proporcionar una muestra que comprende, o se sospecha que comprende un polinucleótido; (b) contactar la muestra con uno o más cebadores o una o más sondas para detectar en forma específica al menos una parte del polinucleótido NtMRP; y (c) detectar la presencia de un producto de amplificación, en donde la presencia de un producto de amplificación indica la presencia del polinucleótido NtMRP en la muestra. En un aspecto adicional, también se proporciona el uso de uno o más cebadores o sondas para detectar en forma específica al menos una parte del polinucleótido NtMRP. También se proporcionan equipos para detectar al menos una parte del polinucleótido NtMRP, que comprenden uno o más cebadores o sondas para detectar en forma específica al menos una parte del polinucleótido NtMRP. El equipo puede comprender reactivos para amplificación de polinucleótido - tal como la reacción de cadena de polimerasa (PCR) - o reactivos para tecnología de detección - hibridación de sonda de polinucleótido - tal como Manchados Southern, Manchados Northern, hibridación in situ o microformación . El equipo puede comprender reactivos para tecnología de detección de enlace de anticuerpo tal como Manchados Western, ELISAS, espectrometría de masa SELDI o tiras de prueba. El equipo puede comprender reactivos para secuenciación de ADN. El equipo puede comprender reactivos y/o instrucciones para determinar un contenido de metal pesado - tal como cadmio-. En algunas modalidades, un equipo puede comprender instrucciones para uno o más de los métodos descritos. Los equipos descritos pueden ser útiles para determinación de identidad genética, estudios filogenéticos, genotipificación, haplotipificación , análisis de pedigrí o reproducción de planta, particularmente con calificación codominante.
La presente descripción también proporciona un método para genotipificar una planta, una célula de planta o un material de planta que comprende un polinucleótido NtMRP. La genotipificación proporciona un medio para distinguir homólogos de un par de cromosomas y se puede utilizar para diferenciar segregadores en una población de planta. Se pueden utilizar métodos de marcador molecular para estudios filogenéticos, caracterizar relaciones genéticas entre variedades de cosechas, identificar cruces o híbridos somáticos, localizar segmentos cromosomales que afectan los rasgos monogénicos, clonación basada en mapas y el estudio de herencia cuantitativa. El método específico de genotipificación puede emplear cualquier número de técnicas analíticas de marcador molecular que incluyen amplificación de polimorfismos de longitud de fragmento (AFLPs). Las AFLPs son el producto de diferencias alélicas entre fragmentos de amplificación originados por variabilidad de secuencia de nucleótido. Por lo tanto, se describe un medio para seguir la segregación de NtM P, así como secuencias cromosomales genéticamente enlazadas a estos genes o polinucleótidos, utilizando las técnicas tales como análisis AFLP.
La presente invención se describe en forma adicional en los ejemplos que se encuentran a continuación, los cuales no están proyectados para limitar el alcance de la misma, descrita en las reivindicaciones adjuntas.
EJEMPLOS Se proporcionan los siguientes ejemplos como una ilustración y no una limitación. A menos que se indique de otra manera, se emplean técnicas y métodos convencionales de biología molecular, biología de plantas, bioinformáticas y reproducción de planta.
Ejemplo 1. Identificación de secuencia genómica de ADN NtMRP3 Biblioteca de tabaco BAC. Se preparó una biblioteca de Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) como se indica a continuación: se aislaron núcleos de hojas de plantas que crecen en invernadero de la variedad de tabaco Nicotiana de Hoja Ancha de Hicks (Hicks Broad Leaf). Se aisló el ADN de alto peso molecular de los núcleos de acuerdo con protocolos estándar, y se digirió parcialmente con BamHI y Hindlll y se clonó en los sitios BamHI o Hindlll del vector plNDIG05 BAC. Se obtuvieron más de 320,000 clones con una longitud de inserto promedio de 135 mega pares base que cubren aproximadamente 9.7 veces el genoma de tabaco.
Ensamble de secuencia de genoma de tabaco. Se presentaron a secuenciación un gran número de clones BAC levantados en forma aleatoria utilizando el método Sanger, que genera más de 1,780,000 secuencias sin procesar de una longitud promedio de 550 pares base. Se aplicó filtración de metilo utilizando una cepa Mcr+ de Escherichia coli para la transformación y aislamiento únicamente de ADN hipometilado. Todas las secuencias se ensamblaron utilizando el ensamblador de genoma CELERA que produce más de 800,000 secuencias que comprenden más de 200,000 contigs y 596,970 secuencias simples. Los tamaños de contig son de entre 120 y 15,300 pares base con una longitud promedio de 1,100 pares base.
La secuencia genómica del ADN NtMRP3 se identificó mediante secuenciación de un BAC que contiene parte del genoma que incluye el ADN NtMRP3. La secuencia se establece en la figura 6.
Ejemplo 2: Transformación de Variedades de Tabaco con Vectores de Expresión de ARNi NtMRP3 Se esterilizaron semillas de tabaco y se germinaron en un plato de petri que contiene medio basal MS suplementado con 5 ml/L de mezcla de conservación de planta (PPM). Se seleccionaron sembradíos, en aproximadamente 7 a 10 días después de la germinación, para transformación con diversos vectores de expresión ARNi NtMRP3. Se inoculó una colonia simple de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 en un medio LB líquido que contiene 50 mg I'1 de canamicina (mono sulfato de canamicina) y se incubó durante 48 horas a una temperatura de 28°C con agitación recíproca (150 ciclos min"1). Se recolectaron células cultivadas mediante centrifugación (6000xg, 10 minutos), y se suspendieron a una densidad final de 0.4 a 0.7 ODeoo, con 20 mi de medio MS líquido que contiene 20 g' de sacarosa. Los días 7 a 10 de la siembra, las explantas se sumergieron en una suspensión bacteriana durante 5 minutos, y se embotellaron en papeles filtro estéril. Se colocaron cincuenta explantas en alícuotas de 40 mi de un medio de agar REG (medio basal MS suplementado con 0.1 mg I"1 de ácido 1-naftalenoacético (NAA) y 1 mg I"1 de bencilaminopurina (BAP)) en platos de petri de 100 mm X 20 mm. Las explantas se cocultivaron con Agrobacterium a una temperatura de 25°C. Después de 3 días de cocultivo, las explantas se lavaron y transfirieron a un medio RCPK (medio REG con 100 mg"1 de canamicina, 500 mg I"1 de carbenicilina y 5 mi de PPM) para seleccionar los transformantes.
Las explantas se subcultivaron cada 2 semanas. Después de 8 a 12 semanas de crecimiento bajo condiciones selectivas, las plantas sobrevivientes, que representan transformantes que han integrado las construcciones de expresión ARNi NtMRP3 en sus genomas, se transfiere en un medio de enraizamiento (medio basal MS suplementado con 100 mg I"1 de canamicina). Las plantas enraizadas se transfieren a tarros para promover el crecimiento adicional.
Ejemplo 3: Expresión de polín ucleótido NtMRP3 en plantas de tabaco.
Para determinar la expresión del polinucleótido NtMRP3, se aisló ARN celular total de varias partes de las plantas. El ARN total se aisló utilizando el Reactivo TRI® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Para eliminar las impurezas de ADN, el ARN purificado se trató con DNasa libre de RNasa (TURBO ADN-free, Ambion, Austin TX). Para sintetizar la primera hebra de cADN, aproximadamente 10 pg de ARN total se transfirió en forma inversa utilizando el Equipo High Capacity cADN Archive (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para medir el nivel de transcripciones en las muestras, se llevó a cabo un RT-PCR cuantitativo de 2 pasos de acuerdo con la química a base de sonda Taqman MGB. La mezcla RT contiene 4 µ? de mezcla dNTP, cebadores aleatorios 1X, amortiguador RT 1X, 10 g de cADN, transcriptasa inversa 50U Multiscribe (Applied Biosystems), Inhibidor de RNasa 2U Superase (Ambion), y agua libre de nucleasa. La mezcla PCR contiene una Mezcla Taqman Universal PCR 1X (Applied Biosystems, Foster City, CA), 400 nM de cebador directo, 400 nM de cebador inverso, 250 nM de sonda Taqman MGB, 2 ng de cADN y agua libre de nucleasa. Se llevó a cabo RT-PCR utilizando ABI 7500 Real-Time System (Applied Biosystems, Foster City, CA) y bajo condiciones de amplificación: 50°C durante 2 minutos; 95°C durante 10 minutos; 40 ciclos a una temperatura de 95CC durante 15 seg.; y 60°C durante 1 minuto.
Ejemplo 4: Silenciación de expresión de polinucleótido NtMRP3 en plantas de tabaco.
Se encuentra una primera secuencia parcial que codifica una transcripción NtMRP3 putativa utilizando anotaciones Tobacco Genome Initiative (TGI). Desde esta secuencia particular, se generaron cebadores para silenciar la expresión de polinucleótido NtMRP3 en tabaco utilizando un método ARNi. Se amplificó la secuencia de ARNi NtMRP3 correspondiente a partir de cADN mediante RT-PCR y posteriormente se insertó en el vector Gateway pB7GWIWG2(ll) mediante un vector de entrada, exactamente tal como lo describe el fabricante (Invitrogen). Este vector contiene un promotor para expresión constitutiva (el promotor CaMV 35S de virus de mosaico de coliflor) del transgen en todos los tejidos de la planta y el gen bar para la selección de herbicida con Basta en placas de agar (30 mg/ml). Posteriormente la construcción se insertó en el genoma del tabaco Burley KY14 mediante Agrobacterium tumefasciens utilizando un procedimiento de disco de hoja clásico. De los callos, se regeneraron líneas individuales y se seleccionaron en Basta. Posteriormente se monitorearon líneas de silenciación mediante RT-PCR y se crecieron para producción de semillas. Se recolectaron semillas T1 , se volvieron a crecer en placas de agar que contiene Basta para selección y se crecieron plantas resistentes en charolas flotantes antes del cultivo en el campo.
