CN116574719A - AsMIPS1基因克隆、表达载体构建和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及AsMIPS1基因克隆、表达载体构建和应用。本发明通过对匍匐翦股颖耐热性和热敏性植株进行分析，挖掘到抗热胁迫和抗镉胁迫的新基因—肌醇‑1‑磷酸合成酶编码基因，试验结果表明，肌醇‑1‑磷酸合成酶编码基因编码的肌醇‑1‑磷酸合成酶在热胁迫和镉胁迫下具有较高的表达，可缓解热胁迫和镉胁迫下的叶绿素损失、光化学抑制、丙二醛积累、导电率上升，并可提高植物抗氧化酶活性，具有提高植物抗逆性的功能，在抗逆性植物育种中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及AsMIPS1基因克隆、表达载体构建和应用。
背景技术
自然环境中，高温、重金属污染等胁迫会导致植物生长发育受阻。随着全球气候变暖，高温等极端天气频发，严重限制了作物的栽培种植和产量。此外，镉是环境中毒性较强的重金属元素之一，随着工业的发展，农田土壤镉污染严重，据调查，我国镉的点位超标率为7.0％。
匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera)属禾本科植物，一种冷季型草坪草。由于其耐低修剪、成坪速度快、再生能力强等优点，是世界范围内广泛应用的优质草种，尤其用于建植高质量的精细草坪，如高尔夫球场的果岭和运动场草坪等。然而，匍匐翦股颖耐热性较差、重金属土壤条件下难生长，并导致草坪质量降低，在其使用过程中，常常会因为受到高温胁迫或环境重金属污染而对其生长发育和草坪质量造成严重影响。因此，提高匍匐翦股颖的耐热性及重金属抗性是目前亟待解决的问题，同时匍匐翦股颖分布范围广泛，也是抗逆基因挖掘的重要材料。
利用基因工程提高植物抗逆性是现代增强植物抗逆性的一个重要方法。利用基因工程可以把有抵抗外界逆境功能的基因筛选出来，来提高植物抗逆性，但目前对匍匐翦股颖抗逆性基因的研究和挖掘还不够深入，因此，挖掘匍匐翦股颖多效抗逆性基因，为植物抗逆基因库提供新的基因资源是有待解决的重要问题。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供AsMIPS1基因克隆、表达载体构建和应用。
本发明提供了肌醇-1-磷酸合成酶,所述肌醇-1-磷酸合成酶具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
本发明所述的肌醇-1-磷酸合成酶，其来源于匍匐翦股颖，其氨基酸序列为首次公开，与现有其他物种的肌醇-1-磷酸合成酶的氨基酸序列存在差异。
本发明提供了编码所述肌醇-1-磷酸合成酶的核酸。
进一步的，本发明所述的核酸，其可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。在本发明实施例中，所述核酸为DNA形式。所述DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。所述DNA可以是单链的或是双链的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如编码区和非编码区，非编码区如调控序列(例如启动子或转录终止子)。核酸在拓扑学上可以是线性或环状的。核酸可以是载体(如表达或克隆载体)的一部分，或一个片段。所述核酸可直接从天然来源获得，或者可由重组、酶法或化学技术辅助制备。
更进一步的，在本发明的具体实施例中，所述的核酸来源于匍匐翦股颖LOFSTL-93，具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
本发明对匍匐翦股颖的强耐热性植株LOFSTL-93和热敏感植株W66569的进行试验分析，挖掘到耐热性关键基因—肌醇-1-磷酸合成酶(AsMIPS1)编码基因，其编码产物肌醇-1-磷酸合成酶在高温下仍具有较高的表达水平，可对高温下光化学效率降低、叶绿素含量降低、丙二醛和导电率降低进行缓解，同时发现所述酶可提高植物镉胁迫抗性，具有提高植物抗逆性的性能。经进一步序列分析表明，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，为尚未公开的编码匍匐翦股颖肌醇-1-磷酸合成酶的新基因，为植物抗逆性基因资源库提供了新的基因来源。