Se pesaron aproximadamente 500 mg de la planta y se digirieron en 10 mi de HN03 concentrado mediante un sistema de digestión 5 de sistema de reacción acelerado con microondas (CE Corporation, Mathews, NC). Se analizaron las concentraciones de metal pesado utilizando espectrofotometría de masa-plasma acoplado en forma inductiva ("ICP-MS," Agilent 7500A; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Como un control de tabaco no transgénico, se preparó una muestra que consiste en hojas de tabaco Virginia, certificadas con pulido CTA-VTL-2. Ejemplo 5: Identificación de secuencia genómica de ADN NtM RP4 La secuencia genómica de ADN NtMRP4 se identificó mediante secuenciación de un BAC que contiene parte del genoma que incluye ADN NtMRP4. La secuencia se establece en la figura 1.
Ejemplo 6: Transformación de Variedades de Tabaco con Vectores de Expresión ARNi NtMRP4. Se esterilizaron semillas de tabaco y se germinaron en un plato de petri que contiene medio basal MS suplementado con 5 ml/L de una mezcla conservadora de plantas (PPM). Los sembradíos, aproximadamente de 7 a 10 días después de la germinación, se seleccionaron para transformación con diversos vectores de expresión ARNi NtMRP4. Se inoculó una sola colonia de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 en un medio LB líquido que contiene 50 mg I"1 de canamicina (mono sulfato de canamicina), y se incubó durante 48 horas a una temperatura de 28°C con agitación recíproca (150 ciclos min"1). Se recolectaron células cultivadas mediante centrifugación (6000xg, 10 minutos), y se suspendieron a una densidad final de 0.4 a 0.7 OD60o, con 20 mi de medio MS líquido que contiene 20g"1 de sacarosa. Los días 7 a 10 del sembradío, las explantas se sumergieron en una suspensión bacteriana durante 5 minutos, y se mancharon en papeles filtros débiles. Se colocaron cincuenta explantas en alícuotas de 40 mi de medio de agar REG (medio basal MS suplementado con 0.1 mg I"1 de ácido 1-naftalenoacético (NAA) y 1 mg 1 de bencilaminopurina (BAP)) en platos de petri de 100 mm X 20 mm. Las explantas se cocultivaron con Agrobacterium a una temperatura 25°C. Después de 3 días de cocultivo, las explantas se lavaron y transfirieron a un medio RCPK (medio REG con 100 mg"' de canamicina, 500 mg I"1 de carbenicilina y 5 mi de PPM) para seleccionar los transformadores. Las explantas se cocultivaron cada 2 semanas. Después de 8 a 12 semanas de crecimiento bajo condiciones selectivas, las plantas sobrevivientes, que representan transformantes que han integrado las construcciones de expresión ARNi NtMRP4 en sus genomas, se transfieren a un medio de enraizamiento (medio MS suplementado con 100 mg G 1 de canamicina). Las plantas enraizadas se transfirieron a macetas para promover el crecimiento original.
Ejemplo 7: Expresión de polinucleótido NtMRP4 en plantas de tabaco Para determinar la expresión del polinucleótido NtMRP4, se aisló ARN celular total de diversas partes de la planta. El ARN total se aisló utilizando TRI® Reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Para eliminar las impurezas de ADN, se trató ARN purificado con DNasa libre de RNasa (TURBO ADN-free, Ambion, Austin TX). Para sintetizar la primera hebra de cADN, aproximadamente 10 pg del ARN total se transcribieron en forma inversa utilizando el Equipo High Capacity cADN Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para medir el nivel de transcripciones NtMRP4 en las muestras, se llevó a cabo una RT-PCR de 2 pasos cuantitativa de acuerdo con la química a base de sonda Taqman MGB. La mezcla RT que contiene 4 µ? de mezcla dNTP, cebadores aleatorios 1X, amortiguador RT 1X, 10 g de cADN, transcriptasa Inversa 50U Multiscribe (Applied Biosystems), Inhibidor de RNasa 2U Superase-ln (Ambion) y agua libre de nucleasa. La mezcla PCR contiene una Mezcla 1X Taqman Universal PCR Master (Applied Biosystems, Foster City, CA), 400 nM de cebador directo, 400 nM de cebador inverso, 250 nM de sonda Taqman MGB, 2 ng de cADN, y agua libre de nucleasa. Se llevó a cabo RT-PCR utilizando un Sistema ABI 7500 Real-Time (Applied Biosystems, Foster City, CA) y bajo condiciones de amplificación: 50°C durante 2 minutos; 95°C durante 10 minutos; 40 ciclos a una temperatura de 95°C durante 15 seg; y a una temperatura de 60°C durante 1 minuto.
Se expresó el polín ucleótido NtMRP4 en tejidos de tabaco tal como se determina mediante RT-PCR utilizando cADN de pétalos, estambre, pistilo, sépalos, cápsula, tallos, hojas y raíces.
Cuando las plantas de tabaco se cultivaron en una solución hidropónica, la expresión del polin ucleótido NtMRP4 se regula ligeramente mediante cadmio en plántulas tanto en raíz como hojas de plántulas de N. tabacum (TN90, ver figura 2). Sin embargo, aunque el polin ucleótido NtMRP4 se encuentra como también inducido en la hoja de N. rustios, se observan datos opuestos en las raíces de N. rustica (desactivación) en comparación con N. tabacum, lo que sugiere que el polinucleótido Nt RP4 puede desempeñar un papel en la acumulación de cadmio en raíces y una alta tolerancia a cadmio de N. rustica.
Ejemplo 8: Silenciación de expresión de polinucleótido NtMRP4 en plantas de tabaco Se encuentra una primera secuencia parcial (CHO_SL022xb24f 1.ab1 ) que codifica para una transcripción NtMRP4 putativa (no mostrada) utilizando las anotaciones Iniciales de Genoma de Tabaco (TGI). A partir de esta secuencia en particular, se generaron cebadores para silenciar la expresión de polinucleótido NtMRP4 en tabaco utilizando un método (figura 1). La secuencia ARNi MRP4 correspondiente se amplifica de cADN mediante RT-PCR y posteriormente se inserta en un vector Gateway pB7G Wl WG2(II) mediante un vector de entrada, exactamente tal como lo describe el fabricante (I nvitrogen) . Este vector contiene un promotor para la expresión constitutiva (el promotor Ca V 35S de virus de mosaico de coliflor) del transgen en todos los tejidos de la planta, y el gen bar para la selección de herbicidas con Basta en placas de agar (30 mg/ml). Posteriormente la construcción se inserta en el genoma del tabaco Burley KY14 mediante Agrobacterium tumefasciens utilizando un procedimiento de disco de hoja clásico. De los callos, se regeneraron líneas individuales y se seleccionaron en Basta. Posteriormente se monitorearon líneas de silenciación ARNi mediante RT-PCR y se crecieron para producción de semillas. La figura 3 muestra que la silenciación NtMRP4 es efectiva en líneas transgénicas, incluyendo las líneas 1 y 2. Se colectaron semillas T1, se volvieron a crecer en placas de agar que contiene Basta para selección y las plantas resistentes se crecieron en charolas flotantes antes de la cultivación en el campo.
Se pesaron aproximadamente 500 mg de la planta y se digirieron en 10 mi de HN03 concentrada mediante el sistema de digestión 5 del sistema de reacción, acelerado con microondas (CEM corporation, Mathews, NC). Se analizaron concentraciones de metal pesado utilizando espectrofotometría de masa-plasma acoplada en forma inductiva ("ICP-MS," Agilent 7500A; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Se preparó bajo condiciones comparables en la forma de un control de tabaco no transgénico, una muestra que consiste en hojas de tabaco Virginia, certificadas con pulido, CTA-VTL-2.
La figura 4 muestra una reducción de cadmio de hoja cercana al 20% en dos líneas de ARNi NtMRP4 probadas (líneas 1 y 2) seguido de dos experimentos de campo sucesivos en dos años consecutivos. En cada caso, las unidades experimentales consisten en cuatro réplicas independientes de 4 plantas recolectadas (peso, línea 1 y línea 2) y plantas de control de vector en el segundo año del experimento Field) que se aleatorizaron con bloques. Además, se agregaron muestras de control a los bloques con el objeto de controlar tendencias espaciales. Los análisis de las líneas ARNi Nt RP4 demuestran un efecto fuerte y estadísticamente significativo para reducir el nivel promedio de cadmio.
Ejemplo 9: Análisis de altura y peso en plantas derivadas de plantas de tabaco, en donde se silenció la expresión del polinucleótido NtMRP4.
La altura y el peso de las líneas Nt RP4 silenciadas se ve ligeramente afectada en comparación con plantas de control. Sin embargo, no se encuentran diferencias significativas en hojas recolectadas secas entre plantas ARNi NtMRP4 y las plantas de control de vector o tipo silvestre, lo que indica que la degradación de las construcciones NtMRP4 no tiene un efecto estadísticamente relevante en la biomasa seca. Se confirman estados de datos a través de otro experimento de campo que muestra que la sobreexpresión de AtMRP4 (homóloga al nucleótido NtMRP4) en el mismo antecedente de tabaco (KY14), conduce a 10 al 30% más acumulación de cadmio en las hojas (dependiendo de las líneas transgénicas). Se puede apreciar que la degradación de la codificación de mARN para la proteína NtMRP4, reduce en forma significativa el nivel de cadmio en la hoja de tabaco.
Ejemplo 10: Identificación de mutantes inducidos por EMS en NtMRP4 Se elaboró una biblioteca de ADN de plantas Nicotiana tabacum que han sido expuestas a metanosulfonato de etilo (EMS) y se clasifican para mutantes en el exón 1 y exón 2 del polinucleótido NtMRP4, secuenciando la parte relevante del gen NtMRP4 de las plantas individuales.
Para exón 1 NtMRP4Exon1FW (5'-CATCTCCTTACGAAGGATACTACC-3') y NtMRP4Exon1 REV (5'-GCTGCAAGCTCTCCTTTTCTAA-3') se utilizan para secuenciación, y para el exón 2, NtMRP4Exon2FW (5'-GTG CAATCTGG CAAATATAGTGAG- 3') y NtMRP4Exon2REV (5'-AAAATG ACATAGG AGCATGC AGTA-3') se utilizan para secuenciación.
En la tabla 1 se presenta una revisión general de todos los mutantes encontrados en el exón y exón 2 del polinucleótido NtMRP4. Se indica el codón original (codón ori) y el codón mutado (codón mut) así como el aminoácido original (AS ori) y la sustitución de aminoácido (AS mut) o codón de detención. Ejemplo 11: Protocolo de búsqueda para la selección de sitios objetivo de nucleasa de dedo de zinc.
Este ejemplo ilustra como buscar el gen NtMRP4 para clasificar el surgimiento de sitios objetivo únicos dentro de la secuencia de gen determinada en comparación con una base de datos de genoma determinada para desarrollar herramientas para modificar la expresión del gen. Los sitios objetivo identificados por los métodos de la presente descripción, incluyendo los que se describen más adelante, los motivos de secuencia y el uso de cualquiera de los sitios o motivos para modificar la secuencia de gen correspondiente en una planta, tal como tabaco, están comprendidos en la presente descripción.
Algoritmo de búsqueda Se desarrolló un programa de computadora que permite clasificar una secuencia de nucleótido de consulta de entrada (objetivo) para el surgimiento de dos motivos de ADN de subcadena de longitud total separados por un tamaño espaciador determinado utilizando una distribución de subíndice con una base de datos de ADN, tal como por ejemplo el ensamble de secuencia de genoma de tabaco del Ejemplo 1. La construcción de la distribución de subíndice y la búsqueda utilizan la biblioteca libdivsufsort de fuente abierta-2.00 (http://code.google.eom/p/ libdivsufsort/), la cual convierte cualquier cadena de entrada directamente en una cadena transformada Burrows-Wheeler. El programa escanea la secuencia de nucleótido de entrada completa (objetivo) y regresa todas las combinaciones de subcadena que ocurren menos de un número de veces seleccionado en la base de datos de ADN seleccionada.
Selección de sitio objetivo para mutagénesis transmitida por nucleasa de dedo de zinc de una secuencia de consulta Un dominio de enlace de ADN de dedo de zinc reconoce una secuencia de nucleótido de tres pares base. Una nucleasa de dedo de zinc comprende una proteína de dedo de zinc que comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más dominios de enlace de ADN de dedo de zinc, y la nucleasa no específica de la enzima de restricción Tipo US. Las nucleasas de dedo de zinc se pueden utilizar para introducir un rompimiento de hebra doble en una secuencia objetivo. Para introducir un rompimiento de hebra doble, se requiere un par de nucleasas de dedo de zinc, una de las cuales enlaza a la hebra más (superior) de la secuencia objetivo, y la otra a la hebra menos (inferior) de la misma secuencia objetivo separada por 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más nucleótidos. Al utilizar plurales de 3 para cada uno de los dos motivos de ADN de subcadena de longitud fija, se puede utilizar el programa para identificar dos sitios objetivo de proteína de dedo de zinc separados por una longitud espadadora determinada.
Entradas del programa 1. La secuencia de ADN de consulta objetivo 2. La base de datos de ADN que será buscada 3. El tamaño fijo de primer motivo de ADN de subcadena 4. El tamaño fijo del espaciador 5. El tamaño fijo del segundo motivo de ADN de subcadena 6. El número de valor de umbral de surgimientos de la combinación de las entradas 3 y 5 del programa separadas por la entrada 4 del programa en la base de datos de ADN elegida de la entrada 2 del programa.
Salida del programa 1. Una lista de secuencias de nucleótido para cada secuencia con el número de veces que ocurre la secuencia en la base de datos de ADN, con un máximo del valor de umbral de la entrada 6 del programa.
Ejemplo 12: Expresión de perfilamiento de transcripciones NtMRP3 y NtMRP4 en tabaco Desarrollo y análisis de ExonArray de tabaco. Utilizando los clones BAC obtenidos como se describen en el Ejemplo 1, se identificaron 272,342 exones combinando y comparando los datos EST de tabaco y las secuencias filtradas con metilo obtenidas de la secuenciación BAC. Para cada uno de estos exones, se diseñaron cuatro oligonucleótidos 25-mer y se utilizaron para construir una ExonArray de tabaco. La ExonArray se elaboró mediante Affymetrix (Santa Clara, USA) utilizando protocolos estándar.
Expresión de NtMRP3 y NtM RP4 en tabaco. Se aisló ARN de especies Nicotiana crecidas en tierras Cd+ (contaminado con Cd) y Cd- (con deficiencia de Cd) y se analizó utilizando protocolos de hibridación estándar y herramientas analíticas. Se llevó a cabo el perfilado de expresión para identificar conjuntos genéticos relacionados con la acumulación Cd y para determinar la influencia de la tierra Cd, en la variación de las construcciones NtMRP3 y NtMRP4. Se localizan las sondas NtMRP3 y NtMRP4 utilizadas en el primero y último exones, así como la región 3'UTR. Los resultados mostrados en la tabla 2, indican que las hojas de las plantas N. tabacum crecidas en una tierra contaminada con Cd, acumulan más Cd que las plantas N. rustica crecidas en la misma tierra. Las raíces de las plantas N. tabacum acumulan menos Cd que las raíces de plantas N. rustica. En forma interesante, tanto NtMRP3 como NtMRP4 no son reguladas por Cd, pero su expresión es diferente en las dos especies Nicotiana, lo que sugiere que ambos genes llevan en forma diferente la captación, translocación y acumulación Cd en accesos de Nicotiana (los datos están en log 2 que corresponde al promedio de tres réplicas biológicas). Como controles, se muestra la expresión de tres genes de mantenimiento (UBP12, exones 1 y 2), a-tubulina y la proteína ribosomal S16.
Cualquier publicación mencionada o aquí descrita proporciona información relevante descrita antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Las manifestaciones de la presente invención no serán construidas como una admisión de que los inventores no están titulados para anteceder dichas descripciones. Todas las publicaciones mencionadas en la especificación anterior están incorporadas a la presente invención como referencia. Varias modificaciones y variaciones de la presente descripción podrán ser apreciadas por los expertos en la técnica, sin apartarse del alcance y espíritu de la misma. Aunque la presente invención ha sido descrito en relación con modalidades preferidas específicas, deberá quedar entendido que la presente invención, tal como se reivindica, no deberá limitarse en forma indebida a dichas modalidades. De hecho, varias de las modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la presente invención, las cuales son obvias para los expertos en los campos de biología celular, molecular y de plantas, o campos relacionados, están proyectadas para estar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