进一步的，本发明所述的核酸，还包括与所述核酸编码相同氨基酸序列的核酸，其可以为所述核酸经过序列优化获得，所述序列优化包括但不限于密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点等。
本发明提供了调控植物抗逆性的制剂，其包括如下I)～II)所示中的至少一种：
I)、含有本发明所述的肌醇-1-磷酸合成酶的混合物；
II)、整合或靶向本发明所述的核酸的重组载体；
III)、含有II)的宿主细胞。
本发明所述的调控植物抗逆性的制剂包括提高植物抗逆性的制剂和/或降低植物抗逆性的制剂；
所述提高植物抗逆性的制剂包括：含有本发明所述的肌醇-1-磷酸合成酶的混合物；整合本发明所述的核酸的重组载体；以及含有所述重组载体的宿主细胞。所述整合本发明所述的核酸的重组载体，用于将所述核酸整合进入待改造宿主，从而能提高宿主的抗逆性。
所述降低植物抗逆性的制剂包括：靶向本发明所述的核酸的重组载体；以及含有所述重组载体的宿主细胞。所述靶向本发明所述的核酸的重组载体，其上含有本发明所述的核酸的某一区段，所述某一区段可以为gRNA目的片段、所述核酸的两端核苷酸序列的重组片段或所述核酸关键位点突变的片段，用于降低所述核酸的转录和翻译或达到直接敲除所述核酸的目的。
进一步的，本发明所述的重组载体还可以用于所述的核酸的扩增、保存和/或基因整合编辑等；在本发明的一些具体的实施例中，本发明所述的重组载体包括载体骨架和本发明所述的核酸，所述载体骨架包括T载体等克隆载体和可进行宿主体内表达的载体，如pCAMBIA1301-35SN。
本发明所述重组载体，是指重组的核酸载体，是一种重组DNA分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达或基因突变改造所必不可少的合适的核酸序列或元件。对模式植物或植物细胞中的表达必需的核酸序列或元件包括启动子、核糖体结合位点及可能的其它序列和元件。对模式植物或植物细胞中的基因突变改造必需的核酸序列或元件包括核酸内切酶编码基因、小crRNA及可能的其它序列和元件。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而，本发明意图包括表达载体的这样的其它形式，其发挥等价作用，其在本领域是已知的或将变为已知的，包括但不限于：质粒，噬菌体颗粒，病毒载体和/或仅为潜在的基因组插入物。
本发明所述的宿主细胞，其来源包括植物、细菌、真菌、噬菌体或病毒，本发明对此不做限定。本发明使用重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞，这样转化的宿主细胞有能力复制含有目的基因的载体或表达期望蛋白质。
进一步的，本发明所述的宿主细胞可作为基因编辑工具的载体，其含有将目标基因替换或产生目的突变的全部组件，用于所述组件的保存、扩增或基因编辑。
本发明的一些具体的实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌DH5α，其作为中间宿主用于核酸的扩增以及序列分析。
在本发明的另一些具体的实施例中，所述宿主细胞为拟南芥，其作为受体植株，在其内进行所述核酸的表达、所述核酸或所述核酸的编码产物的功能验证。
本发明提供了筛选抗逆性植物的制剂，其以本发明所述的肌醇-1-磷酸合成酶和/或本发明所述的核酸为靶标。
本发明的一些具体的实施例中，所述筛选抗逆性植物的制剂包括引物组，所述引物组以本发明所述的核酸为靶标。
进一步的，所述的引物组包括引物F和引物R；
所述引物F具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
所述引物R具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
本发明提供了如下i)～iv)所示中的至少一种在调控植物抗逆性中的应用：
i)、本发明所述的肌醇-1-磷酸合成酶；
ii)、本发明所述的核酸；
iii)、本发明所述的调控植物抗逆性的制剂。
进一步的，所述调控植物抗逆性包括提高植物抗逆性和/或降低植物抗逆性中的至少一种。
更进一步的，所述抗逆性包括抗热胁迫和/或抗镉胁迫中的至少一种。
本发明提供了如下A)～C)所示中的至少一种在缓解植物叶绿素损失、光化学抑制、丙二醛积累、导电率上升和/或提高植物抗氧化酶活性中的应用:
A)、本发明所述的肌醇-1-磷酸合成酶；
B)、本发明所述的核酸；
C)、本发明所述的调控植物抗逆性的制剂。
本发明提供了植物抗逆性的调控方法，其特征在于，包括利用和/或靶向如下a)～c)所示中的至少一种对植物进行基因组编辑：
a)、本发明所述的肌醇-1-磷酸合成酶；
b)、本发明所述的核酸；
c)、本发明所述的调控植物抗逆性的制剂。
本发明提供了抗逆性植物的筛选方法，其为利用本发明所述的制剂。
本发明通过对匍匐翦股颖耐热性和热敏性植株进行分析，挖掘到抗热胁迫和抗镉胁迫的新基因—肌醇-1-磷酸合成酶编码基因，试验结果表明，肌醇-1-磷酸合成酶编码基因编码的肌醇-1-磷酸合成酶在热胁迫和镉胁迫下具有较高的表达，可缓解热胁迫和镉胁迫下的叶绿素损失、光化学抑制、丙二醛积累、导电率上升，并可提高植物抗氧化酶活性，具有提高植物抗逆性的功能，在抗逆性植物育种中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1示高温胁迫下两个匍匐翦股颖材料叶片指标，其中，A为表型，B为光化学效率，C为健康指数，D为叶绿素a含量，E为叶绿素b含量，F为总叶绿素含量差异；
图2示高温胁迫下两个品种匍匐翦股颖材料叶片的丙二醛含量和电导率别的差异，其中，A为丙二醛(MDA)含量，B为电导率(EL)；
图3示高温胁迫下两个品种匍匐翦股颖AsMIPS基因表达量差异；
图4示AsMIPS1开放阅读框PCR产物；
图5示匍匐翦股颖AsMIPS1蛋白的预测分析，其中，A为二级结构预测，B为保守结构域预测，C为三级结构预测，D为磷酸化位点预测；
图6示不同植物的MIPS1蛋白同源蛋白系统进化树；
图7示AsMIPS1插入pCAMBIA1301-35SN为过表达载体示意图；
图8示过表达AsMIPS1拟南芥纯合植株筛选，其中，A为野生型拟南芥；B为T1代植株；C为T2代植株；D为T3代植株；
图9示过表达AsMIPS1拟南芥转基因植株鉴定及AsMIPS1表达量检测，其中，A为转基因植株鉴定，B为AsMIPS1表达量检测；
图10示高温和镉胁迫对过表达AsMIPS1拟南芥叶片叶绿素含量和叶素荧光参数(Fv/Fm)的影响，其中，A为叶绿素含量，B为叶素荧光参数(Fv/Fm)；
图11示高温和镉胁迫对过表达AsMIPS1拟南芥叶片丙二醛(MDA)含量和电导率(EL)的影响，其中，A为丙二醛(MDA)含量，B为电导率(EL)；
图12示高温和镉胁迫对过表达AsMIPS1拟南芥叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化物酶(POD)活性的影响，其中，A为超氧化物歧化酶(SOD)活性，B为过氧化物酶(POD)活性。
具体实施方式
本发明提供了AsMIPS1基因克隆、表达载体构建和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
引物AsMIPS1F的序列为：atgttcatcgagagcttccg(SEQ ID NO:1)；
引物AsMIPS1R的序列为：tcacttgtactccaggatcatgttg(SEQ ID NO:2)；
AsMIPS基因序列为：atgttcatcgagagcttccgcgtggagagccccaacgtgcggtacggcgccggcgagatcgagtcggagtaccgctacgacaccacggagctggtgcacgagagccacaacggcgcgtccaactgggtcgtccgccccaagtccgtcaactaccagttcaagaccaacaccaacgtccccaagctcggggtgatgcttgtgggcttgggcggcaacaatggctctacactcatggctggggtcatcgccaacagggaggggatctcatgggcgaccaaggacaaggtgcagcaggccaactacttcggctccctcacccaggcctccaccatcagggtcggaagctacaacggagaggagatctatgcgccattcaagagccttctgcccatggtgaacccagaggacattgtgttcgggggctgggacatcagcagcatgaacatggctgatgccatgaccagggccaaggtgctggacatcgacctgcagaagcagctcaggccctacatggagtccattgttccacttcctggtatctatgacccggacttcatcgctgccaaccagggatcccgggccaacaatatcctcaagggcaccaagaaagagcagatggagcaggttatcaaggacatcagggagttcaaggagaagaacaaagttgacaaggtagtggtgctgtggactgcaaacactgagaggtacagcggtgtctctgtcgggcttaatgacacgatggagaacctcttggcgtctgtggagaagaacgaggcagagatctctccatcaacactttatgccattgcctgcgtcatggagggtgtgccgttcatcaacgggagccctcagaacacctttgtccctgggctgatcgatcttgcaattaagaacaactgcctgattggcggtgatgatttcaagagtggccagaccaagatgaagtctgtcctggttgatttccttgttggtgctggaatcaagcccacctcgattgtcagctacaaccacctggggaacaacgatgggatgaacctgtctgcaccgcaaaccttccgttccaaggagatctccaagagcaacgtggtggatgacatggtctcgagcaacgctatcctctacgagcccggggagcatccggatcacgttgtcgtgatcaagtatgtgccttacgttggagatagcaagagggccatggatgagtacacctcagagatcttcatggggggtaagagcaccatcgtgctgcacaacacctgtgaggactcgctcctcgctgcgcccatcatccttgacctggtgctcctggccgagctgagcaccaggattcagctgaaagcagagggacaggacaagttccactccttccaccctgttgccaccatcctgagctacctcaccaaggcaccccttgtccctcctggcacaccggtggtgaacgcgctggcgaagcagagggccatgctggagaacatcatgagggcctgcgtcggcctggcgcccgagaacaacatgatcctggagtacaagtga(SEQ ID NO:3)；
引物pCAMBIA1301-AsMIPS1F的序列为：gggggcccggtaccatgttcatcgagagcttccgcgt(SEQ ID NO:4)；
引物pCAMBIA1301-AsMIPS1R的序列为：gatctgcagtctagatcacttgtactcgaggatcatgttg(SEQ ID NO:5)；
验证引物F的序列为：cgacagtggtcccaaaga(SEQ ID NO:6)；
验证引物R的序列为：gtgagggagccgaagtag(SEQ ID NO:7)；
肌醇-1-磷酸合成酶的氨基酸序列：MFIESFRVESPNVRYGAGEIESEYRYDTTELVHESHNGASNWVVRPKSVNYQFKTNTNVPKLGVMLVGLGGNNGSTLMAGVIANREGISWATKDKVQQANYFGSLTQASTIRVGSYNGEEIYAPFKSLLPMVNPEDIVFGGWDISSMNMADAMTRAKVLDIDLQKQLRPYMESIVPLPGIYDPDFIAANQGSRANNILKGTKKEQMEQVIKDIREFKEKNKVDKVVVLWTANTERYSGVSVGLNDTMENLLASVEKNEAEISPSTLYAIACVMEGVPFINGSPQNTFVPGLIDLAIKNNCLIGGDDFKSGQTKMKSVLVDFLVGAGIKPTSIVSYNHLGNNDGMNLSAPQTFRSKEISKSNVVDDMVSSNAILYEPGEHPDHVVVIKYVPYVGDSKRAMDEYTSEIFMGGKSTIVLHNTCEDSLLAAPIILDLVLLAELSTRIQLKAEGQDKFHSFHPVATILSYLTKAPLVPPGTPVVNALAKQRAMLENIMRACVGLAPENNMILEYK(SEQ ID NO:8)。