TABLA 1 Codón AS Codón AS Amplicón f seq r seq orí ori mut mut Exón 1 NtMRP4-1 gaagctggaatg attttaaagag gau asp aau asn Exón 1 NtMRP4-1 atgcttatt gatcgacact cga arg uga stop Exón 1 NtMRP4-1 aggttgtcatg tcagctagac ugc cys ugu cys Exdn 1 Nt RP4-1 tgctcagcta acaggctcatg aga arg aaa lys Exón 1 Nt RP4-1 acaggctcatg tgttggacag ggu giy gau asp Exón 1 Nt RP4-1 caggctcatg tgttggacag ggu gly gau asp Exón 1 NtMRP4-1 tgttggaca attgtaaattat cag gln caá gln Exón 1 NtMRP4-1 ccgtagatgct agcagctttc cag gln uag stop Exón 1 NtMRP4-1 gcagctgtcc atatgatgcta gau asp aau asn Exón 1 NtMRP4-1 gctacagcta attccatttg cau his uau tyr Exón 1 NtMRP4-1 attccatttg ctcatgccatt «99 trp uga stop Exón 1 NtMRP4-1 tgccattgcaa tttctgtggc guu val auu He Exón 1 NtMRP4-1 ctttagccatc tttatactta cuu leu uuu phe Exón 1 NWIRP4-1 ttcaactgtt taacactagc gua val aua ile Exón 1 NtMRP4-1 tggacttgca cagtgatggta gca ala acá thr Exón 1 NtM P4-1 aggcaacaaat agatgctta gag glu aag lys Exón 1 NtMRP4-1 ttataaagtt caggcatggg uuc phe uuu phe Exón 1 NtMRP4-1 ttataaagtt caggcatggga uuc phe uuu cys Exón 1 NtMRP4-1 attgaatcttt cgcgagtccga uuc phe uuu phe Exón 1 NtMRP4-1 aatctttccgc agtccgagt gag glu aag lys Exón 1 NIMRP4-1 agtacggatg ttgtccaagtt ugg trp uga stop Exón 1 N1 RP4-1 agttcttgtact aatagctggt uca ser uua leu Exón 1 NtMRP4-1 cattgtcttgt gagcactcct ugg trp uag stop Exón 1 NtMRP4-1 tlgtcttgtg agcactcctc ugg trp uga stop Exón 1 NtMRP4-1 tggagcactc tcttctagt cu pro cuu leu Exón 1 NtMRP4-1 tcttctagttg tacgctcactt gcu ala guu val Exón 1 NtMRP4-1 atcccgcttg cgcaggaaca gcg ala acg thr Exón 1 Nt RP4-1 atcccgcttg cgcaggaaca gug val aug met Exón 1 NtMRP4-1 gaaccgatca ggctttccct agg arg aag lys Exón 1 NtMRP4-1 aaccgatcag gctttccctc agg arg aga arg Exón 1 Nt RP4-1 catgatctca tttcacaagca cuu leu uuu cys Exón 1 Nt RP4-1 atctcttgata atlggacaaat aga arg aaa lys Exón 2 Nt RP4-2 tattagaagct gaatggatttt gga gly aga arg Exón 2 NIMRP4-2 ttcaccgcga atctctcttc acá thr aua ile Exón 2 Nt RP4-2 aaacaaccaaa agagcaatgc gag gly aag lys Exón 2 NtMRP4-2 ccttgaagaat aaaatcttctc uca ser uua leu Exón 2 NtMRP4-2 agaatcaaaat ttctcgaagat ucu ser uuu phe Exón 2 NtMRP4-2 tatctaaggaa aaaacggaga gaa glu aaa lys Exón 2 NtMRP4-2 tcaacagtcta atctga acá thr aua ile ???? 2 Nt RP4-2 atctgatagg gggattrtaaa ggg giy agg arg ???? 2 NtMRP4-2 acttataaag aagaagaaag gaa glu aaa lys ???? 2 . NtMRP4-2 aacttataaag aagaagaaag gaa giu aaa lys ???? 2 Nt RP4-2 aaggaagaa aaagagaaactg gaa gtu aaa lys ???? 2 NtMRP4-2 gctatatatta tgaagcttttg acu thr auu ¡le ???p 2 NÍMRP4-2 gctatatatta tgaagcttttg acu thr auu ile ???? 2 NtMRP4-2 gaagcttttg atggtgggg 99a giy gaa glu ???? 2 Nt RP4-2 ttggatggtg ggcgtagtgct ugg trp uga stop ???? 2 NtMRP4-2 ttgtggcaaa ttctctaatg agu ser aau asn ???? 2 Nt RP4-2 gttctctaat gcaagtga aug leu aua leu ???? 2 NtMRP4-2 gcaaagttct taatggcaag cua leu uua leu ???? 2 Nt RP4-2 tattggctg catatgaaac gca ala acá thr ???? 2 NtMRP4-2 caacaaatga atgcttaatt gag glu gaa gtu ???? 2 NtMRP4-2 cttcagcrgay gtgccatglcct cgu arg ugu cys ???? 2 NtMRP4-2 tgtccttcaat cttctctgtt ccu pro ucu ser ???? 2 NtMRP4-2 ggcatgggaa aacattttaa gaa glu aaa lys TABLA 2 Raiz N. rustica Rali TN90 Hoja N. rustica Hoja TN90 Cd Bajo Cd Alto Cd Ba|o Cd Alto Cd Bajo Cd Alto Cd Balo Cd Alto N1MRP3_exón1 5.9 4.9 7.5 7.7 5.6 5.8 7.5 7.9 N1MRP3_exón2 1.8 1.7 7.0 7.1 2.2 2.0 5.5 6.5 NtMRP3~ex4n2 6.1 5.6 9.6 9.6 4.1 4.5 9.0 9.6 N1MRP3 exones 8 y 10 5.3 5.4 7.5 7.4 5.3 5.1 8.5 7.1 N1MRP4 exon 1 6.4 6.4 5.1 4 5 7.6 8.2 7.6 7.3 N1MRP4 3'UTR 6.2 6.4 3.9 38 79 7.9 5.9 6.5 M1MRP4 exon 1 7.5 7.7 5.9 5.4 9.3 9.1 9.1 9.4 NtMRP4 exón 11 (último exon) 6.2 6.1 5.0 4.8 7.6 7.8 7.2 7.2 exdn 1 de proteaaa especifica de ublquitlna 12 (UBP12) 6.7 6.6 6.3 57 6.2 5.4 5.8 6.1 exon 2 de prcteasa específica de ublquitlna 12 (UBP12) 6.5 6.9 6.0 60 6.3 6.6 5.9 5.7 Beta-tubullna 5.8 5.6 5.7 6.0 5.4 5.5 5.8 5.6 ProtoEna rlbosomal S16 9.9 10.1 9.9 10.5 11.7 11.7 11.3 11.3 S E C U E N C I AS /e l s om b rea d o i nd i ca l a posi ci ó n d e l os e xó n es) S E Q I D N o . 1 (se cu e n ci a d e A D N d e N t M R P4 co n 5 ' y 3 ' U T R ) tcctagtactgtaagtgaaccagcaaggaaactgcaaagtagatttcttgttcatcaaat aaatccttgagctgagagatatgattttttctaaggaatttctctttggctctctgtagt ggtgagtttgattcatatttcaatctagtttttagctttgcttaaaagcttcttcttgcc actagaccaaatccttttcctttttgcatgacacttttttgagtttcatttctcttattt atagagaaaatcttttgatggggatggttttttttctcttttgcattaatgattagaatt tatcattgttaaatggtactccctcaataactttttgatttaaaaaaaaaactgtccttt cattcataatcatcatctcctttattatattactctaaactgttgctaaagttccttttt gtatattttccctacatgaacttttgctgtactgtgaaagttgatgaacttttattgtac aatgttttggtccagtagctaacagcccttttatttaattctgagaggtctctttctctt tctcttcacactttcacatgtttccgtttcctgtagatttctcctttctctttccttggt tctttttccaactcataatcttcatgtgatttcaatttttgtttgtttttattccatcct ttgtctcttttgatatgggtgacaaacatcttctcttgctgaataaaaatttcacctttt. ttcagtgtatgcagattcaggggatataaagacataaaggatgaatcttttatggtataa catggatatgaggaacagtatgtcttcagaatcttgtttagcatcactttcttgttctgc ctccacatttcaatcgtcagaggattcagcagttgttaaatggttaagattcattttcct ctctccatgtccacaaaggactcttctatcttccattgatgtgctgcttttgcttacttt cattgtatttgcagtacaaaagttgtactcaaagttgaggtccaatgagcactctaettc tagcattgataagcctctaattgcacacaacaggacttctgttagaaccaatctttggtt taagctgtctctgattttgtcagctattttagccttatcttctatagttttatgcatttt ggttattgtgggaaattcccagtcgccttggaaagtcatagatggactgtattggttgtt tcaggcgattacacatgttgtaatcactatactaatagttcatgagaaaagatttcacgc tatttcccatccactgtccctgcgcgtgttttggattgcaaactttgtagttatgagttt gttctttggttgtgggateacaaggcttgtgtcacttaaggaaattgatcctaatttaag aatggatgatataagttcattagtttcatttcctatttctgttgttctcttcattgttgc cattaaaggttcgaccggagttgctgtaattagtgattctgaatctcacttaagtgatga aaccaatggttatgaactcctggataaatccagtgtgagtggctttgcttcagcttctct aacatcgaaagccttttggatttggatgaaccctttactgcaaaaaggttacaagtcacc tctcaagattgatgaagttccttcactttccccactgcatagagcagagaaaatgtctca acttttcgaaagaaattggcctaaacctgaagaaatatcaaagcatcctgtccgaacaac attgctgcgttgcttttggaaggaagttatttttactgccattcttgcagtaattagggt atgtgttatgtatgtagggccaacactcatacaaagatttgttgattacacagcaggaaa gaggacatctccttatgaaggatactaccttataggaactctcctaatagccaaatttgt ggaagttctaacctctcatcagttcaactttaactcccaaaagcttggcatgcttattcg agcgacacttctcacttctttgtataagaaggggttaaggttgtcatgctcagctagaca ggctcatggtgttggacagattgtaaattatatggccgtcgatgctcagcagctgtccga tatgatgctacagctacattccatttggctcatgccattgcaagtttecgtggetttagg 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(Exón 4) gaatgtgtgaggggaattcttaaagataaaaccattttgcttgtcacacaccaagttgacttcttgcataatgttga cctgatcctt SEQ ID NO: 17 (Exón 5) gtcatgcgagatgggatgatcgtgcaatctggcaaatataatgagatattagaagctggaatggattttaaagagct agtagctgcacatgagacctctttagaacttgttgacgtggaaacaaccaaagagagcaatgcctcccttgaagaat caaaatcttctcgaagattatctaaggaagaaaacggagatgataaatctcaacagtctacatctgataggggggat tctaaacttataaaggaagaagaaagagaaactggaaaagtcagtcctcgtgtgtacaagctatatattaetgaagc ttttggatggtggggtgtagtgctagttatcttgttttcgttcttgtggcaaagttctctaatggcaagtgattatt ggctggcatatgaaacttcagcggatcgtgccatgtccttcaatccttctctgtttattgggatatacggtgttact gcagttgtttcttcgttgctgatagtgatcaggatgtattttgtgacacttatggggctcaagactgcccaaatatt tttcggacagattctttacagcatactgcatgctcctatgtcattttttgacacaacaccttccggaagaattctga gtcgg SEQ ID NO: 18 (Exon 6) gcatctaatgatcagaccaacattgatgtcttcctcccgttttttatgaatctcactttggccatgtttatcacact gctcggcatcatcatcatcacatgccaatattcttggcctaccgtactacttttgattcctctgggttggcttaata tctggtaccgg SEQ ID NO: 19 (???? 7) ggatattatcttgcaacatctcgtgaattgactcggcttgactcaattacaaaagcacctgttattcatcatttctc cgaaagcatctcaggcgctatgactatacgttgctttaggaagcaggagatgttttgtaacgagaatgtaaaccgag tgaattccaatctgcgaacggatttccacaacaatggatccaatgaatggttgggctttcgactggaattgatggga agcttacttctttgtgtttctgcaatgctcatgattgtcttacctagcagcatcatcaagccag SEQ ID NO: 20 (Exon 8) aaaatgttggtttgtcactatcatatggcttgtctcttaatagtgtcctattctggtccatctttgtgagttgcttt gtggaaaataaaatggtttctgtcgaaagattaaaacagttctcagaaataccatcagaagcagagtggagaaagat ggatttcctcccaccttcaagttggccaagccgtgggaatgttgagcttgaaaacgtgcag SEQ ID NO: 21 (Exon 9) gttagatatcgtccgaacactcctctagtgcttaaaggagttactctcagcattagagggggagagaagataggtgt tgttggccgtacagggggtggaaaatcaacattaattcaagttttctttcgtttggtggagcctgcagctggaagaa taatcattgatgacgtagatatatccagacttgggcttcatgatcttagatctcgcttcgggatcattccccaagag ccagccctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgaccccattggacaatattcagatgatgaaatttggaag SEQ ID O: 22 (Exon 10) agcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggcgtctttaaaacccgaaaaacttgattcaccag S E Q I D N O : 23 ( Se cu e n c i a A R N i ) aagagccagtcctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgaccc cattggacaatactcagatgatgaaacttggaaggtaatctaacttgccgactgaaataa tttacaaaaatctcaaaatatagtacagagttagccaaacatgtcttctgagtgctgaga tctttttggattacaaattctgtaagagcaacatactatttgttagcgagaagaaaagca tatactccagtgttttgttatctcccagaatgtctctaacatgaaatcgtgtacattgca gagcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaaacccgaaaaacttgattc accaggtaaattttcctcctctacgtcatccttgtggttctttgcggaattatgcaacca actttttatgtgtttcaaatatatatactgataactgaatactgtcattggtaaatcata gttgttgataacggagataactggagtgtcggacagaggcagcttctttgcttgggaaga gtgatgctaaaacgtagcagacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgattca cagacagatgcagtgattcagaaaatcatccgcgaggactttgcggcctgtactataatc agcattgcccacagaataccaacagtcatggactgtgatagagttcttgttatagatgca ggtgctgatttctctccttttactttgtaccttattctgaatctggtaaatgattattta tctgtatgtgatggtttccaaccaatcatagtcagtacctttatgaagaaattgcctaat gttagccaagtagtagtaaatgcatgaagtcattagcctatttgttttggattttgtgag tttcatacttcaaactggaagcttatgctatactatctgatcccttgtttgtatagattg 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RVIKFQAWEEHFNKRIESPRESEYGWLSKFLYSIAGNIIVLWSTPLLVATLTFGSAIL LGIPLGAGTVFTATSLFKMLQEPIRAFPQSMISLSQAMISLDRLDKYMMSKELVDKAVER LEGCGGTIAMQVKDGAFCWDDE SKEELKIW FEIRKGELAAVVGTVGAGKSSLLASVLG EMHKLSGQVTICGSTAYVAQTSWIQNGTIQENILFG P RDRYKEVIRVCCLEKDLEIM EFGDQTEIGEROINLSGGQKQRIQLARAVYQDCDIYLLDDVFSAVDAHTGSEIFKECVRG ILKDKTILLVTHQVDFLHNVDLILVMRDGMIVQSGKYNEILEAGMDFKELVAAHETSLEL VDVETTKESNASLEESKSSRRLSKEENGDDKSQQSTSDRGDSKLIKEEERETGKVSPRVY KLYITEAFGWWGWLVILFSFLWQSSLMASDYWLAYETSADRAMSFNPSLFIGIYGVIAV VSSLLIVIRMYFVTLMGLKTAQIFFGQILYSILHAPMSFFDTTPSGRILSRASNDQTNID VFLPFFMNLTLAMFITLLGIIIITCQYSWPTVLLLIPLGWIJNIWYRGYYILATSRELTRLD SIT APVIHHFSESISGVMTIRCFRKQE FC1TONV1TOV S LRMDFH NGSNEWLGFRLE LMGSLLLCVSAMFMIVLPSSIIKPENVGLSLSYGLSLNSVLFWSIFVSCFVENKMVSVER LKQFSEIPSEAEWR MDFLPPSSWPSRGNVELE VQVRYRP TPLVLKGVTLSIRGGEKI GWGRTGGGKSTLIQVFFRLVEPAAGRIIIDDVDISRLGLHDLRSRFGIIPQEPVLFEGT VRSNIDPIGQYSDDEIWKEPRTLPTQRCGVFKTRK -FTSC- -RR-LECRTEAASLLGKS DAKT-QTSIYG-GNCLC-FTDRCSDSENHPRGLCGLYYNQHCPQNTNSHGL- -SSCYRCR C-FLSFYFVPYFESGK-LFICM-WFPT HSQYLYEEIA-C-PSSSKCM SEQ ID NO: 25 (secuencia de proteína de NtM RP4; estructura 2 5' y 3'; - codón de detención putativo) WI-GTVCLQ LV-HHFLVLPPHF RQRIQQLLNG-DSFSSLHVHKGLFYLPLMCCFCLLS LYLQYKSCTQS-GPMSTLLLALISL-LHTTGLLRLGKS -MDCIGCFRRLHML-SLY- -FM RK FTLFPIHCPCACFGLQTL-L-VCSLWGSQGLCHLRKLILI -EWMI -VH-FHFLFLL FSSLLPLKVRPELL-LVILNLT-V KPMVM SWINPV-VALLQLL-YRKPFGFG-TLYCK VTSHLSRLMKFLHFPHCIEQRKCL FSKEIGLNLKKYQSILSEQHCCVAFGRKLFLLPF LQ-LGYVLCM-GQHSY DLLITQQERGHLLMKDTTL-ELS - - PNLWKF-PLISSTLTPKS LACLFERHFSLLCIRRG-GCHAQLDRLMVLDRL-IIWPSMLSSCPI-CYSYIPFGSCHCK FLWL-ASFILTSVLQLL-R-LDLQQ- YLWCLELKETTGFNLTS -RIVILE-KRQMRCLI ICAL-SSRHGK ILTKELNPSANPSMDGCPSSCTQSLGISLSCGALLF-WLHSLLEVQSC WESRLVQGQCSLQHLSSRCCRNRSGLSLNP-SHFHKQ-YLLIDWTNI - - RS -WIKLWKD - KWGVQLLCR-KMELFAGMMKTVKKN-KM-TLRLEKESLQQ-WGQLGRGSLPSLHLYLV RCTSCRVRSQFWQLPMLHKHRGFRMARYKKISCLVCQ-TETDTRK- SGFAAWRRTWK-W SLETRLK-E VASTSVWRSSESSLQELFTRTVIFIF-MMYS QLMLTLALKSSRNV-GE FLKIKPFCLSHTKLTSCIMLT- SLSCEMG- SCNLA IMRY-KLEWILKS- -LHMRPL-NL LTMKQP RAMPPLKNQNLLEDYLRKKTEMINLNSLHLIGGILNL-RKKKEKLEKSVLVCT SYILLKLLDGGV-C-LSCFRSCGKVL-WQVIIGWHMKLQRI PCPSILLCLLGYTVLLQL FLRC SGCIL-HLWGSRLPKYFSDRFFTAYCMLLCHFLTQHLPEEF-VGHLMIRPTLM SSSRFL-ISLWPCLSHCSASSSSHANILGLPYYF-FLWVGLISGTGDIILQHLVN-LGLT QLQKHLLF11SLKASQVL-LYVALGSRRCFVTRM-TE-IPICEWISTTMDPMNGWAFDWN - EAYFFVFLQCS-LSYLAASSSQKMLVCHYHMACLLIVSYSGPSL-VALWKIKWFLSKD -NSSQKYHQKQSGERWIFSHLQVGQAVGMLSLKTCRLDIVRTLL-CLKELLSALEGER - VLLWQGVENQH-FKFSFVWWSLQLEE-SLMT- 1YPDLGFMILDLASGSFPKSQSFLKEL -EATLTPLDNIQMMKFGRSLERCQLKDWSLKPEKLDSPWDNGDNWSVGQRQLLCLGRV MLKRSRLLFMDEATASVDSQTDAVIQKIIREDFAACTIISIAHRIPTVMDCDRVLVIDAG ADFSPFTLYLILNLVNDYLSVCDGFQPIIVSTFMKKLPNVSQVWNA- SEQ ID NO: 26 (secuencia de proteína de NtM RP4 ; estructura 3 5' y 3'; - codón de detención putativo) GYEEQYVFRILFSITFLFCLHISIVRGFSSC-MVKIHFPLSMSTKDSSIFH-CAAFAYFH CICSTKWLKVEVQ-ALYF-H- -ASNCTQQDFFALESHRWTVLWSGDYTCC HYTNSS- EKISRYFPSTVPARVLDCKLCSYEFVXiWL DHKACVT-GN-S-FK G-YKFISFISYFCC SLHCCH-RFDRSCCN- -F-ISLK- -NQWL-TPG-IQCEWLCFSFSNIESLLDLDEPFTAK RLQVTSQD- -SSFTFPTA-SRENVSTFRKKLA-T-R IKASCPNNIAALLLEGSYFYCHS CSN-GMCYVCRA THTKIC-LHSRKEDISL-RILPYRNSPNSQICGSSNLSSVQL-LPKA WHAYSSDTSHFFV-EGVKWMLS-TGSWCWTDCKLYGRRCSAAVRYDATATFHLAHAIAS FCGFRHPLYLPRCFNCC ASWTCSSDGICGVW -KKQQVSI -HHEES-F-NESDK-DA-L YARYKVPGMGRTF-QKN- 1LPRIRVWMWQVLVX.NRWEYHCLVEHSSSSGYTHFWKCNLV GNPAWCRDSVHCNISLQDVAGTDQGFPSIHDLTFTSNDIS- - IGQIYDE-GVSG-SCGKT RRLWGYNCYAGERWSFLLG- -KQ-RRIEKCKL-D-KRRACSSSGDSWGGEVFPPCICTW- DAQWGSGHNLWFNCLCCTNIVDSEWHDTRKYPVWYANEQRQIQGSDPGLLLGEGLGNNG VWRPD-NRRTWHQPQWWSEAANPACKSCLPGL-YLSSR-CIQCS-CSHWL-NLQGMCEGN S- - HFACHTPS-LIA-C-PDPCHARWDDRAIWQI - -DIRSWNGF-RASSCT-DLFRTC -RGNNQREQCLP-RIKIFSKII-GRKRR- -ISTVYI- -GGF-TYKGRRKRNWKSQSSCVQ AIYY-SFWMVGCSASYLVFVLVAKFSNGK-LIAGI-NFSGSCHVLQSFSVY DIRCYCSC FFVADSDQDVFCDTYGAQDCPNIFRTDSLQHTACSYVIF-HNTFRKNSESGI- -SDQH-C LPPVFYESHFGHVYHTARHHHHHMPIFLiAYRTTFDSSGIiA-YLVPGILSCNIS-IDSA-L NYKSTCYSSFL-KHLRCYDYTLL-EAGDVL-RECKPSEFQSANGFPQQWIQ-MVGLSTGI DGKLTSLCFCNVHDCLT-QHHQARKCWFVTIIWLVS- -CPILVHLCELLCGK-NGFCRKI KTVLRNTIRSRVEKDGFSPTFKLAKPWEC-A-KRAG-ISSEHSSSA-RSYSQH-RGREDR CCWSYRGWKININSSFLSFGGACSWKNNH- -RRYIQTWAS-S-ISLRDHSPRASPF- NC EKQH-PHWTIFR- -NLEGASNAANSKMWCL-NPKNLIHQLLITEITGVSDRGSFFAWEE- C-NVADFYLWMRQLPLLIHRQ Q-FRKSSARTLR VL-SALPTEYQQSWTVIEFLL-MQ LISLLLLCTLF-IW-MIIYLYVMVSNQS-SVPL-RNCLMLAK MH S E Q I D N O : 27 (S ecu e n ci a d e cA D N d e N t M R P 4 ta l com o se de riva de sec ue n ci a ció n d i recta d e cA D N) atggatatgaggaacagtatgtcttcagaatcttgtttagcatcactttcttgttctgcctccacatttcaatcgtc agaggattcagcagttgttaaatggttaagattcattttcctctctccatgtccacaaaggactcttctatcttcca ttgatgtgctgcttttgcttactttcattgtatttgcagtacaaaagttgtactcaaagttgaggtccaatgagcac tetacttctagcattgataagcctctaattgcacacaacaggacttctgttagaaccaatctttggtttaagctgtc tctgattttgtcagctattttagccttatcttctatagttttatgcattttggttattgtgggaaattcccagtcgc cttggaaagtcatagatggactgtattggttgtttcaggcgattacacatgttgtaatcactatactaatagttcat 5 gagaaaagatttcacgctatttcccatccactgtccctgcgcgtgttttggattgcaaactttgtagctatgagttt gttctttggttgtgggatcacaaggcttgtgtcacttaaggaaattgatcctaattcaagaatggatgatataagtt cattagtttcatttcctatttctgttgttctcttcattgttgccattaaaggttcgaccggagttgctgtaattagt gattctgaatctcacttaagtgatgaaaccaatggttatgaactcctggataaatccagtgtgagtggctttgcttc agcttctctaatatcgaaagccttttggatttggatgaaccctttactgcaaaaaggttacaagtcacctctcaaga ttgatgaagttccttcactttccccactgcatagagcagagaaaatgtctcaacttttcgaaagaaattggcctaaa