本发明采用的试剂耗材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 AsMIPS1基因克隆、表达载体构建和应用
1、匍匐翦股颖AsMIPS1基因挖掘和克隆
以耐热性强的LOFSTL-93和热敏感的W66569匍匐翦股为试验材料，取2cm×2cm匍匐翦股颖草皮扩繁在直径12cm、高32cm的白色PVC管中，在植物生长室(23℃、14h光照条件/19℃、10h黑暗条件)中进行生长扩繁，待其成坪可用于后续高温试验。试验共设置两个处理组：①正常培养(白天23℃/14h光照、夜晚19℃/10h黑暗)；②高温处理(白天38℃/14h光照、夜晚条33℃/10h黑暗)，每两日定量浇水以保持水分充足。分别于胁迫第0、7、15天取样测定生理生化指标。
试验显示，高温显著降低了两个材料的光化学效率和叶绿素含量，提高了丙二醛含量和电导率(图1和2)。与热敏感材料W66569相比较，热胁迫下耐热材料LOFSTL-93维持了显著较高的光化学效率和叶绿素含量，以及显著较低的丙二醛积累量和电导率水平(图1和2)。此外，LOFSTL-93也在热胁迫下维持了显著较高的AsMIPS1基因表达水平(图3)。AsMIPS1(英文全称为myo-inositol-1-phosphate synthase 1)是编码肌醇-1-磷酸合成酶的关键基因，该酶参与调节肌醇、棉子糖、抗坏血酸等众多代谢物的合成和转化。
为进一步验证AsMIPS1是调节匍匐翦股颖耐热性的关键基因，用植物总RNA提取试剂盒提取耐热材料LOFSTL-93总RNA，并反转录为cDNA作为克隆模板，在已测转录组数据库中得到匍匐翦股颖MIPS的mRNA序列，去NCBI数据库中比对得到同源基因序列并在保守区域用Primer Premier 5设计特异性引物AsMIPS1F-atgttcatcgagagcttccg(SEQ ID NO:1)和AsMIPS1R-tcacttgtactccaggatcatgttg(SEQ ID NO:2)。使用高保真酶对目的片段进行扩增。PCR完成之后，使用1％琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：1×TAE电泳缓冲液，150V，25min)检测目的条带，之后在蓝光下对含有目的条带的区域进行切胶，用普通琼脂糖凝胶回收试剂盒对目的片段进行回收，随之用TA克隆试剂盒对目的片段进行TA克隆连接至T载体，通过热激法将连接产物转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞中，已转化的产物在37℃、200r/min摇床活化1h，将活化后的菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基中倒置过夜培养，待第二天培养基上长出阳性单克隆菌落后用灭菌过的牙签挑取后混匀在含有Amp的液体LB培养基中扩繁，6～8h之后对菌液进行PCR验证和测序，得到一条长1533bp的AsMIPS基因序列(如SEQ ID NO:3所示，图4)，编码510个氨基酸(如SEQ ID NO:8所示)，经电泳检测条带一致，命名为AsMIPS1。
使用ProtParam预测结果表明，AsMIPS编码510个氨基酸，分子式为C2489H3951N661O760S23，相对分子质量为56033.10，理论等电点为5.46，带正电荷的氨基酸残基(Arg+Lys)48个，负电荷氨基酸残基(Asp+Glu)58个。蛋白质稳定系数为34.36，推测为稳定蛋白，平均疏水系数为-0.150，介于0.5和-0.5之间，推测其为两性蛋白。用SOMPA对AsMIPS序列进行二级结构预测，结果表明由40％的α-螺旋，6.47％的β-转角，16.86％的延伸链和36.67％的无规则卷曲组成AsMIPS1的二级结构。SMART对序列进行保守结构域预测，结果显示AsMIPS1可能含有两个结构域，一个是位于L62-R494的NAD结构域，一个是位于G310-S423的Inos-1-P结构域。用SWISS-MODEL对AsMIPS序列进行三级结构预测，结果表明其空间结构是由大量α-螺旋，β-折叠形成的。用NetPhos预测该蛋白有丝氨酸(Ser)位点20个，苏氨酸(Thr)位点14个，络氨酸(Thr)位点1个，可能被PKC、PKA、GSK3、cdk5、DNAPK、CKII等多种磷酸化激酶磷酸化(图5)。