cctgaagaaatatcaaagcatcctgtccgaacaacattgccgcgttgcttttggaaggaagttatttttactgcca tcctcgcagtaatcagggtatgtgttatgtatgtagggccaacactcatacaaagatttgttgattacacagcagga aagaggacatctccttatgaaggatactacc tataggaactctcctaatagccaaatttgtggaagttctaacctc tcatcagctcaaccttaactcccaaaagcttggcatgcttattcgagcgacacttctcacttctttgtataagaagg ggttaaggttgtcatgctcagctagacaggctcatggtgttggacagattgtaaattatatggccgtcgatgctcag cagctgcccgatatgatgctacagctacattccatttggctcatgccattgcaagtttctgtggctttaggcatcct ttataettacctcggtgcttcaaetgttgtaacgctagctggacttgcagcagtgatggtatttgtggtgtttggaa -|Q ctaaaagaaacaacaggtttcaatttaacatcatgaagaatcgtgattctagaatgaaagcgacaaatgagatgctt aattatatgcgcgttataaagttccaggcatgggaagaacattttaacaaaagaattgaatccttccgcgaatecga gtatggatggttgtccaagttcttgtactcaatcgctgggaatatcattgtcttgtggagcactcctcttctagtgg ctacactcacttttggaagtgcaatcttgttgggaatcccgcttggtgcagggacagtgttcactgcaacatctctc ttcaagatgttgcaggaaccgatcagggctttccctcaatccatgatctcactttcacaagcaatgatatctcttga tagattggacaaatatatgatgagtaaggagttagtggataaagctgtggaaagactagaaggttgtgggggtacaa ttgctatgcaggtgaaagatggagcttCttgctgggatgatgaaaacagtaaagaagaatcgaaaaatgtaaacttt gagattagaaaaggagagcttgcagcagtagtggggacagttggggcggggaagtettccctccttgeatetgtact tggtgagatgcacaagttgtcgggtcaggtcacaatttgtggttcaactgcctatgttgcacaaacatcgtggattc agaatggcacgatacaagaaaatatcctgtttggtatgccaatgaacagagacagatacaaggaagtgacccggrgtt tgctgcttggagaaggacttggaaataatggagtttggagaccagactgaaataggagaacgtggcatcaacctcag tggtggtcagaagcagcgaatccagcttgcaagagctgtttaccaggactgtgatatttaccttctagatgatgcac tcagtgcagttgatgctcacaceggctctgaaatcttcaaggaatgtgtgaggggaattcttaaagataaaaccatt -|g CtgcCtgtcacacaccaagttgacttcttgcataatgttgaccCgatccttgtcacgcgagatgggatgatcgtgca atctggcaaatataatgagatattagaagctggaatggattttaaagagctagtagctgcacatgagacctctttag aacttgttgacgtggaaacaaccaaagagagcaatgcctcccttgaagaatcaaaatcttctcgaagattatctaag gaagaaaacggagatgataaatctcaacagtctacatctgataggggggattctaaacttataaaggaagaagaaag agaaactggaaaagtcagtcctcgtgtgtacaagctatatattactgaagcttttggatggtggggtgtagtgctag ttatcttgttttcgttcttgtggcaaagttctctaatggcaagtgattattggctggcatatgaaacttcagcggat cgtgccatgtccttcaatccttctctgtttattgggacatacggtgttaccgcagccgtttcttcgttgctgatagt gatcaggatgtattttgtgacacttatggggctcaagactgcccaaatatttt cggacagattctttacagcatac tgcatgctcctatgtcattttttgacacaacaccttccggaagaattctgagtcgggcatctaatgatcagaccaac attgatgtcttcctcccgttttttatgaatctcactttggccatgtttatcacactgctcggcatcatcatcatcac atgccaatattcttggcctaccgtactacttttgattcctctgggttggcttaatatctggtaccggggatattatc ttgcaacatctcgtgaattgactcggctcgactcaattacaaaagcacctgttattcatcatttctctgaaagcatc tcaggtgttatgactatacgttgctttaggaagcaggagatgttttgtaacgagaatgtaaaccgagtgaattccaa 2Q tctgcgaatggatttccacaacaatggatccaatgaatggttgggctttcgactggaattgatgggaagcttecttc tttgtgtttctgcaatgttcatgattgtcttacctagcagcatcatcaagccagaaaatgttggtttgtcactatca tatggcttgtctcttaatagtgtcctattctggtccatctttgtgagttgctttgtggaaaataaaatggtt ctgt cgaaagattaaaacagttctcagaaataccatcagaagcagagtggagaaagatggactttctcccacccccaagtt ggccaagccgtgggaatgttgagcttgaaaacgtgcaggttagatatcgtccgaacactcctctagtgcttaaagga gttactctcagcattagagggggagagaagataggtgttgttggtcgtacagggggtggaaaatcaacattaattca agttttctttcgtttggtggagcctgcagctggaagaataatcattgatgacgtagatatatccagacttgggcttc atgatcttagatctcgcttcgggatcattccccaagagccagtcctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgac cccattggacaatattcagatgatgaaatttggaagagcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaa acccgaaaaacttgattcaccagttgttgataacggagataaetggagtgtcggacagaggcagcttctttgcttgg gaagagtgatgctaaaacgtagcagacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgactcacagacagatgca gtgattcagaaaatcatccgcgaggaccttgcggcctgtactataatcagcattgcccacagaataccaacagtcat oc ggactgtgatagagttcttgttatagacgcaggaatagcaaaagagtttgacaaaccatctcgtttgcttgaaaggc cttcactttttggggctttggttcaagaatatgccaaccgatcctctgagctctaa SEQ ID No. 28 (Secuencia de ADN de NtM RP3 con 5' y 3' UTR) ccgtcaacccagtcttggccaccacataaacacagctttgacttgtctctcccttttccctactttcaccacccttt tcaatttcccaccttatattcattattatatttaatcaatcaaatcaaagttggaaaaaaagggagtaataatcaaa jtaagtgaatg gatgaaaattaggggactctagactagtaccttagtcgatagtgttttgagtttccatctgtggacaccatagcttg aacaagaaccagcgaaatgcaggtcatgcctgtggcttgagggaaactgcaacaatcctatggcagggaaagaaacc tacatctagtgatgcaatattgattgtgaagtggeatttgtttttgtttagactttttgatgagaaaatgtatacgt aactttgtgtttacaataatttgaatgtatgttgagtcaagtgattagttagttaagagtgcacggattttgctact tctgggtaaaagaagtaaaccttgttgttgagagttgaaag gaaattactagtgtcgaattttgccgcataagcta aatgaaacacttttacgataaactcctagtgcaacaaaggaaaaattcattggcaagactagctgt tatgtttcac gac S EQ I D N o . 29 ( Secu en cia de A D N de NtM R P3 si n 5' y 3' UTR) Sgtatgttggcgttgatgaatccctccgaaaccccat tttcttacgtgtcattagttgttctttgcacctgggattgttccttgtaattcttgggttgtgttgttggaatacaa tcaa aagttctctatcttcatgttttctttccttgaagtttgttgtgttgaataactcttaagagcacattttctccgttt SEQ ID No. 30 (Intrón 1 de NtM P3) gtatgttggcgttgatgaatccctccgaaaccccattttcctacgtgtcattagttgttctttgcacctgggattgttcctt gtaattcttgggttgtgttgttggaataeaatcag SEQ ID No. 31 (Intrdn 2 de NtM P3) gtaagtcctttcatatatatgctttattttcatgcttgatatattttacctagccacttgactgacccatcctttaa ttgcag SEQ ID No. 32 (Intrón 3 de NtMRP3) gtactctttcctttcagtaattatggtttgcttaatatcatatatagacttaactcatttaactatgatatttctct tcag SEQ ID No. 33 (Intrón 4 deNtMRP3) gtaagtgaatgattacattttctttatttagccccttttttttccttattagtgtcaatctttctgttacatgacta atcaatgttctgtgaaaattagctagtaatttcagaattaactcaaatgtactttggtatgaaaacag SEQ ID No. 34 (Intrón 5 deNtMRP3) gttgctacgaccacetttttcgtgttctttgccttcacaattattctactatatgett tteacaaagtgagtcata actttagcgacattcataaacgtgagttacatttaagtggtgagtttgttttcattgcag SEQ ID No. 35 (Intrón 6 de Nt RP3) gtaagttctctatcttcatgttttctttccttgaagtttgttgtgttgaataactcttaagagcacatt ctccgt ttcttgatttacag SEQ I No. 36 (Intrón 7de Nt RP3) gtaaattaagttattctctggtgttaattatgcaggttaatttgttggtatgggttggtatatctgaaaacttttaa tag SEQ ID No. 37 (Intrón 8 deNtMRP3) gtgacagcteggttttgcctatttttggatttattttgtttcagataggaaaatgacaaattttattttattgagaa actttgtttgatgttatgcttcag SEQ ID No. 38 (Intrón 9 de NtMRP3) gtaacttcaagaaccacatcattttctgatgatttccacttttagagctgtaataatcatcttcattgcgttgctgc ag SEQ ID No. 39 (Intrón 10 deNtMRP3) gtaagaatcatcgtttatgttctggagcaagcggagaaggaaattcttggtagttaccttttttttatgctatgctg cag SEQ ID No. 40 (Exon 1 de NtMRP3) SEQ ID No. 41 (Exón 2de tMRP3) SEQ ID No. 47 (Exón 8 de NtMRP3) 15 20 25 S E Q I D N o . 51 (S ec u e n ci a d e cA D N d e N t M R P 3 ta l co m o se a n t i ci pa d e la s ecu e n cia d e l cl o n BAC ) atggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgaggagggacaataatgctggc cacaaacagagtagtaceaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaccttgttttgt tcaataggtctagccatctttagctttgtgttatgtttgttagctcatttttattggtat agaaatggttggtcagaagaaaaaattataacccttttggattttgcattaaagttgcta gcttggttgtcaatctctgttttcttgcacacccagttccttaa tcttgtgaaaccaaa taccctcttgttttaagagtttggtgggggcttttcttctttgtttcttgttattgcctt gttacagaccttgtttatggggaaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacct gatgttgttttcactcttatggggttattcttctgttttgttgggtttattgttaaaaca gagagtgaggagaatatgcttcaggaacccctcttaaatggtagtgttgccaatggcatg gactcaaagaagtctactggggatcaaactgtcaccccttatgccaatgctaacat tt agtctctttactttctcttggatgggtcccctaatttctgttggcaacaagaaaccatta gaccttgaggatgttcctcagcttcactttgatgatagtgtcaaagggagttttcctatt tttagagaaaaactagaatctgtgggtgggggaaatagtaaccgtgtgactaccttcatg ctggtgaaggctttggttttcacagcacggaaggagatagtgttatcggctctcttcgtg cttctttacgctctggcgtcttttgttggeccgtacctcattgatacettagttcagtat ctgaatggaaaacgagactttgataatgaaggttatgtcttagtggctgcattcttcgtt gcaaagttggtggagtgtttggcgcaaaggcattggtttttcaaggtgcagcagggaggg tatcgggcacgggcagcactggtttccaaaatctacaacaagggtttaaccctctcctgt cagtcaaagcaaagccacactagtggagagatcatcaattttatgacagttgatgccgag aggattggtgacttcggttggtatatgcatgatccttggatggtaatcatacaagttgct ctggcattggtgatactctataaaaatcttggcctagctgctatcgccgcgtttgttgct acaataatagtgatgttggcaaacatccctttagggagtttgcaggagaagtttcaggag aaactcatggaatcgaaagatagaaggatgaaggctacatctgaagtettaaggaatatg agaatactcaagcttcaagcttgggagatgaagtttctgtctaggatcttggacctcagg actacagaggcaggatggttgatgaaatatgtgtacacatcagctatgactacttttgtc ttctgggttgctcctacatttgtttctgtgacgacctttggcgctgcaatgcttatggga atcccacttgaatctgggaagatattgtctgcacttgcgacatttagaattcttcaagag eccatctacaatetcccagatacaatttcaatgattgctcaaaccaaagtttctcttgat cgtattgcatcttccctttctcttgatgacttgcagcctgatgtcatagagaagcttcca aaaggtagttctgatgaagcaattgagattgtaggtgggaacttcgcttgggatgcatcc acctcgactccacttctaaaggatgtaaatcttagagtgcttaatggcatgagagttgcc atttgtggtacagttggttcaggaaaatcaagcttactgtctagcattttaggagagatg cccaaattatcagggactattaaacttagtggaacgaaggcttatgttgcacagtcgccc tggatacagagtggaaagatagaggagaacatattatttggtaaagagatgcagagggag aagtatgataaagttcttgaagcgtgctccttaaagaaagacctggaaattctctctttt ggcgatcaaacagaaataggggagaggggcattaatttgagcggtggacagaagcagaga atacagattgctcgtgctctttaccaagatgctgatgtttacctatttgatgatccgttc agtgctgtggatgctcataccggatcccatctcttcagtgaatgtataatggggctattg aattcaaaaacagttttatatgttacacatcaagtggagtttttgcctgctgcggatttg atcttggtcatgaaagatggaaggatcagtgaaactgggaaatacaatgatcttctcaaa ttaggtagtgacttcatggaacttgtgggtgctcaccaagaagctttaacagcaattgac acagttaagggagaagcattgagaaagagtgaggaaatgactggtgataatacaaatgta cagaaggataaaaatatttcagatggccaaaatggtaaagtggatgatattgttggaaca aagggacaaattgttcaggaggaggaaagagagaaaggtagtgttggtttttcagtttac tggaaatatataacaactgcatatggaggtgctcttgtgccatttatgctgttggcacaa gttggtttteagctccttcaaattggaagcaattattggatggcgtgggcaactcccgtc tcaaagagtgagccacctcctgttgggagttctactctcatcattgtctatgttgcttta ggaattgcaagtgctttatgcatccttgctagaaccatgtttcttgttaccgctggatat aagacagcctctttgcttttccataaaatgcatctttgcattttccgtgctccaatgtcc ttcttcgatgccacaccgagtgggcggattctaaacagagcatcgacagatcaaagtgca attgatctgaatgttcccattcaagttggatcctttgccttcacaataatacagctttta gggattattggagtaatgtcacaagttgcatggcaggtcttcattgtctttattccggtc attgcagtttgcatctggttggagcaatattacataccatcagcacgagaactggcacgg ctaaatgggacatgcaaagctccagtaatacagcactttgccgagacaatttcaggatca agcacaattagaagtttcgatcaggaatctagattccaggacacaagtatgaaattgata gacaattattctcggcctaagtttcacatcgctgctgcaatggagtggctttgtttgcgt ttggatatgttatctctgatcacttttgctttctctttaattttcttgatctctcttcct gttggaacaattgacccaagtgttgctggcttagctgttacatatgggcttaatctgaac ataatacaagctcgggttgtttggaatctttgtatgatggaaaataaaattatttctgtt gaaagaatacttcagtatactgctcttccaagtgaatctcctcttatcatagaatccaac agaccagaccctaactggccatcttgtggagaggttgattttagcaatcttcaggtccga tatgctcctcacatgcctctcgtgttgcgaggccttacatgcactttctttggtggaaag aagactggaattgtcggtaggacaggcagcggtaaatctactctaatacagaccctette cgcatagttgaaccagctgctggacaaataaaaatagatggtatcagcatctcctcaatt ggtttgcatgatctacggtctagattgagtataattccacaggatccaactatgt tgag ggaacagttcgcagcaacctagacccgcttgaagagtattcagatgaacaaatttgggag gcgctcgataagtgtcagctaggagaagaagtgaggaagaaagaaggcaaactttattct acagtatctgagaatggagagaactggagtgtaggccaaaggcagctggtctgccttggc cgtgtgctactgaaaaagagcaaggtcctggtccttgacgaggctacagcatctgtcgac actgcaactgataatcttattcagcaaactctaaggctgcacttctctgattccacggtt ataaccattgctcataggattacatctgtgcttgacagtgatatggtcctactattagat catgggctcattgctgaatacggcactccagccaggttgttagagaacgaatcctcattg tttgctaagctcgtggcagagtatagtatgaggtcaaattcaagttttgagaatgtttca gacatgtga SEQ ID No. 52 (Secuencia de proteína de NtMRP3; 5' y 3'; -denota codón de detención putativo) MEIA GMSVFQSLRRDNNAGHKQSSTRNARFLYYKSTLFCSTGLAIFSFVLCLLAHFYWY RWGWSEE IITLLDFALKLLAWLSISVFLHTQFLHSCETKYPLVL VWWGLFFFVSCYCL VIDLVYGE NQSLPTQFCIPDVVFTL GLFFCFVGFIVKTESEEWMLQEPLL?>IGSVANGM DS STGDQTVTPYANAHIFSLFTFSWMGPLISVGNK PLDLEDVTQLHFDDSV GSFPI FREKLESVGGGNS RVTTFMLVKALVFTARKEIVLSALFVLLYALASFVGPYLIDTLVQY LWGKRDFDNEGYVLVAAFFVAKLVECLAQRHWFFKVQQGGYRARAALVSKIYNKGLTL3C QSKQSHTSGEII FMTVDAERIGDFGWYMHDPWMVIIQVALALVTLYKNLGLAAIAAFVA TIIVMLANIPLGSLQEKFOEKLMESKDRP.M ATSEVLRNMRILKLQAWEMKFLSRILDLR TTEAGWLMKYVYTSAMTT VFWVAPTFVSVTTFGAAMLMGIPLESGKILSALATFRILQE PIYHLPDTISMIAQTKVSLDRI SFLSLDDLQPDVIE LPKGSSDEAIEIVGG FAVi/DAS TSTPLLKDVNLRVL GMRVAICGTVG5G SSLLSSILGEMP LSGTIKLSGT AYVAQSP WIQSGKIEE ILFGKEMQRE YDKVLEACSLK DLEILSFGDQTEIGERGINLSGGQ QR IQIARALYQDADVYLFDDPFSAVDAHTGSHLFSECI GLLNSKTVLYVTHQVEFLPAADL ILVM DGRISETGKYNDLLKLGSDFMELVGAHQEALTAIDTVKGEALRKSEEMTGD TNV Q DK ISDGQ GKVDDIVGT GQIVQEEEREKGSVGFSVY YITTAYGGALVPFMLLAQ VGFQLLQIGSNY MAWATPVS SEPPPVGSfJTLIIVYVALGIASALCILARTMFLVTAGY TASLLFH^1HI rFPAPM5FFDATP3GRILNRASTDQSAIDLNVPIQVGSFAFTIIQ.LL GIIGVMSQVA QVFIVFT.PVTAVCIWLEQYYIPSARELARLMGTCKAPVI0HFAETISG3 3TIP.SFDQESRFQDTSKKLIDNySRPKFHIAAAMEWLCLRLDMLSLI FA.FSLI LIS.LP VGTIDPSVAGLAVTYGLNL I IQARVVW LCMMENKI ISVERILQYTALPSESPLI IES R DPNWPSCGEVDFSKLQVP.VAPH PLVLRGLTCTFFGGKKTGIVG TGSGKSTLIQTLF • RIVEPAAGQIKIDGISISSIGLHDLRSRLSIIPQDPTMFEGTVRSNLDPLEEY.SDEQIWE ALDKCQLGEEVR EGKLYSTVSENGENWSVGQRQLVCLGRVLLK SKVLVLDEATASVD TATDNLIQQTLRLHFSDSTVITIAHRITSVLDSDMVLLLDHGLIAEYGTPARLLE ES3L . FAKI.VAEYSMRSHSSFEMVSDM- SEQ ID NO: 53 (Exón 11 deNtMRP4) Ctgttgataacggagataactggagtgtcggacagaggcagcttctttgcttgggaaga gtgatgctaaaacgtagcagacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgattca cagacagatgcagtgattcagaaaatcatccgcgaggactttgcggcctgtactataatc agcattgcccacagaataccaacagtcatggac gtgatagagttcttgttatagatgca ggtgctgatttctctccttttactttgtaccttattttgaatctggtaaatgattattta tctgtatgtgatggtttccaaccaatcatagtcagtacctttatgaagaaattgcctaat gttagccaagtagtagtaaatgcatga

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una planta o una célula de planta mutante, que no tiene origen natural o transgénica que comprende: (a) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: (i) un polinucleótido que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia que tiene al menos el 71% de identidad de secuencia con SEC ID NOs: 1, 2, 27, 28 o 29 o 51; o (ii) un polinucleótido que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia que tiene al menos 65% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEC ID NOs: 3 a 23 o 30 a 50 o 53; o (iii) un polinucleótido que codifica un polipéptido NtMRP que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia que tiene al menos el 65% de identidad de secuencia con cualquiera de la SEC ID NOs. 24 a 26 o 52, y en donde el polipéptido tiene actividad de transporte de metal pesado; o (b) una construcción de polinucleótido de al menos 15 nucleótidos contiguos de longitud que es al menos el 65% idéntica a una región de cualquiera de las SEC ID NOs: 1 a 23 o 27 a 51 o 53; o (c) un ARN de hebra doble que comprende al menos dos secuencias que son al menos parcialmente complementarias entre sí, y en donde la hebra de sentido comprende una primera secuencia y una hebra antisentido que comprende una segunda secuencia, y en donde al menos una de las secuencias comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de ARN NtMRP; o (d) un vector de expresión que comprende el polinucleótido tal como se establece en (i), (ii) o (iii) o la construcción de polinucleótido tal como se establece en el (b).