通过MEGA软件采用Neighbor-Joining法构建了AsMIPS1与其他不同物种MIPS1蛋白的系统发育进化树(图6)。根据进化树构建结果可得，匍匐翦股颖AsMIPS1与燕麦肌醇-1-磷酸合成酶1蛋白(AsMIPS1)亲缘关系最近，属于同一个小的进化分支，与禾本科的玉米、水稻(Oryza sativa)的肌醇-1-磷酸合成酶1蛋白亲缘关系也较近，与豆科鹰嘴豆(Cicerarietinum)，大豆(Glycine max)的肌醇-1-磷酸合成酶1蛋白亲缘关系最远(图6)。
2、过表达AsMIPS1显著提高拟南芥的耐热和耐镉性
以pCAMBIA1301-35SN为过表达载体，设计在5`端和3`端加入同源臂碱基的引物(pCAMBIA1301-AsMIPS1F-gggggcccggtaccatgttcatcgagagcttccgcgt(SEQ ID NO:4)和pCAMBIA1301-AsMIPS1R-gatctgcagtctagatcacttgtactcgaggatcatgttg)(SEQ ID NO:5)。以重组T载体为模板，使用高保真酶扩增出带有同源臂碱基的目的片段。使用KpnI和XbaI限制性内切酶对pCAMBIA1301-35SN进行双酶切及载体线性化电泳验证。使用无缝克隆试剂盒对之前扩增好的目的片段和线性化载体进行连接，连接产物转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞中，已转化的产物在37℃、200r/min摇床活化1h，将活化后的菌液均匀涂布在含有卡那霉素(Kan)的LB固体培养基中倒置过夜培养，待第二天培养基上长出阳性单克隆菌落后用灭菌过的牙签挑取后混匀在含有Kan的液体LB培养基中扩繁，6～8h之后对菌液进行PCR验证，随后送至生物公司测序，AsMIPS1基因序列完整插入载体11339～11363bp位置，所得重组载体命名为pCAMBIA1301-AsMIPS1(图7)，最后转化至EH105感受态细胞用于拟南芥侵染。
采用花序侵染法将重组过表达载体转化至Col-0型拟南芥中，将活化后的农杆菌以1:50比例加入200mL的液体LB+潮霉素培养基中，20℃，200r/min摇菌约24h至菌液OD600＝0.8～1.2，取50mL菌液，5000r/min离心15min，弃上清之后将菌液重悬在5％的蔗糖溶液(取5g蔗糖溶于ddH2O定容至100mL，加入20μL silwet混匀)。转化时将已开花授粉的花序和种子剪掉，将拟南芥花序浸入蔗糖溶液中20s后用黑色箱子避光处理培养2d，后置于光照条件培养，重复侵染3次，每三天一次，待拟南芥成熟结种后收取T0代转基因种子。
选取饱满的T0代转基因拟南芥种子酒精消毒1min，次氯酸钠消毒5min后铺在含有潮霉素抗性的1/2MS固体培养基种中筛选阳性植株，两周之后挑取正常萌发、生长良好的阳性幼苗移栽至含有珍珠岩和蛭石的营养土生长，待成熟后收取T1代转基因种子，如此重复收到T3代转基因种子，并提取T3代植株叶片DNA，以此为模板进行PCR验证，跑胶、测序都正确认定为阳性植株。验证引物F-cgacagtggtcccaaaga(SEQ ID NO:6)，验证引物R-gtgagggagccgaagtag(SEQ ID NO:7)。
收取花序侵染后的T0代拟南芥种子，种植在含50mg/L潮霉素的1/2MS培养基中进行抗性筛选，幼苗能正常发育长出真叶、叶片呈现绿色且根系发达的初步认定为阳性过表达植株，幼苗无法正常生长、呈现出枯黄状或无法长出绿色的真叶及根系认定为阴性植株，图8依次为野生型拟南芥、过表达拟南芥T1代植株、过表达拟南芥T2代植株、过表达拟南芥T3代植株。三代植株均在含有潮霉素抗性的1/2MS培养基中生长(图8)。
提取转基因拟南芥T3代植株总DNA，以此为模板，以F端为载体序列和R端为目的基因序列来设计检测引物，进行PCR和琼脂糖凝胶电泳验证后，共有4株拟南芥与预期条带大小一致(图9)，证明这四株都是阳性转基因株系，分别编号为OE1～OE4，以β-actin为内参基因，进行实时荧光定量PCR检测四个株系的AsMIPS1在转基因拟南芥及野生型拟南芥中的转录水平。结果表明OE1和OE3株系的表达量较高，OE4略低，野生型拟南芥中AsMIPS1不表达(图9)，后续实验采用株系OE1和OE3来探究AsMIPS1提高植物耐热和耐镉性。
选取籽粒饱满野生型(WT)和AsMIPS1过表达拟南芥(OE1和OE3)种子，用75％酒精消毒1min后，灭菌水清洗1次，后加入1％次氯酸钠消毒5min后，灭菌水清洗5次，之后将种子均匀铺在含有或不含有抗性的1/2MS固体培养基中，在4℃冰箱中春化2天后转入光照培养箱中继续培养。待其生长12天选取大小一致的幼苗转入营养土中(营养土：珍珠岩：蛭石＝9：1：1)，置于生长室中正常培养，每隔2天浇一次水，7天浇一次霍格兰营养液。将长势一致的3个材料分为四组：(1)正常培养的对照组(材料放置在正常培养箱中)；(2)高温胁迫组(材料放置在38/33℃(白天/黑夜)高温培养箱中进行高温胁迫)；(3)镉胁迫组(材料放置在正常培养箱中，且土壤中浇灌500μmol/L的镉溶液进行胁迫)；(4)高温+镉同时胁迫组(放置在38/33℃(白天/黑夜)高温温度培养箱培养，且土壤中浇灌500μmol/L的镉溶液进行胁迫)。通过测定叶片叶绿素含量(Chl)、光化学效率(Fv/Fm)、丙二醛(MDA)含量、电导率(EL)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及过氧化物酶(POD)活性比较野生型植株和过表达AsMIPS1的转基因株系之间的抗性差异。
结果显示，热胁迫、镉胁迫或热+镉胁迫显著降低了叶片Chl含量和Fv/Fm，但与野生型(WT)相比，过表达AsMIPS1的转基因材料(OE1和OE3)在胁迫下维持了显著较高的Chl含量和Fv/Fm，说明过表达AsMIPS1能有效缓解热胁迫和镉胁迫导致的叶绿素损失和光化学抑制，提高植物抗性(图10A和B)。MDA是植物膜脂过氧化的产物，其含量越高表明植物在胁迫下受到的氧化伤害越严重。EL表示植物细胞膜的稳定性，其值越大说明细胞膜稳定性越差。热胁迫和镉胁迫显著诱导了MDA的积累和EL的升高，但过表达AsMIPS1能有效缓解高温和镉胁迫引起的丙二醛积累以及电导率上升(图11A和B)。热胁迫和镉胁迫下，过表达AsMIPS1的拟南芥维持了显著较高的抗氧化酶SOD和POD的活性(图12A和B)，这些结果表明过表达AsMIPS1的转基因植株耐热性和耐镉性显著增强。AsMIPS1可以用于显著改善植物耐热和耐镉性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.肌醇-1-磷酸合成酶，其特征在于，具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的肌醇-1-磷酸合成酶的核酸。
3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
4.调控植物抗逆性的制剂，其特征在于，包括如下I)～III)所示中的至少一种：
I)、含有权利要求1所述的肌醇-1-磷酸合成酶的混合物；
II)、整合或靶向权利要求2或3所述的核酸的重组载体；
III)、含有II)的宿主细胞。
5.筛选抗逆性植物的制剂，其特征在于，以权利要求1所述的肌醇-1-磷酸合成酶和/或权利要求2或3所述的核酸为靶标。
6.如下i)～iii)所示中的至少一种在调控植物抗逆性中的应用：
i)、权利要求1所述的肌醇-1-磷酸合成酶；
ii)、权利要求2或3所述的核酸；
iii)、权利要求4所述的制剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述调控植物抗逆性包括提高植物抗逆性和/或降低植物抗逆性中的至少一种。
8.如下A)～C)所示中的至少一种在缓解植物叶绿素损失、光化学抑制、丙二醛积累、导电率上升和/或提高植物抗氧化酶活性中的应用:
A)、权利要求1所述的肌醇-1-磷酸合成酶；
B)、权利要求2或3所述的核酸；
C)、权利要求4所述的制剂。
9.植物抗逆性的调控方法，其特征在于，包括利用和/或靶向如下a)～c)所示中的至少一种对植物进行基因组编辑：
a)、权利要求1所述的肌醇-1-磷酸合成酶；
b)、权利要求2或3所述的核酸；
c)、权利要求4所述的制剂。
10.抗逆性植物的筛选方法，其特征在于，为利用权利要求5所述的制剂。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014164014A1 (en) * | 2013-03-11 | 2014-10-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genes for improving nutrient uptake and abiotic stress tolerance in plants |