2. Una planta mutante, que no tiene origen natural o transgénica, en donde se disminuye la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta forma, o la actividad de la proteína codificada de esta forma, y las hojas de la planta tienen una reducción en contenido de cadmio de al menos 5% en comparación con una planta de control en la cual la expresión de NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta forma, o la actividad de la proteína codificada de esta forma no ha sido disminuida.
3. El material de planta que incluye biomasa, semillas u hojas que comprende células o tejido de la planta tal como se describe en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2.
4. Un producto de tabaco que comprende una parte de la planta tal como se describe en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2, o un material de la planta tal como se describe en la reivindicación 3.
5. Un método para reducir los niveles de cadmio en al menos parte de una planta, en donde el método comprende el paso de reducir la expresión de un polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta forma o la actividad de la proteína codificada de esta forma, en comparación con una planta de control en la cual no se ha disminuido la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta forma o la actividad de la proteína codificada de esta forma.
6. Un planta mutante, que no tiene origen natural o trangénica obtenida o que se puede obtener a través del método tal como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque existe una reducción en el contenido de cadmio de al menos aproximadamente el 5% en al menos una parte de la planta, en comparación con una planta de control, en la cual la no se ha reducido la expresión del polinucleótido NtMRP y la actividad de la proteína codificada de esta forma o la actividad de la proteína codificada de esta forma.
7. Un polipéptido NtMRP aislado expresado mediante una polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: (i) un polinucleótido que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia que tiene al menos el 71% de identidad de secuencia con las SEQ ID Nos: 1, 2, 27, 28 o 29 o 51 ; o (¡i) un polinucleótido que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia que tiene al menos el 65% de identidad de secuencia con las SEQ ID Nos: 3 a 23 o 30 a 50 o 53; o un polinucleótido que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia establecida en cualquiera de las SEQ ID Nos. 24 a 26 o 52, en donde el polipéptido tiene actividad de transporte de metal pesado.
8. Un anticuerpo que enlaza específicamente al polipéptido aislado tal como se describe en la reivindicación 7.
9. Un método para detectar un plinucleótido NtMRP en una muestra, en donde el método comprende los pasos de: (a) proporcionar una muestra que comprende un plinucleótido; (b) contactar la muestra con uno o más ceadores o una o más sondas para detectar específicamente al menos una parte del polinucleótido NtMRP ; y (c) detectar la presencia de un producto de amplificación, en donde la presencia de un producto de amplificación es indicativa de la presencia del polinucleótido NtMRP en la muestra.
10. Un polinucleótido aislado seleccionado del grupo consiste en : un polinucleótido que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia que tiene al menos el 71% de identidad de secuencia con las SEQ ID Nos: 1, 2, 27, 28 o 29 o 51; o un polinucleótido que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia que tiene al menos el 65% de identidad de secuencia con las SEQ ID Nos: 3 a 23 o 30 a 50 o 53; o un polinucleótido que comprende, consiste o consiste esencialmente en la secuencia establecida en cualquiera de las SEQ ID Nos. 24 a 26 o 52, en donde el polipéptido tiene actividad de transporte de metal pesado.
11. Una construcción de plinucleótido de al menos 15 nucleótido contiguos de longitud, que es al menos el 65% idéntica a una región de cualquiera de las SEQ ID Nos: 1 a 23 o 27 a 51 o 53.
12. Un ARN de hebra doble que comprende al menos dos secuencias que son almenos parcialmente complementarias entre sí, y en donde una hebra de sentido, comprende una primera secuencia y hebra antisentido que comprende una segunda secuencia, en donde al menos una de las secuencias comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de ADN NtMRP.
13. El ARN de hebra doble tal como se describe en la reivindicación 12, caracterizado porque comprende una primera secuencia que tiene al menos el 65% de identidad de secuencia con al menos 10 nucleótidos de NtMRP3 o NtMRP4; una segunda secuencia; y una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, colocada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia está colocada entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia está enlazada en forma operable a la primera secuencia de la tercera secuencia.
14. El ADN de hebra doble tal como se describe en la reivindicación 12 o en la reivindicación 13, caracterizado porque la primera secuencia tiene al menos el 65% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 3 a 23 y 30 a 50 y 53 y/o, en donde la tercera secuencia tiene al menos el 65% de identidad de secuencia con el complemento inverso de la secuencia correspondiente a SEC ID NOs: 3 a 23 y 30 a 50 y 53.
15. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado tal como se describe en la reivindicación 10 o la construcción de polinucleótido tal como se describe en la reivindicación 11. RESUMEN Se describe una planta o célula de planta transgénica que no tiene origen natural, mutante que comprende (a) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de: (i) un polinucleótido que comprende, que consiste de o que consiste esencialmente de una secuencia que tiene al menos 71% de secuencia de identidad de SEC ID NOs: 1, 2, 27, 28 o 29 o 51; o (ii) un polinucleótido que comprende, que consiste de o que consiste esencialmente de una secuencia que tiene al menos 65% de identidad de secuencia de SEC ID NOs: 3 a.23 o 30 a 50; o (iii) un polinucleótido que codifica un polipéptido Nt RP que comprende, que consiste de o que consiste esencialmente de una secuencia que tiene al menos 65% de identidad de secuencia a cualquiera de SEC ID NOs: 24 a 26 o 52, y en donde el polipéptido tiene actividad de transportador de metal pesado; o (b) una construcción de polinucleótido de al menos 15 nucleótidos contiguos en longitud que es al menos 65% idéntico a una región de cualquiera de SEC ID NOs: 1 a 23 o 27 a 51; o (c) un ARN de estructura de cadena doble que comprende al menos dos secuencias que son al menos parcialmente complementarias entre sí y en donde una estructura de cadena de sentido comprende una primera secuencia y una estructura de cadena antisentido comprende una segunda secuencia y en donde al menos una de las secuencias comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de NtMRP ARN; o (d) un vector de expresión que comprende el polinucleótido como se establece en (i), (ii) o (iii) o la construcción de polinucleótido como se establece en (b).
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