| CN107920489A (zh) * | 2015-09-09 | 2018-04-17 | 菲利普莫里斯生产公司 | 天冬酰胺含量减少的植物 |
| CN112592911A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-02 | 南京师范大学 | 一种耐热性α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体在制备葡萄糖醛酸中的应用 |
| CN112980754A (zh) * | 2019-12-13 | 2021-06-18 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种枯草芽孢杆菌全细胞催化淀粉制备肌醇的方法 |
| CN116286864A (zh) * | 2023-02-22 | 2023-06-23 | 北京市农林科学院 | 马蔺耐镉基因IlDTX49及其编码蛋白与应用 |
-
2023
- 2023-06-28 CN CN202310772885.6A patent/CN116574719B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014164014A1 (en) * | 2013-03-11 | 2014-10-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genes for improving nutrient uptake and abiotic stress tolerance in plants |
| CN107920489A (zh) * | 2015-09-09 | 2018-04-17 | 菲利普莫里斯生产公司 | 天冬酰胺含量减少的植物 |
| CN112980754A (zh) * | 2019-12-13 | 2021-06-18 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种枯草芽孢杆菌全细胞催化淀粉制备肌醇的方法 |
| CN112592911A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-02 | 南京师范大学 | 一种耐热性α-葡萄糖醛酸酶多肽融合体在制备葡萄糖醛酸中的应用 |
| CN116286864A (zh) * | 2023-02-22 | 2023-06-23 | 北京市农林科学院 | 马蔺耐镉基因IlDTX49及其编码蛋白与应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| NAOTO MITSUHASHI等: "Localization of myo-inositol-1-phosphate synthase to the endosperm in developing seeds of Arabidopsis", JOURNAL OF EXPERIMENTAL BOTANY, vol. 59, no. 11, 4 July 2008 (2008-07-04) * |
| 吴俐;王若仲;徐文忠;: "拟南芥中myo-肌醇-多磷酸合成与代谢及其信号", 植物学报, no. 01, 10 January 2013 (2013-01-10) * |
| 徐婷婷等: "陆地棉基因GhMIPS1A的克隆及功能分析", 棉花学报, vol. 34, no. 2, 15 March 2022 (2022-03-15) * |
| 杨海波等: "柳枝稷肌醇-1-磷酸合成酶PvMIPS2基因的克隆及表达分析", 分子植物育种, 13 June 2023 (2023-06-13) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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